JPH0138474B2 - - Google Patents
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- JPH0138474B2 JPH0138474B2 JP55009888A JP988880A JPH0138474B2 JP H0138474 B2 JPH0138474 B2 JP H0138474B2 JP 55009888 A JP55009888 A JP 55009888A JP 988880 A JP988880 A JP 988880A JP H0138474 B2 JPH0138474 B2 JP H0138474B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は固定化グルコースイソメラーゼ系に関
する。 グルコースイソメラーゼはグルコース（デキス
トロース）をレブロース（フルクトース）に変換
する酵素の一般名である。グルコースイソメラー
ゼは、微生物の生産物として発見されたので、グ
ルコースからレブロース含有シロツプを工業的に
大規模に製造することは、主要な商業的方法にな
つている。 レブロース含有シロツプは、グルコースイソメ
ラーゼを含有する細胞を使用する回分式システム
で製造されうるが、回分法に対立するものとして
連続法を容易にするので固定化酵素が好ましい。
かくして、グルコースイソメラーゼを各種担体上
に固定する方法が提案され、そして先行技術とし
て記載されている。 例えば、グルコースイソメラーゼをある種の無
機担体上に固定化することは、米国特許第
3556945号および第3992329号各明細書に記載され
ている。 グルコースイソメラーゼのための担体としてセ
ルロース誘導体および合成樹脂を使用することも
また文献に記載されている。すなわち、米国特許
第3909354号明細書には、陰イオン交換セルロー
スまたは合成陰イオン交換樹脂のいずれかに結合
されたグルコースイソメラーゼを使用してグルコ
ースをレブロースに変換することが記載されてい
る。米国特許第4078970号明細書には、デキスト
ロース水溶液法に従つて測定して4.5％以上の微
孔およびポリアニオン塩分解法に従つて測定して
0.035meq／ml樹脂以上のイオン交換容量を有す
る陰イオン交換樹脂上に吸着され結合されたグル
コースイソメラーゼが開示されている。これらの
樹脂は、触媒として過酸化ベンゾイルを使用し、
水中でスチレン、ジビニルベンゼン、ポリスチレ
ンおよびトルエンを懸濁重合し、ついでクロルメ
チル化および陰イオン交換基の導入を行なうこと
によつて製造される。特開昭49−80160号公報に
は、特定のポリフエノール樹脂上にグルコースイ
ソメラーゼを固定化することが記載され、一方特
公昭48−56770号公報には、ポリスチレン、ポリ
フエノール、アルキレン、ポリアミンおよび脂肪
族アミンのイオン交換樹脂に酵素を結合するため
にトリアジン誘導体を使用することが記載されて
いる。ベルギー国特許第862765号明細書には、イ
オン特性を有しない巨大孔酵素担体が記載されて
いる。 グルコースイソメラーゼのためのすでに記載さ
れた担体の多くは、レブロース含有シロツプを生
産する作用があるが、それらはある種の欠点を有
する。例えば、いくつかの担体は、酵素活性が劣
つたものとなる結果を生じ、一方他の担体は、供
給量を低くする必要がある。更に、これらの担体
の多くは、高価であり、いくつかのものは再生
し、数回再使用しなければならず、このことは製
造コストを増大させることになる。 先行技術において知られている酵素担体が極め
て多いにもかかわらず、特定のポロシテイー
（porosity）分布および水による膨潤能力を有す
るフエノール樹脂は、特定のグルコースイソメラ
ーゼのための担体として使用された場合、驚くべ
き予想外の性質を有することが発見された。 更に詳細にいえば、本発明はストレプトマイセ
ス・オリボクロモゲネス（Streptomyces
olivochromogenes）ATCC Nos.21114；21713
（微工研菌寄第1602号）；21714（微工研菌寄第1603
号）または21715（微工研菌寄第1604号）から誘導
されたグルコースイソメラーゼを含む固定化グル
コースイソメラーゼ系に関するものである。寄託
された菌株ATCC Nos21713；21714および21715
は、ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス
ATCC No.21114の変異菌体である。グルコース
イソメラーゼは、ATCC No.21715の微生物の変
異菌株から誘導することもできる。ATCC No.
21715微生物またはその変異株から誘導される市
販のグルコースイソメラーゼは、CPC・インタ
ーナシヨナル・インコーポレーテツド（CPC
International Inc.、International Plaza、
Englewood Cliffs、New Jersey、U.S.A）から
Ｇ−993の商品名で市販されている。このグルコ
ースイソメラーゼは、微孔の少くとも30％が約30
ないし約250Åの半径を有する約30Å以上の微孔
の範囲内において１ｇ当り約40ないし約200m2の
全表面積を有する多孔性のフエノール樹脂上に固
定化されたものであり、この系は担体１ml当り
500単位の酵素負荷が提供されたときに少くとも
90％の結合効率を有するかまたは担体１ml当り
1000単位の酵素負担が提供されたときに少くとも
80％の結合効率を有し、そして少くとも10日の異
性化中の酵素半減期を有する。 本発明は、グルコースイソメラーゼに対する高
い結合能力、高い流量、長いカラム寿命および低
い酵素消費量をもたらし、従つて経済的な工業的
方法において使用するのに極めて魅力的なものと
する単一使用システムを目ざすものである。 更に詳しくは、特許請求の範囲に記載した多孔
性フエノール樹脂の担体は、図面の曲線１に類似
したポロシテイ分布をもつ。この曲線は、水銀細
