JPH0137115B2 - - Google Patents
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- JPH0137115B2 JPH0137115B2 JP57122799A JP12279982A JPH0137115B2 JP H0137115 B2 JPH0137115 B2 JP H0137115B2 JP 57122799 A JP57122799 A JP 57122799A JP 12279982 A JP12279982 A JP 12279982A JP H0137115 B2 JPH0137115 B2 JP H0137115B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明の分野
本発明は、一定の細胞を培養する特殊な方法に
よる、プラスミノーゲン賦活体（p.a.）の製造法
に関する。本発明により、新規培養法、ならびに
ビールスによる形質転換あるいは発癌物質や補発
癌物質である化合物（誘発物質）の処理を施すこ
となく高いp.a.生産性を示す一定の細胞株が提供
される。該細胞は生産循環の終期に染色体および
生育上の特色に変化がなく、各細胞株に用いた標
準条件で増殖し再循環できる。 本発明の背景 ウロキナーゼは血栓に対する治療薬の成分とし
て用いられる蛋白分解酵素である。その効力は既
に証明され、米国F.D.Aの規制に従つて使用が許
可されており、ヨーロツパおよび日本でも同様で
ある。ウロキナーゼおよびプラスミノーゲン賦活
体とよばれる二つの酵素は本質的には同一のもの
と考えられる。ウロキナーゼは現在主に尿から生
産されるが、尿中には極少量、８単位／mlの割で
しか存在しない。最終製品の調製費が非常に高
く、しかも少量しか入手できない。そのため、商
業的規模でp.a.を生産する方法を開発すべく努力
が重ねられている。 本発明の要約 本発明はプラスミノーゲン賦活体（以下p.a.と
いう）の製法ならびに、生産された酵素に関す
る。本発明は該酵素p.a.が普通の二倍体細胞から
商業的規模で生産できるとの予期せざる知見に基
いている。以下詳細に説明するごとく、p.a.生産
性を有する細胞を分離し、多量のp.a.を生産する
ように調整した。 定着したヒトの二倍体細胞の一定細胞株、たと
えばIMR−90、WI−38またはHEL−299は、ま
ず胎生子牛血清以外の、好ましくは馬血清のよう
な血清を含む培地で約５−15日間培養するか、あ
るいはポリ−Ｄ−リジンのようなマトリツクスで
被覆した皿上で培養するとp.a.生産能を獲得する
ことを見出した。かくして調整した細胞は、それ
以後はラクトアルブミン加水分解物を含む無血清
培地あるいは他の適当な栄養培地で培養すると少
なくとも15日間連続してp.a.を生産・分泌する。
培地中にp.a.が蓄積し、一定の濃度に達すると、
p.a.の生産は減少し、最後には停止する。最高濃
度は多くの通常の細胞株で約１単位／ml、形質転
換した細胞で３−５単位／ml、豚の膀胱細胞で30
−50単位／ml、IMR−90で100−300単位／mlで
ある。栄養培地からp.a.を連続的に取除くと最高
濃度到達を避けることができ、細胞はかなり長時
間に亘つてp.a.を生産する。IMF−90では約50単
位／日／105細胞の割でp.a.が生産される。p.a.は
また培地から回収され再循環される。線維芽細胞
により産生されたp.a.は分子量65〜75KDを有す
ることが分つた。このものはTPAに対して生じ
たポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
と反応した IMR−90はポリオおよび風疹用の生ワクチン
の生産源として認可されているWI−38と同様な
細胞株である。これら細胞株の培養については文
献に詳細な記載があり、最適条件はよく知られて
いる。本発明による方法をIMR−90細胞株を例
にとつて説明する。これは単なる一例示であり、
同様に定着したまたは類似の性質を有する新規な
細胞株も同様に使用することができるものと理解
すべきである。また以下の記載も単なる例示と理
解すべきである。 好適な実施態様の記載 本発明は特定条件下で一定の二倍体細胞を培養
し、培養物から目的物を回収することからなるプ
ラスミノーゲン賦活体（p.a.）の製造に関する。 用いられる好適な細胞株はIMR−90で、これ
はW.W.ニコルス（Nichols）（1977）によつて16
週令女性胎児の肺から得られたヒト二倍体線維芽
細胞株である。該細胞はATCC（CCL186、第７
継代培養）から入手した。IMR−90、WI−38、
HEL−299のいずれについてもp.a.を著量生産す
るという報告はない。本研究では、それらは最初
