JPH0139751B2 - - Google Patents
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- JPH0139751B2 JPH0139751B2 JP55163054A JP16305480A JPH0139751B2 JP H0139751 B2 JPH0139751 B2 JP H0139751B2 JP 55163054 A JP55163054 A JP 55163054A JP 16305480 A JP16305480 A JP 16305480A JP H0139751 B2 JPH0139751 B2 JP H0139751B2
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- JP
- Japan
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- plasmid
- strain
- solution
- bacillus subtilis
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は、プラスミドの製法および新規なプラ
スミドに関し、ベクターとして使用可能なプラス
ミドを提供することを目的とするものである。 遺伝子操作により、微生物に新らしい能力を賦
与し、それを用いて種々の有用な物質を生産する
技術の開発が進められており、微生物に新らしい
能力を与えるためのベクターとして、使用可能と
思われるプラスミド（プラスミドDNA）も、
種々のものが知られるようになつた。しかし、広
い用途に充分に対応するため更に多くの有用かつ
安全なプラスミドの開発が期待されている。 本発明者は、腸内に常在し病原性に問題のない
ストレプトコツカス・フエカリス
（Streptococcus faecalis）に由来するプラスミ
ドが枯草菌（Bacillus subtilis）に安定に存在
し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性
を有しており、ベクターとして用い得ることを確
かめ、本発明を完成した。 すなわち、本発明はストレプトコツカス・フエ
カリスの菌体からプラスミドを分離し、これを枯
草菌に移入し、再びこれよりプラスミドを分離す
ることにより、プラスミドを製造する方法および
このようにして得られたプラスミドpTP62に関
するものである。 ストレプトコツカス・フエカリスは腸内常在連
鎖球菌として知られており、これをプラスミドの
供与体とすることは安全性の面から好ましいと考
えられる。この菌種には多くの株が知られている
が、処理操作上何らかのマーカーのあることが便
利であり、例えば薬剤に対する低抗性（耐性）の
ある株が好ましい。特にテトラサイクリン耐性
株、クロラムフエニコール耐性株はプラスミドを
得るために適していると思われる。代表的な例と
しては、本発明者が、テトラサイクリン、クロラ
ムフエニコール、ストレプトマイシン、カナマイ
シンおよびエリスロマイシン耐性の野生株である
KSf2株と薬剤耐性をもたない株であるKSf24ｍ
株の接合伝達により得たKSf2−２株を挙げるこ
とができ、この株は微生物工業技術研究所に（受
託番号微工研菌寄）第5772号として保管されてい
る。 ストレプトコツカス・フエカリスの培養は、通
常この菌種に用いられている培養法によつてよ
く、例えばブレインハートインフエージヨン培地
（BHI培地）、CY培地等肉エキス、ペプトン、無
機塩類等を含む普通培地で25〜40℃好ましくは37
℃前後で十数時間乃至数十時間、好ましくは18〜
24時間培養する。菌体は遠心分離等によつて集
め、必要に応じて洗滌し、適当な緩衝液に懸濁さ
せ、界面活性剤の存在下リゾチームを作用させて
溶菌する。界面活性剤としては、ブリジ−58
（Brij−58、花王アトラス(株)）（菌懸濁液中の最終
濃度0.2〜１％、特に0.7％程度（ｗ／ｖ））、Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム（半井化学薬品
