JPH01308228A - 免疫調整剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本願発明は新規な免疫調節剤に関し、更に詳細には腫瘍
プロモーターではない一連の新規なプτコテインキナー
ゼＣアクチベークーに関する。

本発明の背景 細胞活性化研究に関する最近の研究（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ
。

Ｍ、Ｊ、、１９８４年、第２メンセンジヤーとしてのイ
ノシトールトリホスフェートおよびジアシルグリセロー
ル、旧ｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２２０．３４５　　；　Ｋｉ
ｋｋａｗａ　、、Ｕ。

等、１９８３年、腫瘍促進ポルボールエステルの可能な
レセプター・蛋白質としてのプロティンキナーゼＣＸＪ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５８．１１４４２；Ｎ
１５ｈｉｚｕｋａ　。

Ｙｌ、１９８４年、細胞表面シグナル形質導入および腫
瘍促進におりるプロティンキナーゼＣの役割、Ｎａｔｕ
ｒｅ＝　３０８．６９３参照）およびＴ−細胞抗原レセ
プター（ＴｃＲ）介在Ｔ−リンパ球刺激に関係のある生
化学的経路（Ｉｎ　（！　ｉ　ｓ　ｓ等、１９８４年、
ヒｌ−Ｔ−細胞活性化におレノる１３表面分子の役割：
　Ｔ３−依存性活性化は細胞質の遊離力ルシウＪ、の増
加をもたらす、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＬＩＳＡ、、　８ＬＸ、４］６９　；Ｉｍｂｏ
ｄｅｎ　、、Ｊ、Ｂ、等、１９８５年、Ｔ−細胞抗原レ
セプターによる１〜ランスメンプランシグナル化二　Ｔ
−３抗原レセプターコンブ１ソツクスの混乱によりイノ
シトールリン酸が生成しそして細胞内貯蔵からカルシラ
Ｊ、イオンが放出される、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、−１
，、、ｑ、ｊ、−２４４６；　Ｔｒｕｎｃｂ、Ａ６等、
１９８５年、カルシウムイオノフオアとポルボールエス
テルとの相乗作用によっ−Ｃ迂回したリンパ球活性化の
初期段階、Ｎａｔｕｒｅ、３１１℃、３１８　　；　ｌ
ｌｔｓｕｎｏｍｉｙａ、Ｎ６等、１９８６年、スＩ・ツ
プトフロー蛍光定量法により明らかになったア四免疫細
胞毒性Ｔ−リンパ球活性化における初ｙｐ　＋−ランス
メンプラン結果、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃ、ｉ、　ＬＩＳＡ、８３、＋８７７　；　Ｂｅｒｒ
ｉｅｂｉ、　Ｇ、等、１９８７年、細胞毒性Ｔ−リンパ
球による抱合体形成および必殺攻撃誘発に対する抗原−
レセプターの必要性はプロティンキナーゼＣアクチヘー
ターおよび（、ａ＋１−イオノフオア乙こより迂回する
ことができる、Ｐｒｏｃ、　ｔｌａｔｌ、八ｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８４．１３６４参ＩＩＩりによって
免疫調節剤の設計および開発の新しい知的基礎が創生さ
れた。

特に関心があるのは、Ｔ−リンパ球活性化におけるＡｇ
　−レセプター介在トランスメンプランシグナル化経路
を妨げる良く定義された剤の免疫調節特性の評価である
。多数の研究によってプロティンキナーゼＣ（上記のＮ
１５ｈｉｚｕｋａ参照）がヘルパー（上記のＩｍｂｏｄ
ｅｎ等およびＴｒｕｎｃｈ等参照）および細胞毒性（上
記のＵ　ｔｓｕｎｏｍ　ｉｙａ等およびＢｅｒｒｅｂｉ
等参照）　Ｔ−リンパ球の活性化に関係があることが示
されている。イノシ１−−ルリン脂質代謝とプロティン
キナーゼＣ（ポルボールエステルの主要な細胞レセプタ
ー）の活性化との間の関連の発見はリンパ球活性化にお
けるホルボールエステルの影響の説明に役立っている。

それ故、ホルボールエステルが潜在的腫瘍プロモーター
でないとしたら、それらは免疫調節剤として評価するた
めの優れた候補者であると考えられよう　（Ｊｅｆｆｅ
ｒｙ　、Ａ。

門８．１９８６年、腫瘍プロモーターのコンピューター
支援模型製作：ホルボールエステル、テレオシジン（ｔ
、ｅｌｅｏｃｉｄｉｎ）　Ｂおよびアプリシアトキシン
（ａｐｌｙｓｉａｔｏｘｉｎ）の活性原理、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、即２４１参照）。

従って、免疫応答を増強または抑圧する能力に一ついて
試験できる、非−腫瘍を促進するプロティンキナーゼＣ
のアクチベーターを確認する必要がある。本願発明は、
非−腫瘍促進だけでなく幾つかのインヒドロおよびイン
ビボ系で潜在的抗−新生物特性を有することが見い出さ
れているプロティンキナーゼＣアクチヘーターの確認お
よび使用に向りられている。上述の要件に合致すること
が見い出されている特別の化合物は、エクトブロクタ（
Ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ）門の海生動物（ｇ連名ブリオゾ
ア（Ｂｒｙｏｚｏａ）　）に含まれる生合成生成物の新
たに発見された系統群で見い出され、［ブリオスタチン
（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎｓ）　ｌと命名された。マウス
Ｐ３８８　リンパ球白血病（ＰＳ）系で、ブリオスタチ
ン］　（ＮＳＣ３３９５５５）は１０〜７０μｇ　／　
ｋｇの注射投与値で５′２〜９６％の寿命延長およびイ
ンビＩ・口の細胞株Ｐ３８８に対し０．８９μｇ／　の
ＥＤｓｏを示した（Ｐｅｔｔｉｔ、　Ｇ。

Ｒ６等、１９８２年、ブリオスタチン１の単離および構
造、Ｊ、静ｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　、１０４−
１６８６６参照）。

更に、ブリオスタチン１はＭ５３１マウス卵巣肉腫系で
５〜４０ｇ／ｋｇで３１〜６８％の寿命延長をもたらし
たことが見い出された（Ｐｅｔｔｉｔ、、Ｇ、Ｒ，，１
９８４年、ブリオスタチン４の構造。地理的に異なるブ
グラネリチナ（ｂｕｇｕｌａ　ｎｅｒｉｔｉｎａ）（ブ
リオゾア）の重要な抗新生物成分、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　
Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　、１０６．６７６Ｂ参照）。同
様に、ブリオスタチン１および２ば１ＩｔＪＪＸプロモ
ーターの拮抗剤であることが見い出された。

