JPH0138478B2 - - Google Patents
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- JPH0138478B2 JPH0138478B2 JP56059516A JP5951681A JPH0138478B2 JP H0138478 B2 JPH0138478 B2 JP H0138478B2 JP 56059516 A JP56059516 A JP 56059516A JP 5951681 A JP5951681 A JP 5951681A JP H0138478 B2 JPH0138478 B2 JP H0138478B2
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- Japan
- Prior art keywords
- ifn
- cells
- virus
- production
- strain
- Prior art date
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- Expired
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
〔〕 発明の背景
技術分野
本発明は、ヒトＴリンパ芽球細胞からのβ型イ
ンターフエロンの産生および精製に関する。 現在、ウイルスで誘発されるインターフエロン
（以下、IFNということがある）は、次の二つの
型に大別される。すなわち、その一つはα型IFN
であつて、これにはヒト白血球IFNすなわちヒト
白血球で産生されるものおよびヒトリンパ芽球
IFNたとえばバーキツトリンパ腫由来の
Namalva株や白血病細胞BALL−１（Ｂ細胞株）
より産生されるものがある。他はβ型IFNと呼ば
れるものであつて、ヒト腺維芽細胞より産される
ヒト腺維芽細胞IFNがその代表例である。 α型およびβ型IFNは、物理化学的性状および
生物学的性状が異なつている。従つて、この差、
特に生物学的性状の差、に着目して適当なものを
目的に応じて利用することになろうが、特に癌治
療を目的とする場合は両IFNをうまく使いわける
ことによつてIFNの抗腫瘍効果を効率よく発揮さ
せることができるであろう。 いずれの型のIFNであつても、適当なヒト細胞
にインターフエロン誘発剤を作用させることによ
つて産生させることができるが、精製をも考慮し
たその製造法には難易の差がある。すなわち、α
型IFNは細胞の維持または培養が比較的容易であ
つて、たとえば培養は浮遊培養によつて行なうこ
とができ、精製も比較的容易であるので、α型
IFNの大量製造は比較的容易である。しかし、β
型IFN、具体的にはヒト線維芽細胞IFN、の製造
は必ずしも容易ではない。すなわち、ヒト線維芽
細胞IFN産性の場合は線維芽細胞を単層培養で維
持する必要があり、培養継代操作が煩雑であるば
かりでなく、二倍体の状態でIFNを産生させるた
めや細胞に寿命があつたりして、継代数に限りが
ある。また、培養した線維芽細胞株間にはIFN産
生能や増殖能に大きい差がみられるので、次から
次へと新しく増殖能のすぐれたIFN産生能が高い
二倍体細胞を培養して行かなければならない。 ところで、IFNは細胞がある種の物質（すなわ
ちIFN誘発剤）で刺激されたときに産生する生理
活性糖タンパクであるが、すべての細胞が誘発剤
によつてIFNを産生するかというとそうではな
い。たとえば、何種類かのヒトリンパ芽球株化細
胞についてIFN産生能を調べたところ、いくつか
の株化細胞はニユーカスル病ウイルスまたはセン
ダイウイルスで誘発させることによつてIFNを産
生することができたが、他のものは同様に誘発を
行なつても検知可能なIFNを産出しなかつたこと
が報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA77
(10)、5938−5945（1980））。 〔〕 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えてβ型IFNを比
較的容易に製造することを目的とし、ヒト胸腺性
リンパ芽球細胞の株化細胞であるRPMI8402株を
ウイルスで刺激してIFNを産生させることによつ
てこの目的を達成しようとするものである。 従つて、本発明によるβ型インターフエロンの
製造法は、ヒト胸腺性リンパ芽球細胞の株化細胞
であるRPMI8402株にウイルスを作用させてβ型
インターフエロンを産生させること、を特徴とす
るものである。 効 果 本発明はヒトリンパ性白血病患者より分離およ
び株化された胸腺細胞性のリンパ芽球
（RPMI8402株）にウイルスを感染させるとβ型
IFNが産生されることを発見したことに基くが、
胸腺性リンパ芽球（以下、Ｔリンパ芽球という）