非生産株と考えられていたが、馬血清を含む培地
で培養し、次いで他の栄養培地で培養することに
よりそれらの細胞をp.a.の著量生産株に変えるこ
とができることを見出した。 ATCCから入手したIMR−90を解かし、
ATCCが勧める10％FCS含有培地に植えた。一継
代培養後細胞をLH培地に移し、酵素含量を測定
した。その結果p.a.の生成が僅かに（４日後５単
位／ml以下）認められた。 FCSで二継代培養後、IMR−90細胞を10％HS
含有培地で二次培養した。この培地で四継代培養
（約12分裂）後、細胞をLHに移した。その第１
図の結果は、細胞が非常に高いp.a.生産株になつ
たことを示している。該酵素は急速に生産され、
溶液中の濃度は約100単位／mlに達した。 次いで同じ細胞をHSで連続的に二次培養し、
p.a.生産を時おり調べた。第１表の結果はp.a.生
産能力が、細胞に老令のきざし、つまり緩慢な分
裂と増殖停止（flattening）が見えはじめるまで
保持されたことを示している。 これは65−70分裂に相当するとみられる22−24
継代後も観察された。
よる、プラスミノーゲン賦活体（p.a.）の製造法
に関する。本発明により、新規培養法、ならびに
ビールスによる形質転換あるいは発癌物質や補発
癌物質である化合物（誘発物質）の処理を施すこ
となく高いp.a.生産性を示す一定の細胞株が提供
される。該細胞は生産循環の終期に染色体および
生育上の特色に変化がなく、各細胞株に用いた標
準条件で増殖し再循環できる。 本発明の背景 ウロキナーゼは血栓に対する治療薬の成分とし
て用いられる蛋白分解酵素である。その効力は既
に証明され、米国F.D.Aの規制に従つて使用が許
可されており、ヨーロツパおよび日本でも同様で
ある。ウロキナーゼおよびプラスミノーゲン賦活
体とよばれる二つの酵素は本質的には同一のもの
と考えられる。ウロキナーゼは現在主に尿から生
産されるが、尿中には極少量、８単位／mlの割で
しか存在しない。最終製品の調製費が非常に高
く、しかも少量しか入手できない。そのため、商
業的規模でp.a.を生産する方法を開発すべく努力
が重ねられている。 本発明の要約 本発明はプラスミノーゲン賦活体（以下p.a.と
いう）の製法ならびに、生産された酵素に関す
る。本発明は該酵素p.a.が普通の二倍体細胞から
商業的規模で生産できるとの予期せざる知見に基
いている。以下詳細に説明するごとく、p.a.生産
性を有する細胞を分離し、多量のp.a.を生産する
ように調整した。 定着したヒトの二倍体細胞の一定細胞株、たと
えばIMR−90、WI−38またはHEL−299は、ま
ず胎生子牛血清以外の、好ましくは馬血清のよう
な血清を含む培地で約５−15日間培養するか、あ
るいはポリ−Ｄ−リジンのようなマトリツクスで
被覆した皿上で培養するとp.a.生産能を獲得する
ことを見出した。かくして調整した細胞は、それ
以後はラクトアルブミン加水分解物を含む無血清
培地あるいは他の適当な栄養培地で培養すると少
なくとも15日間連続してp.a.を生産・分泌する。
培地中にp.a.が蓄積し、一定の濃度に達すると、
p.a.の生産は減少し、最後には停止する。最高濃
度は多くの通常の細胞株で約１単位／ml、形質転
換した細胞で３−５単位／ml、豚の膀胱細胞で30
−50単位／ml、IMR−90で100−300単位／mlで
ある。栄養培地からp.a.を連続的に取除くと最高
濃度到達を避けることができ、細胞はかなり長時
間に亘つてp.a.を生産する。IMF−90では約50単
位／日／105細胞の割でp.a.が生産される。p.a.は
また培地から回収され再循環される。線維芽細胞
により産生されたp.a.は分子量65〜75KDを有す
ることが分つた。このものはTPAに対して生じ
たポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
と反応した IMR−90はポリオおよび風疹用の生ワクチン
の生産源として認可されているWI−38と同様な
細胞株である。これら細胞株の培養については文
献に詳細な記載があり、最適条件はよく知られて
いる。本発明による方法をIMR−90細胞株を例
にとつて説明する。これは単なる一例示であり、
同様に定着したまたは類似の性質を有する新規な
細胞株も同様に使用することができるものと理解
すべきである。また以下の記載も単なる例示と理
解すべきである。 好適な実施態様の記載 本発明は特定条件下で一定の二倍体細胞を培養
し、培養物から目的物を回収することからなるプ
ラスミノーゲン賦活体（p.a.）の製造に関する。 用いられる好適な細胞株はIMR−90で、これ
はW.W.ニコルス（Nichols）（1977）によつて16
週令女性胎児の肺から得られたヒト二倍体線維芽