本発明の簡単な要約 本願発明は、系におけるマウス細胞毒性Ｔ−リンパ球（
「ＣＴＣ」）発現およびエフェクター機能に与えるブリ
オスタチン１および２の刺激効果の本願発明者の発見に
基づいている。特に、ブリオスタチン１および２ば組換
え体Ｂ−細胞刺激因子ＭＢＳＦ−ＩＪ）と相乗して休止
Ｔ−細胞を刺激して増殖させそして細胞毒性１゛−リン
パ球に分化させることが見い出された。インビボ感作肺
臓細胞の研究でブリオスタチンがＣＴＬの発現に必要な
インターロイキン−２（１”ＩＬ−２Ｊ　ンのン農度を
劇的に減少させ且っＩｆ、−２で誘導される細胞毒性の
発現を高めることが明らかにされている。クローン化し
たＣＴＬを使用して、４β−ホルボール−１２−ミリス
テー１〜−１３−アセテ−）（ｒＰＭΔ」）と同じく、
ブリオスタチン１および２ば共にＡ、　−特異的細胞毒
性を阻害することが示されるがＴｃＲ−交差結合の要件
を迂回でき、そしてＡｇを有さない標的細胞に対して溶
解性顆粒のエキソザイトーシスおよび細胞毒性の誘発す
ることができる。

本願明細書で使用されるように、ＴｃＲはＴ−リンパ球
の抗原レセプターと同一である。示されるように、本願
発明はインヒポにおける免疫調節のためにブリオスタチ
ン１およびブリオスタチン２を単独かまたはインターロ
イギン−２プラスＢ−細胞刺激因子と組合わせて使用す
るものである。

従って、本願発明の原理的な目的は患者の自己免疫系内
でのインターロイギン−２およびガンマ−インターフェ
ロンの内生的産生を増強する非蛋白免疫刺激剤を提供す
ることである。

本願発明のも・う１つの目的は、新生物増殖に苦しんで
いる宿主にクローン化した蛋白質物質（インターロイキ
ン−２および／またはガンマ−インターフェロン）と同
時に静脈内投与するとき、所望の治療効果を達成するの
に必要な上記のクローン化した異種蛋白質物質の量を実
質的に減少させることによりアナフィラキシ−反応の危
険性を著しく減少させる非−蛋白質免疫調節剤を提供す
ることである。

本願発明の更にもう１つの目的は、プロティンキナーゼ
Ｃを活性化して投与される宿主の自己免疫系内でのイン
ターロイキン−２およびガンマ−インターフェロンの内
生的産生を刺激する新規で改良された方法を提供するこ
とである。

本願発明の更にもう１つの目的は、効果を高めるために
潜在的抗−腫瘍プロモータープロテインキナーゼＣアク
チヘーターを同時投与することによるインターロイキン
−２および／またはガンマ−インターフェロンのような
りローン化された蛋白質物質を、一定の治療効果を達成
するのにこれまで必要であった量を実質的に減量して投
与する新規で有用な方法を提供することであり、この方
法によってアナフィラキシ−反応の危険性が最少になる
。

本願発明のなお更にもう１つの目的は独特の免疫増強物
質およびこのような物質を使用する方法を提供すること
であり、その際宿主の自己免疫系が活性化されて内生的
インターロイキン−２およびガンマ−インターフェロン
を産生じ、異種蛋白（例えばカリツメ・ルニア州のシー
タスコーポレーション（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）から人手可能な、例えばクローン化したインタ
ーロイキン−２およびクローン化したガンマ−インター
フェロン）の導入により宿主の生化学的平衡がおかされ
ることなく新生物細胞を攻撃し新生物の拡大を防（Ｔ−
細胞（リンパ球）の特異性を増大する。

本願発明の更にもう１つの目的は独特の免疫増催物質お
よびこのような物質を使用する方法を提供することであ
り、この方法によって規制量のクローン化したインター
ロイキン−２およびガンマ−インターフェロン（異種蛋
白）を少量ではあるが有効量のブリオスタチン１または
ブリオスタチン２と実質的に同時に宿主に注射して添加
することによって宿主の自己免疫系を高め、これによっ
て上記異種蛋白の上記規制量はブリオスタチンの同時注
射なしで実質的に同一の治療効果を得るのに必要な量の
約１７１０から約１７２０となり、異種蛋白のヒト免疫
系への導入によるアナフィラキシ−および他の既知副作
用の危険性を約１７１０〜１／２０に減少させる。

上記目的および下記に見られる更にそれ以」二の目的は
、特に添付の図面と併せて読むとき、本願発明の例示的
実施態様に関する以下の詳細な記載から容易に理解され
るとおり、非常に予期されない態様で本願発明によって
実現される。

好ましい実施態様の記載 本願発明は、本願明細書で［ブリオスタチン１およびブ
リオスタチン２」と名付けた、新規に発見した免疫調節
剤並びに（ａｌ宿主の自己免疫系内での内生的インター
ロイ４−ン−２およびガンマ−インターフェロン（自己
産生されるこれら蛋白質は宿主の生化学と適合可能であ
る）の産生を刺激するためかまたは（ｂｌ共に適合不可
能な蛋白質形態であるクローン化したインターロイキン
−２およびガンマ−インターフェロンの活性を増強して
アナフィラキシ−をもたらす抗原反応を非常に消失させ
、それによって宿主の生化学的構成と適合できない蛋白
質材料の使用による不利な副作用の危険性をかなり減少
させるというイ」随的な利益を有しながら所望の治療効
果を得るのに必要な異種蛋白の量を実質的に減少させる
ためかのいづれかのために、新生物増殖に苦しんでいる
宿主の治療に上記ブリオスタチンを使用する方法に関す
る。

知られているとおり、癌は（宿主の自己免疫系中の）Ｔ
−細胞が癌細胞を認識できないこと、そしてそれによっ
て癌細胞が宿主内に自由に増大できることに起因する。

本願明細書に従ってブリオスタチンを使用づるとＴ−細
胞認識の範囲が拡がり、それによってそうでなければ生
起しないＴ−細胞活性により得られる結果が可能になる
と思われる。更に、本願発明の方法は異種蛋白のような
高危険量の毒性材料を使用しないで」１記結果を達成し
、そして通常は呼吸困難、発汗、熱および場合によって
は死亡によって表わされる典型的な蛋白質アナフィラキ
シーの危険性を実質的に最少にする。

以下の節ではブリオスタチンの製造およびブリオスタチ
ンから得られる全体的に予期されない利益を示すプロト
コールを考察する。

ブリオスタチン１および２の単離と零卸殴東太平洋のブ
グラネリチナ５００　ｋｇ　（新鮮動物）から調製した
塩化メチレン抽出物は溶媒分配シーケンスの９：１　４
：１メタノール−水とりグロインー四塩化炭素で更に分
画し、次いで上記のペティソト、ジー・アール・（Ｐｅ
ｔｔｉｔ、　Ｇ、Ｒ，）等、１９８２年およびペティソ
トジー・アール等、１９８３年、海生ブリオシアンブグ
ラネリチナ由来のブリオスタチン２の構造、Ｊ、Ｎａｔ
ｕｒａｌ、Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、、４６．５２８に報告さ
れたシリカゲルとセファデックスＬＨ−２０の両方を使
用する広範なカラムクロマトグラフィー技術で更に分画
した。両ブリオスクチンは図１枢で−２に示されるよう
に非常に珍しい構造の巨大環状の２０員環ラクトンであ
る。ブリオスタチン２ばブリオスタチン１の７−ジスア
セチル誘導体である。

