JPH0136839B2

JPH0136839B2 -

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Publication number: JPH0136839B2
Application number: JP56174380A
Authority: JP
Inventors: Girisu Suteiibun
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-04-29
Filing date: 1981-10-30
Publication date: 1989-08-02
Also published as: JPS57179749A; US4411993A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、従来文献中で「Ｔ細胞増殖因子」又
は「TCGF」として知られるインターロイキン２
（今後「IL−２」と略す。）の活性を阻害する抗
体、およびその製法に関連している。 IL−２は、ホニユウ類の細胞介在免疫応答に
影響を及ぼす事が判明している可溶性タンパク質
である。従来、マウス、ラツト、人間のリンパ球
をＴ細胞マイトゲンで刺激する事により製して来
た。IL−２に帰因する免疫応答は(i)胸腺細胞有
系分裂の増加、(ii)脾細胞、胸腺細胞、無胸腺症ヌ
ードマウスの脾細胞培養において、アロ抗原に特
異的な細胞障害性Ｔ細胞の生成、(iii)抗原特異性へ
ルパー又はキラーＴ細胞株の長期のin vitroにお
ける増殖促進、(iv)ヒツジ赤血球細胞で刺激したヌ
ードマウスの脾細胞培養中の抗赤血球（赤血球細
胞）プレークを形成する細胞応答の促進、であ
る。 in vivoにおけるＴ細胞依存免疫応答に影響を
及ぼすその能力から、IL−２はin vivoでの細胞
介在免疫性における重要な役割を演じていると考
えられる。IL−２のin vivoでの能力に関する研
究は、生物学的効果を検査する場合に比べて、血
清学的には、IL−２の存在を決定する事の出来
る試薬が無いため、進展しなかつた。さらに、こ
の免疫調節分子の性質のみならずIL−２と他の
リンホカイン活性との生化学的比較に関する研究
はIL−２と反応する抗体の発展により明らかと
なるであろう。したがつて、本発明の主要な目的
は、血清学的に、その存在を検定するのに用いる
事の出来るIL−２活性を阻害する抗体の製法を
発展させる事にある。本発明は、人間以外の哺乳動物のＢ−リンパ球
をマウス、ラツトまたはヒトのインターロイキン
２で免疫し、この免疫されたＢ−リンパ球をＢ細
胞マイトゲンで活性化し、マイトゲンで活性化し
た上記Ｂ−リンパ球細胞を人間以外の哺乳動物の
骨髄腫細胞と融合せしめて、抗−インターロイキ
ン−２モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞を製し、このハイブリドーマ細胞を培養
してIgG抗−インターロイキン２モノクローナル
抗体を産生させることからなるマウス、ラツト、
ヒトのインターロイキン２活性を阻害するIgG抗
インターロイキン２モノクローナル抗体の製法に
関連している。たとえば、抗−IL−２抗体産生
のマウスＢ−リンパ球をマウスミエローマ細胞と
融合せしめ、出来たハイブリドーマ細胞を、選択
した培地中in vitroで培養し、抗−IL−２抗体を
含む上清を遊離させるか又は、マウスの腹腔内に
ハイブリドーマ細胞を注入し高濃度の抗−IL−
２抗体を得るものである。融合工程に先だち、in
vivoでラツトIL−２にて前以つて免疫化してお
いたマウス脾細胞を、Ｂ細胞マイトゲンを含む培
地でin vitroにて培養し活性化する。融合工程に
おいては、刺激した抗−IL−２抗体産生細胞を
マウスミエローマドライバー細胞と混合し、次に
融合剤をそこに加える。出来た融合細胞を培養す
る場合、細胞混合物を、非融合ドライバー細胞の
増殖を防ぐ化合物を加えた培地中で培養する。本
発明の方法により、活性化Ｂ−リンパ球の抗−
IL−２抗体産生能力、及び薬剤標識ミエローマ
細胞の不滅性を阻害するハイブリドーマ細胞が得
られる。本発明の方法は、マウス抗−IL−２抗体産生、
ハイブリドーマ細胞を、その単一細胞の組織培養
培地中in vitroでの懸濁化によりクローン化する
事をも特徴としている。単一細胞が適当な密度に
増殖した後、抗−IL−２抗体が連続的に発生す
るように、培養液中に再び懸濁させる。上述のハイブリダイゼーシヨン及び抗−IL−
２抗体製造法はBALB／Ｃマウスより得た脾細
胞を、BALB／Ｃマウスから得たSP2／D.AG14
（以後（「SP2」）と略す）ミエローマドライバー
細胞と共に用いた。本発明の抗−IL−２抗体産
生部分はこれら二種の細胞株の融合及びハイブリ
ドーマ細胞のクローン化により発生したハイブリ
ドーマ細胞で行つた。本発明者は、4E12B2D10
で表わすクローン化細胞株を固定した。これはマ
ウス、人間、ラツト源からのIL−２活性を中和
する能力がある。本発明により製したハイブリドーマ細胞株によ
つて得た上清で検定を行つた結果、そこに含まれ
る抗−IL−２抗体が、モノクロンＢ細胞ハイブ
リドーマでありそのイムノグロブリンＧ生成物が
人間、マウス、ラツトIL−２の分子に存在する
決定因子に対し支配される事を示している。この
考え方はクローン化したハイブリドーマ細胞培養
上清を、タンパク質Ａ−結合セフアローズカラム
中にて通過させ、マウス、ラツト、人間のIL−
２活性を阻害する純イムノグロブリンＧ分画を得
たという発見に基いている。第二に、ハイブリド
ーマ由来のIgGは凍結乾燥スタフイロコツカス
アウレウス（staphylococcus aureus）と共に
用いて、「非標識」及び本質的に標識したIL−２
活性を促進する能力がある。その上、純IgG分画
と結合したセフアローズは非常に反応性のある
IL−２吸着体である。本発明に従い、あらかじめin vivoで、たとえ
ばラツトIL−２により免疫化した、マウスＢリ
ンパ球をＢ−細胞マイトゲンを含む培地中、in
vitroで細胞培養する事により活性化が行なわれ
る。マイトゲン刺激リンパ球細胞は、二種の異る
細胞を混合し、次にこれを粒状にする事により、
悪性腫瘍、マウスミエローマ細胞と融合する。細
