JPH0132839B2 - - Google Patents
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- JPH0132839B2 JPH0132839B2 JP55160940A JP16094080A JPH0132839B2 JP H0132839 B2 JPH0132839 B2 JP H0132839B2 JP 55160940 A JP55160940 A JP 55160940A JP 16094080 A JP16094080 A JP 16094080A JP H0132839 B2 JPH0132839 B2 JP H0132839B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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Description
本発明は新規な蛋白質（PP11）およびその製
法に関する。 本発明の目的は、下記性質すなわち (a) ヘキソース2.6±0.5％、 ヘキソースアミン1.0±0.3％、 フコース0.05±0.03％および ノイラミン酸0.26±0.07％ からなる炭水化物含量3.9±0.9％、 (b) 沈降係数S0 20，w3.5±0.2秒、 (c) 超遠心分離器で測定された分子量44300±
6000、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中で測定された分子量
62000±3000、 (e) 吸光率Ｅ１％ cm（280nｍ）13.4±1.0および (f) α1−グロブリンのそれと同様の電気泳動運動
性 を有することを特徴とする蛋白質PP11にある。 この蛋白質の特徴的性質を説明するために以下
のデータを示す。 沈降係数は280nｍでのUV走査技術を使用して
ダブルセクターセル中で60000rpmでベツクマン
分析用超遠心分離装置（Spinco装置型式Ｅ）中
で測定される。0.2モル／のNaclを含有する
0.05M燐酸塩緩衝液（PH6.8）が溶媒として用い
られる。蛋白質濃度は光学濃度約３を生ずるよう
に調整される。沈降係数は20℃の水に適合するよ
うに変換される。 超遠心分離装置における分子量を測定するため
に沈降平衡法が使用される。この方法において
は、蛋白質の濃度は光学濃度約1.0を生ずるよう
に調整される。測定は9000rpmで行われる。記録
は光電走査器を用い、280nｍでUV光学装置を用
いて行われる。 0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含
有しているポリアクリルアミド（PAA）7.5％の
ゲルがSDS−PAAゲル中における分子量を測定
するために使用される。人間の胎盤ラクトジエン
（HPL）および人間のアルブミン、そしてまたそ
の集合物が比較物質として使用される。 吸光率を測定するためには物質を蒸留水中に溶
解させて0.10％の濃度となす。 電気泳動運動性は、マイクロスケール修正をな
したベツクマン・インスツルメンツ社のミクロゾ
ーンR200装置においてPH8.6のジエチルバルビツ
ール酸ナトリウム緩衝液を用いてセルロースアセ
テート膜（Sartorius社製品）上で測定される。 炭水化物はH.E.Schultze氏等により
「Biochem.Z」第329巻第490頁（1958）に記載さ
れている方法により測定される。 アミノ酸分析はS.Moore氏等の「Anal.Chem.」
第30巻第1185頁（1958）における記載によりベツ
クマン社のマルチクロムＢ液体クロマトグラフ装
置を用いて行われる。シスチンは蛋白質を過蟻酸
を用いて酸化したのちシステイン酸として測定さ
れる〔「Anal.Chem.」第238巻第235頁（1963）参
照〕。トリプトフアン含量はH.Edelhoch氏により
「Biochemistry」第６巻第1948頁（1967）に記載
された方法により測光的に直接測定される。 表１はPP11のアミノ酸分析の結果を包含して
いる。
法に関する。 本発明の目的は、下記性質すなわち (a) ヘキソース2.6±0.5％、 ヘキソースアミン1.0±0.3％、 フコース0.05±0.03％および ノイラミン酸0.26±0.07％ からなる炭水化物含量3.9±0.9％、 (b) 沈降係数S0 20，w3.5±0.2秒、 (c) 超遠心分離器で測定された分子量44300±