がウイルスの感染によつてβ型IFNを産生すると
いうとは思いがけなかつたことというべきであ
る。何故ならば、従来のリンパ芽球から産生され
たIFNは主としてα型であつたからである。 ヒトＴリンパ芽球細胞は株化細胞であるから理
論上は永久に継代可能であり、また浮遊培養が可
能であるから大量培養も線維芽細胞に比べて簡単
であるうえ、IFN誘発も線維芽細胞に比べてはる
かに容易である。 従つて、本発明はβ型IFNの工業的大量製造法
としてすぐれたものであると思料される。 〔〕 発明の具体的説明 １ IFN産生細胞 本発明でIFNを産生させるべく使用する細胞
は、ヒト胸腺性リンパ芽球細胞の株化細胞であ
るRPMI8402株である。 RPMI8402株は、ヒト急性リンパ芽球性白血
病由来の株化リンパ芽球細胞であり、その性質
はMinowadaにより詳細に検討されている。こ
の細胞の特長の第一は、Namalva細胞などの
ようにEBウイルス核抗原性が陰性である点で
ある。これは、最終製品の検定をする上で作業
が非常に容易であり、またEBウイルスの混入
がないため発癌性という点でも安全である、と
いう特長につながる。第二の特長としては、増
殖がよいことおよび維持が簡単であることがあ
げられる。 ２ ウイルス IFN誘発剤としてのウイルスの具体例は、各
種の文献、たとえば、Interferon：Theory
and Applications（Plenum Press、1973）、に
示されている。 これらのうちで好ましいものは、センダイウ
イルス（HVJ）、ニユーカツスル病ウイルス
（NDV）、麻疹ウイルス、ブルータングウイル
ス等、である。 ウイルスは、紫外線照射、加熱等によつて不
活化したものでもよい。 ３ IFNの産生 使用する細胞が浮遊培養可能なヒトリンパ芽
球細胞であることを除けば、本発明によるIFN
の製造は誘発剤としてウイルスを使用するIFN
の産生に慣用されあるいは使用しうる任意の方
法によつて実施することができる。 具体的には、たとえば、RPMI8402株を適当
な液体培地中で継代培養し、この細胞培養液を
そのまゝあるいは細胞濃度を適当に調節し、あ
るいは好ましくはウイルス接触時およびその後
に用いる培養とIFN誘発とに適した培地に変え
てから、適当なウイルスと接触させる。ウイル
ス接触後はIFN誘発に適した条件を維持して、
ウイルスによるIFNの産生を行なわせる。所定
時間後、細胞培養液の液相部分（特に、上清）
を回収し、紫外線照射、酸性化／中性化処理そ
の他によつてウイルスを不活化し、その後は糖
タンパクの一般的精製法に従つてIFNを分離な
いし濃縮する。 精製法の具体例を示せば、たとえば、下記の
通りである。硫酸アンモニウムあるいは酢酸亜
鉛による濃縮、あるいはエタノール分画法によ
る濃縮、コロイジンバツグ、ホローフアイバ
ー、透析膜その他を用いての限外過等での濃
縮後、セフアデツクスＧ−200、100、50、25等
によるゲル過を行なつたり、CM−セフアデ
ツクス、DEAE−セフアデツクス、DEAE−セ
ルロース、SP−セフアデツクス等のイオン交
換クロマトグラフイーにて精製を行なう。この
ような精製により、比活性を10〜100倍上げる
ことができる。また、SDS−ゲル電気泳動法に
より容易に精製も可能である。 ４ TC−IFNの性質 本発明によるとヒトＴリンパ芽球細胞からの
IFN（TC−IFNと呼ぶことにする）は、β型の
ものである。 本発明により得られるIFNがβ型であること
は、抗ヒトα型IFN抗体ではいかなる濃度によ
つても中和されないこと、反対に抗ヒトβ型
IFN抗体ではその濃度に応じて部分的ないし完
全に中和されること、から明らかである。 このIFNの性質（および産生）についての詳
細は、後記実験例に示した通りである。 ５ 実験例 実施例 １ (1) IFNの製造実験手順 (1) RPMI8402株 リンパ芽球性白血病より株化されたＴ細胞
の性質をもつたリンパ芽球である。５〜10％
仔牛血清あるいは５〜10％胎児牛血清又は10
％混合血清（FBS：NCS＝２：１）加
RPMI1640培地にて培養され、２×105個／
mlで植え込むと、４〜５日で２〜３×106
個／mlに達する。通常は、１×106個／mlの
細胞濃度付近で、２日に１回の液替え操作に
て維持する。 (2) ウイルス（センダイウイルス（HVJ）） HVJを10日目の受精鶏卵により増殖させ、
漿尿液を19000rpm、120分遠心後、沈査を無
血清RPMI1640培地で浮遊させ、
20000HA／mlに調整後−80℃に分注保存し
た。 (3) IFNの産生 継代培養されたRPMI8402株を、1000rpm
で５分間遠心し、５％FBS加RPMI1640培地
で、５×106個／mlに調整し、HVJウイルス
500HA／mlを加え、CO2インキユベーター