細胞株である。該細胞はATCC（CCL186、第７
継代培養）から入手した。IMR−90、WI−38、
HEL−299のいずれについてもp.a.を著量生産す
るという報告はない。本研究では、それらは最初
非生産株と考えられていたが、馬血清を含む培地
で培養し、次いで他の栄養培地で培養することに
よりそれらの細胞をp.a.の著量生産株に変えるこ
とができることを見出した。 ATCCから入手したIMR−90を解かし、
ATCCが勧める10％FCS含有培地に植えた。一継
代培養後細胞をLH培地に移し、酵素含量を測定
した。その結果p.a.の生成が僅かに（４日後５単
位／ml以下）認められた。 FCSで二継代培養後、IMR−90細胞を10％HS
含有培地で二次培養した。この培地で四継代培養
（約12分裂）後、細胞をLHに移した。その第１
図の結果は、細胞が非常に高いp.a.生産株になつ
たことを示している。該酵素は急速に生産され、
溶液中の濃度は約100単位／mlに達した。 次いで同じ細胞をHSで連続的に二次培養し、
p.a.生産を時おり調べた。第１表の結果はp.a.生
産能力が、細胞に老令のきざし、つまり緩慢な分
裂と増殖停止（flattening）が見えはじめるまで
保持されたことを示している。 これは65−70分裂に相当するとみられる22−24
継代後も観察された。
【表】
【表】
細胞をHS培地で標準操作によつて連続的に二
次培養した。p.a.生産量を測るために、細胞をト
リプシン消化後HS培地にプレート移植し（２×
105細胞、30mmプレート、1.5ml培地）、24時間後
に培地をLHに変えた。LH移植してから96時間
後に培地の一部で活性を測定した。プラスミノー
ゲンなしのプレートで行なつた空試験は陰性であ
つた。 第７継代後凍結したIMR−90を解かし
DMEM／FCSで２継代（第８および第９継代）
培養した。 最初の実験は第９継代後に凍結し液体窒素中に
保存した細胞で行なつた。細胞を解かし、
DMEM／FCSで２継代、次いでDMEM／HSで
継代培養した。 ＊ 第８継代からつけた継代番号。 ＊＊ 0.5×105細胞 特殊な非再生産性変異によるp.a.生産の可能性
を除くために、第９継代後凍結した細胞から実験
を繰返した。その結果、p.a.生産能力は再現され
ることがわかつた。 ある一定の条件下では、上記線維芽細胞株は血
清の存在下一定基質で培養することによりp.a.を
生産するように調整することができる。下記の
種々化合物で前もつて被覆した培養容器を用い種
種の血清で細胞を増殖させ、p.a.生産能力の発現
を追跡した。培地中のp.a.量は、血清とマトリツ
クスの両者によつて変化することが見出された。
ポリ−Ｄ−リジンで被覆した容器で得られた結果
（第４表）は、細胞が通常は酵素生産に貢献しな
いようなFCSのような培地中でもこのマトリツク
ス上ではp.a.を生産するように適応できることを
示している。
次培養した。p.a.生産量を測るために、細胞をト
リプシン消化後HS培地にプレート移植し（２×
105細胞、30mmプレート、1.5ml培地）、24時間後
に培地をLHに変えた。LH移植してから96時間
後に培地の一部で活性を測定した。プラスミノー
ゲンなしのプレートで行なつた空試験は陰性であ
つた。 第７継代後凍結したIMR−90を解かし
DMEM／FCSで２継代（第８および第９継代）
培養した。 最初の実験は第９継代後に凍結し液体窒素中に
保存した細胞で行なつた。細胞を解かし、
DMEM／FCSで２継代、次いでDMEM／HSで
継代培養した。 ＊ 第８継代からつけた継代番号。 ＊＊ 0.5×105細胞 特殊な非再生産性変異によるp.a.生産の可能性
を除くために、第９継代後凍結した細胞から実験
を繰返した。その結果、p.a.生産能力は再現され
ることがわかつた。 ある一定の条件下では、上記線維芽細胞株は血
清の存在下一定基質で培養することによりp.a.を
生産するように調整することができる。下記の
種々化合物で前もつて被覆した培養容器を用い種
種の血清で細胞を増殖させ、p.a.生産能力の発現
を追跡した。培地中のp.a.量は、血清とマトリツ
クスの両者によつて変化することが見出された。
ポリ−Ｄ−リジンで被覆した容器で得られた結果
（第４表）は、細胞が通常は酵素生産に貢献しな
いようなFCSのような培地中でもこのマトリツク
ス上ではp.a.を生産するように適応できることを
示している。
【表】
一度適応すると、これら細胞は上記のごとく無
血清培地中で酵素生産を続けた。その調整細胞は
生産手段に使われる。 上記観察に従つて、生産をある程度詳細に特定
した。これらの実験では、細胞をHS含有培地に
増殖させ、LH含有培地に移し、培地中のp.a.量
を追跡した。 第２図に要約した結果は、初期継代の細胞で