6000、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中で測定された分子量
62000±3000、 (e) 吸光率Ｅ１％ cm（280nｍ）13.4±1.0および (f) α1−グロブリンのそれと同様の電気泳動運動
性 を有することを特徴とする蛋白質PP11にある。 この蛋白質の特徴的性質を説明するために以下
のデータを示す。 沈降係数は280nｍでのUV走査技術を使用して
ダブルセクターセル中で60000rpmでベツクマン
分析用超遠心分離装置（Spinco装置型式Ｅ）中
で測定される。0.2モル／のNaclを含有する
0.05M燐酸塩緩衝液（PH6.8）が溶媒として用い
られる。蛋白質濃度は光学濃度約３を生ずるよう
に調整される。沈降係数は20℃の水に適合するよ
うに変換される。 超遠心分離装置における分子量を測定するため
に沈降平衡法が使用される。この方法において
は、蛋白質の濃度は光学濃度約1.0を生ずるよう
に調整される。測定は9000rpmで行われる。記録
は光電走査器を用い、280nｍでUV光学装置を用
いて行われる。 0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含
有しているポリアクリルアミド（PAA）7.5％の
ゲルがSDS−PAAゲル中における分子量を測定
するために使用される。人間の胎盤ラクトジエン
（HPL）および人間のアルブミン、そしてまたそ
の集合物が比較物質として使用される。 吸光率を測定するためには物質を蒸留水中に溶
解させて0.10％の濃度となす。 電気泳動運動性は、マイクロスケール修正をな
したベツクマン・インスツルメンツ社のミクロゾ
ーンR200装置においてPH8.6のジエチルバルビツ
ール酸ナトリウム緩衝液を用いてセルロースアセ
テート膜（Sartorius社製品）上で測定される。 炭水化物はH.E.Schultze氏等により
「Biochem.Z」第329巻第490頁（1958）に記載さ
れている方法により測定される。 アミノ酸分析はS.Moore氏等の「Anal.Chem.」
第30巻第1185頁（1958）における記載によりベツ
クマン社のマルチクロムＢ液体クロマトグラフ装
置を用いて行われる。シスチンは蛋白質を過蟻酸
を用いて酸化したのちシステイン酸として測定さ
れる〔「Anal.Chem.」第238巻第235頁（1963）参
照〕。トリプトフアン含量はH.Edelhoch氏により
「Biochemistry」第６巻第1948頁（1967）に記載
された方法により測光的に直接測定される。 表１はPP11のアミノ酸分析の結果を包含して
いる。
【表】
PP11は下記の性質を有し、これらの性質はそ
の単離に用いられうる。 (1) 硫酸アンモニウムを用いて、水溶液からPH
7.0でそして30〜60％飽和で沈殿される。 (2) 水溶液のアクリジン塩基例えば２−エトキシ
−６，９−ジアミノアクリジン乳酸塩〔「リバ
ノール（Rivanol）」（登録商標）〕を用いてPH
値４〜９でそして塩基の濃度0.2〜0.8％（ｗ／
ｖ）で沈殿される。 (3) 真正グロブリン沈殿の条件下すなわち稀緩衝
液溶液中でPH５〜６に調整することによつて沈
殿されない。 (4) 調製用電気泳動ではその運動性はα1−グロブ
リンのそれと同様である。 (5) 「セフアデツクス（Sephadex）」（登録商標）
を用いるゲル過においては分子量30000〜
90000を有する蛋白質と同じように挙動する。 (6) 伝導度約０〜２ｍＳでそしてPH約７〜９で例
えばDEAE−セルロースあるいはDEAE−セフ
アデツクスのような弱塩基性イオン交換体に結
合しうる。 (7) 免疫吸着により水溶液から濃縮され且つ単離
されうる。 本発明のもう一つの目的は上述の性質を利用し
てこの蛋白質を含有している溶液を分別すること
からなるPP11の取得方法である。 硫酸アンモニウム以外に、製造生化学に慣用さ
れるその他の中性塩を使用してPP11を沈殿させ
ることももちろん可能である。アクリジン塩基の
他に蛋白質分別に知られているような水溶性キノ
リン塩基の誘導体も本発明による方法の範囲内で
使用されうる。その電気泳動挙動例えばその分子