胞粒状物を融合剤を含む培地中に再び懸濁させた
後、細胞溶液を粒状にし、種々の添加物、フイー
ダー細胞及び、非融合ミエローマ細胞の増殖を防
ぎ、抗−IL−２抗体産生ハイブリドーマ細胞を
遊離せしめるための選択的抑制剤を加えた、他の
タンパク含有培地中に懸濁させる。一方、抗−
IL−２抗体は細胞粒状物から得たハイブリドー
マ細胞をマウスの腹腔内に注入し、高濃度の抗−
IL−２抗体を含む腹水を取る事により、得る事
が出来る。（実施例３参照）本発明は又、本抗体が産生される事の判明して
いるハイブリドーマ細胞株をクローン化して、効
力ある抗−IL−２抗体産生細胞株を決定する事
に関連している。クローン化は抗−IL−２抗体
産生のハイブリドーマ細胞をフイーダー細胞、及
び非融合ミエローマ細胞の増殖を防ぐ選択的抑制
剤を含む培地中in vitroで個々に培養するような
限界希釈法で行う。本発明の方法において、BALB／Ｃ雌マウス
を抗−IL−２抗体産生Ｂ−リンパ球源として用
いるのが好ましい。IL−２免疫化マウスから得
た、活性化脾細胞をSP2マウスミエローマ細胞
株、と融合し構成分たる抗−IL−２抗体を生産
出来る数種のハイブリドーマ細胞株を得る。さら
にBALB／Ｃマウス由来の細胞においても同様
である（図１参照）。最も効力のあるIL−２阻害
物細胞株の一ツ（4E12）のクローン化は抗−IL
−２抗体を産生できる種々のクローン化ハイブリ
ドーマ細胞株に帰着した。これは4E12B2と称す
る細胞株を含む。さらに、効力のある抗体源
（4E12B2D10）は4E12B2クローン化細胞株のサ
ブクローン化により得られた。4E12、4E12B2、
4E12B2D10の試料はAmerican Type Culture
Collection（12361Parklawn Drive、Rockville、
Maryland20852）に、それぞれ、HB8093、
HB8092、HB8091として供託している。上述及び図１において、親細胞及びクローン化
細胞株で製した抗−IL抗体の効力は、IL−２活
性を阻害して、イフエクターＴ細胞応答を誘発す
る抗体の能力を検定して確認する。検定法に関し
て、本発明のハイブリドーマ細胞によつて製した
上清を、IL−２含有培地中で細胞障害性Ｔ細胞
（以後、CTLLと略す）と混合する。IL−２の刺
激により増殖するCTLL細胞はトリチウム標識チ
ミジン（以後、〔 ³H〕Tdrと略す）を取り込む
がIL−２の存在しない培地で培養した細胞は基
準量の〔 ³H〕Tdrを取り込むのみである。図１
において〔 ³H〕Tdrの取り込みが低ければ低い
程、細胞株により製した抗体はより効果的にIL
−２活性を阻害する。上に概略の如く、本発明の抗−IL−２抗体製
造法において融合の前に、IL−２で免疫化し、
抗体産生Ｂ−リンパ球を、その脾臓より得る。免
疫化は、抗−IL−２活性のin vivoによる発生を
誘発するのに十分な量により経時的に行う。理想
的には免疫化は、４週間に、3000単位を毎週投与
して行う。IL−２のみを投与するよりも、もし
ろ完全、又は非完全フロインドアジユバントと混
合する。又、IL−２を全量、体の一部位に投与
するよりも、マウスやラツトの複数の個所に投与
するのが良好である。（例えば後脚と腹腔内。）本発明に従い、融合前に、IL−２免疫化マウ
スの脾細胞を取り、そこから単一細胞懸濁液を製
する。脾細胞を種々の添加剤を加えた培地中で培
養し、これにＢ細胞マイトゲンを加えて、融合前
に、「免疫化」脾細胞を活性化する。本発明の方法において、マウス脾細胞で、抗−
IL−２抗体を得るためIL−２を用いる。後述の
如く、IL−２は又、IL−２活性を阻害する能力
のハイブリドーマ上清試料を検定するのに用い
る。このためのIL−２はマウス脾細胞、特定の
マウス胸腺腫（LBRM−33）又は人間の白血病
（Jurkat−FHCRC）細胞を、種々添加物を加え
たタンパク質含有培地中in vitroで培養して製す
る。IL−２含有の上清を産生するのを刺激する
のに、培地にＴ細胞マイトゲンを加える。この
後、上清を取り、IL−２を、さらに濃縮して精
製する。例えば、一連の硫酸アンモニウム沈澱、
ゲル過クロマトグラフイー、イオン交換クロマ
トグラフイープレパラテイブ、平板等電集束法、
で行う。異種のマウスミエローマ細胞を活性化抗体産生
脾細胞と融合せしめ、融合後増殖能のあるハイブ
リドーマ細胞にする。このようなドライバー薬剤
−標識ミエローマ細胞株はBALB／Ｃマウス由
来のSP2ミエローマ細胞である。さらに、ドライ
バー細胞株としては、NS−１、P3、XC3、
Ag8、その他薬剤・標識BALB／Ｃマウスミエロ
ーマ細胞株を含む。本発明の融合工程は、ドライバーミエローマ細
胞を活性化抗−IL−２抗体産生細胞を混合し、
次に遠心して粒状にする。この後、細胞粒を二種
の細胞の融合を促進する融合剤を含む、わずかに
アルカリ性の培地中で懸濁させる。融合剤は種々
の形のエチレンオキサイドと水の縮合ポリマー、
例えばポリエチレングリコール（今後PEGと略
す）1500である。他の融合剤としては、デオキシ
リボ核酸（今後DNAと略す）変換ビールス例え
ばセンダイビールス又はそこから得られる融合タ
ンパク質である。最適の融合には、融合剤の量と
濃度をコントロールしなければならない。例え
ば、免疫化BALB／Ｃマウス脾細胞をSP2ミエロ
ーマ細胞と融合するのにPEG1500を用いる場合、
40％（重量／容量）を含有せしめる。しかしなが
らPEG1500の容量は0.5〜３ミリリツトル、濃度
は培地容量の35〜60％重量で変化させる事が出来
る。本発明の方法は数種の培養法を包含する。すな
わち(i)、(a)抗−IL−２抗体産生細胞をin vivoで
生成せしめるため、動物を免疫化する。(b)、IL
−２活性を阻害する能力をハイブリドーマ上清で
スクリーニングする。以上の目的で用いるため
IL−２を製する。(ii)親の抗−IL−２抗体産生細
胞をＢ細胞マイトゲンでハイブリダイゼーシヨン
の前に活性化する。(iii)抗−IL−２抗体産生細胞
を薬剤感応性ミエローマ細胞と融合する。(iv)モノ
クローナル抗体産生細胞をクローン化及びサブク
ローン化する。(v)親及びクローン化ハイブリドー
マ細胞により抗−IL−２抗体を製する。(vi)ハイ
ブリドーマ上清中に存在する抗−IL−２抗体を