は、培地中の酵素濃度の上限は約100単位／mlに
達したことを示している。この上限は後期継代細
胞では増加する。非常に古い細胞では、培地中の
酵素濃度が300単位／mlに達しても酵素生産は止
まらなかつた。 これらの結果は、培地中のp.a.量がp.a.形成と
なんらかの負要因によつて決められていることを
強く示唆している。負要因としては、酵素合成あ
るいは分泌に及ぼす抑制型フイードバツクまた
は、酵素を阻害するかその崩壊を触媒する他の細
胞産物の生成があげられる。HS含有培地での細
胞の繰返し継代培養はこの負抑制を減じ、その結
果培地中に高酵素活性の増強をもたらすと考えら
れる。 100単位／mlの活性は約１mg／の酵素濃度に
相当するので、上記実験での生産量は１−３mg／
の割である。 採取および精製 細胞により生産されたp.a.はウロキナーゼを吸
着することが知られている吸着剤を用いる培養物
からの吸着、膜を用いる濃縮、または両者の併用
により採取できる。以下に２つの方法を例示す
る。 １ 吸着 p.a.を含むLH培地を細砕シリカで処理した。
即ち、溶液１ml当り１−２mgの固体を加え、１
時間混合した。ついで固体を遠心分離で回収し
た。上清は最初に存在したp.a.の５％以下を含
んでおり、下記のとおり再使用した。 固体の分析の結果、p.a.は塩基、とくにアン
モニア、有機アミンおよび重合アミンの処理で
シリカから定量的に遊離し、得られたp.a.の溶
液はこの分野で用いられる種々の方法によつて
更に精製することができた。 ２ 透析濃縮 p.a.を含むLH培地を透析袋に移し、吸水性
物質を外側に置いた。酵素は10−20倍に濃縮さ
れ、75％以上の総回収率であつた。 p.a.における培地置換効果 IMR−90によるp.a.生産の経時変化と他の細胞
で以前に観察された経時変化の類似点を考慮し
て、培地の繰返し置換による効果を調べた。先に
見られたように、第２図の如く、IMR−90の培
養時に酵素濃度が高くなると酵素生成速度が減ず
るが、この減速は潅水により大巾に解消される。
潅水は明らかに上述した負のフイードバツク調節
機構を妨げる。 第３図の結果は、培地に著量の酵素が蓄積して
いるときは培地置換がp.a.生成に影響を及ぼす
が、p.a.の初期生産には影響しないことを示して
いる。この事はFCS培地で増殖した細胞をLHに
移して行なつた実験（第４図）により証明され
た。これらの細胞はp.a.を非常に緩慢に生産する
ので培地中の濃度は低く、p.a.生成は培地置換に
よつて影響されなかつた。 培地の経費は重要な経済的要因であると思われ
るので、培地循環の可能性を調べる実験を行なつ
た。使用した培地をシリカで処理してp.a.を除
き、新鮮培地と１：１に希釈して戻した。シリカ
の処理で90％以上のp.a.が培地から除かれること
がわかつた。第５図の結果は培地の反復使用が可
能であることを示している。事実、循環した培地
を用いた場合の方が、新鮮培地を潅水した場合よ
りも、多量のp.a.が生産されることが観察され
た。 上記実験のp.a.生産に用いられた培地は、p.a.
に関する実験で通常用いられるものと同様、ラク
トアルブミンを加水分解物を含んでいる。しかし
動植物由来蛋白質の加水分解物で、微生物増殖の
基質として用いられる種々のペプトンを用いても
p.a.が生産されることがわかつた。結果の一例を
第５表に示す。
血清培地中で酵素生産を続けた。その調整細胞は
生産手段に使われる。 上記観察に従つて、生産をある程度詳細に特定
した。これらの実験では、細胞をHS含有培地に
増殖させ、LH含有培地に移し、培地中のp.a.量
を追跡した。 第２図に要約した結果は、初期継代の細胞で
は、培地中の酵素濃度の上限は約100単位／mlに
達したことを示している。この上限は後期継代細
胞では増加する。非常に古い細胞では、培地中の
酵素濃度が300単位／mlに達しても酵素生産は止
まらなかつた。 これらの結果は、培地中のp.a.量がp.a.形成と
なんらかの負要因によつて決められていることを
強く示唆している。負要因としては、酵素合成あ
るいは分泌に及ぼす抑制型フイードバツクまた
は、酵素を阻害するかその崩壊を触媒する他の細
胞産物の生成があげられる。HS含有培地での細
胞の繰返し継代培養はこの負抑制を減じ、その結
果培地中に高酵素活性の増強をもたらすと考えら
れる。 100単位／mlの活性は約１mg／の酵素濃度に
相当するので、上記実験での生産量は１−３mg／
の割である。 採取および精製 細胞により生産されたp.a.はウロキナーゼを吸
着することが知られている吸着剤を用いる培養物
からの吸着、膜を用いる濃縮、または両者の併用
により採取できる。以下に２つの方法を例示す
る。 １ 吸着 p.a.を含むLH培地を細砕シリカで処理した。