■ 全研究中に使用した８週令の雄りＢｉ２、Ｂ１０および
ＢＡＬＢ／Ｃマウスはメリーランド州フレドリンクのチ
ャールズリハ−（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）から購
入した。

豊凶 下記の細胞溶解性Ｔ−細胞クローンおよび標的細胞を使
用した：細胞毒性Ｔ−リンパ球（ｒ（：ＴＬ’Ｊ　）Ｏ
Ｈ２（Ｈ−２ｄに特異的なＨ−２”　）＜５ｔａｅｒｚ
、　Ｕ。

Ｄｌ等、１９８５年、ハイブリッド抗体はＴ−細胞によ
る攻撃用部位を的とし得る、Ｎａｔｕｒｅ、　３１４　
＋　６’２８参照）　、ＣＴＬ　２Ｃ（Ｈ−２ｂに特異
的なＨ−２’）（上記のＢｅｒｒｅｂｉ　＋　Ｇ、参照
）；ＣＴＩ、ＢＭＬＯ−３７（Ｈ−２’に特異的なＨ２
’　）（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ、Ｊ、Ａ。

１９８７年、リンパ球培養集団と混合した変異株＋１−
２１（ｂｍｌｏ抗−１１−２Ｋｂに由来する細胞毒性Ｔ
−細胞（ＣＴＬ）クローンの特性化：第１５回国際白血
球培養物会議の議事録、５ｕｓｓｅｘ＋Ｊ、　Ｗｉｌｌ
ｅｙ　＆　５ｏｎｓ。

Ｌｔｄ、、１４９頁）　　；　　Ｐ８１５　　（マウス
の肥満細胞腫細胞株、＋１−２’　）　、ＰＬ−４（Ｔ
−細胞リンパ腫、Ｈ−２ｂ）。標的腫瘍細胞は１０％の
Ｆｅ２　（メリーランド州ベセスダ、Ｂｉｏｆ　１ｕｉ
ｄｓ）を補給したＰＰＭ１１６４０培地で維持した。Ｃ
ＴＬクローンはグレースプルツク、エイ・エル・（Ｇｌ
ａｓｅｂｒｏｏｋ、、Ａ、Ｌ、）およびエフ・ダブリュ
・ツイツチ（Ｆ、Ｗ、Ｐｉｔｃｈ）、１９８０年、異形
反応性のクローン化Ｔ−細胞株、■。

クローン化したアンブリファイアニー細胞株と細胞溶解
性Ｔ−細胞株との間の相互作用、Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ　、、鼠、８７６に記載されたようにして、照射
した刺激細胞およびコンカナバリンＡ−活性化ラソト牌
臓細胞のＩｆ、−２含有上澄液を使用して維持した。

邦１１１ｊｌ’Ｉ７−・ム欠イ エフェクター細胞および５１　Ｃｒ−標識標的細胞は、
グラブスタイン、ケイ（Ｇｒａｂｓｔｅｔｎ、　Ｋ、）
　、１９８０年、細胞介在細胞熔解応答、細胞免疫学で
の選択された方法、ビー・ビー・ミソシェル（Ｂ、　Ｂ
　、Ｍｉｓｈｅｌ）およびニス・エム・シーギ（Ｓ、Ｍ
、Ｓｈｉｉｇｉ）編集（→ノーンフランシスコ、フリー
マン（Ｆｒｅｅｍａｎ））、１２４頁に記載された種々
のＨ／Ｔ比で混合して、９６ウエルのプレートに３重複
させてインキュー・−卜した。標的細胞数は、５１Ｃｒ
−放出アッセイを細胞溶解性Ｔ−細胞り１コーンで実施
したときウェル当たり１０’個の細胞であった。肺臓細
胞およびリンパ節Ｔ−細胞をエフェクターとして研究し
たときにはウェル当たり５Ｘ］、０３個の標的細胞を使
用した。ＰＭＡ　、ブリオスタチン１およびブリオスタ
チン２は０．５ｎｇ／ｍｌから１１００ｎ／ｍｌの範囲
の最終濃度で加えた。レシチン−依存性細胞毒性アッセ
イはＣＴＬと５１　Ｃｒ−標識標的細胞の混合物にＣｏ
ｎＡ　１．Ｏｇ／ｍｌを加えて実施した。インキュヘー
ション後、９６ウエルのプレートを遠心しく１分、８０
０　ｒｐｍ　。

４℃）、全上澄液を採取し、試１′モｉ中の放射能を旧
数し一１各３重複の平均値を測定した。特異的５１Ｃｒ
放出のパーセン１−は １００　　Ｘ　　　（□そ一一□１２□−）／（↓−す
ン式中、土はＣＴＬの存在下での５１　Ｃｒ放出であり
、±ばＣＴＬの不存在下の標識標的細胞からの自然放出
であり、そして±は標的細胞中の総ｃｐｍ数であるとし
て計算した。標的細胞からのＳ　Ｉ　Ｃｒ　　の自然放
出は総ｃｐｍの１５％を超えなかった。

このアッセイはタカヤマ、エイチ（Ｔａｋａｙａｍａ＋
　Ｈ，）等、１９８７年、抗原レセプターが細胞毒性Ｔ
−リンパ球から１−リプシンタイプのエステラーゼ分泌
を誘発した（Ｊ、　ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１３８．５６
６　）　、に記載されたとおりに実施した。簡単に言え
ば、エフェクター細胞はインギュベーション培地に再懸
濁しそして１００μβ当たり１０′個の細胞の濃度で９
６ウエルのプレート（イムロン（Ｉｍｍｕｌ、ｏｎ））
に３重複でインキュベートした。ホルボールミリステー
ドアセテート（　ｒＰＭＡ　Ｊ　）　、ブリオスタチン
１およびブリオスタチン２は］、Ｑｎｇ／ｍｌの最終濃
度で加え、Ｃａ”’イオノフオアＡ２３１８７　　（遊
離酸、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　Ｃ　７５２２）ば０．５
　ＩＩ　ｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。ウェル当たりの
総容量は２００μβに調節した。

インキュベーション（３７°Ｃ１５％ＣＯ□）の４時間
後に、プレートを回転（１分、２００　Ｘ　Ｇ）　！，
て上澄液５０μβを採取した。ＢＬＴ−Ｅ総含量はＰＢ
Ｓ中０．１％のトすＩ・ンＸ−１．００で１０５個のエ
フェクター細胞を溶解して測定した。