で37℃／24時間の条件に維持したのち、
3000rpmで10分間遠心して、上清を回収し
た。上清は、HVJウイルスを不活化するた
めに紫外線で２時間照射するか、あるいは
1N−HClでPH２処理を３〜４日行なつてか
ら1N−NaOH液で再びPH７に再調整した。 (4) IFNの精製 粗IFN液に80％飽和になるように硫酸アン
モニウムを低温で加え、４℃にて一昼夜撹拌
する。その後、9000rpmで30分遠心し、沈査
をPBS（−）に再溶解させて、３日間PBS
（−）にて透析する。得られた濃縮IFN液を
PH4.0に調整し、SP−セフアデツクスＣ−25
にIFNを吸着させ、PH8.0で0.1M四ホウ酸ナ
トリウム液でIFNを溶出して精製する。 (2) IFN産生の詳細 (1) IFN産生の時間的経過（第１表） IFN産性は、HVJウイルス添加後９時間
付近で開始され、24時間で最高に達し、以後
減少して行く傾向にあつた。
ンターフエロンの産生および精製に関する。 現在、ウイルスで誘発されるインターフエロン
（以下、IFNということがある）は、次の二つの
型に大別される。すなわち、その一つはα型IFN
であつて、これにはヒト白血球IFNすなわちヒト
白血球で産生されるものおよびヒトリンパ芽球
IFNたとえばバーキツトリンパ腫由来の
Namalva株や白血病細胞BALL−１（Ｂ細胞株）
より産生されるものがある。他はβ型IFNと呼ば
れるものであつて、ヒト腺維芽細胞より産される
ヒト腺維芽細胞IFNがその代表例である。 α型およびβ型IFNは、物理化学的性状および
生物学的性状が異なつている。従つて、この差、
特に生物学的性状の差、に着目して適当なものを
目的に応じて利用することになろうが、特に癌治
療を目的とする場合は両IFNをうまく使いわける
ことによつてIFNの抗腫瘍効果を効率よく発揮さ
せることができるであろう。 いずれの型のIFNであつても、適当なヒト細胞
にインターフエロン誘発剤を作用させることによ
つて産生させることができるが、精製をも考慮し
たその製造法には難易の差がある。すなわち、α
型IFNは細胞の維持または培養が比較的容易であ
つて、たとえば培養は浮遊培養によつて行なうこ
とができ、精製も比較的容易であるので、α型
IFNの大量製造は比較的容易である。しかし、β
型IFN、具体的にはヒト線維芽細胞IFN、の製造
は必ずしも容易ではない。すなわち、ヒト線維芽
細胞IFN産性の場合は線維芽細胞を単層培養で維
持する必要があり、培養継代操作が煩雑であるば
かりでなく、二倍体の状態でIFNを産生させるた
めや細胞に寿命があつたりして、継代数に限りが
ある。また、培養した線維芽細胞株間にはIFN産
生能や増殖能に大きい差がみられるので、次から
次へと新しく増殖能のすぐれたIFN産生能が高い
二倍体細胞を培養して行かなければならない。 ところで、IFNは細胞がある種の物質（すなわ
ちIFN誘発剤）で刺激されたときに産生する生理
活性糖タンパクであるが、すべての細胞が誘発剤
によつてIFNを産生するかというとそうではな
い。たとえば、何種類かのヒトリンパ芽球株化細
胞についてIFN産生能を調べたところ、いくつか
の株化細胞はニユーカスル病ウイルスまたはセン
ダイウイルスで誘発させることによつてIFNを産
生することができたが、他のものは同様に誘発を
行なつても検知可能なIFNを産出しなかつたこと
が報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA77
(10)、5938−5945（1980））。 〔〕 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えてβ型IFNを比
較的容易に製造することを目的とし、ヒト胸腺性
リンパ芽球細胞の株化細胞であるRPMI8402株を
ウイルスで刺激してIFNを産生させることによつ
てこの目的を達成しようとするものである。 従つて、本発明によるβ型インターフエロンの
製造法は、ヒト胸腺性リンパ芽球細胞の株化細胞
であるRPMI8402株にウイルスを作用させてβ型
インターフエロンを産生させること、を特徴とす
るものである。 効 果 本発明はヒトリンパ性白血病患者より分離およ
び株化された胸腺細胞性のリンパ芽球
（RPMI8402株）にウイルスを感染させるとβ型
IFNが産生されることを発見したことに基くが、
胸腺性リンパ芽球（以下、Ｔリンパ芽球という）
がウイルスの感染によつてβ型IFNを産生すると
いうとは思いがけなかつたことというべきであ
る。何故ならば、従来のリンパ芽球から産生され
たIFNは主としてα型であつたからである。 ヒトＴリンパ芽球細胞は株化細胞であるから理
論上は永久に継代可能であり、また浮遊培養が可
能であるから大量培養も線維芽細胞に比べて簡単
であるうえ、IFN誘発も線維芽細胞に比べてはる