濃縮、精製、スクリーニングする。マウスリンパ
球細胞の増殖を促進する事が判明している種々の
型の細胞培養培地を、これらの異る培養工程で用
いる事が出来る。培地はローズウエル・パーク・
メモリアル・インステイシユート（Poswell
Park Memorial Institute）（以後RPMIと略す）
1640倍地、クリツク（click）培地、ダルベツコ
（Dulbecco）改良イーグル培地（以後DMEMと
略す）を包含する。親及びクローン化ハイブリドーマ細胞から得た
抗IL−２抗体含有上清の製造において、培地に、
種々の添加物を個々に、又は併用して加える事が
出来る。この場合、牛胎児血清（以後FCSと略
す）を熱不活性化、例えば56℃30分間加熱したも
のを加える事が出来る。加えるFCSの量は全培養
容量の５〜20％である。他の添加物としては、ペ
ニシリン、25〜250単位／ミリリツトル（50単
位／ミリリツトルが良好）を加える。全培養量の
１ミリリツトルあたり20〜250マイクログラムの
濃度範囲でストレプトマイシンを用いる事が出来
る。理想的には50マイクログラム／ミリリツトル
である。さらに添加物として(i)10〜150ミリモル
（理想的には100ミリモル）の濃度のピルビン酸ナ
トリウム、(ii)10〜60ミリモル（理想的には25ミリ
モル）の濃度のＮ−２−ヒドロキシ−ピペラジン
−XI′−２−エテン−スルホン酸（以後Hepe′sと
略す）、(iii)150〜500マイクログラム／ミリリツト
ル（理想的には300マイクログラム／ミリリツト
ル）の新鮮なＬ−グルタミンがある。さらに１〜
30ミリモル（理想的には16ミリモル）の
NaHCO₃を加える事が出来る。上述の如く、本発明の抗−IL−２抗体生成工
程において、融合前に、免疫化BALB／Ｃ脾細
胞の如き抗体産生細胞をＢ−細胞マイトゲンで活
性化する。又、Ｔ細胞マイトゲンはBALB／Ｃ
マウスの如き抗−IL−２抗体産生細胞株の免疫
化に用いるためラツトIL−２を製する目的で利
用するし、後述の如く、抗−IL−２活性を阻害
するための、本発明における抗−IL−２抗体の
能力を検定するのに用いる目的でマウスやラツ
ト、人間のIL−２を利用する。Ｔ細胞マイトゲ
ンは、種々市販の基本的植物糖タンパク質、例え
ば、フイトヘマグルチニン（以後、PHAと略
す）、コンカナバリンＡ（以後ConAと略す）アメ
リカヤマゴボウマイトゲン（以後PKMと略す）
である。異つた濃度でマイトゲンを用いる事が出
来るが、PHAを用いる場合、マウス（LBRM−
33）及び人間の悪性腫瘍（Jurkat−FHCRC）細
胞株を刺激しIL−２を生産せしめるのに１％容
量を用いると十分である。マウス、ラツトIL−
２生産の刺激にConAを用いる場合は培地１ミリ
リツトルあたり５マイクログラム用いると良い。融合前におけるマウス脾臓の刺激において、脾
細胞をＢ細胞マイトゲンＥ・Coliリポポリサツカ
ライド（以後LPSと略す）又はPKMで活性化す
る。LPSを用いる場合、理想的には、培地１ミリ
リツトルあたり20−100マイクログラム濃度を加
える事が出来る。融合後ハイブリドーマ細胞を培養する工程にお
いて、ピポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン（以後HATと略す）の如き親のミエローマ細
胞増殖阻害物又は抑制剤を培地中に加えて非融合
ミエローマ細胞の増殖を防ぐ。ヒポキサンチンは
培地１リツトルあたり10〜20ミリグラム（13.6ミ
リグラム／リツトルが良好）を加える事が出来
る。又、アミノプテリンの濃度は0.1〜0.2ミリグ
ラム／リツトルで0.176ミリグラム／リツトルが
良好でチミジンの濃度は、3.0〜4.5ミリグラム／
リツトルを用い理想的には、3.88ミリグラム／リ
ツトルが良い。融合細胞及びそのクローンを培養する工程にお
いて、細胞の増殖を誘発せしめるため、フイーダ
ー細胞を培地に加える事が出来る。現在明白に証
明されていないが、フイーダー細胞は、少量のハ
イブリドーマ細胞を増加せしめ最適の細胞密度に
するよう機能すると考えられる。又、フイーダー
細胞は、ハイブリドーマ細胞に、増殖のために必
要な栄養を供給するものと考えられる。
BALB／Ｃマウス由来胸腺細胞を含む種々のフ
イーダー細胞を用いる事が出来る。他のフイーダ
ー細胞としてはマウス脾細胞、照射マウス腹腔滲
出細胞、マウスマクロフアージ、がある。フイー
ダー細胞を種々の濃度で培地に加える事が出来る
が、HAT含有培地に0.5〜５×10⁶細胞数／ミリ
リツトル（最適には３×10⁶細胞数／ミリリツト
ル）濃度で加えると良い。上述の本発明における異つた培養工程は種々の
環境条件下で行う事が出来る。しかしながら培養
は、35〜38℃で、空気中５〜10％のCO₂を含む湿
潤条件下に保つ事が必要である。又理想的には培
地のPHは7.2〜7.4のわずかにアルカリ性条件下に
するべきである。上述の如く、本発明は、十分な量の抗−IL−
２抗体を産生する事が知られているハイブリドー
マ細胞株をクローン化して抗−IL−２抗体の能
力ある源を決定する事を包含している。クローン
化したハイブリドーマ細胞を、上述の如きハイブ
リドーマ4E12細胞による抗IL−２抗体生産の方
法と本質的に同一の方法で種々の添加物を加えた
培地中で培養する。4E12細胞の如き、より効力
のある親、ハイブリドーマ細胞を平底ミクロプレ
ート容器中で、培養する、限界希釈法でクローン
化する。新鮮なクリツク培地200マイクロリツト
ルに15％容量FCS、100ミリモルピルビン酸ナト
リウム、13.6ミリグラム／リツトルのヒポキサン
チン、0.176ミリグラム／リツトルのアミノプテ
リン、3.88ミリグラム／リツトルのチミジンを加
えた培地（以後HAT培地と略す）中に接種す
る。BALB／Ｃマウスの胸腺細胞を３〜６×10⁶
細胞数／リツトルの濃度で加え、細胞成長を良好
に促進せしめる。１週間培養後、ミクロプレート
容器において顕微鏡的に、ハイブリドーマ細胞が
増殖した単一集落培養物を検定する。一度同定し
たら、この増殖培養物を100マイクロリツトルの
新鮮なHAT培地で３日毎に加えて培養する。ハ
イブリドーマ細胞密度が50〜70％集落になつた
ら、上清を取り抗−IL−２反応性を検定する。図１で4E12B2と命名したハイブリドーマ細胞
