JPH01316661A - 抗原又は抗体の測定剤及び測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、抗原又は抗体の測定剤およびこの測定剤を用
いた抗原又は抗体の測定法に関する。

（ロ）従来の技術 臨床検査の分野においては、抗原、抗体または、ハプテ
ンを担体に固定させ、それぞれに対応する抗原、抗体と
、この担体との凝集反応を利用して、検体中の抗体や、
抗原を高感度に検出することができるので、様々な疾患
の血清診断に広く用いられている。この反応に用いられ
る担体には、ポリスチレンラテックスなどに代表される
合成担体や、赤血球、細菌菌体を用いた生物担体など（
米国特許第３０８８８７５号明細書）がある。

一般に合成担体は、化学的に安定で、それ自信は抗原性
をもたないなどの長所を持つが、抗原。

抗体或いは、ハプテンが結合しにくいという欠点がある
。また、粒径の均一性、非特異的凝集などの点で問題も
ある。

他方、生物担体は、粒径が安定しているなどの特徴杢持
つが、安定性の低さ、その担体の持つ抗原性のために感
変が悪いなどの欠点を有する。

（ハ）発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、抗原、抗体または、ハブテンを密に固
定し、しかも高感度に検体中の抗原、抗体を検出可能な
新規試剤を、臨床試薬として提供することにある。

本発明のさらに池の目的は、上記の試剤を用いろ新規な
抗原又は抗体の測定法を提供することにある。

（ニ）課題を解決するための手段及び作用本発明者は、
種々の検討の結果、固定用担体として特定のポリマーグ
ラフトカプセルを採用し、かかるカプセル壁の物質透過
性の制御の原理を、抗原又は抗体の測定に応用すること
により、前記の目的が達成されることを見い出した。

本発明は、以上の知見に基づいて完成されたもので、平
均粒径０．１〜５ｘｘの水不溶性・色素透過性高分子カ
プセルと、グラフト高分子鎖を介して上記高分子カプセ
ル表面に固定された抗原、抗体またはハプテンと、前記
カプセル内に保持された色素溶液、からなる抗原又は抗
体の測定剤を提供しようとするものである。さらに本発
明は、上記測定剤を試料液に接触さ仕て色素を該試料液
中に放出させ、固定された抗原、抗体又はハプテンにつ
いての抗原−抗体反応の進行に伴なって生じる上記色素
放出速度又は放出量の変化を吸光度又は蛍光光度で検出
することにより、試料液中の抗原又は抗体を測定するこ
とからなる抗原又は抗体測定法を提供するものである。

本発明の測定剤に用いる水不溶性・色素透過性の高分子
の材料としては例えば、低密度ポリエチレン、高密度ポ
リエチレン、直鎖状低密度ポリエチレン、エチレン−酢
酸ビニル共重合体、ポリプロピレン、プロピレン共重合
体、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレ
ン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレ
ンなどのいわゆるビニル重合体あるいはポリエチレンテ
レフタレート、ポリエチレンイソフタレート、ナイロン
６、ナイロン６−６、ナイロン２−１２、ナイロン１２
などのいわゆる重縮合体、ポリウレタン、ポリサルホン
などの重付加体、セルロース及び羊毛などの天然高分子
などが用いられる。これらのうち、通常、ナイロン類を
用いるのが好まし本発明における高分子カプセルは、上
記高分子材料のモノマーを用いてマイクロカプセルを製
造する当該分野で公知の方法により作製することができ
る。例えばナイロン類を用いる場合、一方のモノマーを
対応するモノマーと触媒を含有する溶液中に液滴として
添加してその表面で重縮合を進行させ、所望厚みのカプ
セル外壁（通常１−１０μｍが好ましい）が形成された
状態でこれを取り出し、内部に残存する未重合モノマー
を溶媒等で置換除去することにより得ることができる。

また、この平均粒径は、０．１〜５ｚｉ＋とするのが適
している。

本発明において、上記高分子カプセルへ抗原、抗体又は
ハプテンを固定化するに先立って、グラフト高分子液、
通常、抗原、抗体又はハプテンを固定しうる官能基を有
するグラフト高分子液が結合される。ここで官能基とし
てはアミノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、水酸基
等が挙げられる。かかるグラフト高分子鎖の導入手法は
種々あるが、例えばカプセル高分子材料としてナイロン
を用いた場合には、まずセリウム塩を触媒とし、ジビニ
ルモノマーを少量グラフト重合して、二重結合分子績を
導入し、次に過硫酸カリウムを触媒としてアミノ基、ス
ルホン基、カルボキシル基、水酸基等を有するモノマー
をグラフト重合させろことで行うことができる。