量のごときによつては、α1−グロブリンを他の蛋
白質から分離させるのに適当なその他の手段を用
いても蛋白質は単離されうる。ゲル過、ゲルク
ロマトグラフイーあるいは限外過の種々の方
法、あるいはまた、それにより弱塩基性イオン交
換体に結合できそして再びそこから溶離されうる
PP11の性質もまたこの目的に使用されうる。 PP11はPP11を濃縮するかあるいはこの蛋白質
を他の蛋白質から分離する作用を有する上記手段
の適当な組み合せを用いて単離されうる。 従つて、本発明の目的は、PP11を濃縮するた
めの個々の段階、そして濃縮手段の組合せから生
ずるPP11の精製法であるとみなされるべきであ
る。 濃縮過程は手段１〜６の少なくとも１種あるい
はそれらの化学的もしくは生化学的な均等手段を
用いることからなる。 本発明のもう一つの目的は、この蛋白質PP11
を含有している液体を蛋白質の単離のための既知
の操作の一つもしくはそれ以上に付し、そして各
場合においてPP11の特徴を有する蛋白質が存在
する物質を取得することからなるPP11の製法で
ある。 前記のパラメーターに加えて、分離操作から生
ずるフラクシヨン中に存在しているであろう
PP11を検出しそして測定するために免疫化学的
方法も使用されうる。何故ならばPP11は抗原性
質を有しているからである。 この目的に使用されうる抗血清は以下の方法で
取得されうる。PP11を含有している胎盤蛋白質
フラクシヨン〔H.Bohn氏の「Experientia」第
27巻第1223頁（1971）に記載の方法により人間の
胎盤ラクトジエン（HPL）の結晶化から得られ
る母液〕を用いて兎に免疫賦与することにより多
価抗血清が得られ、それを用いてPP11が検出さ
れうる。正常な人間の血清およびPP11を含有し
ていない胎盤フラクシヨンでか、あるいは蛋白質
例えばHPLでの吸着により、この抗血清は抗原
PP11に対して充分特異的となされうる。この特
異的な抗血清は一方ではPP11の免疫学的検出に
そして他方では免疫吸着剤（これはPP11の濃縮
および単離に使用されうる）の調製に使用されう
る。 オウヒターロニー（Ouchterlony）ゲル拡散技
術〔SchultzeおよびHeremans両氏編
「Molecular Biology of Human Proteins」第
１巻第134頁を対照されたい〕はPP11の免疫学的
検出に使用されうる。 本発明の適用により得られるPP11の助けによ
つて既知方法により動物に免疫賦与することによ
りモノ特異的な抗血清が製造されうる。PP11は
抗原性質を有する。動物にこの蛋白質を用いて免
疫賦与すると特異的な抗体が形成される。免疫学
的方法を用いるPP11の検出および測定は、一方
では妊娠の監視のために、そして他方では腫瘍
（特に栄養胚葉のみならず非栄養胚葉性腫瘍）の
検出、そしてまた疾患の経過の監視およびかかる
疾患における治療の監視のために診断上重要であ
る。 従つてPP11はPP11の検出および測定に使用さ
れうる抗血清を調製するのに使用されうる。 本発明を以下の実施例により説明する。 実施例 (A) 胎盤の抽出およびリバノールおよび硫酸アン
モニウムでの抽出液の分別 冷凍された人間の胎盤1000Kgを切断ミキサー
中で粉砕しそして0.4％（ｗ／ｗ）塩化ナトリ
ウム溶液1000を用いて抽出する。組織残留物
が遠心分離により分離されたのち、抽出液を20
％（ｗ／ｗ）酢酸を用いてPH6.0に調整し、そ
してこれに２−エトキシ−６，９−ジアミノア
クリジン乳酸塩〔リバノール（Rivanol）（登
録商標）、ヘキスト社製品〕の３％（ｗ／ｗ）
溶液200を撹拌下に加える。２％（ｗ／ｗ）
Nacl溶液500を遠心分離により分離された沈
殿に加え、この混合物を４時間撹拌しそして沈
殿した２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリ
ジンクロライドを遠心分離して除去する。この
溶液中に、撹拌下に固体硫酸アンモニウムを最
終濃度30％（ｗ／ｗ）に達するまで加えると
PP11が他の蛋白質と共に沈殿する。沈殿を遠
心分離する。約4.5Kgの湿潤ペーストがこれで
得られ、このものは以後「フラクシヨンＡ」と
称される。 (B) セフアデツクスＧ−150でのゲル過 フラクシヨンA1500ｇを水中に溶解させそし
て0.05％のNaN3を含有する0.01Mトリス−Hcl