即ち、溶液１ml当り１−２mgの固体を加え、１
時間混合した。ついで固体を遠心分離で回収し
た。上清は最初に存在したp.a.の５％以下を含
んでおり、下記のとおり再使用した。 固体の分析の結果、p.a.は塩基、とくにアン
モニア、有機アミンおよび重合アミンの処理で
シリカから定量的に遊離し、得られたp.a.の溶
液はこの分野で用いられる種々の方法によつて
更に精製することができた。 ２ 透析濃縮 p.a.を含むLH培地を透析袋に移し、吸水性
物質を外側に置いた。酵素は10−20倍に濃縮さ
れ、75％以上の総回収率であつた。 p.a.における培地置換効果 IMR−90によるp.a.生産の経時変化と他の細胞
で以前に観察された経時変化の類似点を考慮し
て、培地の繰返し置換による効果を調べた。先に
見られたように、第２図の如く、IMR−90の培
養時に酵素濃度が高くなると酵素生成速度が減ず
るが、この減速は潅水により大巾に解消される。
潅水は明らかに上述した負のフイードバツク調節
機構を妨げる。 第３図の結果は、培地に著量の酵素が蓄積して
いるときは培地置換がp.a.生成に影響を及ぼす
が、p.a.の初期生産には影響しないことを示して
いる。この事はFCS培地で増殖した細胞をLHに
移して行なつた実験（第４図）により証明され
た。これらの細胞はp.a.を非常に緩慢に生産する
ので培地中の濃度は低く、p.a.生成は培地置換に
よつて影響されなかつた。 培地の経費は重要な経済的要因であると思われ
るので、培地循環の可能性を調べる実験を行なつ
た。使用した培地をシリカで処理してp.a.を除
き、新鮮培地と１：１に希釈して戻した。シリカ
の処理で90％以上のp.a.が培地から除かれること
がわかつた。第５図の結果は培地の反復使用が可
能であることを示している。事実、循環した培地
を用いた場合の方が、新鮮培地を潅水した場合よ
りも、多量のp.a.が生産されることが観察され
た。 上記実験のp.a.生産に用いられた培地は、p.a.
に関する実験で通常用いられるものと同様、ラク
トアルブミンを加水分解物を含んでいる。しかし
動植物由来蛋白質の加水分解物で、微生物増殖の
基質として用いられる種々のペプトンを用いても
p.a.が生産されることがわかつた。結果の一例を
第５表に示す。
【表】
細胞を10％HSを加えた培地に105細胞／30mm皿
の割でプレート移植し、48時間後に培地を表示し
たペプトンを含む新鮮培地に替えた。培地中のp.
a.を24時間後に分析した。 ラクトアルブミン加水分解物 0.5％バイオ・
ラブ、イスラエル（Bio−lab、Israel） カゼイン加水分解物 ２％ギブコ、米国
（Gibco、USA） D.M.ペプトン 0.5％サイエンテイフイツク・
プロテイン・レイバー社（Scientific Protein
Labor.Inc.） トリプトース燐酸ブロス 0.5％デイフコ
（Difco） プレマトン−Ｋ 0.5％フムコ・シエフイール
ド・ケミカルス（Humko Sheffield Chemicals） IMR−90細胞の培養 １ 標準操作 細胞を常法どおり、フアルコン（Falcon）
90mmプラスチツクプレートを用いDMEMとＦ
−12との１対１（容積比）混合培地で培養し、
米国ギブコ（Gibco USA）製の胎児子牛血清
または馬血清を10％の濃度になるように加え
た。各プレートは５×105細胞と７mlの培地で
種培養した。プレート当り約８×106細胞にな
つた３−５日目に集密状態（confluence）達し
た。細胞を継代培養するために0.25％トリプシ
ン溶液（バイオラブ、エルサレム）でトリプシ
ン消化した。トリプシン溶液（２−３ml）をプ
レートに加え、１分後に室温でトリプシン溶液
の大部分を吸い出すと、細胞は溶液の薄膜で覆
われた状態で残つた。15−20分後に、少量の新
鮮培地を加え、細胞と混合しピペツトを用いて
数回にわたり細胞の懸濁液を得た。次いで各プ
レートに新鮮培地（５ml）を加え、一部を細胞
数計測および再移植のために取り出した。 また、他の大きさのプレート、または他の細
胞培養用容器を用い、上記の表面積対細胞の割
合で、同じ一般的手法に従つて細胞の培養を行
つた。 ２ IMR−90の付着および増殖に及ぼす基質の
効果 種々の基質および被覆物上でのIMR−90の
培養の検討を行なつた。移植効率および増殖に
関する併合効果を得るために、細胞をプレート
移植し、種々の基質上に４日間増殖させた。 第２、３表の結果は、プレートの被覆により
培養が改善できることを示している。最も単純
で効果的な被覆物はゼラチンである。さらに、
ゼラチン被覆はまたゲルボンド（Gelbond）の
ような他の表面での増殖をも可能にする。
の割でプレート移植し、48時間後に培地を表示し
たペプトンを含む新鮮培地に替えた。培地中のp.