孔測定法により細孔の大きさと容積を測定し、細
孔に集められる容積と半径との間の関係を表わす
積分曲線を描き、この積分曲線を微分して更に説
明的な、細孔の半径の微分増加に対応する細孔の
容積の増加を表わす微分分布曲線を得ることによ
つて得た。この測定の詳細な説明は、表面積の測
定の説明と一緒に、「アドソープシヨン・オン・
ソリツズ」（“Adsorption On Solids”）、ブイ・
ポネツク等、バターワーズ（Butterworths）、
1974、頁38〜39、540〜545及び552〜555に記載さ
れている。ここで明らかにした表面積とポロシテ
イをもつどんなフエノール樹脂も本発明の実施に
使用し得るが、陰イオン交換能力をもつ樹脂を使
用するのが好ましい。有用なことがわかつた特別
の樹脂は、デユオライトES−562及びデユオライ
トES−568である。これらはダイアモンド・シヤ
ムロツク（Diamond Shamrock）社から入手し
得るフエノール−ホルムアルデヒド樹脂である。 本発明の実施に使用する特別のグルコースイソ
メラーゼ酵素はストレプトマイセス・オリボクロ
モゲネス（Streptomyces olivochromogenes）
ATCC 第21114号；第21713号；第21714号又は
第21715号から得られる。寄託された株ATCC第
21713号；第21714号及び第21715号は、ストレプ
トマイセス・オリボクロモゲネスATCC第21114
号の突然変位異株（mutant strains）である。グ
ルコースイソメラーゼは、またATCC第21715号
の微生物の突然変異株から得ることもできる。こ
の明細書で先に指摘したように、ATCC第21715
号の微生物又はそれの突然変異株から得られる商
業上入手し得るグルコースイソメラーゼは、アメ
リカ合衆国、ニユー・ジヤージー州、エングルウ
ツド・クリフス、インターナシヨナル・プラザ、
シー・ピー・シー・インターナシヨナル・インコ
ーポレイテツドがＧ−993という名で売つている。
液体の酵素濃縮物は、米国特許第4077842号に記
載されている方法で製造される。酵素の活性につ
いては、１単位と（Ｕという）を、次の効力検定
法を使用し、標準化した一セツトの条件の下でグ
ルコース溶液から生じたケトースを分光光度定量
で調べた場合に、0.01モルのMgCl2及び0.01モル
のCoCl2の存在下でPH7.5且つ60℃で0.1モルのグ
ルコースの溶液中で毎分１ミクロモルのレブロー
スを生じる酵素の量と定義する。 ストツク液は、次の様に調製される： 効力検定用ストツク液成分 量 0.01M MgCl2 １ml 0.001M CoCl2 １ml 1.0Mの燐酸塩緩衝液、PH7.5 0.5ml 無水Ｄ−グルコース 1.44ｇ 蒸留水 7.5mlの全量に調整する。 効力検定すべき酵素製剤を、先ず1U／mlから
6U／mlまで含むように希釈する。 酵素による異性化は１mlの酵素製剤を３mlのス
トツク液に加え、30分間60℃に保温することによ
り行う。保温期間の終りに、１mlの部分試料をと
つて９mlの量の0.5Nの過塩素酸中で急冷させる。
急冷させた部分試料を次に250mlの全量に希釈す
る。対照として、比較のために、保温期間の初め
に、溶液の形の１mlの酵素製剤の代りに１mlの水
を使用してグルコースブランク試験を行う。次に
ケトースをシステイン−硫酸法で測定する。この
効力検定のために1Uを、上記の異性化の条件で
毎分１ミクロモルのレブロースを生じるのに必要
な酵素の活性の量と定義する。 本発明の固定化した系を製造するのには、多孔
性フエノール樹脂を、乾燥した樹脂の担体１ml当
り大体100単位と1000単位の間の酵素溶液から成
るグルコースイソメラーゼ溶液と混合する。酵素
製剤は非常に濃縮されていて酵素溶液１ml当り約
1000単位から約2500単位まで含んでいるのが好ま
しい。多孔性樹脂を先ず、好ましくは脱塩水で洗
う。次に樹脂を、PHが7.0と9.0の間、好ましくは
7.5と8.5の間になるように処理する。8.2に接近し
た製品のPHを得るための最終のPH調節に先だつて
苛性ソーダ洗浄工程をとり入れるのが好ましく、
このようにしてレブロースへの変換を最高にする
ことができる。希望したPHが得られた後、酵素吸
着処理を酵素溶液の濃度等のフアクターに応じて
少なくとも20時間行う。PHが希望した範囲内に確
実に止まつているように最終の洗浄をこの時に行
うことができる。一旦酵素が固定化されれば、生
じた系は直ちに使用することができ、又は水もし
くは例えばしめつた系の中に使用する時まで貯蔵
することができる。 使用するときには系を澱粉加水分解物の溶液と
反応させる。「澱粉加水分解物」なる語は、澱粉
を酸及び／又は酵素で加水分解して製造されるシ
ロツプ又は乾燥製品を示すものとして使用され
る。本発明で異性化に使用する好ましいタイプの
澱粉加水分解物は、酸又は酵素で20又はそれより
も小さいD.E.に希釈してから酵素でD.E.90以上、
好ましくは約95に糖化することにより製造され
る。「D.E.」なる語は、「デキストロース・エクイ
バレント」の略語で、デキストロースとして計算
して全固体のパーセントとして表わした材料の還
元糖含量のことである。糖化処理中、PHは約4.0
と約5.0の間の範囲にあるべきである。当該技術
分野に属する者に既に知られている緩衝剤を、希
望したPHを得るために使用することができる。 好ましい連続プロセスは、多孔性フエノール樹
脂粒子を、栓をしたフロー−スルー（flow−
through）・カラムに入れて酵素の固定化処理を、
澱粉加水分解物をカラムに通す前に行う。澱粉加
水分解物の液の濃度は、少なくとも30重量％であ
るのが好ましい。流量（BVHという）を処理の
間最高の異性化、例えばグルコースのフルクトー
スへの約45％の変換を保証するように調節する。
BVHは、１時間当りの床（bed）の容量におけ
るカラムの流量である。 本発明方法の別の態様では、約50ないし約
600ppmの間のSO2が、澱粉加水分解物の供給物