マウスＩ８抗原Ｉ−八５゛４″９およびＴ−Ｅｄ・ｋ（
Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Δ．等、１９８１年、Ｉ−
ＡおよびＩ−Ｅザブ領域によってコードされた■３　−
抗原上の共有アロ抗原決定因子：Ｉ領域遺伝子複製の証
明、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２７、２４８８参照）
に向けられたモノクローナル抗体１’１５／１．１４．
１５．２（ラット１９Ｇ）は非毒性のウサギ補体（カナ
ダ　オンタリオ州のＣｅｄａｒ　Ｌｉｎｅ、低−Ｔｏｘ
　−　Ｍウサギ補体）と−緒に１／１００腹水液の最終
希釈で使用した。マウスＪＬ−２レセプターに対する７
　Ｄ４ラットＩｇ　Ｍ抗体（Ｍａｌ．ｅｋＩＴ．等、１
９８３年、マウスインターロイキン−２レセプター・リ
ガンドコンプレックスと反応性のラットモノクローナル
抗体の同定および初期特性化、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｉｌ．
＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＬＩＳＡ、則、５６９４参照）
およびＭＡＲ　１８．５　（Ｌａｎｉｅｒ、１，、等、
１９８２年、ラット免疫グロブリン鎖に対するモノクロ
ーナル抗体、丁（ｙｂｒｉｄｏｍａ　、上、１２５参照
）マウス抗ーラソトカソバ鎖抗体は以前に記載されてい
る。

状釆 ７１Ｌ−２は「バイオジエン（Ｂｉｏｇｅｎ）　Ｊ　　
（マサチューセソツ州ケンブリッジ）から得た。組換え
体Ｂ細胞刺激因子（ＢＳＦ　−１．１．Ｌ　−　４　）
はイムネソクスコーポレーションＯｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から提供された。

インビボ惑作牌臓細胞の精製 ＢＩＯマウスを５〜７．５　Ｘ１０６個の照射したＰ８
１５（Ｉｆ−２’）細胞を用いてインビボで免疫化した
。

２〜３週間後に動物を層殺し、肺臓細胞を採取した。赤
血球を低張塩溶液で熔解した。

細胞は５０　Ｘｌ０６個の細胞当たり１／１０に希釈し
たＭ　５／１１４．１５．２　ｍＡｂ含有腹水１００μ
ｐでインキュへ−１−した。室温で３０分後、細胞を洗
浄し、５×１０６個の細胞当たりＭＡＲ１８，５含有細
胞上澄液１００μｐおよびウサギ補体１．００．ｕ／を
加えた。３７℃でのインキュベーションを４５分間続行
し、死亡細胞はハイパークーフィコール（ｔｌｙｐａｑ
ｕｅ−Ｆｔｃｏｌｌ）遠心法で除去し、洗浄し、次いて
図面の説明に特定されているように、ＩＬ−２、Ｐｌ’
ｌＡ若しくはフ゛リオスタチンを添加し、または添加し
ないでＲＰ旧培地／１０％ＦＣ５中で３０間インキュへ
−トシた。Δｇを有する標的細胞に対する細胞毒性は標
的としてＰ８１５肥満細胞腫細胞を使用して５ＩＣｒ−
放出アソセイで測定した。

−イーンヒドｌ（−容■−ルＷ月嚇１則１匂の得青製肺
臓細胞はＢＩＯマウスから採取し、照射したＤＢＡ−２
牌臓細胞と１：１　の比で混合した。細胞ばｌ？ＰＭ　
ｌ−１６４０培地を含む５％ＦＣ３中２　Ｘｌ０６／ｍ
ｌの濃度で培養した。培養１４日後に細胞は下記したよ
うにして精製した。

マウスリンパ節から得たノ］葵士−イに止ユニ凝膳■猜
製 腸間膜リンパ節はウィルスを有しない８〜１２週令のＢ
ＡＬＢ／ｃマウスから採取した。２つのナイロンウール
カラムを通過後、■ａ陽性細胞は−」−記したようにし
て抗−１８モノクロ一ナル抗体Ｍ５／１１４に低−Ｔｏ
ｘ−Ｍウサギ補体を加えたもので引き続いて溶解した。

次いで、濃密な小さい休止１゛−細胞は修正した不連続
性パーコール（Ｐｅｒｃｏ　］、　］　）勾配法勾配法
ｆｒａｎｃｏ等、１９８２年、抗免疫グロブリンに応答
するＢ−リンパ球の頻度、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、＋
１５５．１５２３参照）によって分離した。６６〜７０
％の密度帯中で採取した精製Ｔ−細胞は小さい休止細胞
であると考えられた。ｍＡｂで染色し次いで蛍光分類分
析して、それらのほとんど全てがＴｈｙ　１”であるこ
とが明らかにされた：細胞の８０％がＬ３Ｔ４’であり
細胞の２０％がｔ、ｙｔ　　２“であった。

インビボ感作ヱー妹の肺臓から得た細胞毒性Ｔ−細胞の
乙」クモ」びり心！しζ与ｊニーるブリオス一久す！−
此−枕夫グースー９影！ インヒポ感作マウスの肺臓から得た精製Ｔ−細胞を増殖
因子の不存在下でインビトロでインキュベートしたとき
、最大毒性活性は２４時間目に検出された；細胞を更に
ｉ＠養しつづりるにつれて細胞毒性は減少した（データ
は示していない）。インギュヘーション培地にＩＩ、−
２の濃度を増加させ乍ら添加すると、下記図２Ａおよび
表１に示されるとおり、マウス肺臓細胞毒性リンパ球の
集団の溶解単位数が増加した。γＩＬ−２／ｍｌの２Ｕ
／ｍｌは小さな影響しか有さなかった：細胞毒性の最大
誘導（１０７個の肺臓Ｔ−細胞当たり５１溶解単位）は
図２八に示されるようにｒｌＬ−２の２（ＩＩＪ／ｍｌ
　を用いた感作細胞のインキュヘーション７２時間後に
達成された。しかしながら、０．７８ｍ？のブリオスタ
チン２またはＰＭＡがインキュヘーション期間中に存在
したときには、２Ｕ／ｍｌ　のｒｌＬ−２は、図２に示
されるように、２０１／ｍｌのＴ１、−２で誘導される
のと同じ程度のＣＴＬ発現を誘導した（以下の表１参照
）。

更に、ＰＭＡ並びにブリオスタチン１および２は高濃度
のｒＴＩ、−２で得られる細胞毒仕度も増強させた。

ブリオスタチンおよびＩＬ−２で刺激された細胞溶解性
細胞は１ｌ−２ｄを存する標的細胞に特異的であり　（
図３参照）、これはそれらがＨ−２’を有する細胞株Ｐ
８１５で感作したマウスから発現したことを示している
。ＥＬ４標的細胞に対する細胞毒性は全（検出されなか
った。しかしながら、ブリオスタチンおよびＩＬ−２が
誘導した細胞毒性細胞は、図３に示されるように、Ｃｏ
ｎ　Ａの存在下でＥＬ７４細胞を溶解することができた
。