株の如き抗−IL−２抗体の最も高い力価を産す
るクローン化細胞株をサブクローン化して更に効
力のある抗体産生細胞株を検策する。サブクロー
ン化の方法は初期のクローン化で用いた方法と同
一である。ハイブリドーマ4E12B2細胞をサブク
ローン化する方法を用いるとさらに効力ある抗−
IL−２抗体産生細胞株（4E12B2D10と命名）が
決定出来る。図１に示す如く、4E12B2D10細胞
株は4E12B2D10細胞株は4E12B2細胞の同系列の
ものよりも抗IL−２抗体の産生量が多い。効力
ある抗−IL−２抗体産生、クローン化ハイブリ
ドーマ細胞株（4E12B2D10）を同定した後、
HATのないクリツク培地中に入れて十分量の上
清を得、上清に含有する抗体をさらに特性づけ
る。一方効力のある抗−IL−２抗体産生混成ク
ローン化細胞株は、このクローン化した抗−IL
−２抗体産生細胞をマウス腹腔に注入し、後述実
施例３に示す如く高濃度の抗−IL−２抗体を含
む腹水を取る。本発明の親及びクローン化ハイブリドーマ細胞
のハイブリドーマ培養上清により製した抗−IL
−２抗体は、例えばどの細胞株が十分量の抗体を
産生するかを確めるためにスクリーニングする。
スクリーニング法は長期培養から得たイフエクタ
ー細胞のIL−２依在応答を防ぐための抗体の能
力を検定した。このスクリーニング法は複合化剤
の存在及び存在しない場合の両者で行つた。モノ
クローナル抗体は一般に大型沈澱複合体の形成能
がないので複合化剤のない場合、スクリーニング
はIL−２の活性部位上、又は、その近辺に存在
する決定因子と反応する中和抗体をのみ決定する
が錯化剤を用いた場合は、スクリーニングは、中
和抗体の他に、IL−２分子の他の部位における
決定因子に対して指図する抗体を表わす事にな
る。簡単に言えば、スクリーニング法は、100マイ
クロリツトルのクリツク培地に10％容量のFCSを
加えた培地中４×10⁴個のIL−２依存CTLL細胞
を懸濁せしめる。約50マイクロリツトルの1/5希
釈ハイブリドーマ上清、50マイクロリツトルのラ
ツトIL−２（0.5単位／ミリリツトルIL−２活性）
を含む条件づけ培地を懸濁培地に加え、200マイ
クロリツトルにする。その後、50マイクロリツト
ルのFCSを添加したクリツク培地（中和スクリー
ニング法）又は50マイクロリツトルの凍結乾燥し
たスタフイロコツカスアウレウス
（Staphylococcus aureus）（Igsorb、Enzyme
Center社、ボストン、M.A）（沈澱スクリーニン
グ法）を加える。沈澱スクリーニング培養物は1/
２００最終希釈のIgsorb試薬を含む。５％Co₂含有湿潤空気中37℃で24時間培養後、
スクリーニング培養物に、４時間毎、0.5マイク
ロキユーリーのトリチウム標識チミジン（以後
〔 ³H〕Tdr）（New England Nuclear、ボスト
ン・MA）（特異的放射活性が20ミリキユーリ
ー／ミリモル）をパルスで加える。この後、培養
物をグラスフアイバー過板上（例えば、多様自
動試料収穫機の備品）に取る。CTLL細胞による
〔 ³H〕Tdr取り込みを液体シンチレーシヨンに
より測定する。この方法によりIL−２にさらさ
れたCTLL細胞は十分量の〔 ³H〕Tdrを取り込
む（約10000〜20000cpm）。しかしIL−２及び抗
−IL−２抗体含有ハイブリドーマ上清の存在下
で培養したCTLL細胞はシンチレーシヨンにより
〔 ³H〕Tdrの取り込みは、単にバツクグラウン
ドである（約80−200cpm）。スクリーニングに用いたIL−２の量（約0.5単
位／培養）は後述の如きCTLL細胞応答IL−２微
量検定における基準IL−２含有条件づけ培地の
検定で決定する。スクリーニングの結果は上の図１に示してあ
る。最初のプレート番号４（図Ａ）における、ハ
イブリドーマのうちで中和スクリーニングでIL
−２依存CTLL細胞〔 ³H〕Tdr取り込みを十分
阻害する上清をミクロ容器培養4E12によ生産さ
れた。さらに沈澱スクリーニングにおいて、
Ibsorbを加えると上清の阻害効果が増大した。続
いて限界希釈クローン化により、中和及び沈澱ス
クリーニングにおいてIL−２依存増殖を顕著に
阻害する4E12B2を単離した。（図１、Ｂ）。この
ハイブリドーマのサブクローンによる娘クローン
の全てがIL−２活性を十分に阻害する上清を生
産した。（図１、Ｃ、及び図２）。これは最も阻害
効果を持つ細胞株（4E12B2D10）を含むサブク
ローンハイブリドーマが単一クローンである事を
示している。全てのスクリーニングにおいて、SP2ミエロー
マ培養から得た上清を利用した基準培養はIL−
２誘発CTLL細胞増殖の阻害を、中和又は沈澱ス
クリーニングにおいて、これを介在しなかつた。
SP2条件づけ培地検定スクリーニングは８〜10×
10³cpmの〔 ³H〕Tdrを取り込んだ。基準実験
で、HAT培地をハイブリドーマ培養上清の代り
に用いても同じ結果を得た。上述の如く、全ての4E12B2娘クローン細胞が
IL−２活性を十分阻害する上清を生産するとい
う事実は、これらのハイブリドーマが単一クロー
ンである事を示している。さらに研究により、ハ
イブリドーマ上清に存在する抗−IL−２活性は
タンパク質Ａに対し強い親和力を有する事が判明
した。タンパク質Ａは、イムグロブリンＧのFc
部分に強い親和性を示す事が知られているため、
抗−IL−２活性のタンパク質Ａに対する親和性
は、4E12B2D10ハイブリドーマ上清に存在する
抗−IL−２活性がIgG抗体の存在による事を示し
ている。上述の如く、IgGが単一クローンの生成
物であつた。ハイブリドーマ上清を分画化し分画における
IL−２活性の阻害効果を検定する方法は
4E12B2D10ハイブリドーマ培養から24時間上清
25ミリリツトル中に存在するタンパク質を、固形
硫酸アンモニウムをゆつくりと、70％（重量／容
量）の飽和になるまで加える事により沈澱させこ
れを４℃で１夜撹拌後、タンパク質沈澱物を
10000×ｇで20分間遠心し、粒状にする。これを、
出来るだけ少量の0.9％NaCl（PH7.2）無菌水中に
懸濁せしめる。次に24時間1000倍量の0.9％NaCl
水で透析する。３ミリリツトルの透析タンパク質
溶液をタンパク質Ａセフアローズカラム
（Pharmacia Fine Chemicals、Piscataway、N.