に加えられる。少なくとも約300ppmのSO2を、
グルコースイソメラーゼの安定性を高めるために
加えるのが好ましい。 以下、例を挙げて本発明のプラクチスを説明す
る。 例 １ ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス
（ATCC No.21715）を液体培地に30℃で約50時間
振盪培養する。培養物を次で１分間に10000回転
で20分間遠心分離して菌体を集める。湿潤菌体を
秤量し、次で10ｍＭのMgCl2を含有するイオン交
換水（３倍容量）中に懸濁させる。湿潤菌体の
0.02重量％のリゾチーム〔ボーエリンガー・マン
ハイム社（Boehringer−Mannheim Co.）の製
品および１％のトルエンを次に添加しそして細胞
溶解を穏やかな攪拌下に30℃で24時間実施する。
生じた溶解物を次に10000回転／分で20分間遠心
分離しそして細胞残留物を取り除く。 次に、等しい容量のイソプロピルアルコールを
穏やかな攪拌下に上澄に添加する。この混合した
溶液を更に遠心分離しそして沈殿物を集める。次
にこの沈殿物を、10ｍＭのMgCl2を含有する僅か
な量の脱イオン水中に溶解する。上記の一連の操
作の実施で、最初の細胞内グルコースイソメラー
ゼの70％以上の回収率で溶解状態でグルコースイ
ソメラーゼが得られた。 デユオライト（Duolite）ES−562−このもの
は、ダイアモンド・シヤムロツク社（Diamond
Shamrock Corp.）、ペインスヴイル
（Painesville）、オハイオ州から入手し得るフエ
ノール・ホルムアルデヒド樹脂である−の孔のサ
イズおよび孔の容積は、カルロ・エルバ・ストル
メンタチオネ（Carlo Erba Strumentazione）、
ミラノ、イタリアから入手し得るマーキユリー・
プレツシヤー・ポロシメーター型200（Mercury
Pressure Porosimeter Model 200）を使用して
測定した。その結果を図面の曲線１に表わす。
BET法で測定した時の比表面積は100m2／ｇであ
つた。次で10mlの樹脂をビーカー中に於て、
0.1Mのクエン酸100ml（PH1.5）にて間欠的攪拌
下に１時間洗浄する。クエン酸をデカンテーシヨ
ンによつて除去する。次で樹脂を、気泡を除く為
に、熱い脱塩水にて２度洗浄する。同じ処置を、
４つのバツチの樹脂を準備する為に４回繰返す。 ４本の10mlのカラムに、処理済みの樹脂10mlを
充填しそしてこの樹脂を再び、２時間の間4BVH
にて脱塩水の順流により洗浄する。４本のカラム
を同じウオターバスに集め、簡単なマルチ・チヤ
ンネル蠕動ポンプに集める。４本のカラムは、温
度および／または流量の変動によるいかなる矛盾
も避ける為に使用する。 次で樹脂を0.1Mの酢酸マグネシウム（PH7.4）
にて4BVHで１時間洗浄する。 前記のグルコースイソメラーゼ溶液を、各カラ
ムに480U／ml（担体）の酵素が負荷されるよう
に供給し、そして樹脂に固定する為に16時間、
4BVHの流量で再循環する。次で樹脂を、流出液
総容量40mlが結合された酵素の測定に役立ち得る
まで4BVHで0.1Mの酢酸マグネシウム（PH7.4）
にて洗浄する。 次にカラムに、硫酸マグネシウムとして
200ppmのMg++を含有する純粋な50％d.s.のデキ
ストロース溶液を供給し、そして水酸化ナトリウ
ムにて8.4のPH値に調整する。4BVHの一定の流
量を使用する。１時間後に、カラム温度は60℃に
上昇する。異性化した液体の最初のサンプルを、
60℃で１時間溶離した後に各カラムから取り出
し、そしてブロース含有量をポーラリメトリー
（polarimetry）によつて測定する。第２番目の
サンプルは、20時間の連続的異性化の後に取り出
す。 次に、下に記した式を、結合した酵素の量を計
算する為に使用した。即ち、樹脂に結合されたグ
ルコースイソメラーゼの％および結合した酵素活
性を算出した。結合した酵素活性は、１時間およ
び20時間後にBVH45％として測定された。 結合した酵素の％＝100−（流出液中で測定されたＵ／m
l）×40×100／供給酵素ＵBVH45％＝BVH×％log
51.2／51.2−ｘ．916 （但し、Ｘは実際の転化率である） ４本のカラムによつて、96％の結合が、１時間
後の3.7BVの活性および20時間後の7.0BVの活性
とともに決定された。このことは顕著な結合能力
および活性を表わしている。 例 ２〜18 本発明に従う樹脂担体の活性および結合してい
る％を確認する為に、いくつかの試験を以下の一
般的手順に従つて実施する。 例２〜９に於て、2.5×30cmの寸法を有するカ
ラムに、100mlのデユオライトES−562樹脂を充
填する。次で、樹脂を１時間の間60℃で脱塩水に
て洗浄して、入り込んでいる気泡を除く。次で、
充填された樹脂を0.1Mの酢酸マグネシウム（PH
7.5）にて25℃で4BVHの流量にて1.5時間洗浄す
る。例１に記載された、示された酵素負荷量のグ
ルコースイソメラーゼ溶液を、4BVHの流量で各
カラムに添加し、そして24時間の間再循環する。
その後に、樹脂を0.1Mの酢酸マグネシウム（PH
7.4）を用いて4BVHの流量で3/4時間洗浄し、そ
して例１に記載の手順に従つて結合した酵素の測
定の為に流出液を集める。 次に各カラムに、50％d.s.の98DE加水分解物お
よび水酸化ナトリウムで表示したPHに緩衝した硫
酸マグネシウム（200ppmMg++）を含有する溶
液を供給する。供給溶液のいくつかは酵素の為の
安定剤としてSO2を含有している。6BVHの初期
流量を使用する。１時間後にカラムの温度を60℃
に高め、そして流量を連続的異性化率（デキスト
ロースを42％のレブロースに異性化する）を達成
する為に調整する。第１表に、結合％、45％の転
化率の為の初期BVH流量、最初のおよび第２番
目の半減期、使用した総床容積（bed volume）
および酵素消費量を示す。酵素消費量は１ｇの乾
燥生成物当りの単位（Ｕ）で表わす（Ｕ／ｇd.