a.を24時間後に分析した。 ラクトアルブミン加水分解物 0.5％バイオ・
ラブ、イスラエル（Bio−lab、Israel） カゼイン加水分解物 ２％ギブコ、米国
（Gibco、USA） D.M.ペプトン 0.5％サイエンテイフイツク・
プロテイン・レイバー社（Scientific Protein
Labor.Inc.） トリプトース燐酸ブロス 0.5％デイフコ
（Difco） プレマトン−Ｋ 0.5％フムコ・シエフイール
ド・ケミカルス（Humko Sheffield Chemicals） IMR−90細胞の培養 １ 標準操作 細胞を常法どおり、フアルコン（Falcon）
90mmプラスチツクプレートを用いDMEMとＦ
−12との１対１（容積比）混合培地で培養し、
米国ギブコ（Gibco USA）製の胎児子牛血清
または馬血清を10％の濃度になるように加え
た。各プレートは５×105細胞と７mlの培地で
種培養した。プレート当り約８×106細胞にな
つた３−５日目に集密状態（confluence）達し
た。細胞を継代培養するために0.25％トリプシ
ン溶液（バイオラブ、エルサレム）でトリプシ
ン消化した。トリプシン溶液（２−３ml）をプ
レートに加え、１分後に室温でトリプシン溶液
の大部分を吸い出すと、細胞は溶液の薄膜で覆
われた状態で残つた。15−20分後に、少量の新
鮮培地を加え、細胞と混合しピペツトを用いて
数回にわたり細胞の懸濁液を得た。次いで各プ
レートに新鮮培地（５ml）を加え、一部を細胞
数計測および再移植のために取り出した。 また、他の大きさのプレート、または他の細
胞培養用容器を用い、上記の表面積対細胞の割
合で、同じ一般的手法に従つて細胞の培養を行
つた。 ２ IMR−90の付着および増殖に及ぼす基質の
効果 種々の基質および被覆物上でのIMR−90の
培養の検討を行なつた。移植効率および増殖に
関する併合効果を得るために、細胞をプレート
移植し、種々の基質上に４日間増殖させた。 第２、３表の結果は、プレートの被覆により
培養が改善できることを示している。最も単純
で効果的な被覆物はゼラチンである。さらに、
ゼラチン被覆はまたゲルボンド（Gelbond）の
ような他の表面での増殖をも可能にする。
【表】
実験は30mmプレート上で、1.5mlHS培地を用
い１×105細胞から行なつた。ゲルボンドを用
いる実験では、円形フイルムを作りプレートの
底を覆つた。ゼラチンは0.03％水性溶液として
使用し、20分間プレートに存在させて、吸引で
除いた。 96時間増殖の後、細胞をトリプシン消化で分
離し、細胞数を数えた。 ＊ ゲルボンド（Gelbond）はポリエステル
薄膜の商品名（マリン・バイオカロイズ、
Marin Biocaloids）である。膜の片側は親水
性になつており、実験にはそちら側を用いた。
どのような方法で親水性にしたかは明らかでな
いが、アルカリを用いたものと思われる。
い１×105細胞から行なつた。ゲルボンドを用
いる実験では、円形フイルムを作りプレートの
底を覆つた。ゼラチンは0.03％水性溶液として
使用し、20分間プレートに存在させて、吸引で
除いた。 96時間増殖の後、細胞をトリプシン消化で分
離し、細胞数を数えた。 ＊ ゲルボンド（Gelbond）はポリエステル
薄膜の商品名（マリン・バイオカロイズ、
Marin Biocaloids）である。膜の片側は親水
性になつており、実験にはそちら側を用いた。
どのような方法で親水性にしたかは明らかでな
いが、アルカリを用いたものと思われる。
【表】
異なる細胞群を使い、2.6×104細胞を30mmの
プレートに植える以外は、実験の詳細は第２表
と同様である。プレートはプロタミン硫酸また
はポリ−Ｄ−リジン（0.1mg／ml）で処理した。 ５分間インキユベートした後、プレートを殺
菌水で２度、培地で１度洗い、細胞をプレート
移植した。 細胞マトリツクスはCCL6細胞（ヒト腸、上
皮）を単層増殖させ、0.5％トリトンＸ−100−
水で処理して調整した。10分間インキユベート
した後プレートをPBSで２度、培地で１度洗
つた。この段階でプレートは細胞をプレート移
植できる状態になる。 単 位 酵素活性はCTA単位で表わされる。 酵素分析はNIH（米国）から入手した標準ウロ
キナーゼで検定した線維素プレート法（fibrin
plate method）によつて行なつた。 p.a.生産に使用後の細胞の特徴 上記のごとくp.a.生産に適応させたIMR−90の
核型分析を行なつた。染色体の通常の補体（2N
＝46）は親の細胞株で報告されているのと同じ実
験結果を示した。12日間LH培地でp.a.の生産に
使われた細胞を10％FCS含有生育培地に移し、上
記標準条件で増殖させた。細胞を１ケ月追跡した
ところ、生育速度、集密（confludnce）時の細胞
濃度および細胞の形態的外観は親のIMR−90と
同じであつた。p.a.生産もまた通常細胞の程度に
下つていた。 WI−38、HEL−299などの細胞株の細胞でも
同様の結果が得られるので、本発明は、またそれ
ら細胞株によるp.a.の生産にも拡げられる。
プレートに植える以外は、実験の詳細は第２表
と同様である。プレートはプロタミン硫酸また
はポリ−Ｄ−リジン（0.1mg／ml）で処理した。 ５分間インキユベートした後、プレートを殺
菌水で２度、培地で１度洗い、細胞をプレート
移植した。 細胞マトリツクスはCCL6細胞（ヒト腸、上
皮）を単層増殖させ、0.5％トリトンＸ−100−
水で処理して調整した。10分間インキユベート
した後プレートをPBSで２度、培地で１度洗
つた。この段階でプレートは細胞をプレート移
植できる状態になる。 単 位 酵素活性はCTA単位で表わされる。 酵素分析はNIH（米国）から入手した標準ウロ
キナーゼで検定した線維素プレート法（fibrin
plate method）によつて行なつた。 p.a.生産に使用後の細胞の特徴 上記のごとくp.a.生産に適応させたIMR−90の
核型分析を行なつた。染色体の通常の補体（2N
＝46）は親の細胞株で報告されているのと同じ実