J.）に適応させる。セフアローズカラムは、あら
かじめ0.9％NaCl（PH7.2）で平衡化し、さらに0.9
％NaClで洗浄する。次に0.9％NaClで洗浄し、
セフアローズカラムからの液を保存し抗−IL
−２活性を検定する。タンパク質Ａセフアローズ
マトリツクスに結合したハイブリドーマ生成物を
溶出させるため、カラムを0.2モルグリシンHCl
（PH３）緩衝液で洗浄する。カラム洗浄液（溶出
液）を100倍量の0.9％NaCl（PH7.2）で透析し、次
に100倍量のハンク（Hank）緩衝塩溶液（以後
HBSSと略す）で透析する。この後、溶出液を上述の沈澱スクリーニング法
で抗−IL−２活性を検定する。タンパク質Ａセ
フアローズカラムにハイブリドーマを適応した
液も検定する。図３に示す如く酸溶出液には、は
つきりした抗−IL−２活性が存在するのに対し
液には存在しない。図３は又、IL−２依存
CTLL細胞〔 ³H〕Tdr取り込みの阻害能を測定
する事によりIL−２活性の阻害に関する粗
4E12B2D10上清の効力を示してある。上の図２
におけるように、図３はHAT培地及びSP2ミエ
ローマ細胞培養上清の両者はスクリーニング検定
において、IL−２活性の阻害能がない。図３のデータは、4E12B2D10ハイブリドーマ
上清に存在する抗−IL−２阻害活性は単一クロ
ーン（IgG）抗体の存在によるためのものであり
タンパク質Ａセフアローズカラムに結合し、溶出
する事が出来る事を示している。さらに、亜型実
験によれば単一クローン抗−IL−２はガンマ2b
亜網のIgGである事を示している。上述のIgsorb沈澱法を用いる事により、前述の
タンパク質Ａセフアローズ親和法により精製した
4E12B2D10からの抗体はラツト、マウス、人間
のIL−２活性を等しく効果的に阻害する事が判
明した。以下の表に示す如く、他の二種のハイ
ブリドーマ上清（5GBH5C6及び2D4A7）におい
てもこの阻害能があつた。これらの結果から、タ
ンパク質Ａセフアローズ精製によりハイブリドー
マ上清から単離した抗体は、三種のIL−２全て
に分配されている決定因子と反応する事を示して
いる。【表】 (b) 基準増殖と比較した阻害％(50％濃度の1〓／m
lラツトIL〓2の存在下で培養した4000CTLL細
胞による^３H〓Tdr取り込み9.3×10^３cpm)
Igsorb沈澱法は、上述の抗−IL−２抗体スクリ
ーニング法で用いたものと本質的に同じである。
培養試料は各々、4000CTLL細胞数、0.5単位／
ミリリツトルのIL−２（種にかかわらず同量）、
希釈した量の溶出抗体、1/200最終希釈のIgsorb、
を含有する。ラツトIL−２含有条件づけ培地は、上述の如
く、ハイブリダイゼーシヨンする前にBALB／
Ｃ雌マウスを免疫化するために用いたIL−２の
場合と同様に製する。条件づけ培地を含むマウス
IL−２は条件づけ培地１ミリリツトルあたり
PHA（１％容量、Grand.Island Biologicals社、
Grand Island、ニユーヨーク）刺激10⁶LBRM−
33マウスリンパ腫細胞により製する。人間の条件
づけ培地含有IL−２は(i)培地１ミリリツトルあ
たり、10⁷脾細胞を利用した正常人間脾細胞、(ii)
培地１ミリリツトルあたり10⁶悪性腫瘍細胞を利
用したJurkat−FHCRC人間白血病Ｔ細胞、をマ
イトゲン刺激により製した。上述のタンパク質Ａセフアローズ法によりハイ
ブリドーマ上清から得た後4E12B2D10由来抗体
は、IL−２活性を沈澱させる能力がある事を確
認した。この発見は、4E12B2D10培養が単一ク
ローンＢ細胞から成り、そのイムノグロブリンＧ
生成物が、人間、マウス、ラツトIL−２の分子
に存在する決定因子に対して支配するという考え
方を支持する。沈澱法において、(i)SP2条件づけ培地、(ii)
HAT培地、(iii)1/20希釈タンパク質Ａセフアロー
ズ精製の4E12B2D10IgG、を個々に0.5ミリリツ
ターずつを、3.0単位／ミリリツトルのIL−２を
含むラツト条件づけ培地0.5容量ずつとそれぞれ
混合する。混合物を15×75ミリリツトルのガラス
遠心管中、37℃で30分間インキユベートする。そ
の後250マイクロリツトルのIgsorb（クリツク培地
中1/16希釈）を各遠心管に加え、インキユベーシ
ヨンを、さらに45分間続けた後、各試料を400×
ｇで20分間遠心し、上清試料以下に述べる如く、
基準のIL−２依存CTLL〔 ³H〕Tdr取り込み実験
により残りのIL−２活性を検定する。検定の結果は、図４に示す。IL−２活性と
4E12B2D10からの抗体とのインキユベーシヨン
を含む検定の結果、ラツトIL−２生物活性の免
疫沈澱を得る。同様にラツトIL−２条件づけ培
地と等量の(i)SP2ミエローマ細胞による条件づけ
培地、(ii)HAT培地との処理により、希釈に対応
して、IL−２活性の力価減少がみられた。 4E12B2D10からのモノクローナル抗体は放射
性標識IL−２を沈澱せしめる能力を持つ事が判
明した。この結果から4E12B2D10上清がIL−２
分子に存在する決定因子と反応する抗体生成物を
持つ単一クローンＢ細胞ハイブリドーマを含む事
が明らかであるばかりでなく、IL−２の存在は
従来の検定法により必要とするものよりも容易に
決定が出来る根拠となる。実際の沈澱工程の前に、IL−２産生マウスガ
ン細胞株、LBRM−33を、五種の異るアミノ酸、
³H標識ロイシン、リジン、フエニルアラニン、
プロリン、チロシン（Amersham Corp.、
Arlington Height、IL.、カタログ番号TRK550）
の存在下で培養し、生合成的に ³H−標識IL−２
活性物を製する。 ³H−標識IL−２生産工程にお
いて、培地１ミリリツトルあたり７×10⁵LBRM
−33細胞数を、２％容量のFCSを添加した25ミリ
リツトルのRPMI1640培地中で培養する。各培養
試料は、五種の各アミノ酸を欠乏濃度（正常値の
20％）を含有する。培養開始時に、あらかじめト
リチウム化したアミノ酸を対応する培地に加え、
１ミリリツトルあたり10マイクロキユーリーの濃
度にする。48時間培養後、Ｔ細胞植物マイトゲ
ン、PHA、を最終濃度が１％容量になるよう各
培地に加える。24時間後、IL−２含有上清を取
り、85％硫酸アンモニウム沈澱により濃縮する。
その後上清を、Gillis等の「リンパ球調節分子−
の生化学的、生物学的性質、ラツト及び人間リ
ンホカインの精製、124.The Journal of
Immunology1954（1980）」に記述の如く、ジエチ
ルアミノエチル（以後DEAEと略す）セルローズ
イオン交換クロマトグラフイー及びセフアデツク
スＧ−100ゲル過クロマトグラフイーで分画す
る。この方法により33000〜36000分子量の活性分
画（20〜100単位／ミリリツトル）が生成され