s.）。 例13では、酵素を前述の如き量で前処理した樹
脂にバツチ系に於て加え、そして得られる担体酵
素をカラム中に導入する以前に室温で完全に乾燥
する。乾燥は酵素の部分的変性をもたらすと思わ
れる。
する。 グルコースイソメラーゼはグルコース（デキス
トロース）をレブロース（フルクトース）に変換
する酵素の一般名である。グルコースイソメラー
ゼは、微生物の生産物として発見されたので、グ
ルコースからレブロース含有シロツプを工業的に
大規模に製造することは、主要な商業的方法にな
つている。 レブロース含有シロツプは、グルコースイソメ
ラーゼを含有する細胞を使用する回分式システム
で製造されうるが、回分法に対立するものとして
連続法を容易にするので固定化酵素が好ましい。
かくして、グルコースイソメラーゼを各種担体上
に固定する方法が提案され、そして先行技術とし
て記載されている。 例えば、グルコースイソメラーゼをある種の無
機担体上に固定化することは、米国特許第
3556945号および第3992329号各明細書に記載され
ている。 グルコースイソメラーゼのための担体としてセ
ルロース誘導体および合成樹脂を使用することも
また文献に記載されている。すなわち、米国特許
第3909354号明細書には、陰イオン交換セルロー
スまたは合成陰イオン交換樹脂のいずれかに結合
されたグルコースイソメラーゼを使用してグルコ
ースをレブロースに変換することが記載されてい
る。米国特許第4078970号明細書には、デキスト
ロース水溶液法に従つて測定して4.5％以上の微
孔およびポリアニオン塩分解法に従つて測定して
0.035meq／ml樹脂以上のイオン交換容量を有す
る陰イオン交換樹脂上に吸着され結合されたグル
コースイソメラーゼが開示されている。これらの
樹脂は、触媒として過酸化ベンゾイルを使用し、
水中でスチレン、ジビニルベンゼン、ポリスチレ
ンおよびトルエンを懸濁重合し、ついでクロルメ
チル化および陰イオン交換基の導入を行なうこと
によつて製造される。特開昭49−80160号公報に
は、特定のポリフエノール樹脂上にグルコースイ
ソメラーゼを固定化することが記載され、一方特
公昭48−56770号公報には、ポリスチレン、ポリ
フエノール、アルキレン、ポリアミンおよび脂肪
族アミンのイオン交換樹脂に酵素を結合するため
にトリアジン誘導体を使用することが記載されて
いる。ベルギー国特許第862765号明細書には、イ
オン特性を有しない巨大孔酵素担体が記載されて
いる。 グルコースイソメラーゼのためのすでに記載さ
れた担体の多くは、レブロース含有シロツプを生
産する作用があるが、それらはある種の欠点を有
する。例えば、いくつかの担体は、酵素活性が劣
つたものとなる結果を生じ、一方他の担体は、供
給量を低くする必要がある。更に、これらの担体
の多くは、高価であり、いくつかのものは再生
し、数回再使用しなければならず、このことは製
造コストを増大させることになる。 先行技術において知られている酵素担体が極め
て多いにもかかわらず、特定のポロシテイー
（porosity）分布および水による膨潤能力を有す
るフエノール樹脂は、特定のグルコースイソメラ
ーゼのための担体として使用された場合、驚くべ
き予想外の性質を有することが発見された。 更に詳細にいえば、本発明はストレプトマイセ
ス・オリボクロモゲネス（Streptomyces
olivochromogenes）ATCC Nos.21114；21713
（微工研菌寄第1602号）；21714（微工研菌寄第1603
号）または21715（微工研菌寄第1604号）から誘導
されたグルコースイソメラーゼを含む固定化グル
コースイソメラーゼ系に関するものである。寄託
された菌株ATCC Nos21713；21714および21715
は、ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス
ATCC No.21114の変異菌体である。グルコース
イソメラーゼは、ATCC No.21715の微生物の変
異菌株から誘導することもできる。ATCC No.
21715微生物またはその変異株から誘導される市
販のグルコースイソメラーゼは、CPC・インタ
ーナシヨナル・インコーポレーテツド（CPC
International Inc.、International Plaza、
Englewood Cliffs、New Jersey、U.S.A）から
Ｇ−993の商品名で市販されている。このグルコ
ースイソメラーゼは、微孔の少くとも30％が約30
ないし約250Åの半径を有する約30Å以上の微孔
の範囲内において１ｇ当り約40ないし約200m2の
全表面積を有する多孔性のフエノール樹脂上に固
定化されたものであり、この系は担体１ml当り
500単位の酵素負荷が提供されたときに少くとも
90％の結合効率を有するかまたは担体１ml当り
1000単位の酵素負担が提供されたときに少くとも
80％の結合効率を有し、そして少くとも10日の異
性化中の酵素半減期を有する。 本発明は、グルコースイソメラーゼに対する高
い結合能力、高い流量、長いカラム寿命および低
い酵素消費量をもたらし、従つて経済的な工業的
方法において使用するのに極めて魅力的なものと
する単一使用システムを目ざすものである。 更に詳しくは、特許請求の範囲に記載した多孔
性フエノール樹脂の担体は、図面の曲線１に類似
したポロシテイ分布をもつ。この曲線は、水銀細
孔測定法により細孔の大きさと容積を測定し、細
孔に集められる容積と半径との間の関係を表わす
積分曲線を描き、この積分曲線を微分して更に説
明的な、細孔の半径の微分増加に対応する細孔の
容積の増加を表わす微分分布曲線を得ることによ
つて得た。この測定の詳細な説明は、表面積の測
定の説明と一緒に、「アドソープシヨン・オン・
ソリツズ」（“Adsorption On Solids”）、ブイ・