(株)）（最終濃度１〜10％、特に2.5％程度）および
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、最終濃度１〜10
％、特に2.5％程度）等を挙げることができ、後
に行なう処理に応じて適宜選択する。リゾチーム
は菌懸濁液中に数十μｇ乃至数百μｇ／mlになる
程度の範囲で加えればよく、０℃乃至37℃に数十
分乃至数時間、例えば、30分〜３時間作用させれ
ば溶菌する。溶菌後は50℃程度に温度を上げて
DNA分解酵素（DNase）によるDNAの分解を
防ぐのが適当である。溶菌処理液からプラスミド
を分離するには一般的な方法でよく、例えば、塩
化セシウムを用いた密度勾配遠心法が適当であ
り、臭化エチジウムの存在下で行なうのがより好
ましい。得られる所望の分画は、イソアミルアル
コール、ｎ−オクタノール等のアルコール類で臭
化エチジウムを抽出して除去し、適当な緩衝液を
用いて透析してセシウムを除去し、プラスミドの
水溶液を得る。このプラスミドの量はUV吸収に
より測定することができ、このものは凍結保存あ
るいは冷蔵による保存も可能である。プラスミド
は電子顕微鏡によつて長さを測定し、分子量を計
算することができる。 次に、得られたストレプトコツカス・フエカリ
スのプラスミドを枯草菌に移入し、枯草菌の形質
転換を行なうが、このとき異種のプラスミドは枯
草菌によつて破壊されることがあるので、制限酵
素および修飾酵素の欠損した株を使用するのが適
している。制限欠損、修飾欠損の枯草菌は人工的
に変異させて作成することもでき（Uzumi et al
Molec.gen.Genet152 65−69（1977）参照）、ま
た、オハイオ州大学のバチル・ジエネデイツク・
ストツク・センターにBGSC No.1A253として保
管され、何人も入手可能なRM125株のような公
知の株を使用することもできる。 プラスミドの移入に当つては、枯草菌にDNA
取込み能を与え、コンピテント細胞とすることが
有利であり、このためにはアナグノストプロスら
の方法（C.Anagnostopoulos ＆ J.Spizizen；
J.Bacteriol.81 741〜746（1961））を応用するの
が適当であり、カザミノ酸、マグネシウム、グル
タメイト等を含む合成培地で培養する。その他に
もチヤンらのプロトプラストを用いる形質転換法
（S.Chang et al（Molec.gen.Genet.168 111−
115（1979）を用いることもできる。 コンピテント細胞化した枯草菌をプラスミド溶
液と合せて適当な培地、例えばBHI培地で37℃
程度に数十分乃至数時間培養すると枯草菌は形質
転換される。この際培地に適宜抗生物質等を加え
て培養し、プラスミドにより伝達された薬剤耐性
により望む菌株を分離取得するのが便利である。 形質転換された枯草菌は、適当な培地で増殖さ
せてプラスミドを多量に生産することも可能であ
るが、生育させやすい菌株を用いて生産する方が
工業化などには有利であり、イノシン、イノシン
酸、アデニル酸等の製造に使用されている菌株な
ど多くの菌株が使用可能である。従つて形質転換
された枯草菌からプラスミドを分離し、これを別
の株の枯草菌に移入するが、この操作は前述のス
トレプトコツカス・フエカリスからのプラスミド
の分離と枯草菌への移入と同じく行なえばよい。 安全性の面からは特定の栄養素がなければ生育
できないような株を選び意図的な培養以外には増
殖しないものを用いるのが好ましい。この種の菌
株の例としては、アルギニン、メチオニン、ヒス
チジン、アデニン、ロイシン、トリプトフアン、
チロシン等の一種または二種以上を要求する株な
どがあり、代表例としては実験室などでも広く用
いられている枯草菌168アデニン要求株、枯草菌
168ロイシン、メチオニン、アデニン、ヒスチジ
ン要求株、枯草菌168アデニン、グアニン要求株
などがある。このような株を形質転換して必要な
栄養素を含有した培地で増殖させた後プラスミド
を前述と同様に分離すると、ベクターとして使用