各々、多量の放射活性が得られた。（約
100000cpm／ミリリツトル）（図５参照）。免疫沈澱工程において、 ³H−標識IL−２含有
分画をクリツク培地で希釈し、その20ミリリツト
ル中に1200cpmの放射活性を有するようにする。
20ミリリツトルずつを各々、ハイブリドーマ上清
の連続log₂希釈物の存在下、37℃でインキユベー
トする。各上清試料を無菌15×75ミリリツトルガ
ラス遠心管中に入れFCS含有クリツク培地10％容
量と混合して全体を50マイクロリツトルにする。
混合物を空気中５％CO₂気流中37℃にて30分間イ
ンキユベートする。その後、20マイクロリツトル
のIgsorb（1/2希釈）を加え、さらに45分間インキ
ユベートする。２ミリリツトルの0.9％NaClを加
え、免疫沈澱物を400×ｇで５分間遠心する。粒
状物を２ミリリツトルの0.9％NaClで２回洗浄
し、3.5ミリリツトルのバイオフラー（Bioflour）
シンチレーシヨンカクテル（New England
Nuclear）を各管に加え、ボルテクスミキサーで
混合して、プラスチツク製ミニシンチレーシヨン
バイアルに移す。最後に、トリチウム放射活性標
識粒状物を液体シンチレーシヨンにより測定す
る。免疫沈澱物の ³H−標識IL−２活性測定結果
を表に示す。【表】ローズ酸溶出物
1. 各反応混合物に1200cpmを加える
同じ沈澱法を、HAT培地、SP2条件づけ培地、
のlog₂連続試料及び4E12B2D10ハイブリドーマ
上清の1/5希釈物を用いて行う。（表参照）。興
味ある事には、4E12B2D10上清の放射標識IL−
２を沈澱させる能力は1/20希釈ハイブリドーマ上
清を用いた場合でも794cpm残存する。さらにこ
の能力は、10倍過剰濃度の非放射標識IL−２の
存在下では同じ免疫沈澱の生成により阻害され
る。 4E12B2D10ハイブリドーマ細胞株がIL−２分
子に存在する、いくつかの決定因子に対して支配
する、単一クローンIgG抗体を生産するという考
え方は、ハイブリドーマ抗体がセフアローズ4B
に、CNBr介在結合する事により、十分量のIL−
２を吸着するマトリツクスを形成するという事実
によりさらに確められた。この結果は本発明の抗
体が生物学的活性IL−２の親和性による精製に
有益である事を示している。用いた検定法は、タンパク質Ａセフアローズア
フイニテイークロマトグラフイーにより上述の如
く、4E12B2D10ハイブリドーマ細胞株から濃縮
されたハイブリドーマ上清への精製を包含してい
る。タンパク質Ａセフアローズカラムクロマトグ
ラフイー精製法により溶出した抗体は、0.5モル
NaCl及び0.1モルNaHCO₃（PH8.3）から成る緩衝
液１ミリリツトルあたり２ミリグラムの濃度にな
るように希釈する。抗体の濃度はベツクマン
（Beckman）分光光度計を用い紫外線吸光度
（280nｍ）により決定する。この場合E¹ ₂₈₀＝10.0
と仮定する。精製抗体を加える前に、１グラムのCNBr活性
化セフアローズ4B（Pharmacia Fine Chemicals
社）を200ミリリツトルの冷１ミリモルHClで洗
浄して膨潤させる。膨潤したセフアローズ4Bを
200×ｇで10分間遠心して粒状とし、次に、この
活性化CNBrセフアローズ4Bを0.9％NaClで洗浄
し、緩衝液に懸濁させて、３ミリリツトルスラリ
ーにする。このスラリーを15cm³コニカル遠心管中
で１ミリリツトルの4E12B2D10抗体と混合する。
室温でシエーカーを用いて２時間振とうし、
CNBrセフアローズ4Bに抗体を結合させる。こ
の後、ゲルを粒状にし、過剰の非結合抗体を除
く。上述の結合方法により結合しなかつたCNBr
活性抗体部位は、100ミリリツトルの、0.5モル
NaCl及び0.2モルグリシン（PH8.0）緩衝液中に、
ゲルを懸濁してブロツクし、このゲルを再びシエ
ーカーで２時間混合する。抗体結合セフアローズによりIL−２活性が除
去されるのはCNBr活性セフアローズ部位にIL−
２が直接結合するためではない事を確めるための
基準として、第二CNBrセフアローズスラリーを
製する。上述の結合法を用いて、第二スラリー
に、１ミリリツトルあたり１ミリグラムの牛血清
アルブミン（以後BSAと略す）を含む溶液１ミ
リリツトルを結合させる。 IgG及びBSA結合セフアローズゲルの両者を
0.5モルNaCl、0.2モルグリシン（PH8.0）緩衝液
で処理し、10ミリリツトルの結合緩衝液で３回、
0.1モル酢酸ナトリウム緩衝液（0.5モルNaCl中、
PH４）で３回、10ミリリツトルの結合緩衝液で３
回、順々に洗浄する。IL−２アフイニテイーク
ロマトグラフイーを行う前に無菌0.9％NaCl（PH
7.2）中でカラムを平衡化する。アフイニテイークロマトグラフイーを行う場
合、３単位／ミリリツトルのIL−２活性を持つ
ラツト脾細胞条件づけ培地10ミリリツトルで、各
ゲルカラム中を通過させる。液を取り、基本的
IL−２微量検定により残つたIL−２活性を調べ
る。この場合後述の如く、CTLL細胞のIL−２依
存〔 ³H〕Tdr取り込みにより調べる。図６に示
す如く、ラツト脾細胞条件づけ培地をBSA−結
合セフアローズカラム通過させて得た液は最初
のラツト脾細胞由来IL−２溶液に存在するIL−
２活性と同じくらい多いが、4E12B2D10抗体結
合セフアローズ中を通過させて得たラツト脾細胞
条件づけ培地の液には最初に存在したIL−２
活性の５％以下の存在を示すのみである。CNBr
−セフアローズに結合した抗IL−２抗体のIL−
２活性吸着能は、IL−２分子に存在する、いく
つかの決定因子に対して支配されるモノクローナ
ル抗体が4E12B2D10ハイブリドーマ細胞株によ
り生成される事を示している。上述の免疫沈澱、アフイニテイークロマトグラ
フイー、スクリーニング実験（親及びクローン化
細胞株により生成される抗−IL−２抗体の効果
を検定する）におけるIL−２濃度はGillis等の
「Ｔ細胞増殖因子：生成のパラメーター及び定量
微量検定」120、Journal of Immunology、2027
（1978）に記述されているIL−２微量検定法によ
り決定する。検定法を概略すればIL−２試料の
log₂希釈物中に、約4000ネズミCTLL細胞を入れ
る。各培養物において、10％容量のFCSを加え
て、全体を200マイクロリツトルにしたclick培地
中に、このCTLL細胞を懸濁させ、５％CO₂含有
湿潤空気中37℃で12時間インキユベートする。こ
れに４時間毎200ミリキユーリー／ミリモルの特
異活性を持つ〔 ³H〕Tdrを0.5マイクロキユーリ
ー（New England Naclear社より入手、ボスト
ン、MA）パルスで加える。これをグラスフアイ
バー過板上（例えば多様、自動試料収穫機の備
品を用いる）に取りCTLL細胞による〔 ³H〕
Tdr取り込みを液体シンチレーシヨンにより測定