ポネツク等、バターワーズ（Butterworths）、
1974、頁38〜39、540〜545及び552〜555に記載さ
れている。ここで明らかにした表面積とポロシテ
イをもつどんなフエノール樹脂も本発明の実施に
使用し得るが、陰イオン交換能力をもつ樹脂を使
用するのが好ましい。有用なことがわかつた特別
の樹脂は、デユオライトES−562及びデユオライ
トES−568である。これらはダイアモンド・シヤ
ムロツク（Diamond Shamrock）社から入手し
得るフエノール−ホルムアルデヒド樹脂である。 本発明の実施に使用する特別のグルコースイソ
メラーゼ酵素はストレプトマイセス・オリボクロ
モゲネス（Streptomyces olivochromogenes）
ATCC 第21114号；第21713号；第21714号又は
第21715号から得られる。寄託された株ATCC第
21713号；第21714号及び第21715号は、ストレプ
トマイセス・オリボクロモゲネスATCC第21114
号の突然変位異株（mutant strains）である。グ
ルコースイソメラーゼは、またATCC第21715号
の微生物の突然変異株から得ることもできる。こ
の明細書で先に指摘したように、ATCC第21715
号の微生物又はそれの突然変異株から得られる商
業上入手し得るグルコースイソメラーゼは、アメ
リカ合衆国、ニユー・ジヤージー州、エングルウ
ツド・クリフス、インターナシヨナル・プラザ、
シー・ピー・シー・インターナシヨナル・インコ
ーポレイテツドがＧ−993という名で売つている。
液体の酵素濃縮物は、米国特許第4077842号に記
載されている方法で製造される。酵素の活性につ
いては、１単位と（Ｕという）を、次の効力検定
法を使用し、標準化した一セツトの条件の下でグ
ルコース溶液から生じたケトースを分光光度定量
で調べた場合に、0.01モルのMgCl2及び0.01モル
のCoCl2の存在下でPH7.5且つ60℃で0.1モルのグ
ルコースの溶液中で毎分１ミクロモルのレブロー
スを生じる酵素の量と定義する。 ストツク液は、次の様に調製される： 効力検定用ストツク液成分 量 0.01M MgCl2 １ml 0.001M CoCl2 １ml 1.0Mの燐酸塩緩衝液、PH7.5 0.5ml 無水Ｄ−グルコース 1.44ｇ 蒸留水 7.5mlの全量に調整する。 効力検定すべき酵素製剤を、先ず1U／mlから
6U／mlまで含むように希釈する。 酵素による異性化は１mlの酵素製剤を３mlのス
トツク液に加え、30分間60℃に保温することによ
り行う。保温期間の終りに、１mlの部分試料をと
つて９mlの量の0.5Nの過塩素酸中で急冷させる。
急冷させた部分試料を次に250mlの全量に希釈す
る。対照として、比較のために、保温期間の初め
に、溶液の形の１mlの酵素製剤の代りに１mlの水
を使用してグルコースブランク試験を行う。次に
ケトースをシステイン−硫酸法で測定する。この
効力検定のために1Uを、上記の異性化の条件で
毎分１ミクロモルのレブロースを生じるのに必要
な酵素の活性の量と定義する。 本発明の固定化した系を製造するのには、多孔
性フエノール樹脂を、乾燥した樹脂の担体１ml当
り大体100単位と1000単位の間の酵素溶液から成
るグルコースイソメラーゼ溶液と混合する。酵素
製剤は非常に濃縮されていて酵素溶液１ml当り約
1000単位から約2500単位まで含んでいるのが好ま
しい。多孔性樹脂を先ず、好ましくは脱塩水で洗
う。次に樹脂を、PHが7.0と9.0の間、好ましくは
7.5と8.5の間になるように処理する。8.2に接近し
た製品のPHを得るための最終のPH調節に先だつて
苛性ソーダ洗浄工程をとり入れるのが好ましく、
このようにしてレブロースへの変換を最高にする
ことができる。希望したPHが得られた後、酵素吸
着処理を酵素溶液の濃度等のフアクターに応じて
少なくとも20時間行う。PHが希望した範囲内に確
実に止まつているように最終の洗浄をこの時に行
うことができる。一旦酵素が固定化されれば、生
じた系は直ちに使用することができ、又は水もし
くは例えばしめつた系の中に使用する時まで貯蔵
することができる。 使用するときには系を澱粉加水分解物の溶液と
反応させる。「澱粉加水分解物」なる語は、澱粉
を酸及び／又は酵素で加水分解して製造されるシ
ロツプ又は乾燥製品を示すものとして使用され
る。本発明で異性化に使用する好ましいタイプの
澱粉加水分解物は、酸又は酵素で20又はそれより
も小さいD.E.に希釈してから酵素でD.E.90以上、
好ましくは約95に糖化することにより製造され
る。「D.E.」なる語は、「デキストロース・エクイ
バレント」の略語で、デキストロースとして計算
して全固体のパーセントとして表わした材料の還
元糖含量のことである。糖化処理中、PHは約4.0
と約5.0の間の範囲にあるべきである。当該技術
分野に属する者に既に知られている緩衝剤を、希
望したPHを得るために使用することができる。 好ましい連続プロセスは、多孔性フエノール樹
脂粒子を、栓をしたフロー−スルー（flow−
through）・カラムに入れて酵素の固定化処理を、
澱粉加水分解物をカラムに通す前に行う。澱粉加
水分解物の液の濃度は、少なくとも30重量％であ
るのが好ましい。流量（BVHという）を処理の
間最高の異性化、例えばグルコースのフルクトー
スへの約45％の変換を保証するように調節する。
BVHは、１時間当りの床（bed）の容量におけ
るカラムの流量である。 本発明方法の別の態様では、約50ないし約
600ppmの間のSO2が、澱粉加水分解物の供給物
に加えられる。少なくとも約300ppmのSO2を、
グルコースイソメラーゼの安定性を高めるために
加えるのが好ましい。 以下、例を挙げて本発明のプラクチスを説明す