緩衝液（PH8.0）（緩衝溶液）に対して透析す
る。残存する溶液をセフアデツクスＧ−150を
充填したカラム（60×56cm）に移しそして緩衝
溶液を用いて溶離する。特異的な抗PP11兎
血清を用いるオイヒターロニーゲル拡散試験で
溶離液を検査する。PP11を含有しているフラ
クシヨンを合しそして「フラクシヨンＢ」と称
する。 (C) DEAE−セルロースでのクロマトグラフイー
フラクシヨンＢをDEAE−セルロース（10×28
cmのカラム）に吸着させる。このカラムを緩衝
溶液ですすぎそしてトリクロル酢酸で流出物
中に何らもう沈殿が生じなくなるまで0.85％
（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム溶液を用いて溶離
する。蛋白質は硫酸アンモニウムを30％（ｗ／
ｖ）の濃度となるまで添加することにより溶離
液から沈殿する。沈殿を遠心分離して除去する
（「フラクシヨンＣ」）。 (D) 真正グロブリン沈殿 フラクシヨンＣを水中に溶解させそして緩衝
溶液に対して透析する。この溶液を撹拌下に
2N酢酸を添加することによりPH5.5に調整す
る。附随蛋白質のみを実質上含有している沈殿
を遠心分離して除去する。上澄み液を１モル／
のNaclおよび0.1％のナトリウムアジドを含
有しているPH８の0.1Mトリス−HCl緩衝溶液
（緩衝溶液）で透析する（「フラクシヨン
Ｄ」）。 (E) 免疫吸着によるPP11の濃縮 １ 免疫吸着剤の調製 抗PP11兎血清450mlを0.02M燐酸塩緩衝液
（PH7.0）で透析しそして免疫グロブリンを分
離するためにDEAE−セルロースでクロマト
グラフ処理する。次いで免疫グロブリンフラ
クシヨン（蛋白質6.28ｇ）を、臭化シアン
78.5ｇを用いて活性化され従つて担体に共有
結合しているビード形の特別に精製されたア
ガロース（登録商標、Pharmacia社から入
手可能なセフアロース）628ｇと反応させる。
この方法は「Nature」第214巻第1302頁
（1967）に記載されている。この方法で製造
された免疫吸着剤の助けによつて、PP11は
その溶液、特にPP11富化された胎盤抽出液
フラクシヨンから単離されうる。 ２ 免疫吸着 免疫吸着剤を緩衝溶液に懸濁し、この懸
濁液をクロマトグラフイーカラム（６×20
cm）に仕込みそしてこのカラムを緩衝溶液
ですすぐ。次いでフラクシヨンB40mlをこの
カラムにゆつくり通過させてPP11を免疫吸
着的に結合せしめる。カラムを緩衝液を用
いて充分にすすぎそして吸着された蛋白質を
3Mチオシアン酸カリウム溶液約600mlを用い
て溶離する。PP11を含有している溶離液を
緩衝溶液で透析しそして限外過器を用い
て約10mlまで濃縮する。１回の吸着当りの収
量PP11〜25mg、 PP11の溶離のすぐ後に、カラム中の吸着
剤を再び緩衝溶液を用いて中和しそして充分
に洗う。これは再びPP11の免疫吸着的結合
に用いられうる。 (F) PP11の最終精製 免疫吸着により得られる蛋白質は非特異的に
結合された血清蛋白質および他の胎盤組織蛋白
質でしばしば汚染されている。附随血清蛋白の
主要部分を、例えばセフアデツクスＧ−150で
のゲル過により分離する。次いで残存してい
る附随蛋白を逆のもしくは負の免疫吸着、すな
わちなお不純物として存在している蛋白質すな
わ免疫グロブリン（IgG）、β2−糖蛋白質、
PP10およびPP12等に対する抗体を担体と結合
させたものの助けにより除去する。胎盤1000Kg
の原料から99％以上の純度でPP1190mgが得ら
れる。
の単離に用いられうる。 (1) 硫酸アンモニウムを用いて、水溶液からPH
7.0でそして30〜60％飽和で沈殿される。 (2) 水溶液のアクリジン塩基例えば２−エトキシ
−６，９−ジアミノアクリジン乳酸塩〔「リバ
ノール（Rivanol）」（登録商標）〕を用いてPH
値４〜９でそして塩基の濃度0.2〜0.8％（ｗ／
ｖ）で沈殿される。 (3) 真正グロブリン沈殿の条件下すなわち稀緩衝
液溶液中でPH５〜６に調整することによつて沈
殿されない。 (4) 調製用電気泳動ではその運動性はα1−グロブ
リンのそれと同様である。 (5) 「セフアデツクス（Sephadex）」（登録商標）
を用いるゲル過においては分子量30000〜