あるいは、官能基を持つビニルモノマーをセリウム塩を
触媒として直接カプセル表面にグラフト重合させること
も可能である。

すなわち官能基を存するモノマーを、特に好ましくは、
アミノ基を有するモノマー、例えばｐ−アミノメチルス
チレン、エチレンイミン、アリルアミンなどをカプセル
にグラフトさせる。その際、重合開始剤として硝酸セリ
ウムアンモニウム、過硫酸カリウム等を加える。

また、このポリマーの鎖長、及びグラフト化率は、モノ
マーのモル比等を変化さ仕ろことで、容易に調節が可能
である。さらに七ツマ−の選択によりカプセル表面の疎
水性、親水性の調節が可能となる。

このようにして得られたグラフト化高分子カプセルに、
抗原、抗体又はハブテンが固定されろ。

固定する抗原、抗体またはハブテンの例としては、副腎
皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）　、甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、インシュリン等のホルモン、α−フェトプ
ロティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト
繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、糖鎖抗原ＣＡ　１９
−９等のガン特異物質、ＩｇＧ、フィブリンフィブリノ
ーゲン分解物（ＦＤＰ）、抗トロンビンＩ［［（ＡＴＩ
Ｉｌｒ）　Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）等の血清蛋白成分
、肝炎（ＨＢ）　、エイズ、成人Ｔ白組病（ＡＴＬＡ）
等のウィルス、その他リウマチ因子等が上げられる。も
ちろん、これ以外の抗原、抗体又はハブテンも使用可能
である。

これら抗原、抗体又はハブテンの固定は府記官能基に対
応して常法の化学架橋法によって行えばよい。この化学
架橋法としては、グルタルアルデヒドによる方法やウッ
ドワード試薬Ｋ（ＷＲ−Ｋ）、Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール等の適当
な縮合剤を用いる方法が挙げられる。ただし場合によっ
ては、物理吸着法を適用することも可能であり、この際
にはグラフト高分子鎖は官能基を有してなくてもよい。

抗原、抗体又はハブテンを固定した高分子カプセル内に
、色素溶液ことに水溶液を゛保持さけることにより、本
発明の抗原又は抗体測定剤が得られる。この際の色素溶
液の保持は、上記固定化高分子カプセルを色素水溶液中
に一定時間放置することによりカプセル内水相に色素を
透析導入させることにより行うことができる。ここで色
素としては親水性の色素が用いられる。ここで用いる現
水性の色素は、特に限定するものではないが、例えば、
ローダミン、ボルドーＳ１フクンン、エオシンなどの赤
色色素、あるいはメチレンブルー、クリスタルバイオレ
ットなどの青色色素が挙げられる。特に測定感度が要求
される場合は、Ｆ［ＴＣｌＴＲＩＴＣ，ＸＩＴＣ，カル
ボキシフルオレセイン、ｌ−（キナミド−メチル）ナフ
タレンなどの蛍光色素を用いることが好ましい。保持さ
れろ溶液中の適切な色素濃度は０．０１〜ｌｏｏｍＭで
あり、ことにカルボキシフルオレセインや１−（キナミ
ド−メチル）ナフタレンの場合には０．１〜ｌｏｍＭが
好ましい。

なお、このような本発明の測定剤は、分散液の状態で用
いられてもよく、表面乾燥状態で用いられてもよい。ま
た色素の導入は、後述する抗原又は抗体の測定の直前に
行ってもよい。

本発明の抗原又は抗体測定剤による抗原又は抗体の測定
は、抗原又は抗体を含有しうる試料液にこの測定剤を接
触さ仕ることにより行われる。ここで接触は、測定剤を
直接又は分散液の形態で試料液に添加し、必要に応じて
撹拌することにより行うことができる。

このような接触状態下において、カプセル内の色素はカ
プセル壁のミクロ的空隙を介して試料液へ所定の速度で
放出されるが、固定化された抗原、抗体又はハブテンに
ついての抗原−抗体反応が生じると、対応する抗体又は
抗原が結合してカプセル壁表面又は高分子膜表面のミク
ロ的な空隙が挟められ、この結果、放出する色素量が低
減されることとなる。従って、色素の放出達文や放出量
の変化試料液の吸光度又は蛍光光度変化によってモニタ
ーすることにより、抗原−抗体反応の頻度ひいては試料
液中の抗体又は抗原の量を測定することが可能となる。