かに容易である。 従つて、本発明はβ型IFNの工業的大量製造法
としてすぐれたものであると思料される。 〔〕 発明の具体的説明 １ IFN産生細胞 本発明でIFNを産生させるべく使用する細胞
は、ヒト胸腺性リンパ芽球細胞の株化細胞であ
るRPMI8402株である。 RPMI8402株は、ヒト急性リンパ芽球性白血
病由来の株化リンパ芽球細胞であり、その性質
はMinowadaにより詳細に検討されている。こ
の細胞の特長の第一は、Namalva細胞などの
ようにEBウイルス核抗原性が陰性である点で
ある。これは、最終製品の検定をする上で作業
が非常に容易であり、またEBウイルスの混入
がないため発癌性という点でも安全である、と
いう特長につながる。第二の特長としては、増
殖がよいことおよび維持が簡単であることがあ
げられる。 ２ ウイルス IFN誘発剤としてのウイルスの具体例は、各
種の文献、たとえば、Interferon：Theory
and Applications（Plenum Press、1973）、に
示されている。 これらのうちで好ましいものは、センダイウ
イルス（HVJ）、ニユーカツスル病ウイルス
（NDV）、麻疹ウイルス、ブルータングウイル
ス等、である。 ウイルスは、紫外線照射、加熱等によつて不
活化したものでもよい。 ３ IFNの産生 使用する細胞が浮遊培養可能なヒトリンパ芽
球細胞であることを除けば、本発明によるIFN
の製造は誘発剤としてウイルスを使用するIFN
の産生に慣用されあるいは使用しうる任意の方
法によつて実施することができる。 具体的には、たとえば、RPMI8402株を適当
な液体培地中で継代培養し、この細胞培養液を
そのまゝあるいは細胞濃度を適当に調節し、あ
るいは好ましくはウイルス接触時およびその後
に用いる培養とIFN誘発とに適した培地に変え
てから、適当なウイルスと接触させる。ウイル
ス接触後はIFN誘発に適した条件を維持して、
ウイルスによるIFNの産生を行なわせる。所定
時間後、細胞培養液の液相部分（特に、上清）
を回収し、紫外線照射、酸性化／中性化処理そ
の他によつてウイルスを不活化し、その後は糖
タンパクの一般的精製法に従つてIFNを分離な
いし濃縮する。 精製法の具体例を示せば、たとえば、下記の
通りである。硫酸アンモニウムあるいは酢酸亜
鉛による濃縮、あるいはエタノール分画法によ
る濃縮、コロイジンバツグ、ホローフアイバ
ー、透析膜その他を用いての限外過等での濃
縮後、セフアデツクスＧ−200、100、50、25等
によるゲル過を行なつたり、CM−セフアデ
ツクス、DEAE−セフアデツクス、DEAE−セ
ルロース、SP−セフアデツクス等のイオン交
換クロマトグラフイーにて精製を行なう。この
ような精製により、比活性を10〜100倍上げる
ことができる。また、SDS−ゲル電気泳動法に
より容易に精製も可能である。 ４ TC−IFNの性質 本発明によるとヒトＴリンパ芽球細胞からの
IFN（TC−IFNと呼ぶことにする）は、β型の
ものである。 本発明により得られるIFNがβ型であること
は、抗ヒトα型IFN抗体ではいかなる濃度によ
つても中和されないこと、反対に抗ヒトβ型
IFN抗体ではその濃度に応じて部分的ないし完
全に中和されること、から明らかである。 このIFNの性質（および産生）についての詳
細は、後記実験例に示した通りである。 ５ 実験例 実施例 １ (1) IFNの製造実験手順 (1) RPMI8402株 リンパ芽球性白血病より株化されたＴ細胞
の性質をもつたリンパ芽球である。５〜10％
仔牛血清あるいは５〜10％胎児牛血清又は10
％混合血清（FBS：NCS＝２：１）加
RPMI1640培地にて培養され、２×105個／
mlで植え込むと、４〜５日で２〜３×106
個／mlに達する。通常は、１×106個／mlの
細胞濃度付近で、２日に１回の液替え操作に
て維持する。 (2) ウイルス（センダイウイルス（HVJ）） HVJを10日目の受精鶏卵により増殖させ、
漿尿液を19000rpm、120分遠心後、沈査を無
血清RPMI1640培地で浮遊させ、
20000HA／mlに調整後−80℃に分注保存し
た。 (3) IFNの産生 継代培養されたRPMI8402株を、1000rpm
で５分間遠心し、５％FBS加RPMI1640培地
で、５×106個／mlに調整し、HVJウイルス
500HA／mlを加え、CO2インキユベーター
で37℃／24時間の条件に維持したのち、
3000rpmで10分間遠心して、上清を回収し
た。上清は、HVJウイルスを不活化するた
めに紫外線で２時間照射するか、あるいは
1N−HClでPH２処理を３〜４日行なつてか
ら1N−NaOH液で再びPH７に再調整した。 (4) IFNの精製 粗IFN液に80％飽和になるように硫酸アン
モニウムを低温で加え、４℃にて一昼夜撹拌
する。その後、9000rpmで30分遠心し、沈査