可能なプラスミドを得ることができる。 本発明の態様としては、例えば、KSf2−２株
から得たプラスミドを枯草菌RM125（ｒ−Ｍ、ｍ
−Ｍ、arg15、leuA8）（以下RM125と略す）に
移入し、クロラムフエニコール含有ブレインハー
トインフユージヨン寒天平板で培養して得た株
（KBS14株）からプラスミドを分離すると、分子
量約9.1メガダルトン（Md）のプラスミドと約
18.4Mdのプラスミドが得られる。これらで枯草
菌168を形質転換し得られるクロラムフエニコー
ル耐性株よりプラスミドを分離すると、分子量約
9.1MdのプラスミドpTP62が得られる。このもの
の制限酵素による切断個所数および生じるフラグ
メントの分子量は次の通りである。
スミドに関し、ベクターとして使用可能なプラス
ミドを提供することを目的とするものである。 遺伝子操作により、微生物に新らしい能力を賦
与し、それを用いて種々の有用な物質を生産する
技術の開発が進められており、微生物に新らしい
能力を与えるためのベクターとして、使用可能と
思われるプラスミド（プラスミドDNA）も、
種々のものが知られるようになつた。しかし、広
い用途に充分に対応するため更に多くの有用かつ
安全なプラスミドの開発が期待されている。 本発明者は、腸内に常在し病原性に問題のない
ストレプトコツカス・フエカリス
（Streptococcus faecalis）に由来するプラスミ
ドが枯草菌（Bacillus subtilis）に安定に存在
し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性
を有しており、ベクターとして用い得ることを確
かめ、本発明を完成した。 すなわち、本発明はストレプトコツカス・フエ
カリスの菌体からプラスミドを分離し、これを枯
草菌に移入し、再びこれよりプラスミドを分離す
ることにより、プラスミドを製造する方法および
このようにして得られたプラスミドpTP62に関
するものである。 ストレプトコツカス・フエカリスは腸内常在連
鎖球菌として知られており、これをプラスミドの
供与体とすることは安全性の面から好ましいと考
えられる。この菌種には多くの株が知られている
が、処理操作上何らかのマーカーのあることが便
利であり、例えば薬剤に対する低抗性（耐性）の
ある株が好ましい。特にテトラサイクリン耐性
株、クロラムフエニコール耐性株はプラスミドを
得るために適していると思われる。代表的な例と
しては、本発明者が、テトラサイクリン、クロラ
ムフエニコール、ストレプトマイシン、カナマイ
シンおよびエリスロマイシン耐性の野生株である
KSf2株と薬剤耐性をもたない株であるKSf24ｍ
株の接合伝達により得たKSf2−２株を挙げるこ
とができ、この株は微生物工業技術研究所に（受
託番号微工研菌寄）第5772号として保管されてい
る。 ストレプトコツカス・フエカリスの培養は、通
常この菌種に用いられている培養法によつてよ
く、例えばブレインハートインフエージヨン培地
（BHI培地）、CY培地等肉エキス、ペプトン、無
機塩類等を含む普通培地で25〜40℃好ましくは37
℃前後で十数時間乃至数十時間、好ましくは18〜
24時間培養する。菌体は遠心分離等によつて集
め、必要に応じて洗滌し、適当な緩衝液に懸濁さ
せ、界面活性剤の存在下リゾチームを作用させて
溶菌する。界面活性剤としては、ブリジ−58
（Brij−58、花王アトラス(株)）（菌懸濁液中の最終
濃度0.2〜１％、特に0.7％程度（ｗ／ｖ））、Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム（半井化学薬品
(株)）（最終濃度１〜10％、特に2.5％程度）および
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、最終濃度１〜10
％、特に2.5％程度）等を挙げることができ、後
に行なう処理に応じて適宜選択する。リゾチーム
は菌懸濁液中に数十μｇ乃至数百μｇ／mlになる
程度の範囲で加えればよく、０℃乃至37℃に数十