ブリオスタチン＋ＩＬ−２による細胞毒性細胞発現の増
強はインビボ感作ＩＩＩ臓細胞の３日間のイン上１〜ロ
インキユヘーシヨン中のブリオスタチンの濃度に強く依
存している。０．５　ｎｇ／ｍｌ　またはそれ以下のブ
リオスタチン濃度によりＴ１．Ｔ−２誘導細胞毒性が増
強された；より高濃度のブリオスタチンは効果がない（
１ｎｇ／ｍｌ　）かまたはＩＬ−２誘導細胞毒性を阻害
した（　２　ｎｇ／ｍｌまたはそれ以」二）（データは
示していない）。

インビトリでのＣ几りローンのＷ−３１特異的透介 ５１Ｃ：ｒ−標識したＥＬ−４細胞（Ｉ（−２’）を種
々のＥ／Ｔ比で細胞毒性Ｔ−細胞クローン２Ｇ　　（抗
−Ｈ−２Ｌｄ）と混合したとき５１Ｃｒ−放出は全く観
察されなかった。しかしながら、図４１、こ示されるよ
うに、ブリオスタチン１または２を細胞混合物に加える
と投与量依存的にＥＬ−４細胞の溶解が生じ、最大活性
ば１０　ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン２で生した。ブリ
オスタチン２の濃度を１０倍増加させてもＣＴＬのより
高い細胞毒性は生じなかったので、上記のことは投与量
一応答依存性の高原現象を表わしていると思われる。ブ
リオスタチン２のＬｏｎｇ／ｍｌで、”Ｃｒ−放出値は
、試験した全てのＥ／Ｔ比で同じ濃度のＰＭＡまたはブ
リオスタチン１と比較して一貫してより低かった。、（
データは示していない）。

貴既毒性Ｔ−細胞久月二ス濾荘肚卦放出の透産 ＣＴＬの細胞溶解活性は顆粒のエキソザイト−シスと関
係がある（Ｂｙｋｏｖｓｋａｊａ、、　Ｓ、Ｎ、等、１
９７８年、細胞溶解性Ｔ−リンパ球と標的細胞との相互
作用による該リンパ球の超構造変更、■３分泌顆粒およ
び細胞内小胞の形態形成、Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、＋／ＩＯ＋＋７５　　；　Ｚａｇｕｒｙ、　Ｄ、、　
１９８２年、個々のキラーニー細胞の直接的分析：ＣＴ
Ｌによる加水分解酵素の熔解および分泌に対する標的細
胞の感受性、Ａｄｖ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　Ｂｌｏｌ、＋　１４６＋　１４９　；　Ｈｅ
ｎｋａｒｔ、Ｐ、八、、　１９８５年、リンパ球介在細
胞毒性の機構、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

３　、３１　；　Ｒｕ５ｓｅｌ、Ｊ、Ｉｌ、、１９８６
年、ホルボールエステルは細胞毒性Ｔ−ＩＪンパ球によ
る弱く且つ非特異的標的細胞の溶解を刺激した、Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、　１３６゜２３；上記のＴａｋａｙａ
ｍａ、　Ｉｌ、等参照）ので、特異的標的細胞とのＣＴ
Ｌ相互作用に応答してまたは固定化した抗−ＴｃＲｍＡ
ｂによるＴｃＲの交差結合後に、顆粒関連トリプシン−
タイプのエステラーゼの分泌に影響を与えるブリオスタ
チン１および２の能力を試験した。

新規に開発したＢＬＴ−エステラーゼ分泌アソセ２フ イ　（上記のＴａｋａｙａｍａ、　１１．等）を使用し
て、ブリオスタチン１および２が細胞溶解性Ｔ−細胞を
活性化する能力およびＣＴＬがらの顆粒のエキソシト−
シスを誘発する能力を試験した。閲５に示されるように
、ブリオスタチン１または２単独の添加によっては細胞
溶解性Ｔ−細胞中のＢＬＴ−Ｅ分泌の僅かな増加−しか
誘導しない。しかし乍ら、ブリオスタチンとＣａ１４イ
オノフオアとの組合わせはＣＴＬの活性化を大いに増強
しそして顆粒局在酵素の著しい分泌を誘導する。ＰＭＡ
単独でも、０．５　μｇ／ｍｌノＡ　２３１８７により
大いに増強されるＢＬＴ　−エステラーゼ分泌を僅かに
誘導する。ブリオスタチン１／　Ｃａ２　＋−イオノフ
オアの効果ＰＭＡ／Ｃａ２“−イオノフオアの効果より
僅かに低い（図５に示されるとおり）。しかしながら、
Ｐｌ”ｌΔとブリオスタチンの等モル濃度を使用すると
き、分泌されたＢＬＴ−エステラーゼの量は両組合わせ
で類似していた。ブリオスタチン２またばブリオスタチ
ン２／Ｃａ２“−イオノフオアの組合わせば、常に、等
モル濃度でさえ、細胞毒性Ｔ−細胞の活性化がＰＭＡお
よびブリオスタチン１より有効ではなかった。

Ｃ，ＴＬのＡｇ−特異的細胞毒性に与えるブリオスタチ
ン１または２およびＰＭへの影響を、種々のＥ／Ｔ比で
Ｐ８１５細胞をＣＴ’ＬＯＥ　４細胞と混合して５１Ｃ
ｒ−放出アソセイで試験した。図６で示されるように、
１０ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン２を試料に加えたとき
特異的５１　Ｃｒ−放出は減少した。同様の阻害は１０
ｎｇ／ｍｌ　のＰＭＡを添加することによって達成され
た。しかしながら、同じ濃度のブリオスタチン１はＰＭ
Ａに比べて僅かではあるが一定のより高ｂｌＡＦ。

−特異的”Ｃｒ−放出阻害を生じさせた。マイクロ滴定
プレートのインキュヘーションウェルにＰＭＡおよびブ
リオスタチンを直接加える代わりにＣＴＬをＰＭＡとブ
リオスタチンで予め処理しても記載された効果を有意に
は変化させなかった。

細胞毒性の、感作していない小さい休止Ｔ−細胞に与、
えるＰＭＡ　、フ゛リオスタチン１およびフ゛リオスタ
チン２の影響を測定するとき、ブリオスタチンの強力な
増強特性が見られた。トレン、ジー・（Ｔｒｅｎｎ、　
Ｇ、）等による以前の研究によって、細胞毒性の、小さ
い休止Ｔ−細胞が培地へのＢＳＦ−１およびＰＭへの同
時添加によって細胞毒性の成熟Ｔ−細胞に効果的に分化
することが示され、この効果はＩＬ−２を添加すること
によって増強される。