をPBS（−）に再溶解させて、３日間PBS
（−）にて透析する。得られた濃縮IFN液を
PH4.0に調整し、SP−セフアデツクスＣ−25
にIFNを吸着させ、PH8.0で0.1M四ホウ酸ナ
トリウム液でIFNを溶出して精製する。 (2) IFN産生の詳細 (1) IFN産生の時間的経過（第１表） IFN産性は、HVJウイルス添加後９時間
付近で開始され、24時間で最高に達し、以後
減少して行く傾向にあつた。
【表】
(2) 培地中の血清濃度の影響（第２表）
IFN産生時の培地中に加えるFBS濃度を０
％、２％、５％、10％に変化させて、IFN産
生量を比較、検討した。 血清濃度５％までは、徐々にIFNの産生量
が増加して行き、５％と10％との間には差は
なかつた。無血清でもIFNは産生された。大
量生産および精製の段階を考慮すると、無血
清培地でのIFN産生法が有利であろうと思わ
れる。
％、２％、５％、10％に変化させて、IFN産
生量を比較、検討した。 血清濃度５％までは、徐々にIFNの産生量
が増加して行き、５％と10％との間には差は
なかつた。無血清でもIFNは産生された。大
量生産および精製の段階を考慮すると、無血
清培地でのIFN産生法が有利であろうと思わ
れる。
【表】
(3) HVJ接種量の検討（第３表）
ウイルス接種量を、20HA／ml、100HA／
ml、500HA／ml、2000HA／ml、と変化させ
て、IFN産生量を検討した。HVJウイルス
の量が多いほど、IFN産生量は増加する傾向
にあつた。
ml、500HA／ml、2000HA／ml、と変化させ
て、IFN産生量を検討した。HVJウイルス
の量が多いほど、IFN産生量は増加する傾向
にあつた。
【表】
(4) プライミング効果（第４〜５表）
ヒト白血球IFNや、線維芽細胞IFNでは、
産生細胞をIFNで前処理すると、IFN産生量
が増加するプライミング効果があるが、
RPMI8402株でも同様な効果があるかどうか
を検討した。先ず、RPMI8402株で産生され
るIFNでRPMI8402株を前処理してみた。前
処理IFN量は10U／ml、100U／ml、とし、
前処理時間を30分、60分、120分、180分、
240分と変えた。10U／mlではほとんどプラ
イミング効果は認められず、100U／ml、240
分処理で、多少プライミング効果があつた。
（第４表参照）。 同様に、ヒト白血球IFNで前処理して、プ
ライミング効果を検討した。前処理IFN量は
10U／mlおよび100U／mlで、前処理時間は
30分、60分、120分、180分および240分であ
る。前処理IFN量100U／mlでは240分処理で
プライミング効果が認められ、10U／mlにお
いても同様な傾向を示したが、100U／mlの
前処理に比べてプライミング効果は強いよう
に思える（第５表参照）。
産生細胞をIFNで前処理すると、IFN産生量
が増加するプライミング効果があるが、
RPMI8402株でも同様な効果があるかどうか
を検討した。先ず、RPMI8402株で産生され
るIFNでRPMI8402株を前処理してみた。前
処理IFN量は10U／ml、100U／ml、とし、
前処理時間を30分、60分、120分、180分、
240分と変えた。10U／mlではほとんどプラ
イミング効果は認められず、100U／ml、240
分処理で、多少プライミング効果があつた。
（第４表参照）。 同様に、ヒト白血球IFNで前処理して、プ
ライミング効果を検討した。前処理IFN量は
10U／mlおよび100U／mlで、前処理時間は
30分、60分、120分、180分および240分であ
る。前処理IFN量100U／mlでは240分処理で
プライミング効果が認められ、10U／mlにお
いても同様な傾向を示したが、100U／mlの
前処理に比べてプライミング効果は強いよう
に思える（第５表参照）。
【表】
【表】
(5) 紫外線照射とIFN産生量（第６表）
２培体細胞へのウイルス感染後４〜７時間
に細胞を紫外線照射するとIFN産生量が増加
するという報告がある。そこで、RPMI8402
株でも同様な効果が現われるかどうかを検討
してみた。 RPMI8402株にHVJウイルスを感染させ、
37℃で６時間培養後、紫外線照射時間を10
秒、20秒、40秒、60秒および120秒と変化さ
せて、IFN産生量を測定した。紫外線照射10
秒において、多少、IFN産性量が増加した様
に思えるが、以後、照射時間と共に産生IFN
量は減少して行つた。従つて、２培体細胞に
比べてその効果はないと思われる。
に細胞を紫外線照射するとIFN産生量が増加
するという報告がある。そこで、RPMI8402
株でも同様な効果が現われるかどうかを検討
してみた。 RPMI8402株にHVJウイルスを感染させ、
37℃で６時間培養後、紫外線照射時間を10
秒、20秒、40秒、60秒および120秒と変化さ