90000を有する蛋白質と同じように挙動する。 (6) 伝導度約０〜２ｍＳでそしてPH約７〜９で例
えばDEAE−セルロースあるいはDEAE−セフ
アデツクスのような弱塩基性イオン交換体に結
合しうる。 (7) 免疫吸着により水溶液から濃縮され且つ単離
されうる。 本発明のもう一つの目的は上述の性質を利用し
てこの蛋白質を含有している溶液を分別すること
からなるPP11の取得方法である。 硫酸アンモニウム以外に、製造生化学に慣用さ
れるその他の中性塩を使用してPP11を沈殿させ
ることももちろん可能である。アクリジン塩基の
他に蛋白質分別に知られているような水溶性キノ
リン塩基の誘導体も本発明による方法の範囲内で
使用されうる。その電気泳動挙動例えばその分子
量のごときによつては、α1−グロブリンを他の蛋
白質から分離させるのに適当なその他の手段を用
いても蛋白質は単離されうる。ゲル過、ゲルク
ロマトグラフイーあるいは限外過の種々の方
法、あるいはまた、それにより弱塩基性イオン交
換体に結合できそして再びそこから溶離されうる
PP11の性質もまたこの目的に使用されうる。 PP11はPP11を濃縮するかあるいはこの蛋白質
を他の蛋白質から分離する作用を有する上記手段
の適当な組み合せを用いて単離されうる。 従つて、本発明の目的は、PP11を濃縮するた
めの個々の段階、そして濃縮手段の組合せから生
ずるPP11の精製法であるとみなされるべきであ
る。 濃縮過程は手段１〜６の少なくとも１種あるい
はそれらの化学的もしくは生化学的な均等手段を
用いることからなる。 本発明のもう一つの目的は、この蛋白質PP11
を含有している液体を蛋白質の単離のための既知
の操作の一つもしくはそれ以上に付し、そして各
場合においてPP11の特徴を有する蛋白質が存在
する物質を取得することからなるPP11の製法で
ある。 前記のパラメーターに加えて、分離操作から生
ずるフラクシヨン中に存在しているであろう
PP11を検出しそして測定するために免疫化学的
方法も使用されうる。何故ならばPP11は抗原性
質を有しているからである。 この目的に使用されうる抗血清は以下の方法で
取得されうる。PP11を含有している胎盤蛋白質
フラクシヨン〔H.Bohn氏の「Experientia」第
27巻第1223頁（1971）に記載の方法により人間の
胎盤ラクトジエン（HPL）の結晶化から得られ
る母液〕を用いて兎に免疫賦与することにより多
価抗血清が得られ、それを用いてPP11が検出さ
れうる。正常な人間の血清およびPP11を含有し
ていない胎盤フラクシヨンでか、あるいは蛋白質
例えばHPLでの吸着により、この抗血清は抗原
PP11に対して充分特異的となされうる。この特
異的な抗血清は一方ではPP11の免疫学的検出に
そして他方では免疫吸着剤（これはPP11の濃縮
および単離に使用されうる）の調製に使用されう
る。 オウヒターロニー（Ouchterlony）ゲル拡散技
術〔SchultzeおよびHeremans両氏編
「Molecular Biology of Human Proteins」第
１巻第134頁を対照されたい〕はPP11の免疫学的
検出に使用されうる。 本発明の適用により得られるPP11の助けによ
つて既知方法により動物に免疫賦与することによ
りモノ特異的な抗血清が製造されうる。PP11は
抗原性質を有する。動物にこの蛋白質を用いて免
疫賦与すると特異的な抗体が形成される。免疫学
的方法を用いるPP11の検出および測定は、一方
では妊娠の監視のために、そして他方では腫瘍
（特に栄養胚葉のみならず非栄養胚葉性腫瘍）の
検出、そしてまた疾患の経過の監視およびかかる
疾患における治療の監視のために診断上重要であ
る。 従つてPP11はPP11の検出および測定に使用さ
れうる抗血清を調製するのに使用されうる。 本発明を以下の実施例により説明する。 実施例 (A) 胎盤の抽出およびリバノールおよび硫酸アン
モニウムでの抽出液の分別 冷凍された人間の胎盤1000Kgを切断ミキサー
中で粉砕しそして0.4％（ｗ／ｗ）塩化ナトリ
ウム溶液1000を用いて抽出する。組織残留物
が遠心分離により分離されたのち、抽出液を20
％（ｗ／ｗ）酢酸を用いてPH6.0に調整し、そ
してこれに２−エトキシ−６，９−ジアミノア
クリジン乳酸塩〔リバノール（Rivanol）（登
録商標）、ヘキスト社製品〕の３％（ｗ／ｗ）
溶液200を撹拌下に加える。２％（ｗ／ｗ）