する。この方法によりIL−２存在下で培養した
CTLL細胞は〔 ³H〕Tdrを加えた量に比例して
取り込む。一方、IL−２の無い培地で培養した
CTLL細胞は〔 ³H〕Tdrの取り込みは単にバツ
クグラウンドである。IL−２欠損24時間後95％
以上がトリパン−ブルー陽性であり細胞が死んだ
事を示している。 IL−２濃度はチミジン取り込みのデーターを
分析して定量するが、１単位／ミリリツトルIL
−２活性は、１ミリリツトルの培地中10⁶正常ラ
ツト脾細胞の初期濃度をConA（５マイクログラ
ム／ミリリツトル）刺激により条件づけした48時
間組織培養培地中に存在するIL−２活性の量と
して定義する。１単位／ミリリツトルのIL−２
活性は、１：２希釈で、約10000cpmの〔 ³H〕
Tdr取り込みがみられる。実施例１６週令の老BALB／Ｃ雌マウスを週１回４週
間にわたり3000単位のラツトIL−２で免疫化す
る。ここで用いるIL−２は、培地１ミリリツト
ルあたり１×10⁷ラツト脾細胞を、培地１ミリリ
ツトルあたり５マイクログラムのConAで24時間
刺激して製する。ここで得られた上清を、硫酸ア
ンモニウム沈澱、セフアデツクスＧ−100ゲル
過クロマトグラフイー、DEAE−セルローズイオ
ン交換クロマトグラフイー、プレパラテイブ平板
等電収束法を連続的に行い、上述のGillis等の124
The Journal of Immunology1954（1980）記載
の如く精製する。免疫化においては、0.2ミリリツトル中1000単
位のIL−２を各後脚に皮下注入する。最初の免
疫化の前に、IL−２を完全なFreund佐薬（アジ
ユバント）と混合し、最後の３回の免疫化の前に
IL−２を不完全Freund佐薬と混合する。さらに
又各免疫化の間に、0.5ミリリツトルの0.9％NaCl
中1000単位のラツトIL−２を腹腔内に注射する。融合２日前に、IL−２免疫化マウスから脾臓
を取り単一細胞懸濁液を製する。脾細胞を48時間
クリツク培地で培養する。培地には10％容量の、
熱不活性化（56℃、30分）FCS、25ｍＭ
HEPES緩衝液、16ｍＭ NaHCO₃、50マイクロ
グラム／ミリリツトルのストレプトマイシン、50
単位／ミリリツトルのペニシリン、300マイクロ
グラム／ミリリツトルの新鮮なＬ−グルタミン、
を添加する。培地１ミリリツトル中100マイクロ
グラムのＥ．コーリ（Ｅ．Coli）リポポリサツカ
ライドを加えて脾細胞を活性化する。５％CO₂含
有の湿潤空気中37℃でこれを培養する。約８×
10⁷のLPS−活性化「IL−２免疫」脾細胞を
BALB／Ｃマウスより得た約２×10⁷のSP2ミエ
ローマ細胞と混合して融合せしめる。この細胞株
はイムノグロブリンＬ鎖を組織的には生産しない
SP2／HLGKミエローマ株由来のものである。細
胞混合物を200×g5分間で遠心して粒状にする。
粒状物を37℃の水浴中にて、40％（重量／容量）
ポリエチレングリコール1500を含む、温クリツク
培地（PH7.3、FCS含有せず）１ミリリツトルと
注意深く１分間以上かけて懸濁させる。さらに２
ミリリツトルの温、無血清クリツク培地を次の２
分間で加える。この後８ミリリツトルの同一培地
を加え、200×ｇで５分間遠心して融合工程を終
了する。活性化IL−２免疫化、BALB／Ｃ脾細胞をSP2
ミエローマ細胞と融合して得た抗−IL−２抗体
の組織的生産は、15％容量のFCSと100ミリモル
のピルビン酸ナトリウムを加えたクリツク培地40
ミリリツトル中上述細胞粒状物を懸濁させて行わ
れる。非融合ミエローマ、ドライバー細胞につい
ては13.6マイクログラム／リツトルのヒポキサン
チン、0.176マイクログラム／リツトルのアミノ
プテリン、3.88マイクログラム／リツトルのチミ
ジンを培地に加えて増殖を防ぐ。融合細胞を同一培地で、フイーダー細胞として
の８×10⁸BALB／Ｃ雌マウス胸腺細胞を含む培
地160ミリリツトルに加える。細胞懸濁液全体を
ゆつくり混合し、200マイクロリツトルずつ、平
底マイクロプレート容器（Coster Inc、社No.
3596、ケンブリツジ、MA）中に分注する。これ
を５％CO₂ガス含有湿潤空気中37℃で培養する。実施例２クラスタープレート（Coster、Inc.社No.3524、
ケンブリツジMA.）中２ミリリツトル、又は培
養フラスコ（フアルコンプラスチツク社、No.3013
オツクスフオート、CA）中10ミリリツトルの培
地で、4E12B2D10クローン化ハイブリドーマ細
胞を10⁶／ミリリツトル培養し抗−IL−２抗体を
組織的に生産する。培地は15％容量の熱不活性化
（56℃、30分）FCS、100ｍＭのピルビン酸ナトリ
ウムを加えたクリツク培地を含む。５％CO₂含有
湿潤空気中37℃で培養し、24時間後、上清中には
５〜15マイクログラム／ミリリツトルの抗IL−
２イムノグロブリンＧを含有する。実施例３高濃度の抗−IL−２抗体を製するには、
BALB／Ｃ雌マウスの腹腔内に10⁶4E12B2D10ハ
イブリドーマ細胞を注入し、in vivoで生成させ
る。ハイブリドーマ細胞注入１週間前に、0.5ミ
リリツトルのプリスタン（pristane）を、刺激剤
含有の腹水としてBALB／Ｃマウスの腹腔内に
注入する。14〜17日後、ハイブリドーマ注入腹水
を取り、そこに含有する抗−IL−２イムノグロ
ブリンＧを、タンパク質Ａ−セフアローズへの親
和性により精製する。この分野に精通した者にとつて明らかなよう
に、本発明は、ミエローマ細胞株、培地、培地へ
の添加物、Ｔ及びＢ細胞刺激物、融合剤、細胞増
殖阻害物を、上述の如く、本発明の精神及び本質
的な特徴から離脱せずに実施する事が出来る。上
述の工程は、それ故、全て例示でありこれに限定
されるものでない事を理解されたい。すなわち、
本発明の形態は前述の抗−IL−２抗体製造法の
例に限定されるよりも、むしろ特許請求の範囲に
記載の事項に限定される。

【図面の簡単な説明】

第１図は4E12B2D10ハイブリドーマの単離を
試べるための中和（●印）及び沈澱（〇印）スク
リーニング検定の結果を示すグラフである。IL
−２含有の培地で培養したCTLL細胞は ³HTdr
を取り込むが抗IL−２抗体含有の培地での培養
は取り込まず、このため取り込みが低ければ低い
程各細胞株により生成される抗体は効果的にIL
−２活性を阻害する事になることを示している。
Ａにおける微量容器中の培養４では4E12のみが
IL−２依存CTLL〔 ³H〕Tdr取り込みを阻害し、
Ｂでは4E12培養で限界希釈法によりクローン
4E12Bが最も活性のある上清を産生し、Ｃにおい
て4E12B2培養のサブクローン化により娘クロー
ン（特に4E12B2D10）は顕著にIL−２活性を阻
害する上清を産生することを示している。第２図
は4E12B2D10（▲）、5G8H5C6（■）、2D4A7（●）