る。 例 １ ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス
（ATCC No.21715）を液体培地に30℃で約50時間
振盪培養する。培養物を次で１分間に10000回転
で20分間遠心分離して菌体を集める。湿潤菌体を
秤量し、次で10ｍＭのMgCl2を含有するイオン交
換水（３倍容量）中に懸濁させる。湿潤菌体の
0.02重量％のリゾチーム〔ボーエリンガー・マン
ハイム社（Boehringer−Mannheim Co.）の製
品および１％のトルエンを次に添加しそして細胞
溶解を穏やかな攪拌下に30℃で24時間実施する。
生じた溶解物を次に10000回転／分で20分間遠心
分離しそして細胞残留物を取り除く。 次に、等しい容量のイソプロピルアルコールを
穏やかな攪拌下に上澄に添加する。この混合した
溶液を更に遠心分離しそして沈殿物を集める。次
にこの沈殿物を、10ｍＭのMgCl2を含有する僅か
な量の脱イオン水中に溶解する。上記の一連の操
作の実施で、最初の細胞内グルコースイソメラー
ゼの70％以上の回収率で溶解状態でグルコースイ
ソメラーゼが得られた。 デユオライト（Duolite）ES−562−このもの
は、ダイアモンド・シヤムロツク社（Diamond
Shamrock Corp.）、ペインスヴイル
（Painesville）、オハイオ州から入手し得るフエ
ノール・ホルムアルデヒド樹脂である−の孔のサ
イズおよび孔の容積は、カルロ・エルバ・ストル
メンタチオネ（Carlo Erba Strumentazione）、
ミラノ、イタリアから入手し得るマーキユリー・
プレツシヤー・ポロシメーター型200（Mercury
Pressure Porosimeter Model 200）を使用して
測定した。その結果を図面の曲線１に表わす。
BET法で測定した時の比表面積は100m2／ｇであ
つた。次で10mlの樹脂をビーカー中に於て、
0.1Mのクエン酸100ml（PH1.5）にて間欠的攪拌
下に１時間洗浄する。クエン酸をデカンテーシヨ
ンによつて除去する。次で樹脂を、気泡を除く為
に、熱い脱塩水にて２度洗浄する。同じ処置を、
４つのバツチの樹脂を準備する為に４回繰返す。 ４本の10mlのカラムに、処理済みの樹脂10mlを
充填しそしてこの樹脂を再び、２時間の間4BVH
にて脱塩水の順流により洗浄する。４本のカラム
を同じウオターバスに集め、簡単なマルチ・チヤ
ンネル蠕動ポンプに集める。４本のカラムは、温
度および／または流量の変動によるいかなる矛盾
も避ける為に使用する。 次で樹脂を0.1Mの酢酸マグネシウム（PH7.4）
にて4BVHで１時間洗浄する。 前記のグルコースイソメラーゼ溶液を、各カラ
ムに480U／ml（担体）の酵素が負荷されるよう
に供給し、そして樹脂に固定する為に16時間、
4BVHの流量で再循環する。次で樹脂を、流出液
総容量40mlが結合された酵素の測定に役立ち得る
まで4BVHで0.1Mの酢酸マグネシウム（PH7.4）
にて洗浄する。 次にカラムに、硫酸マグネシウムとして
200ppmのMg++を含有する純粋な50％d.s.のデキ
ストロース溶液を供給し、そして水酸化ナトリウ
ムにて8.4のPH値に調整する。4BVHの一定の流
量を使用する。１時間後に、カラム温度は60℃に
上昇する。異性化した液体の最初のサンプルを、
60℃で１時間溶離した後に各カラムから取り出
し、そしてブロース含有量をポーラリメトリー
（polarimetry）によつて測定する。第２番目の
サンプルは、20時間の連続的異性化の後に取り出
す。 次に、下に記した式を、結合した酵素の量を計
算する為に使用した。即ち、樹脂に結合されたグ
ルコースイソメラーゼの％および結合した酵素活
性を算出した。結合した酵素活性は、１時間およ
び20時間後にBVH45％として測定された。 結合した酵素の％＝100−（流出液中で測定されたＵ／m
l）×40×100／供給酵素ＵBVH45％＝BVH×％log
51.2／51.2−ｘ．916 （但し、Ｘは実際の転化率である） ４本のカラムによつて、96％の結合が、１時間
後の3.7BVの活性および20時間後の7.0BVの活性
とともに決定された。このことは顕著な結合能力
および活性を表わしている。 例 ２〜18 本発明に従う樹脂担体の活性および結合してい
る％を確認する為に、いくつかの試験を以下の一
般的手順に従つて実施する。 例２〜９に於て、2.5×30cmの寸法を有するカ
ラムに、100mlのデユオライトES−562樹脂を充
填する。次で、樹脂を１時間の間60℃で脱塩水に
て洗浄して、入り込んでいる気泡を除く。次で、
充填された樹脂を0.1Mの酢酸マグネシウム（PH
7.5）にて25℃で4BVHの流量にて1.5時間洗浄す
る。例１に記載された、示された酵素負荷量のグ
ルコースイソメラーゼ溶液を、4BVHの流量で各
カラムに添加し、そして24時間の間再循環する。
その後に、樹脂を0.1Mの酢酸マグネシウム（PH
7.4）を用いて4BVHの流量で3/4時間洗浄し、そ
して例１に記載の手順に従つて結合した酵素の測
定の為に流出液を集める。 次に各カラムに、50％d.s.の98DE加水分解物お
よび水酸化ナトリウムで表示したPHに緩衝した硫
酸マグネシウム（200ppmMg++）を含有する溶
液を供給する。供給溶液のいくつかは酵素の為の
安定剤としてSO2を含有している。6BVHの初期
流量を使用する。１時間後にカラムの温度を60℃
に高め、そして流量を連続的異性化率（デキスト
ロースを42％のレブロースに異性化する）を達成
する為に調整する。第１表に、結合％、45％の転
化率の為の初期BVH流量、最初のおよび第２番
目の半減期、使用した総床容積（bed volume）
および酵素消費量を示す。酵素消費量は１ｇの乾
燥生成物当りの単位（Ｕ）で表わす（Ｕ／ｇd.