Nacl溶液500を遠心分離により分離された沈
殿に加え、この混合物を４時間撹拌しそして沈
殿した２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリ
ジンクロライドを遠心分離して除去する。この
溶液中に、撹拌下に固体硫酸アンモニウムを最
終濃度30％（ｗ／ｗ）に達するまで加えると
PP11が他の蛋白質と共に沈殿する。沈殿を遠
心分離する。約4.5Kgの湿潤ペーストがこれで
得られ、このものは以後「フラクシヨンＡ」と
称される。 (B) セフアデツクスＧ−150でのゲル過 フラクシヨンA1500ｇを水中に溶解させそし
て0.05％のNaN3を含有する0.01Mトリス−Hcl
緩衝液（PH8.0）（緩衝溶液）に対して透析す
る。残存する溶液をセフアデツクスＧ−150を
充填したカラム（60×56cm）に移しそして緩衝
溶液を用いて溶離する。特異的な抗PP11兎
血清を用いるオイヒターロニーゲル拡散試験で
溶離液を検査する。PP11を含有しているフラ
クシヨンを合しそして「フラクシヨンＢ」と称
する。 (C) DEAE−セルロースでのクロマトグラフイー
フラクシヨンＢをDEAE−セルロース（10×28
cmのカラム）に吸着させる。このカラムを緩衝
溶液ですすぎそしてトリクロル酢酸で流出物
中に何らもう沈殿が生じなくなるまで0.85％
（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム溶液を用いて溶離
する。蛋白質は硫酸アンモニウムを30％（ｗ／
ｖ）の濃度となるまで添加することにより溶離
液から沈殿する。沈殿を遠心分離して除去する
（「フラクシヨンＣ」）。 (D) 真正グロブリン沈殿 フラクシヨンＣを水中に溶解させそして緩衝
溶液に対して透析する。この溶液を撹拌下に
2N酢酸を添加することによりPH5.5に調整す
る。附随蛋白質のみを実質上含有している沈殿
を遠心分離して除去する。上澄み液を１モル／
のNaclおよび0.1％のナトリウムアジドを含
有しているPH８の0.1Mトリス−HCl緩衝溶液
（緩衝溶液）で透析する（「フラクシヨン
Ｄ」）。 (E) 免疫吸着によるPP11の濃縮 １ 免疫吸着剤の調製 抗PP11兎血清450mlを0.02M燐酸塩緩衝液
（PH7.0）で透析しそして免疫グロブリンを分
離するためにDEAE−セルロースでクロマト
グラフ処理する。次いで免疫グロブリンフラ
クシヨン（蛋白質6.28ｇ）を、臭化シアン
78.5ｇを用いて活性化され従つて担体に共有
結合しているビード形の特別に精製されたア
ガロース（登録商標、Pharmacia社から入
手可能なセフアロース）628ｇと反応させる。
この方法は「Nature」第214巻第1302頁
（1967）に記載されている。この方法で製造
された免疫吸着剤の助けによつて、PP11は
その溶液、特にPP11富化された胎盤抽出液
フラクシヨンから単離されうる。 ２ 免疫吸着 免疫吸着剤を緩衝溶液に懸濁し、この懸
濁液をクロマトグラフイーカラム（６×20
cm）に仕込みそしてこのカラムを緩衝溶液
ですすぐ。次いでフラクシヨンB40mlをこの
カラムにゆつくり通過させてPP11を免疫吸
着的に結合せしめる。カラムを緩衝液を用
いて充分にすすぎそして吸着された蛋白質を
3Mチオシアン酸カリウム溶液約600mlを用い
て溶離する。PP11を含有している溶離液を
緩衝溶液で透析しそして限外過器を用い
て約10mlまで濃縮する。１回の吸着当りの収
量PP11〜25mg、 PP11の溶離のすぐ後に、カラム中の吸着
剤を再び緩衝溶液を用いて中和しそして充分
に洗う。これは再びPP11の免疫吸着的結合
に用いられうる。 (F) PP11の最終精製 免疫吸着により得られる蛋白質は非特異的に
結合された血清蛋白質および他の胎盤組織蛋白
質でしばしば汚染されている。附随血清蛋白の
主要部分を、例えばセフアデツクスＧ−150で
のゲル過により分離する。次いで残存してい
る附随蛋白を逆のもしくは負の免疫吸着、すな
わちなお不純物として存在している蛋白質すな
わ免疫グロブリン（IgG）、β2−糖蛋白質、
PP10およびPP12等に対する抗体を担体と結合
させたものの助けにより除去する。胎盤1000Kg
の原料から99％以上の純度でPP1190mgが得ら