分乃至数時間、例えば、30分〜３時間作用させれ
ば溶菌する。溶菌後は50℃程度に温度を上げて
DNA分解酵素（DNase）によるDNAの分解を
防ぐのが適当である。溶菌処理液からプラスミド
を分離するには一般的な方法でよく、例えば、塩
化セシウムを用いた密度勾配遠心法が適当であ
り、臭化エチジウムの存在下で行なうのがより好
ましい。得られる所望の分画は、イソアミルアル
コール、ｎ−オクタノール等のアルコール類で臭
化エチジウムを抽出して除去し、適当な緩衝液を
用いて透析してセシウムを除去し、プラスミドの
水溶液を得る。このプラスミドの量はUV吸収に
より測定することができ、このものは凍結保存あ
るいは冷蔵による保存も可能である。プラスミド
は電子顕微鏡によつて長さを測定し、分子量を計
算することができる。 次に、得られたストレプトコツカス・フエカリ
スのプラスミドを枯草菌に移入し、枯草菌の形質
転換を行なうが、このとき異種のプラスミドは枯
草菌によつて破壊されることがあるので、制限酵
素および修飾酵素の欠損した株を使用するのが適
している。制限欠損、修飾欠損の枯草菌は人工的
に変異させて作成することもでき（Uzumi et al
Molec.gen.Genet152 65−69（1977）参照）、ま
た、オハイオ州大学のバチル・ジエネデイツク・
ストツク・センターにBGSC No.1A253として保
管され、何人も入手可能なRM125株のような公
知の株を使用することもできる。 プラスミドの移入に当つては、枯草菌にDNA
取込み能を与え、コンピテント細胞とすることが
有利であり、このためにはアナグノストプロスら
の方法（C.Anagnostopoulos ＆ J.Spizizen；
J.Bacteriol.81 741〜746（1961））を応用するの
が適当であり、カザミノ酸、マグネシウム、グル
タメイト等を含む合成培地で培養する。その他に
もチヤンらのプロトプラストを用いる形質転換法
（S.Chang et al（Molec.gen.Genet.168 111−
115（1979）を用いることもできる。 コンピテント細胞化した枯草菌をプラスミド溶
液と合せて適当な培地、例えばBHI培地で37℃
程度に数十分乃至数時間培養すると枯草菌は形質
転換される。この際培地に適宜抗生物質等を加え
て培養し、プラスミドにより伝達された薬剤耐性
により望む菌株を分離取得するのが便利である。 形質転換された枯草菌は、適当な培地で増殖さ
せてプラスミドを多量に生産することも可能であ
るが、生育させやすい菌株を用いて生産する方が
工業化などには有利であり、イノシン、イノシン
酸、アデニル酸等の製造に使用されている菌株な
ど多くの菌株が使用可能である。従つて形質転換
された枯草菌からプラスミドを分離し、これを別
の株の枯草菌に移入するが、この操作は前述のス
トレプトコツカス・フエカリスからのプラスミド
の分離と枯草菌への移入と同じく行なえばよい。 安全性の面からは特定の栄養素がなければ生育
できないような株を選び意図的な培養以外には増
殖しないものを用いるのが好ましい。この種の菌
株の例としては、アルギニン、メチオニン、ヒス
チジン、アデニン、ロイシン、トリプトフアン、
チロシン等の一種または二種以上を要求する株な
どがあり、代表例としては実験室などでも広く用
いられている枯草菌168アデニン要求株、枯草菌
168ロイシン、メチオニン、アデニン、ヒスチジ
ン要求株、枯草菌168アデニン、グアニン要求株
などがある。このような株を形質転換して必要な
栄養素を含有した培地で増殖させた後プラスミド
を前述と同様に分離すると、ベクターとして使用
可能なプラスミドを得ることができる。 本発明の態様としては、例えば、KSf2−２株
から得たプラスミドを枯草菌RM125（ｒ−Ｍ、ｍ
−Ｍ、arg15、leuA8）（以下RM125と略す）に
移入し、クロラムフエニコール含有ブレインハー
トインフユージヨン寒天平板で培養して得た株
（KBS14株）からプラスミドを分離すると、分子
量約9.1メガダルトン（Md）のプラスミドと約
18.4Mdのプラスミドが得られる。これらで枯草