s.）。 例13では、酵素を前述の如き量で前処理した樹
脂にバツチ系に於て加え、そして得られる担体酵
素をカラム中に導入する以前に室温で完全に乾燥
する。乾燥は酵素の部分的変性をもたらすと思わ
れる。
【表】
【表】
【表】
例 19〜22
充填する前にカラムを60℃で脱塩水を用いて半
分満たすこと及び水洗後、樹脂をPHを約８に調整
するために2BVHの流量で２時間25℃で２％
NaOHで洗浄し、ついで2BVHで15時間25℃で
水洗すること以外は、Ｇ−993グルコースイソメ
ラーゼを使用して例２〜18の一般的操作を行う。
次いで樹脂を0.1M塩化マグネシウム（PH7.5）を
用いて25℃で１〜1/2時間、4BVHの流量で洗滌
する。酵素の負荷はＧ−933グルコースイソメラ
ーゼを使用する以外は、例２〜18に示したと同様
に行われる。これに続いて塩化マグネシウムでの
洗浄が25℃で3/4時間、4BVHで行われる。流出
液を結合した酵素の測定のために集める。その際
供給溶液を例２〜18に示した様に加える；その結
果を次の表２に示す。 （例20に於ては供給溶液を脱塩するのでなく脱
石灰する。例22に於ては重亜硫酸ナトリウムの飽
和溶液を供給溶液に加えて約200ppmSO2を供給
する。）
分満たすこと及び水洗後、樹脂をPHを約８に調整
するために2BVHの流量で２時間25℃で２％
NaOHで洗浄し、ついで2BVHで15時間25℃で
水洗すること以外は、Ｇ−993グルコースイソメ
ラーゼを使用して例２〜18の一般的操作を行う。
次いで樹脂を0.1M塩化マグネシウム（PH7.5）を
用いて25℃で１〜1/2時間、4BVHの流量で洗滌
する。酵素の負荷はＧ−933グルコースイソメラ
ーゼを使用する以外は、例２〜18に示したと同様
に行われる。これに続いて塩化マグネシウムでの
洗浄が25℃で3/4時間、4BVHで行われる。流出
液を結合した酵素の測定のために集める。その際
供給溶液を例２〜18に示した様に加える；その結
果を次の表２に示す。 （例20に於ては供給溶液を脱塩するのでなく脱
石灰する。例22に於ては重亜硫酸ナトリウムの飽
和溶液を供給溶液に加えて約200ppmSO2を供給
する。）
【表】
例 23
本発明による樹脂担体の優れた性質を証明する
ために、デユオライトES−562及び米国特許第
3992329号明細書に記載の方法にしたがつてつく
られた約100Å〜約1000Åの範囲の平均細孔直径
を有する多孔性Al2O3−MgO担体材料を使用して
実験を実施した。実験は例１の装置及び操作によ
り行なつた。その結果を下記表３に示す。この結
果は本発明による担体が高い結合能力、高い初期
BV流量及びAl2O3−MgO担体より長いカラム寿
命を有することを証明する。更にこの性質は本発
明による担体に対してはより少ない酵素消費量を
生じる。デユオライトES−562はAl2O3−MgO担
体により消費される酵素の64％しか要求しない。
ために、デユオライトES−562及び米国特許第
3992329号明細書に記載の方法にしたがつてつく
られた約100Å〜約1000Åの範囲の平均細孔直径
を有する多孔性Al2O3−MgO担体材料を使用して
実験を実施した。実験は例１の装置及び操作によ
り行なつた。その結果を下記表３に示す。この結
果は本発明による担体が高い結合能力、高い初期
BV流量及びAl2O3−MgO担体より長いカラム寿
命を有することを証明する。更にこの性質は本発
明による担体に対してはより少ない酵素消費量を
生じる。デユオライトES−562はAl2O3−MgO担
体により消費される酵素の64％しか要求しない。
【表】
【表】
例 24
供給酵素の量の影響を確かめるために、酵素の
種々の量をデユオライトES−562担体に供給す
る。例19〜22の装置及び操作並びに例１の酵素を
使用し、酵素の量のみを変化させる。その結果は
表4Aに示す様にこの樹脂の高い結合能力を示す。
種々の量をデユオライトES−562担体に供給す
る。例19〜22の装置及び操作並びに例１の酵素を
使用し、酵素の量のみを変化させる。その結果は
表4Aに示す様にこの樹脂の高い結合能力を示す。
【表】
同じ操作をAl2O3−MgO担体を用いて行う。そ
の結果を表4Bに示す。この比較データから明ら
かな様に、この担体を用いると最高初期BVは7.3
であり、酵素消費量は酵素負荷とともに減少す
る。480U／ml担体の負荷でもデユオライトES−
562は624U／ml担体で負荷されたAl2O3−MgOと
同じ初期BV流量を示す。
の結果を表4Bに示す。この比較データから明ら
かな様に、この担体を用いると最高初期BVは7.3
であり、酵素消費量は酵素負荷とともに減少す
る。480U／ml担体の負荷でもデユオライトES−
562は624U／ml担体で負荷されたAl2O3−MgOと
同じ初期BV流量を示す。
【表】
【表】
例 25
この例においては、グルコースイソメラーゼ酵
素の安定性を増すために、供給液にSO2を添加す
ることを含む条件下で流通する。例19〜22の装置
及び操作並びに例１の酵素を下記の様に変えて使
用する。 (a) 400ppm SO2を97DE加水分解物の供給液に
加える。 (b) 酵素（240U／ml担体）を担体に供給する。 (c) 供給液をPH7.6に調節する。 表５から、SO2の添加は例24に示した、デユオ
ライト−562及びAl2O3−MgO担体の双方に対す
るカラム寿命を伸ばすが、前者は後者と比較して
酵素消費量が約29％減少することが明らかであ
る。
素の安定性を増すために、供給液にSO2を添加す
ることを含む条件下で流通する。例19〜22の装置
及び操作並びに例１の酵素を下記の様に変えて使
用する。 (a) 400ppm SO2を97DE加水分解物の供給液に
加える。 (b) 酵素（240U／ml担体）を担体に供給する。 (c) 供給液をPH7.6に調節する。 表５から、SO2の添加は例24に示した、デユオ
ライト−562及びAl2O3−MgO担体の双方に対す
るカラム寿命を伸ばすが、前者は後者と比較して
酵素消費量が約29％減少することが明らかであ
る。
【表】
【表】
例 26〜32
本発明によるシステム及び方法が工業的規模で
使用できることを証明するために、直径50cm、高
さ３ｍのカラム中に流通する。Ｇ−993グルコー
スイソメラーゼを基体とする前記グルコースイソ
メラーゼ溶液を、回分式で水酸化ナトリウムで処
理したデユオライトES−562に加える。 次いで夫々のカラムに、上記の得られた担体−
酵素系600を詰める。カラムを硫酸マグネシウ
ムとして200ppmMg++を含有する97DE加水分解
物溶液（50％d.s.）で満たし、水酸化ナトリウム
でPH8.4に調整する。初期カラム温度は53℃であ
る。比較的一定の流通が望ましいので、カラムを