純真な休止Ｔ−細胞を増殖因子およびプロティンキナー
ゼＣアクヂヘーターと−インキュベーションする間０Ｃ
ＴＬ顆粒マーカー、即ちＢＬＴ　−Ｅ（Ｐａｓｔｅｒｎ
ａｃｋ　、　Ｍ、Ｓ、等、１９８５年、細胞毒性Ｔ−リ
ンパ球により発現される新規なセリンエステラーゼ、Ｎ
ａｔｕｒｅ（１、ｏｎｄ）、３１４．７４３参照）の蓄
積を測定し、その結果を図７パネルＡに示す。増殖因子
（ＩＬ−２，１１４）かまたはブリオスタチン１および
２ｍ独ではとちらも休止Ｔ−細胞のＢＬＴ−Ｅ活性の発
現を誘導しなかった。しかしながら、ＩＬ−２ではなく
てｆｌ、−４と組合わせたブ）ノオスタチン】および２
は細胞当たりを基準としてこの顆粒関連酵素の量を劇的
に増大させ、休止Ｔ−細胞のＣＴＬへの分化を示した。

ＣＴＬの発現を増強するブリオスタチンの能力は、図７
のパネルＢで報告した５　１　Ｃｒ−放出アソセイで明
らかにされているように、休止Ｔ−細胞の細胞毒性発現
に与えるブリオスタチン１および２の影響を研究するこ
とによって支持されている。ブリオスタチン１および２
単独並びにＢＳＦ−１およびＩＬ−４単独では、それら
を−緒に加えたときには相乗するが、ＣＴＬ発現を誘導
することはできなかった。興味深いことには、５１　（
’；　ｒ−放出アソセイ　（図７、パネル肋では、ＩＬ
−２の添加はＢＳＦ−１／ブリオスタチンの効果を強め
たが、これば同一条件下で細胞をインキュベーションし
た後に細胞当たりのＢＬＴ−Ｅ量を測定しても当てはま
らなかった（図７、パネル八）。

前述のことから、ブリオスタチン系統群から選択した新
規な一連のプロティンキナーゼＣアクチヘーターの潜在
的免疫増強特性が証明されることを明瞭に理解できる。

潜在的な腫瘍促進活性を有し、ＰＫ−Ｃを活性化するホ
ルボールエステルとは対照的に、ブリオスタチンは腫瘍
促進活性を欠きそして抗−新生物特性を示した（上記の
ｐｅｔｔｉｔ。

Ｇ、Ｒ，等、１９８２年；上記のＰｅｔｔｉ　ｔ、、　
Ｇ、Ｒ，等、１９８３年；および上記のＰｅｔｔｉｔ、
　Ｇ；Ｒ，等、１９８４年参照）。

ＰＭＡとブリオスタチンとの間の重要な細胞−生物学的
差異を、未成ｙ１１細胞に与える影響の違いを含めて観
察した６ＨＬ−６０細胞株の分化はＰＭＡによっては誘
導され得るがブリオスタチンによって誘導され得ないこ
とが示された（　Ｋｒａｆｔ　、　Ａ、Ｓ、等、１９８
６年、ブリオスタチン、即ちカルシウムリン脂質−依存
性のプロティンキナーゼのアクチヘーターはホルボール
エステルが誘導するヒＩ・前骨髄球白血病細胞ＨＬ−６
０の分化を阻害する、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８３．１３３４参
照）。それ故、プロティンキナーゼＣの活性化は多くの
ポルボールエステル様効果を誘導するには十分であるが
、分化の転形は一層複雑であると思われる。ブリオスタ
チン、即ち巨大環状ラクトンは細胞内生化学的経路に与
える種々の影響をＰ）ＩＡに比べより消失させ、その効
果の持続は異なると思われる。ＰＭＡおよびブリオスタ
チンにより誘導されるプロティンりん酸化反応パターン
の差異が弗告されている（Ｂｅｒｋｏｗ、　Ｒ，ｌ、、
等、１９８５年、ブリオスタチン、即ち非ポルボールの
巨大環状ラクトンは無傷のし１〜多多形核白球を活性化
しそしてホルボールエステルレセプターに結合する、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、１３１　、１．１０９参照）。

上記しそして図２〜７に示されるように、ブリオスタチ
ン１および２は、それらが休止Ｔ−細胞およびインビボ
感作Ｔ〜細胞両者の応答並びにクローン化したＴ−リン
パ球の応答の潜在的モジュレータ−である点でＰＭＡに
類似している。更に、これらブリオスタチンは純真な休
止Ｔ−細胞（図７参照）およびインビボ感作肺臓細胞（
図２および表１参照）からの細胞毒性細胞の発現を増強
する。ブリオスタチンはまた、図４に示されるように、
ＣＴＬが特゛異的である決定基を欠いている標的細胞に
対するＣｏｎＡ−依存性細胞毒性も促進する。

ＣＴＬからの細胞溶解素含有顆粒エキソザイトーシスの
定置的研究で、ホルボールエステルかまたはブリオスタ
チンかのいずれかが　Ｃａ”イオノフオアで刺激したＣ
ＴＬからの顆粒エキソザイ）・−シスを相乗的に増強し
得ることか示される（図５参照）。

ブリオスタチンはリンフ才力インと相乗して、マウス腸
間膜リンパ節から得た精製した小さい休止Ｔ−細胞を使
用して示されるように、純真なＴ−リンパ球を刺激する
。ブリオスタチンおよび１１、−４はこの休止Ｔ−細胞
集団にＣＴＬ−プリカーサ−を生じさせて細胞毒性Ｔ−
細胞に分化させる（図７）。この成熟過程はＩＬ−２を
添加することで増強され、顆粒関連のトリプシン−様セ
リンエステラーゼＢＬＴ−Ｅの発現を伴う（図７Δ）。

幾つかの実験でブリオスタチン］は小さい体止Ｔ−細胞
での細胞毒性の誘導がＦ猪Ａより効果的でないが、ブリ
オスタチン２は図７８に示されるように常に同等量の細
胞毒性を誘導した。

図２および３並びに表Ｉに示されるように、インビボで
感作した細胞毒性Ｔ−細胞に与えるブリオスタチンの影
響に関する研究は低投与量の１１．＝２（２単位／ｍ１
）プラスブリオスタチンが高投与量のγＩＬ−２（ｍ１
当たり１０または２０単位）と同しかまたはそれ以」−
のＣＴＬ溶解単位を誘導できることを示している。細胞
培養物中での＋Ｌ−２誘導増殖が、細胞を■Ｌ−２プラ
スブリオスタチンと共にインキュベ−１−したときには
検出されなかったので、」二重効果は刺激されたヘルパ
ーニー細胞からの内生的ＩＬ＝２の追加的放出に依るも
のではない。