菌168を形質転換し得られるクロラムフエニコー
ル耐性株よりプラスミドを分離すると、分子量約
9.1MdのプラスミドpTP62が得られる。このもの
の制限酵素による切断個所数および生じるフラグ
メントの分子量は次の通りである。
【表】
【表】
実施例 １
(1) ストレプトコツカス・フエカリスの野生株
KSf2株由来のテトラサイクリン、クロラムフ
エニコール、ストレプトマイシン、カナマイシ
ン、エリスロマイシン耐性のKSf24ｍ株への接
合伝達 ストレプトコツカス・フエカリスKSf2株お
よびフシジン酸とリフアンピシンに耐性をもち
他の薬剤には耐性をもたずかつプラスミドを持
たないKSf24ｍ株をブレインハートインフユー
ジヨン（BHI）液体培地に接種し、37℃で振
とう培養する。吸光度0.8（600nｍ）になつた
時、KSf2株の培養液0.1ml、KSf24ｍ株の培養
液0.01mlを混和しBHI平板に塗布する。37℃、
20時間培養後、0.85％塩化ナトリウム溶液1.0
mlを加え菌苔をかきとり菌懸濁液とする。この
菌懸濁液を0.85％塩化ナトリウム溶液で希釈し
て10倍、100倍液を作る。 リフアンピシン（25μｇ／ml）、フシジン酸
（25μｇ／ml）、テトラサイクリン（3.13μｇ／
ml）を含有するBHI平板に菌懸濁液の原液、
10倍希釈液、100倍希釈液をそれぞれ0.1mlずつ
塗布する。37℃、48時間培養後、このBHI平
板に生じたコロニーについて同じ組成のBHI
平板を用いて３回シングルコロニー分離を行
う。 ここに得られたコロニーについて、テトラサ
イクリン、エリスロマイシン、クロラムフエニ
コール、ストレプトマイシン、カナマイシン、
リフアンピシン、フシジン酸に対する感受性試
験を行なつた。すべての薬剤に耐性であつたコ
ロニーをKSf2−２株とした。 (2) KSf2−２株からのプラスミドDNAの分離 KSf2−２株をBHI培地10mlに接種し、一夜
静置培養した。この培養液をCY培地（リン酸
二カリウム0.7％、リン酸一カリウム0.3％、硫
酸アンモニウム0.1％、クエン酸ナトリウム
0.05％、デイフコカザミノ酸0.2％、デイフコ
酵母抽出物0.1％、硫酸マグネシウム0.025％、
ブドウ糖0.5％、PH7.0）10mlに吸光度0.1（600n
ｍ）になるように加えた。37℃で振とう培養
し、吸光度0.3（600nｍ）の時にデオキシアデノ
シンを最終濃度250μｇ／ml）になるように加
えた。３分後トリチウムチミジンを最終濃度
10μCi／mlになるように加えた。 吸光度0.8（600nｍ）で氷にて発育を停止し、
10000×ｇで15分間４℃に於てブロスから菌体
を分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜で除い
た。ペレツトをTES緩衝液（0.05M塩化ナトリ
ウム、0.005M EDTA含有トリス−塩酸緩衝液
（PH8.0））によつて再懸濁した。次に、
0.5MEDTA液0.2ml、10mg／ml濃度のリゾチー
ム液0.1mlを加え、混合物を10分間37℃で培養
した。ブリジー58を最終濃度0.5％となるよう
に加え、37℃、10分間培養した。次にＮ−ラウ
ロイルサルコシンナトリウムを最終濃度2.5％
になるように加え、50℃、30分間培養し溶菌を
行つた。溶菌液をピペツトにて粘性をとり、軟
化させたのち、塩化セシウム、臭化エチジウム
と混合し密度1.553の溶液とした。この溶液を
126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠心した。 遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各
分画ごとに10μをワツトマンろ紙GF／Ａに吸
着させ、このろ紙に吸着されたトリチウムの放
射活性を液体シンチレーシヨンカウンター（パ
ツカード3300）にて測定し、cpmにて表わす。
染色体DNAに由来する高活性を示す分画の大
きなピークとプラスミドDNAに由来する小さ
なピークの２つを与える。この小さなピークを