（ホ）実施例 実施例１ テトラハイドロフラン（ＴＨＦ）５０ｘｅにエチレング
リら−ルジメククリレート（ＥＤＭ）を加え、この溶液
中に８ＪＩ９のナイロン２−１２カプセル（平均粒径２
μａ）を入れ窒素ガスを吹き込む。この溶液に重合開始
剤である硝酸セリウムアンモニウム塩を加え窒素ガスを
吹き込みながら室温で重合を行った。

ｐ−アミノメチルスレチン（Ａ￥５）１９をメタノール
１ｘＱに溶解し、さらに蒸留水９スＱを加えた。

この水溶液に、塩酸を加えｐＨ７，０に調整した。この
溶液中に上記の２０Ｍグラフトカプセルを加え、ｄ！１
硫酸カリウムを重合開始剤として添加し６０℃で重合さ
せた。

結果を第１表に示す。

実施例２ 上記方法により求められた実験Ｎｏ、　Ｉのポリマーグ
ラフトカプセルをＯ，ＯＩＭ　ｐＨ７，２リン酸緩衝液
ＣＰＢＳ）　ｔＩＪｘＱ中にいれ２０ＩＩＩＭのグルタ
ルアルデヒド（ＧＡ）のＰＢＳ溶液を０．５ｘＱ加え、
３７℃で３時間撹拌を行った。未反応物を洗浄により除
き、ヒトＩｇＧのＰＢＳ溶液を等容加え３７℃で３時間
撹拌を行いグラフトカプセルへの固定をおこなった。

またウッドワードに試１（ＷＲ−Ｋ）を用いてヒトＩｇ
Ｇを固定した。すなわち、ＩＲ−に試薬ト１をＰＢＳ溶
液１０ｘ（ｌに溶解し、前記ポリマーグラフトカプセル
を加え、５〜１０℃で１時間撹拌を行った。撹拌後洗浄
を行い、これにヒトＩｇＧのＰＢＳ溶液を加え室温にて
１日撹拌を行った。

結果を第２表に示す。なお、抗体量は重量で測定したが
ＥＬ　Ｔ　ＳＡ法によっても確認した。

第２表 実施例３ ■　ヒト［ｇＧ固定ポリマーグラフトカプセルの作製 上記実施例２の方法にて抗体固定ポリマーグラフトカプ
セルを作製した。なお抗体の固定法による感度の違いを
比較するため、グルタルアルデヒド（ＧＡ）とウッドワ
ードに試薬（ＹＲ−Ｋ）を用いて固定をおこなった。

次いで蛍光色素１−（キナミド−メチル）ナフタレン（
３Ｂ）のＰ　Ｂ　Ｓ　（ｔｏｗＱ）溶液を透匠によりカ
プセル内に含ませた。

■　透過係数の測定 上記■で作製したヒトＩｇＧ固定ポリマーグラフトカプ
セル１個を、第３表に示す抗ヒトｒｇＧ濃度の溶液２ｘ
Ｑに加えて３７℃下１５分反応させ、次Ｌ”でＰＢＳ溶
液で洗浄後、ＰＢＳ溶液（２！１２）が注入された光学
セルに移して蛍光分光光度計（ＲＦ−５４０電卓製作所
）を用い、撹拌下で励起波長２８０ｎｓ、蛍光波長３４
０ｎａにおける蛍光光度の変化を測定した。抗原−抗体
反応前と、反応後５分間の透過係数の変化を次式により
測定した。

（以下余白） 第３表 固定化ミクログラフトカプセル測定感度（へ）発明の効
果 本発明の測定剤は抗原、抗体またはハプテンを密に固定
し、かつ検体中の抗原、抗体を高感度で検出することが
できる。

なお、カプセルに結合させるモノマーの選択によりカプ
セル表面の疎水性、親水性の調整が可能なので、本発明
に用いる固定法は抗原、抗体のみならず酵素などの固定
にも利用できる。

また、本発明の抗原又は抗体の測定法は、上記のような
測定剤を用い、かつ放出する色素の速度又は量の変化を
見るという点で、この分野では、これまで試みられなか
ったものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、平均粒径０．１〜５ｍｍの水不溶性・色素透過性高
   分子カプセルと、グラフト高分子鎖を介して上記高分子
   カプセル表面に固定された抗原、抗体またはハプテンと
   、前記カプセル内に保持された色素溶液、からなる抗原
   又は抗体の測定剤。 ２、請求項１記載の抗原又は抗体の測定剤を、試料液に
   接触させて色素を該試料液中に放出させ、固定された抗
   原、抗体又はハプテンについての抗原−抗体反応の進行
   に伴なって生じる上記色素放出速度又は放出量の変化を
   吸光度又は蛍光光度で検出することにより、試料液中の
   抗原又は抗体を測定することからなる抗原又は抗体測定
   法。