かくして、ブリオスタチンば（’、ＴＬの発現に必要な
γＩＬ−２の量をかなり減少させ、それによって不都合
な副作用を減少させる。かくして、本願発明に従ってγ
ＩＬ−２と共にブリオスタチンを使用すると、養子免疫
療法に現在使用される高投与量のｒｌＬ−２の望ましく
ない副作用（Ｍｏｅｒｔｅｌ、Ｃ，Ｇ、＋１９８６年、
リンフ才力イン、ザイトカインおよび飛躍的な前進に関
して、ＪＡＭｆｌ、％汚−１３１４１参照）を軽減する
かまたは回避するのに十分な程低いＴ　Ｌ　−２投与量
で腫瘍拒絶（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、’　Ｓ、Ａ、等、１
９８７年、リンフメカイン活性化ギラー細胞およびイン
ター０イギン−２または高投与量のインターロイキン−
２だけを使用した進行性癌の患者１５７人の治療に関す
る経過幸じ告、Ｎｅｗ　Ｅｎに］、　、１．　Ｍｅｄ、
、３１６．８８９参照）が可能になると思われる。かく
して、ブリオスタチンが抗新生物特性を示すだけでなく
抗腫瘍−プロモーター活性も有しているので、ブリオス
タチンは免疫調節剤として魅力的である。

リンパ球増殖、分化およびエフェクター機能に与えるブ
リオスタチンの影響を詳細に研究すると、ブリオスタチ
ンがリンパ球毒性ではないことが示される。インキュベ
ーション３’Ｂ後てさえＣＴＬのブリオスタチン含有培
養液中の死亡細胞のバーセンＩ・は対照培養液と相違し
ていない（トリバンブルー染色で評価した）ことが−眉
して見られた。

より高濃度のブリオスクチン含有ＣＴＬ培養液中でさえ
１．Ｄ＋ｉ分泌アッセイまたば１〜リパンブルー排除ア
、セイを使用してもブリオスタチンのリンパ球毒性的影
響ぽ見られなかった。しかしながら、ブリオスタチンは
培養２４またば７２時間後にマウスＣＴＬ−細胞のＩＬ
−２誘導発現を増強した（データは示していない）が、
ブリオスタチンはインビボ感作ＩＩＱ！臓細胞のインビ
トロインギュヘーション７２時間後の全体的な細胞回復
を増強せず、下記表１に示される細胞回復指数のＩＬ−
２誘導増加を阻害した。

図６に示されるように、ブリオスタチンを含むプロティ
ンキナーゼＣアクチヘーターの興味ある特性の１つはＣ
ＴＬクローンのΔｇ−特異的細胞毒性の阻害能力である
。かくして、ブリオスタチン１および２が免疫調節剤と
して使用するのに存利な特性を有するＰＫ−’Ｃアクチ
ヘーターであることが証明される。

表　　１ 感作した肺臓細胞での細胞毒性の発生 に与えるブリオスタチンの影響 インキュベ １０７個の　　−ジョン 細胞溝たり　後の細胞 □培養条件　−一−−−　　溌解単較°　腓甚批敗゛培
地　　　　　　　　　　　　〈７１ 培地−１−ｒ　ＩＬ−２（２ｕ／ｍｌ）　　　　　１０
　　　　２培地→−ｒ　ＩＬ−２（１，Ｏｕ／ｍｌ）　
　　　　３３　　　　２．２培地十ＴＩＬ−２（２ｕ／
ｍｌ）＋　ＰＭＡＣ７１１，３培地＋ｒＩｌ、２（２ｕ
／ｍｌ）　＋　Ｂｒｙ’　　４０　　　　０．９培地→
ｒ　ＩＬ−２（２ｕ／ｍｌ）　＋　Ｂｒｙ２７０　　　
　１．０培地−１−γＩＬ−２（２０ｕ／ｍｌ）　　　
　　５０　　　　２．２３培地熔解単位は１０４個の標
的細胞から得た５０％の特異的５１Ｃｒ−放出に必要な
エフェクター細胞数として定義する。

１′細胞回復指数はインキュヘーション３日後の細胞数
に対する培養開始時の細胞数の比として計算した。感作
した肺臓細胞ば実施例１に記載したようにして得た。

ｃＯ，５ｎｇ／ｍｌのＰ？ＩＡまたは０．５ｎｇ／ｍｌ
のブリオスタチン１は、指示されたとき、細胞のインキ
ュベーション中に使用した。

（実施例） 本願発明の理解を更に助＆Ｊるためであって限定するた
めではなく、以下の実施例を提示する。

実施例−上 インビボで感作したＢＩＯ牌臓肺臓は上記したようにし
て製造した。γＩＬ−２かまたはｒｌＬ−２プラスプロ
テインキナーゼＣアクチベーターかのいずれかの存在の
下で３日間の培養後、細胞毒性は１０４個のＰ８１５標
的細胞／ウェルを使用して図２に示されるＥ／Ｔ比でＳ
　Ｉ　Ｃｒ放出アッセイにより測定した。細胞毒性アッ
セイの結果は、 （Δ）γＩＬ−２単　独（ＯＵ／ＭＬ　、２０／ｍｌ　
、　ＩＯＵ／ｍｌ。

２０Ｕ／ｍｌ）と共に培養した細胞； （Ｂ）　ｒ　Ｉｌ−２プラス０．５ｎｇ７ｍｌのブリオ
スタチン１と共に培養した細胞； Ｅ）　ｒ　Ｉｔ、−２プラス０．５ｎ（Ｈ／ｍｌのブリ
オスタチン２と共に培養した細胞； （Ｄ）　ｒ　ＩＬ　−２プラス０．５ｎｇ／ｍｌのＰＭ
Ａ　と共に培養した細胞 に関して示す。結果は全て図２に示す。

大流−例一一す Ｂ　１．　Ｏマウスは上記したようにしてＰ８１５細胞
で免疫化した。Ｉａ　−細胞の激減した肺臓細胞は、０
．５ｎに／ｍｌのブリオスタチン２およびＩＯＵ／ｍｌ
の？ＩＬ−２の存在下でインキュベ−１〜した。３日後
、細胞毒性を１０’個のＰ８１５（Ｉｔ−２″）または
ＥＬ−４（＋１−２ｂ）標的細胞を使用してＳ　Ｉ　Ｃ
ｒ放出アッセイで検査した。ＣｏｎＡを添加して最終濃
度を１０ｎｇ／ｍｌとし、た。得られた結果は図３に示
す。

プ江−側− ＣＴＬ２Ｃクローンは種々の濃度のＰＭＡまたはブリオ
スタチン２の存在下５１Ｃｒ−標識した同系のＥＬ４標
的細胞と共に種々のＥ／Ｔ比で４時間インギュヘートシ
た。結果は図４に示す。

彫缶例　４ １０５個のＣＴＬ（クローンＢＭ　１Ｏ−３７）は９６
ウエルのプレート中でインキュベートし、ＰＭＡ　（］
、Ｏｎｇ／ｍｌ）およびＡ２３１８７（０，５μｇ／ｍ
ｌ）を加えて刺激した。特異的ＢＴ１．−Ｅ分泌は一ヒ
記したようにして測定した。