験結果を示した。12日間LH培地でp.a.の生産に
使われた細胞を10％FCS含有生育培地に移し、上
記標準条件で増殖させた。細胞を１ケ月追跡した
ところ、生育速度、集密（confludnce）時の細胞
濃度および細胞の形態的外観は親のIMR−90と
同じであつた。p.a.生産もまた通常細胞の程度に
下つていた。 WI−38、HEL−299などの細胞株の細胞でも
同様の結果が得られるので、本発明は、またそれ
ら細胞株によるp.a.の生産にも拡げられる。
第１図は、HS培地で増殖したIMR−90細胞に
よるp.a.の生産を示す。細胞は馬血清（HS）含
有培地で継代第８番以後４継代増殖させた。第２
図は、DMEM／HSで種々の時間培養したIMR
−90によるp.a.生産の経時変化を示す。継代番号
12（セツト−１）、継代番号15（セツト−１）、継代
番号20（セツト−１）、継代番号14（セツト−２）、
継代番号20（セツト−２）。第３図は、HS培地で
増殖したIMR−90細胞によるp.a.生産における培
地置換の効果を示す。15継代（HS中６継代）後
のIMR−90細胞を2.5mlのHS培地を含む60mmペト
リ皿に１×105の割でプレート移植した。24時間
後に培地をLHに変えた。矢印で示した時間に、
培地の半量または全量を各プレートから採取し、
新鮮LH培地と置換した。対照のプレートで100μ
の培地をp.a.分析の為に採取し、新鮮LH培地
と置換した。〇は全培地置換、△は半培地置換、
●は無培地置換を示す。第４図は、FCS培地で増
殖したIMR−90細胞によるp.a.生産における培地
置換の効果を示す。FCSで９継代後のIMR−９
細胞をFCS含有培地２mlを含む16.4mmのウエルに
プレート移植した（５×104）。24時間後に培地を
LHを含むものに替えて実験を続行した。〇は全
培地置換、△は半培地置換、●は無培地置換を示
す。第５図は、IMR−90細胞によるp.a.の連続生
産を示す。23継代（HS培地で13継代）後のIMR
−90細胞２×105をHS含有培地2.5mlを含む60mm
ペトリ皿にプレート移植した。24時間後培地を
LHに替え、その後矢印で示した時間に替えた。
グループ１では各プレートの培地半分を採取し、
新鮮LH培地で置換した。グループ２では全培地
を採取した。1.25mlの新鮮LH培地を細胞に加え
た。採取した培地はp.a.を吸着する為にシリカで
処理し、この培地1.25mlをグループ２の各プレー
トに返した。p.a.活性を各時点一部の培地で測定
した。 ●はグループ１、〇はグループ２を示す。
よるp.a.の生産を示す。細胞は馬血清（HS）含
有培地で継代第８番以後４継代増殖させた。第２
図は、DMEM／HSで種々の時間培養したIMR
−90によるp.a.生産の経時変化を示す。継代番号
12（セツト−１）、継代番号15（セツト−１）、継代
番号20（セツト−１）、継代番号14（セツト−２）、
継代番号20（セツト−２）。第３図は、HS培地で
増殖したIMR−90細胞によるp.a.生産における培
地置換の効果を示す。15継代（HS中６継代）後
のIMR−90細胞を2.5mlのHS培地を含む60mmペト
リ皿に１×105の割でプレート移植した。24時間
後に培地をLHに変えた。矢印で示した時間に、
培地の半量または全量を各プレートから採取し、
新鮮LH培地と置換した。対照のプレートで100μ
の培地をp.a.分析の為に採取し、新鮮LH培地
と置換した。〇は全培地置換、△は半培地置換、
●は無培地置換を示す。第４図は、FCS培地で増
殖したIMR−90細胞によるp.a.生産における培地
置換の効果を示す。FCSで９継代後のIMR−９
細胞をFCS含有培地２mlを含む16.4mmのウエルに
プレート移植した（５×104）。24時間後に培地を
LHを含むものに替えて実験を続行した。〇は全
培地置換、△は半培地置換、●は無培地置換を示
す。第５図は、IMR−90細胞によるp.a.の連続生
産を示す。23継代（HS培地で13継代）後のIMR
−90細胞２×105をHS含有培地2.5mlを含む60mm
ペトリ皿にプレート移植した。24時間後培地を
LHに替え、その後矢印で示した時間に替えた。
グループ１では各プレートの培地半分を採取し、
新鮮LH培地で置換した。グループ２では全培地
を採取した。1.25mlの新鮮LH培地を細胞に加え
た。採取した培地はp.a.を吸着する為にシリカで
処理し、この培地1.25mlをグループ２の各プレー
トに返した。p.a.活性を各時点一部の培地で測定
した。 ●はグループ１、〇はグループ２を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 馬血清、新生子牛血清、犬血清、山羊血清又
は幼鶏血清含有培地中多継代培養のため、ポリ−
Ｄ−リジン、ゼラチン又は細胞マトリツクスで被
覆した表面上で二倍体線維芽細胞株を３〜12日間
培養し、ついでカゼイン加水分解物、D.M.ペプ
トントリプトースリン酸塩ブロス、プレマトン−
Ｋ又は他の市販同等物から選んだペプトン含有培
地でこの調整細胞を培養してプラスミノーゲン賦
活体（p.a.）を得、それを培地から採取すること
を特徴とする、p.a.の製造法。 ２ 生産されたp.a.を潅流によつて培養物から連
続的に取り除く、特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ３ p.a.をシリカ上に吸着させ、塩基と接触させ
て脱離させ、次いで常法により精製する、特許請
求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４ 培地をp.a.除去後再循環させる、特許請求の
範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL63317 | 1981-07-15 | ||
| IL63317A IL63317A (en) | 1981-07-15 | 1981-07-15 | Production of plasminogen activator |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5865219A JPS5865219A (ja) | 1983-04-18 |