せて、IFN産生量を測定した。紫外線照射10
秒において、多少、IFN産性量が増加した様
に思えるが、以後、照射時間と共に産生IFN
量は減少して行つた。従つて、２培体細胞に
比べてその効果はないと思われる。
【表】
(6) ５−ブロムデオキシウリジン（BudR）処
理とIFN産生量（第７表） リンパ芽球細胞のIFN産生において、
BudR25μｇ／mlまたは100μｇ／mlで、72時
間あるいは24時間、リンパ芽球を前処理する
とIFN産生量が高められる現象がある。そこ
で、RPMI8402株でその効果を検討した。 BudR量を1μｇ／ml、5μｇ／ml、25μｇ／
mlおよび100μｇ／mlとし、前処理時間は24
時間とした。前処理BudR量の増加に比例し
てIFN産生量は減少し、従つて、BudRによ
る超誘発効果は認められなかつた。
理とIFN産生量（第７表） リンパ芽球細胞のIFN産生において、
BudR25μｇ／mlまたは100μｇ／mlで、72時
間あるいは24時間、リンパ芽球を前処理する
とIFN産生量が高められる現象がある。そこ
で、RPMI8402株でその効果を検討した。 BudR量を1μｇ／ml、5μｇ／ml、25μｇ／
mlおよび100μｇ／mlとし、前処理時間は24
時間とした。前処理BudR量の増加に比例し
てIFN産生量は減少し、従つて、BudRによ
る超誘発効果は認められなかつた。
【表】
(7) RPMI8402株の大量培養（第８表）
RPMI8402株の大量培養が可能かどうかを
検討するために、250mlおよび1000mlのスピ
ンナーフラスコを用いて培養を行なつた。２
×105個／mlで値え込むと４日間で１〜２×
106個／mlまで増殖して行き、以後、生細胞
数は減少して行く傾向にある。さらに、
1000rpmで５分遠心後、沈査の細胞を新鮮な
培養液に浮遊させて培養を続けると、細胞は
増殖を続け、１〜２回の回様な液替え操作に
て３〜４×106個／mlまでに達する。その後、
細胞増殖は平衡に達し、飽和細胞濃度は３〜
４×106個／ml付近であると思われる。
検討するために、250mlおよび1000mlのスピ
ンナーフラスコを用いて培養を行なつた。２
×105個／mlで値え込むと４日間で１〜２×
106個／mlまで増殖して行き、以後、生細胞
数は減少して行く傾向にある。さらに、
1000rpmで５分遠心後、沈査の細胞を新鮮な
培養液に浮遊させて培養を続けると、細胞は
増殖を続け、１〜２回の回様な液替え操作に
て３〜４×106個／mlまでに達する。その後、
細胞増殖は平衡に達し、飽和細胞濃度は３〜
４×106個／ml付近であると思われる。
【表】
(8) スピンナーフラスコでのIFN産生（第９
表） スピンナーフラスコ500mlを用いて、大量
にIFNを産生させた。スピンナーフラスコ
1000mlで増殖させた細胞を1000rpmで５分間
遠心後、沈査を無血清RPMI1640培地に浮遊
させ、細胞数を１×107個／mlに調整した。
接種したHVJウイルス量は1000HA／mlと
2000HA／mlとし、37℃でCO2インキユベー
ターで24時間培養後、培養液を9000rpmで30
分間遠心して、上清を回収した。上清に1N
−HClを加えてPH２にしたのち、４℃に３日
間静置し、1N−NaOHでPH７にもどして、
粗IFN液とした。濃縮のため、硫酸アンモニ
ウムを80％飽和度まで加え、４℃で一昼夜撹
拌し、沈殿を9000rpmで30分間遠心して回収
し、PBS（−）で透析した。結果を第９表に
示した。加えたウイルス量によらず、産生さ
れたIFN量は、ほぼ同量であつた。80％硫安
による濃縮によつて、比活性は僅か改良され
ている。
表） スピンナーフラスコ500mlを用いて、大量
にIFNを産生させた。スピンナーフラスコ
1000mlで増殖させた細胞を1000rpmで５分間
遠心後、沈査を無血清RPMI1640培地に浮遊
させ、細胞数を１×107個／mlに調整した。
接種したHVJウイルス量は1000HA／mlと
2000HA／mlとし、37℃でCO2インキユベー
ターで24時間培養後、培養液を9000rpmで30
分間遠心して、上清を回収した。上清に1N
−HClを加えてPH２にしたのち、４℃に３日
間静置し、1N−NaOHでPH７にもどして、
粗IFN液とした。濃縮のため、硫酸アンモニ
ウムを80％飽和度まで加え、４℃で一昼夜撹
拌し、沈殿を9000rpmで30分間遠心して回収
し、PBS（−）で透析した。結果を第９表に
示した。加えたウイルス量によらず、産生さ
れたIFN量は、ほぼ同量であつた。80％硫安
による濃縮によつて、比活性は僅か改良され
ている。
【表】
(9) 熱及び酸安定性（第10表）
RPMI8402株により産性されたIFNの熱安
定性と酸安定性を検討した。対照としてヒト
白血球IFNとヒト線維芽細胞IFNを用いた。