より得られる上清のIL−２依存CTLL細胞増殖を
阻害する効果を中和Ａ、沈澱Ｂスクリーニングで
検定した結果を示すグラフである。HAT培地
（△）、又はSP2ミエローマ細胞培養上清（〇）を
用いた培養では取り込みが良く、阻害効果が無い
事を示している。横軸には培養希釈数の逆数でプ
ロツトしてある。第３図はHAT培地（〇）、SP2
条件づけ培地（●）クローン化ハイブリドーマ
4E12B2D10細胞株から得た上清（□）、の抗−IL
−２効果を調べるためのIgsorb−沈澱スクリーニ
ング培養を示すグラフである。IL−２依存CTLL
〔 ³H〕Tdr取り込みを阻害する4E12B2D10上清
の能力は、タンパク質Ａ結合セフアローズ（■）
カラム（３ml）を通過させると失われるがグリシ
ン−HCl（PH３）を用いた酸溶出、続いて透析
（□）したものは、抗−IL−２による阻害活性が
増加する（取り込みが少い）ことを示している。
第４図はクリツク培地（△）、SP2条件づけ培地
（〇）、HAT培地（●）、タンパク質Ａセフアロ
ーズ精製4E12B2D10IgG（■）の存在下Igsorb沈
澱の前（▲）後におけるラツト脾細胞条件づけ培
地（3U／ml）の調製物に残存するIL−２活性を
調べたCTLL増殖検定の結果を示すグラフであつ
て、4E12B2D10からの抗体による免疫沈澱のみ
が十分なIL−２活性の減少を示している。第５
図は生合成的に放射標識したLBRM−33細胞由
来のIL−２調製物のセフアデツクスG100カラム
の分画におけるIL−２活性（●）及び ³H−標識
（▲）cpmを表わすグラフである。ゲル過クロ
マトグラフイーの前に、LBRM−33条件づけ培
地に存在する放射標識IL−２を硫酸アンモニア
沈澱、DEAEイオン交換クロマトグラフイーによ
り濃縮することにより33000〜36000分子量の範囲
に活性が認められることを示している。第６図は
BSA結合セフアローズカラム（●）、4E12B2D10
を結合させたカラム（■）を通過させる前（▲）
後のラツト脾細胞条件づけ培地の3U／ml試料中
に存在するIL−２活性を示すグラフであつて抗
体結合セフアローズによりIL−２活性が除去さ
れるのはCNBr活性セフアローズ部位にIL−２が
直接結合するのではない事を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１人間以外の哺乳動物のＢ−リンパ球をマウ
ス、ラツトまたはヒトのインターロイキン２で免
疫し、この免疫されたＢ−リンパ球をＢ細胞マイ
トゲンで活性化し、マイトゲンで活性化した上記
Ｂ−リンパ球細胞を人間以外の哺乳動物の骨髄腫
細胞と融合せしめて、抗−インターロイキン２モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
を製し、このハイブリドーマ細胞を培養してIgG
抗インターロイキン２モノクローナル抗体を産生
させることからなるマウス、ラツト、ヒトのイン
ターロイキン２活性を阻害するIgG抗インターロ
イキン２モノクローナル抗体の製法。２Ｂ−リンパ球細胞をマウス、ラツトまたはヒ
トのインターロイキン２で免疫する段階がマウス
をマウス、ラツトまたはヒトのインターロイキン
２で免疫することからなる特許請求の範囲第１項
の方法。３上述のマウスをインターロイキン２で免疫す
る工程が、約3000単位のインターロイキン２を周
期的に注射することからなる特許請求の範囲第２
項の方法。４上述のＢ−リンパ球を活性化する工程が活性
化培養地中Ｂ細胞マイトゲンの存在下該Ｂ−リン
パ球を培養せしめることからなる特許請求の範囲
第１項の方法。５上述のＢ−リンパ球活性化工程が、インター
ロイキン２で免疫したマウスから脾臓を取り出し
て該脾臓細胞をＢ細胞マイトゲン中で培養するこ
とからなる特許請求の範囲第１項の方法。６上述Ｂ細胞マイトゲンが、アメリカヤマゴボ
ウマイトゲンおよびイー・コリ（E.Coli）リポポ
リサツカライドからなる群より選んだ化合物であ
る特許請求の範囲第１，４または５項の方法。７上述Ｂ−リンパ球細胞及び骨髄腫細胞が、マ
ウスより得たものである特許請求の範囲第１項の
方法。８上述骨髄腫細胞が、イムノグロブリンＬ鎖を
組織的に産生しない骨髄腫細胞である特許請求の
範囲第１項の方法。９上記培地が、非融合細胞の成長を防ぐ選択的
阻害剤を含有する特許請求の範囲第１項の方法。１０上述のハイブリドーマ細胞を培養する工程
が、培地中上記細胞をインビトロで培養してIgG
抗−インターロイキン−２モノクローナル抗体を
製することからなる特許請求の範囲第１項の方
法。１１上述の培地が、非融合Ｂ−リンパ球細胞及
び、非融合骨髄腫細胞の増殖を防ぐ阻害剤を含有
する特許請求の範囲第１０項の方法。１２上記阻害剤がヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジンより選んだ１種以上の化合物
である特許請求の範囲第１１項の方法。１３上記の上清からIgG抗−インターロイキン
−２モノクローナル抗体を回収する工程をさらに
含む特許請求の範囲第１０項の方法。１４上述のハイブリドーマ細胞を培養する工程
が、同系統の人間以外の哺乳類の腹腔内で上述ハ
イブリドーマ細胞をインビボで増殖せしめてIgG
抗−インターロイキン−２モノクローナル抗体を
含有する腹水を製することからなる特許請求の範
囲第１項の方法。１５さらに、上記ハイブリドーマ細胞をクロー
ン化する事からなる特許請求の範囲第１項の方
法。１６人間以外の哺乳類のＢ−リンパ球細胞をマ
ウス、ラツトまたはヒトのインターロイキン−２
で免疫し、この免疫されたＢ−リンパ球細胞をＢ
細胞マイトゲンで活性化し、この活性化されたＢ
−リンパ球細胞を人間以外の哺乳類の骨髄腫細胞
と融合せしめてハイブリドーマ細胞を形成し、こ
のハイブリドーマ細胞を培養してIgG抗−インタ
ーロイキン−２モノクローナル抗体を産生させる
ことにより製されるマウス、ラツトおよびヒトの
インターロイキン２活性を阻害するIgG抗−イン
ターロイキン−２モノクローナル抗体。１７Ｂ−リンパ球細胞をマウス、ラツトまたは
ヒトのインターロイキン−２で免疫する工程がマ
ウスをマウス、ラツトまたはヒトのインターロイ
キン−２で免疫することからなる特許請求の範囲
第１６項のIgG抗−インターロイキン−２モノク
ローナル抗体。１８上述の、Ｂ−リンパ球細胞を活性化する工
程が、Ｂ−リンパ球を活性化培養培地中、Ｂ細胞
マイトゲンの存在下で、培養することからなる特
許請求の範囲第１６項のIgG抗−インターロイキ
ン−２モノクローナル抗体。１９上述のＢ−リンパ球細胞を活性化する工程
が、マウス、ラツトまたはヒトのインターロイキ
ン−２で免疫化した人間以外の哺乳類の脾臓を取
り、活性化培養培地中Ｂ細胞マイトゲンの存在
下、該脾臓細胞を培養することからなる特許請求
の範囲第１８項のIgG抗−インターロイキン−２
モノクローナル抗体。