結果は次のコードを使用して図５に示す。

Ａは培地プラス溶媒ＤＭＳＯ。

ＢばＡ２３１８７（０，５ｎ１ｇ／ｍｌ）　＊独、Ｃは
ＰＭＡ　（ｌｏｎｇ／ｍｌ　）プラス八２３１８７（０
，５μｇ／ｍｌ）　、Ｄはブリオスタチン１　　（Ｌｏ
ｎｇ／ｍｌ）プラスＡ２３１８７（０，５μｇ／ｍｌ）
、 Ｅはフ゛リオスタチン２　（１，０ｎｇ／ｍ＋）プラス
八２３１８７（０，５μｇ／ｍｌ）。

犬覇卆Ｌｊ ＯＨ４ＣＸＴＬ細胞は種々のＥ／Ｔ比で１０’個の５１
Ｃｒ標識Ｐ８１５−細胞と共にインキュベートし、”Ｃ
ｒ−放出はインキュベーション４時間後に測定した。

ＰＭｆｌまたはブリオスタチンを加えて最Ｐ：濃度を１
０ｎｇ／ｍｌ　とした。結果は図６に示す。　　　□太
蓬護り一腫 小さい休止Ｔ−細胞は上記したようにしてＢａｒｂ／Ｃ
腸間膜リンパ節から精製した。精製した細胞は、培地単
独中かまたは培地プラス種々の添加物（７ＩＬ−２，１
００Ｕ／ＭＬ；ＢＳＦ　　−１，２０００ＬＩ／ｍｌ　
；ブリオスタチン１またば２　０．５ｎｇ／ｍｌ）中か
のいずれかで１０６個の細胞／ｍｌ　の細胞濃度で３日
間培養した。細胞毒性は６時間のレクチン介在（Ｃｏｎ
Ａ、　１０μｇ／ｍｌ）　”Ｃｒ−放出アソセイで測定
した。結果は１００／１のＥ／Ｔ比に関して示す。ＢＬ
Ｔ−Ｅ含量の測定では、試験した培養条件の各々の１０
６個の細胞は１００　μρの培地に再懸濁しそして１％
のトリトンＸ−１，００で熔解した。細胞懸濁液５０　
　を」二重したようにしてＢＬＴ−エステラーゼ含量の
測定用に使用した。細胞培養液に単独で添加したとき、
試験した試薬は図７に示されるように細胞の８１、Ｔ−
エステラーゼ含量を増加もさせずまた細胞毒性も誘導し
なかった。

上記から、非常に予期されない態様で上記目的の全てを
実現する新規で且つ有用な方法が本願明細書に記載され
そして示されていることが明らかとなる。本願発明が関
係する通常の技（雨を有する技術者が容易に考えつくよ
うな修正、変更および改変は、本願発明の特許請求の範
囲によってのみ制限される本願発明の精神内で意図され
るものであることが勿論了解される。

【図面の簡単な説明】

図１はブリオスタチン１および２の化学構造を示し、 図２は感作肺臓細胞での細胞毒性の発生に与えるＰＫ−
Ｃアクチベーターの影響を示し、図３はブリオスタチン
／■Ｌ−２が誘導する細胞毒性細胞の抗原特異性を示し
、 図４はへｇ−非−保持標的細胞に対するＣＴＬクローン
の細胞毒性に与えるブリオスタチン２の影響を示し、 図５はＣＴＬクローンからの特異的なりＬＴ−Ｅ放出を
誘導するブリオスタチンとＣａ←イオノフオアの相乗作
用を示し、 図６はブリオスタチン１および２によるＣＴＬり０−ン
のＡＰ、−特異的細胞毒性の阻害を示し、そして 図７は休止Ｔ−細胞におけるＢＬＴ−エステラーゼ発現
および細胞毒性発現に与えるブリオスタチン１および２
並びに増殖因子（ＩＩ、−２、ＩＬ−４，）の影響を示
す。 開示の内容 低濃度のプロティンキナーゼＣアクチヘーター、即ちγ
ＢＳＦ−１と相乗するブリオスタチンＩおよび２は、純
真な、休止リンパ節Ｔ−細胞における分化（顆粒酵素発
現）およびＣＴＬ発現を誘発するのに有用である。ブリ
オスタチンはインビボで感作したＣＴＬの発現をインヒ
ドロでのインキュベーション中に誘発するγＩＬ−２の
効果を大いに増強し、それるこよってインビボで腫瘍拒
絶をするためにより低濃度のγＩＬ−２を使用する証拠
を提供する。ブリオスタチン１および２は共にＡｇ−非
一保持標的細胞に対するＣＴＬクローンの細胞毒性を誘
発し、Ａｇ−特異的標的細胞に対するＣＴＬ細胞毒性を
能書する。ブリオスタチン１および２は非常に低い濃度
で、ＣＴＬからの細胞溶解性顆粒のエキソサイｌ−−シ
ス誘発でＣａ＋＋イオノフオアと相乗する。 ブリオスタチンには腫瘍促進活性がないので、養子免疫
療法における免疫調節薬としてまたｒｌＬ−２の相乗因
子としてそれ自体有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）インターロイキン−２およびガンマーインターフェ
   ロンの宿主内での内在産生を促進する方法であって、該
   方法は下記構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＨまたはＣＯＣＨ＿３である）を有する群
   から選択される少量ではあるが有効量の免疫調節剤を上
   記宿主に投与することからなる。 ２）上記免疫調節剤を静脈内注射によって投与する特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。３）ＲがＨである特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。 ４）ＲがＣＯＣＨ＿３である特許請求の範囲第２項に記
   載の方法。 ５）新生物疾病で苦しんでいる宿主の新生物細胞は攻撃
   するが異種蛋白反応は緩和するＴ−細胞特異性を増強す
   る方法であって、該方法は下記一般的構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＨまたはＣＯＣＨ＿３である）を有する物
   質からなる群から選択される少量ではあるが有効量の免
   疫調節剤を上記宿主に投与することからなる。 ６）上記免疫調節剤を静脈注射によって投与する特許請
   求の範囲第５項に記載の方法。 ７）ＲがＨである特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８）ＲがＣＯＣＨ＿３である特許請求の範囲第６項に記
   載の方法。 ９）新生物増殖に苦しんでいる宿主をクローン化した蛋
   白質インターロイキン−２および／またはガンマーイン
   ターフェロンで治療する方法において、宿主内のこのよ
   うなクローン化した蛋白質に対する異種蛋白反応の危険
   性を本質的に軽減する改良であって、該改良は養子免疫
   治療にこれまで必要であった量の約１／１０から１／２
   ０のクローン化したインターロイキン−２および／また
   はガンマーインターフェロン、並びに下記構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＨまたはＣＯＣＨ＿３である）を有する物
   質からなる群から選択される少量ではあるが有効量の増
   強剤を上記宿主に投与することからなる。 １０）上記剤を静脈注射によって投与する特許請求の範
   囲第９項に記載の方法。 １１）ＲがＨである特許請求の範囲第１０項に記載の方
   法。 １２）ＲがＣＯＣＨ＿３である特許請求の範囲第１０項
   に記載の方法。