| JPH0137115B2 true JPH0137115B2 (ja) | 1989-08-04 |
Family
ID=11052764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57122799A Granted JPS5865219A (ja) | 1981-07-15 | 1982-07-14 | プラスミノ−ゲン賦活体の製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5865219A (ja) |
| DE (1) | DE3226320A1 (ja) |
| FR (1) | FR2510604B1 (ja) |
| GB (1) | GB2104081B (ja) |
| IL (1) | IL63317A (ja) |
| IT (1) | IT1195939B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5951220A (ja) * | 1982-08-02 | 1984-03-24 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 |
| JPS60158115A (ja) * | 1984-01-30 | 1985-08-19 | Meiji Milk Prod Co Ltd | プラズミノーゲンアクチベーターの製造法 |
| JPS60259187A (ja) * | 1984-04-19 | 1985-12-21 | マイルス・ラボラトリ−ス・インコ−ポレ−テツド | プラスミノーゲン活性化因子を増収する方法 |
| US4550080A (en) * | 1984-06-05 | 1985-10-29 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for the preparation of a plasminogen activator |
| EP0163751B1 (en) * | 1984-06-05 | 1989-09-20 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for the preparation of a plasminogen activator |
| US5210037A (en) * | 1988-03-22 | 1993-05-11 | Centocor Incorporated | Method to enhance TPA production |
| AU3364589A (en) * | 1988-03-22 | 1989-10-16 | Invitron Corporation | Method to enhance tpa production |
| DE4128953A1 (de) * | 1991-08-30 | 1993-03-04 | Basf Ag | Verfahren zur kultivierung von saeugerzellen im fliessbettreaktor |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4232124A (en) * | 1979-04-23 | 1980-11-04 | Mann George F | Method of producing plasminogen activator |
| JPS55144887A (en) * | 1979-04-26 | 1980-11-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Preparation of physiologically active substance |
-
1981
- 1981-07-15 IL IL63317A patent/IL63317A/xx unknown
-
1982
- 1982-07-06 GB GB08219498A patent/GB2104081B/en not_active Expired
- 1982-07-13 FR FR8212251A patent/FR2510604B1/fr not_active Expired
- 1982-07-14 JP JP57122799A patent/JPS5865219A/ja active Granted
- 1982-07-14 DE DE19823226320 patent/DE3226320A1/de active Granted
- 1982-07-14 IT IT22392/82A patent/IT1195939B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8222392A0 (it) | 1982-07-14 |
| IT1195939B (it) | 1988-11-03 |
| FR2510604B1 (fr) | 1985-07-12 |
| JPS5865219A (ja) | 1983-04-18 |
| GB2104081A (en) | 1983-03-02 |
| GB2104081B (en) | 1985-06-12 |
| IL63317A0 (en) | 1981-10-30 |
| FR2510604A1 (fr) | 1983-02-04 |
| IL63317A (en) | 1985-05-31 |
| DE3226320A1 (de) | 1983-02-10 |
| IT8222392A1 (it) | 1984-01-14 |
| DE3226320C2 (ja) | 1989-08-17 |
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