60℃／30分の加熱で一部活性は残る。80℃／
30分の加熱で完全に不活化された。PH２処理
にはグリシン−塩酸緩衝液で一昼夜にわたつ
て透析し、さらにPBS（−）で透析後、IFN
活性を測定した。PH２処理ではIFN活性は変
化せず安定であつた。ヒト白血球IFNとヒト
線維芽細胞IFNとの間には差は認められなか
つた。
定性と酸安定性を検討した。対照としてヒト
白血球IFNとヒト線維芽細胞IFNを用いた。
60℃／30分の加熱で一部活性は残る。80℃／
30分の加熱で完全に不活化された。PH２処理
にはグリシン−塩酸緩衝液で一昼夜にわたつ
て透析し、さらにPBS（−）で透析後、IFN
活性を測定した。PH２処理ではIFN活性は変
化せず安定であつた。ヒト白血球IFNとヒト
線維芽細胞IFNとの間には差は認められなか
つた。
【表】
(10) 抗原性（第11〜13表）
RPMI8402株産生IFNの抗原性を調べるた
めに、抗ヒト白血球IFN（抗HL−IFN）と、
抗ヒト線維芽細胞IFN（抗HF−IFN）血清で
中和試験を行なつた。抗HL−IFN血清での
各IFNの中和反応の結果、HL−IFNは中和
されたが、RPMI8402株IFNとHF−IFNは
中和されなかつた。さらに、抗HF−IFN血
清での中和反応では、HL−IFNは中和され
ず、HF−IFNとRPMI8402株IFNは中和さ
れた。 この結果、RPMI8402株IFNはその抗原性
が、HF−IFNと共通していると思われる。
表中、＋は全細胞がウイルスにより変性した
ことを、−は全細胞が変性しなかつたを、△
は50％の細胞がウイルスにより変性したこと
をそれぞれ示す。
めに、抗ヒト白血球IFN（抗HL−IFN）と、
抗ヒト線維芽細胞IFN（抗HF−IFN）血清で
中和試験を行なつた。抗HL−IFN血清での
各IFNの中和反応の結果、HL−IFNは中和
されたが、RPMI8402株IFNとHF−IFNは
中和されなかつた。さらに、抗HF−IFN血
清での中和反応では、HL−IFNは中和され
ず、HF−IFNとRPMI8402株IFNは中和さ
れた。 この結果、RPMI8402株IFNはその抗原性
が、HF−IFNと共通していると思われる。
表中、＋は全細胞がウイルスにより変性した
ことを、−は全細胞が変性しなかつたを、△
は50％の細胞がウイルスにより変性したこと
をそれぞれ示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
以上より、RPMI8402株は大量培養が容易
であり、大量産生も可能であることがわかつ
た。また、プライミング効果もあり、β型
IFNを産生するにはこの株を用いて行なうこ
とが、従来の線維芽細胞より産生するよりも
はるかにすぐれていることがわかつた。精製
についても、80％硫安による沈殿で濃縮が可
能である。 (11) SP−セフアデツクスＣ−25によるクロマ
トグラフイー（第14表） RPMI8402株が産生した粗IFN液をSP−
セフアデツクスＣ−25にPH4.0の0.1M酢酸ナ
トリウム溶液中で吸着させたのち、PH8.0の
0.1M四ホウ酸ナトリウム溶液で溶出した。
IFNの回収率は130％であつたが、夾雑タン
パクとの分離はできなかつた。従つて、SP
−セフアデツクスＣ−25によるイオン交換ク
ロマトグラフイーは大量の粗材料を濃縮する
段階において利用できるものと思われる。
であり、大量産生も可能であることがわかつ
た。また、プライミング効果もあり、β型
IFNを産生するにはこの株を用いて行なうこ
とが、従来の線維芽細胞より産生するよりも
はるかにすぐれていることがわかつた。精製
についても、80％硫安による沈殿で濃縮が可
能である。 (11) SP−セフアデツクスＣ−25によるクロマ
トグラフイー（第14表） RPMI8402株が産生した粗IFN液をSP−
セフアデツクスＣ−25にPH4.0の0.1M酢酸ナ
トリウム溶液中で吸着させたのち、PH8.0の
0.1M四ホウ酸ナトリウム溶液で溶出した。
IFNの回収率は130％であつたが、夾雑タン
パクとの分離はできなかつた。従つて、SP
−セフアデツクスＣ−25によるイオン交換ク
ロマトグラフイーは大量の粗材料を濃縮する
段階において利用できるものと思われる。
【表】
(12) セフアデツクスＧ−100によるクロマトグ
ラフイー（第15表） 「セフアデツクスＧ−100」を用いて、ゲ
ル過を行なつた。流出液は、1M NaClを
含むPBS（−）を使つた。IFN活性を含むフ
ラクシヨンは大部分の夾雑タンパクより遅れ
て流出してくるため、「セフアデツクスＧ−
100」によるゲル過はIFN材料の精製に利
用できる。
ラフイー（第15表） 「セフアデツクスＧ−100」を用いて、ゲ
ル過を行なつた。流出液は、1M NaClを
含むPBS（−）を使つた。IFN活性を含むフ