一定温度処理と可変的な温度処理とを折衷するこ
とによつて操作する。実験室的流通と工業的規模
での流通との比較は困難であり、有意味な半減期
を決定することはできない。工業的期模による流
通の例となる次の結果は、本発明の規模拡大の可
能性を単に示すにすぎない。
使用できることを証明するために、直径50cm、高
さ３ｍのカラム中に流通する。Ｇ−993グルコー
スイソメラーゼを基体とする前記グルコースイソ
メラーゼ溶液を、回分式で水酸化ナトリウムで処
理したデユオライトES−562に加える。 次いで夫々のカラムに、上記の得られた担体−
酵素系600を詰める。カラムを硫酸マグネシウ
ムとして200ppmMg++を含有する97DE加水分解
物溶液（50％d.s.）で満たし、水酸化ナトリウム
でPH8.4に調整する。初期カラム温度は53℃であ
る。比較的一定の流通が望ましいので、カラムを
一定温度処理と可変的な温度処理とを折衷するこ
とによつて操作する。実験室的流通と工業的規模
での流通との比較は困難であり、有意味な半減期
を決定することはできない。工業的期模による流
通の例となる次の結果は、本発明の規模拡大の可
能性を単に示すにすぎない。
【表】
比較例
本発明による樹脂担体の効率を証明するため
に、本発明による樹脂担体と異なるポロシテイ分
布を有する樹脂を使用して実験を行なつた。この
樹脂はデユオライトES−762（図に於て２で示さ
れるポロシテイ分布を有するフエノール性樹脂）
及びデユオライトＡ−７フアイン（Fines）（図に
於て３によつて示されるポロシテイ分布を有する
樹脂）である。なお、デユオライトES−762は、
300Åの平均微孔半径を有するものであり、また
デユオライトＡ−７−フアインは、80〜120m2／
ｇの全表面積を有し、250〜400Åの微孔半径分布
を示すものであつて、いずれも、本発明において
用いる多孔性フエノール樹脂の範囲外のものであ
る。２つの樹脂はダイヤモンド・シヤムロツク社
から入手できる。その結果を表６に示す。デユオ
ライトＡ−７フアインは流通を非連続で行つて極
めて低い初期BVH45％を生じた。デユオライト
ES−762は不十分な寿命及び高い酵素消費量を有
した。Ｇ−993グルコースイソメラーゼを酵素と
して使用した。
に、本発明による樹脂担体と異なるポロシテイ分
布を有する樹脂を使用して実験を行なつた。この
樹脂はデユオライトES−762（図に於て２で示さ
れるポロシテイ分布を有するフエノール性樹脂）
及びデユオライトＡ−７フアイン（Fines）（図に
於て３によつて示されるポロシテイ分布を有する
樹脂）である。なお、デユオライトES−762は、
300Åの平均微孔半径を有するものであり、また
デユオライトＡ−７−フアインは、80〜120m2／
ｇの全表面積を有し、250〜400Åの微孔半径分布
を示すものであつて、いずれも、本発明において
用いる多孔性フエノール樹脂の範囲外のものであ
る。２つの樹脂はダイヤモンド・シヤムロツク社
から入手できる。その結果を表６に示す。デユオ
ライトＡ−７フアインは流通を非連続で行つて極
めて低い初期BVH45％を生じた。デユオライト
ES−762は不十分な寿命及び高い酵素消費量を有
した。Ｇ−993グルコースイソメラーゼを酵素と
して使用した。
【表】
【表】
また流通をデユオライトＡ−368／Ｓでも行つ
たが、BVHが非常に低くかつたので、実験を中
止した。
たが、BVHが非常に低くかつたので、実験を中
止した。
図面は本発明の担体を含む数種の担体の特異的
微孔半径分布曲線を示す図であり、図中、曲線１
は本発明による樹脂担体のポロシテイー分布を示
し、曲線２はデユオライトES−762のポロシテイ
ー分布を示しそして曲線３はデユオライトＡ−７
のポロシテイー分布を示す。
微孔半径分布曲線を示す図であり、図中、曲線１
は本発明による樹脂担体のポロシテイー分布を示
し、曲線２はデユオライトES−762のポロシテイ
ー分布を示しそして曲線３はデユオライトＡ−７
のポロシテイー分布を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 微孔の少くとも30％が約30ないし約250Åの
半径を有する約30Å以上の微孔の範囲内において
１ｇ当り約40ないし約200m2の全表面積を有する
多孔性フエノール樹脂上に固定化されたストレプ
トマイセス・オリボクロモゲネス
（Streptomyces olivochromogenes）ATCC
Nos.21114：21713（微工研菌寄第1602号）：21714
（微工研菌寄第1603号）または21715（微工研菌寄
第1604号）またはそれらの変異株から誘導された
グルコースイソメラーゼからなり、担体１ml当り
500単位の酵素負荷が提供されたときに少くとも
90％の、または担体１ml当り1000単位の酵素負荷
が提供されたときに少くとも80％の結合効率を有
し、そして少くとも10日の異性化中の酵素半減期
を有することを特徴とする固定化グルコースイソ
メラーゼ系。 ２ 多孔性フエノール樹脂が陰イオン交換型樹脂
である特許請求の範囲第１項記載の系。 ３ 約30ないし約250Åの半径を有する微孔の少
くとも50％が50ないし150Åの半径を有する特許
請求の範囲第２項記載の系。 ４ 約30ないし約250Åの半径を有する微孔の少
くとも約20％が約60ないし約90Åの半径を有する
特許請求の範囲第３項記載の系。 ５ 約30ないし約250Åの半径を有する微孔の少
くとも約20％が約70ないし約80Åの半径を有する
特許請求の範囲第４項記載の系。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US755079A | 1979-01-30 | 1979-01-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55108288A JPS55108288A (en) | 1980-08-20 |
| JPH0138474B2 true JPH0138474B2 (ja) | 1989-08-14 |
Family
ID=21726845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP988880A Granted JPS55108288A (en) | 1979-01-30 | 1980-01-30 | Fixed glucoseisomerase system and glucose isomerization |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0014866B1 (ja) |
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