示した分画をとり、ｎ−オクタノールで２回処
理することにより、臭化エチジウムを抽出除去
した。次に水層をSSC（0.15M塩化ナトリウム、
0.015Mクエン酸ナトリウム、PH7.0）の10倍希
釈液に対して透析してプラスミドを分離した。
分子量37.5Md (3) KSf2−２株から得られたプラスミドDNAに
よる枯草菌RM125株の形質転換 一次培養培地を次のようにして作成した。 K2HPO4・3H2O 18.3ｇ KH2PO4 6.0ｇ クエン酸ナトリウム・2H2O 1.0ｇ 硫酸アンモニウム 2.0ｇ カザミノ酸 0.5ｇ 蒸留水 80 ml 以上を溶解後121℃、15分間滅菌する。本溶
液に別滅菌したマグネシウム溶液（20％
MgSO4・7H2O）10mlとグルタメイト溶液
（100mg／ml）１ml、トリプトフアン溶液（５
mg／ml）10mlを加える。本混合液10mlをとりロ
イシン溶液（５mg／ml）１ml、アルギニン溶液
（５mg／ml）１ml、ブドウ糖溶液（50％）１ml、
滅菌蒸留水87mlを加え一次培養培地とした。こ
れに枯草菌の制限骸欠損−修飾欠損株である
RM125株を接種する。 一次培養培地の菌接種時の濁度はクレツト単
位10（クレツトサマーソン吸光度計、フイルタ
ー番号54）になるようにした。接種後、37℃で
振とう培養し、クレツト単位100となつたとき
にグリセリン0.1mlが入つた小試験管に２mlず
つ分注し、ドライアイス・アセトンにより急速
に凍結して−80℃で保存した。保存した一次培
養全量を10mlの下記組成の二次培養培地に接種
した。 二次培養培地は次のようにして作成した。 K2HPO4・3H2O 18.3ｇ KH2PO4 6.0ｇ クエン酸ナトリウム・2H2O 1.0ｇ 硫酸アンモニウム 2.0ｇ 蒸留水 80 ml 溶解滅菌後、本混合液８mlに別滅菌したマグ
ネシウム溶液（20％MgSO4・7H2O）１ml、グ
ルタメイト溶液（100mg／ml）0.1ml、トリプト
フアン溶液（５mg／ml）0.1ml、ヒスチジン溶
液（５mg／ml）0.1ml、５％カズアミノ酸溶液
0.2ml、滅菌蒸留水0.5mlを加える。本混合物１
mlに別滅菌したロイシン溶液（５mg／ml）0.1
ml、アルギニン溶液（５mg／ml）0.1ml、ブド
ウ糖（50％）0.1ml、滅菌蒸留水8.7mlを加え二
次培養培地とした。この10mlに保存した一次培
養全量を接種した。37℃で振とう培養後クレツ
ト単位110となつたコンピテント培養0.9mlに
KSf2−２株より得られたプラスミドDNA溶液
0.1mlを加え、さらに37℃１時間静置培養する。 次にBHI培地４mlを加え37℃、24時間振と
う培養する。本培養0.1mlをクロラムフエニコ
ール6.25μｇ／ml含有のBHI寒天平板に塗布し、
37℃、24時間培養し、109〜1010株に１株の頻
度でクロラムフエニコール耐性株を得た。 得られたクロラムフエニコール耐性株を
KBS14株とした。KBS14株は分子量9.1、18.4
メガダルトンのプラスミドDNA2種を持つてい
た。 枯草菌KBS14株からのプラスミドDNAの抽
出方法はストレプトコツカス・フエカリス
KSf2−２株からのプラスミドDNAの分離方法
と同様にして行つた。 (4) 枯草菌KBS14株より得られたプラスミド
DNAによる枯草菌LMAH株の形質転換 枯草菌LMAH株（Bacillus
subtilis168LMAH761222）は枯草菌RM125株
と同一の方法によつてコンピテンス培養した。
ただし、一次培養培地のアルギニン溶液の代り
にメチオニン溶液（５mg／ml）１ml、ヒスチジ
ン溶液（５mg／ml）１ml、アデニン溶液（２
mg／ml）１mlを加え蒸留水は85mlとした。また
二次培養培地も同様にアルギニン溶液の代りに
メチオニン溶液（５mg／ml）0.1ml、ヒスチジ
ン溶液（５mg／ml）0.1ml、アデニン溶液（５
mg／ml）0.5mlを加え蒸留水は８mlとした。こ
れに枯草菌KBS14株より得たプラスミドDNA
を加えて(4)と同様にして培養し、クロラムフエ