ラクシヨンは大部分の夾雑タンパクより遅れ
て流出してくるため、「セフアデツクスＧ−
100」によるゲル過はIFN材料の精製に利
用できる。
【表】
【表】
なお、Blue Dextran2000（分子量2000000）
のピークが分画番号10付近に、Bovine
Serum Albumin（分子量67000）のピークが
分画番号13〜14付近に、
ChymotrypsinogenA（分子量25000）のピー
クが分画番号19付近に、Cytochrome Ｃ（分
子量12384）のピークが分画番号22付近に、
それぞれ認められた。 (13) SDS−電気泳動（第16表） 0.1％SDS−アクリルアミドゲル電気泳動
を行なつた。分離用ゲル濃度15％、濃縮用ゲ
ル濃度３％の、トリス塩酸緩衝液系を用い
た。IFN活性はほぼ単一のピークに見られ、
大部分の夾雑タンパクとは完全に分離でき
る。IFN回収率は10％程度で低いれけど、比
活性の高い材料を得るための精製法として利
用価値は高い。
のピークが分画番号10付近に、Bovine
Serum Albumin（分子量67000）のピークが
分画番号13〜14付近に、
ChymotrypsinogenA（分子量25000）のピー
クが分画番号19付近に、Cytochrome Ｃ（分
子量12384）のピークが分画番号22付近に、
それぞれ認められた。 (13) SDS−電気泳動（第16表） 0.1％SDS−アクリルアミドゲル電気泳動
を行なつた。分離用ゲル濃度15％、濃縮用ゲ
ル濃度３％の、トリス塩酸緩衝液系を用い
た。IFN活性はほぼ単一のピークに見られ、
大部分の夾雑タンパクとは完全に分離でき
る。IFN回収率は10％程度で低いれけど、比
活性の高い材料を得るための精製法として利
用価値は高い。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト胸腺性リンパ芽球細胞の株化細胞である
RPM1 8402株にウイルスを作用させてβ型イン
ターフエロンを産生させることを特徴とする、β
型インターフエロンの製造法。 ２ ウイルスがセンダイウイルスである、特許請
求の範囲第１項に記載のβ型インターフエロンの
製造法。 ３ RPM1 8402株をウイルスの存在下に浮遊培
養してβ型インターフエロンを産生させる、特許
請求の範囲第１〜２項のいずれかに記載のβ型イ
ンターフエロンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56059516A JPS57175125A (en) | 1981-04-20 | 1981-04-20 | Preparation of beta-interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56059516A JPS57175125A (en) | 1981-04-20 | 1981-04-20 | Preparation of beta-interferon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57175125A JPS57175125A (en) | 1982-10-28 |
| JPH0138478B2 true JPH0138478B2 (ja) | 1989-08-14 |
Family
ID=13115500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56059516A Granted JPS57175125A (en) | 1981-04-20 | 1981-04-20 | Preparation of beta-interferon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57175125A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR199901968T2 (xx) * | 1996-12-24 | 1999-12-21 | Biogen, Inc. | Sabit s�v� interferon form�lleri. |
-
1981
- 1981-04-20 JP JP56059516A patent/JPS57175125A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DEVELOP BIOL STANDARB.=1979 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57175125A (en) | 1982-10-28 |
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