れる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記性質(a)〜(f)すなわち (a) ヘキソース2.6±0.5％、 ヘキソースアミン1.0±0.3％、 フコース0.05±0.03％、および ノイラミン酸0.26±0.07％ からなる炭水化物含量3.9±0.9％、 (b) 沈降係数S0 20，w3.5±0.2秒、 (c) 超遠心分離器で測定された分子量44300±
6000、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中で測定された分子量
62000±3000、 (e) 吸光率Ｅ１％ cm（280nｍ）13.4±1.0、および (f) α1−グロブリンのそれと同様の電気泳動運動
性 を有することを特徴とする蛋白質PP11。 ２ 下記の性質すなわち (a) ヘキソース2.6±0.5％、 ヘキソースアミン1.0±0.3％、 フコース0.05±0.03％、および ノイラミン酸0.26±0.07％ からなる炭水化物含量3.9±0.9％、 (b) 沈降係数S0 20，w3.5±0.2秒、 (c) 超遠心分離装置で測定された分子量44300±
6000、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中で測定された分子量
62000±3000、 (e) 吸光率Ｅ１％ cm（280nｍ）13.4±1.0、および (f) α1−グロブリンのそれと同様の電気泳動運動
性 を有する蛋白質PP11を含有している溶液を下記
の手段すなわち (a′) PH範囲５〜８および30〜60％飽和における
硫酸アンモニウムでの沈殿、 (b′) PH値４〜９そして0.2〜0.8％（ｗ／ｖ）の濃
度における水溶性アクリジン塩基での沈殿、 (c′) 希塩溶液中でのPH値５〜６における真正グ
ロブリン沈澱による付随蛋白質の分離、 (d′) 調製用ゾーン電気泳動およびα1−グロブリ
ンフラクシヨンの回収、 (e′) 分子量30000〜90000の範囲の蛋白質をうる
ためのゲル過、 (f′) 弱塩基性イオン交換体への吸着および蛋白
質の溶離、あるいは (g′) 免疫吸着的濃縮 の少なくとも２つ以上に付すことからなる、前記
(a)〜(f)に示される性質を有する蛋白質PP11の製
法。 ３ 下記性質(a)〜(f)すなわち (a) ヘキソース2.6±0.5％、 ヘキソースアミン1.0±0.3％、 フコース0.05±0.03％、および ノイラミン酸0.26±0.07％ からなる炭水化物含量3.9±0.9％、 (b) 沈降係数S0 20.w3.5±0.2秒、 (c) 超遠心分離器で測定された分子量44300±
6000、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中で測定された分子量
62000±3000、 (e) 吸光率Ｅ１％ cm（280nｍ）13.4±1.0および (f) α1−グロブリンのそれと同様の電気泳動運動
性 を有する蛋白質PP11の検出および測定用の抗血
清を製造するための上記蛋白質PP11を含有する
抗原。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE19792946458 DE2946458A1 (de) | 1979-11-17 | 1979-11-17 | Neues protein pp(pfeil abwaerts)11(pfeil abwaerts) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5686194A JPS5686194A (en) | 1981-07-13 |
| JPH0132839B2 true JPH0132839B2 (ja) | 1989-07-10 |
Family
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| JP (1) | JPS5686194A (ja) |
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-
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-
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