ニコール耐性コロニーのKBS15株を得た。 (5) ストレプトコツカス・フエカリスKSf2−２
株由来のクロラムフエニコール耐性プラスミド
を所有する枯草菌KBS15株からのプラスミド
pTP62の単離 枯草菌KBS15株をデイフイコ・ラボラトリ
ーズ製ブレインハートインフユージヨン
（BHI）培地100mlに接種する。この培地の組
成は次に示す。 カーフブレイン インフユージヨン 20.0 ％ ビーフハート インフユージヨン 25.0 ％ プロテオース ペプトン 1.0 ％ バクト−デキストロース 0.2 ％ 塩化ナトリウム 0.5 ％ リン酸二ナトリウム 0.25％ 蒸留水 1000 ml PHが7.4±0.2であることを確認する。培地を
500ml坂口フラスコ中で予め滅菌する。接種後
フラスコを37℃、約18〜24時間振とう培養す
る。 この細胞懸濁液を１％の率で同培地の20本の
フラスコに接種するのに使用する。37℃で18〜
24時間振とう培養後、10000×ｇで約15分間４
℃に於てブロスから分離し、上澄を菌体ペレツ
トから傾斜で除く。上澄を捨てペレツトを
TES緩衝液によつて２回洗浄後、100mlの25％
蔗糖含有TES緩衝液に再懸濁する。次に0.5M
−EDTA溶液40ml、10mg／ml濃度のリヅチー
ム溶液20mlを加え混合物を30分間37℃で培養す
る。次に50mg／ml濃度のブリジ−58 20mlを加
え、混合物を37℃、10分間培養する。さらに
250mg／ml濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナ
トリウム20mlを加え、50℃で10〜30分間培養す
る（細胞破壊）。溶解物を26000×ｇ、30分間冷
却遠心後、上澄に5M濃度の塩化ナトリウム溶
液50mlを加え一夜放置後、ポリエチレングリコ
ール6000を最終濃度10％となるように加え、さ
らに一夜４℃にて放置した。この混合物を
10000×ｇ、15分間遠心し、ペレツトをTES緩
衝液に溶解した。この溶液を塩化セシウム、臭
化エチジウムと混合し、密度1.553の溶液を与
える。この溶液を126000×ｇで平衡まで（約40
時間）遠心する。紫外線照射下で（365nｍ）
線状染色体及びプラスミドDNAは強い螢光を
発するバンドとして遠心機チユーブの中に見ら
れる。このプラスミドDNAを密度勾配から取
り出し、ｎ−オクタノールで２回抽出すること
により臭化エチジウムを除き、次に水層を10倍
希釈SSC緩衝液に対して透析してpTP62を得
た。 (6) 制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動 すべての使用制限酵素はベゼスタ・リサー
チ・ラボラトリーズ・インク製のものを使用し
た。 プラスミドDNAの消化は次の条件により行
なつた。 Hinc 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.9）、
60ｍＭ塩化ナトリウム、6.6ｍＭ塩化マグネ
シウム、１ｍＭジチオスレイトール
（DTT）、37℃ Tac 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
10ｍＭ塩化マグネシウム、0.1ｍＭ DTT、
60℃ EcoR 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）、
５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭメルカプト
エタノール、50ｍＭ塩化ナトリウム、37℃ Hpa 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ DTT、
37℃ Hind 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、60ｍＭ塩化ナトリ
ウム、37℃ Pst 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
10ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ硫酸アンモ
ニウム、100μｇ／mlBSA、30℃ Hinf ６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
６ｍＭ塩化マグネシウム、100ｍＭ塩化ナト
リウム、６ｍM2−メルカプトエタノール、
37℃ Taq 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.4）、
６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍM2−メルカ
プトエタノール、65℃ Sma 15ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）、
６ｍＭ塩化マグネシウム、15ｍＭ塩化カリウ
ム、32℃ Hpa 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
10ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ DTT、
６ｍＭ塩化カリウム、37℃ 消化混合物はシヤープ等によつてつくられた
１％アガロースゲル中で分析した。（J.Sharp
et al「アガロース−臭化エチジウム電気泳動分
析法を用いたヘモフイルスパラインフルエンザ
菌における２種の制限酵素活性の反応」
Biochemistry、12、3055〜3063（1973））
EcoRI消化λDNAを分子量対照として使用し
た。（トーマス（Thomas）ら、1975「EcoRI制
限酵素によるバクテリオフアージラムダDNA
の解裂の研究」J.Mol.Biol.、91、315〜328） pTP62の制限酵素開裂点の数および開裂断
片の分子量は先に示した通りである。 実施例 ２ (1) 実施例１の(4)の枯草菌LMAH株の代りに枯
草菌168AG株〔Bacillus subtilis405−113−B6
（ATCC No.19163）〕を使用し、同様に培養し
てKBS15b株を得た。 ただし、培地としては、一次培養培地のロイ
シン溶液及びアルギニン溶液の代りにアデニン
溶液（２mg／ml）１ml及びグアニン（５mg／
ml）１mlを加えたもの、二次培養培地のロイシ
ン溶液及びアルギニン溶液の代りにアデニン溶
液（５mg／ml）0.5ml及びグアニン（５mg／ml）
0.1mlを加えたものを使用した。 (2) 上記(1)で得た枯草菌15b株を実施例１の(4)と
同様に処理して実施例１と同一のプラスミド
pTP62を得た。
KSf2株由来のテトラサイクリン、クロラムフ
エニコール、ストレプトマイシン、カナマイシ
ン、エリスロマイシン耐性のKSf24ｍ株への接
合伝達 ストレプトコツカス・フエカリスKSf2株お
よびフシジン酸とリフアンピシンに耐性をもち
他の薬剤には耐性をもたずかつプラスミドを持
たないKSf24ｍ株をブレインハートインフユー
ジヨン（BHI）液体培地に接種し、37℃で振
とう培養する。吸光度0.8（600nｍ）になつた
時、KSf2株の培養液0.1ml、KSf24ｍ株の培養
液0.01mlを混和しBHI平板に塗布する。37℃、
20時間培養後、0.85％塩化ナトリウム溶液1.0
mlを加え菌苔をかきとり菌懸濁液とする。この
菌懸濁液を0.85％塩化ナトリウム溶液で希釈し
て10倍、100倍液を作る。 リフアンピシン（25μｇ／ml）、フシジン酸
（25μｇ／ml）、テトラサイクリン（3.13μｇ／
ml）を含有するBHI平板に菌懸濁液の原液、
10倍希釈液、100倍希釈液をそれぞれ0.1mlずつ
塗布する。37℃、48時間培養後、このBHI平
板に生じたコロニーについて同じ組成のBHI
平板を用いて３回シングルコロニー分離を行
う。 ここに得られたコロニーについて、テトラサ
イクリン、エリスロマイシン、クロラムフエニ
コール、ストレプトマイシン、カナマイシン、
リフアンピシン、フシジン酸に対する感受性試
験を行なつた。すべての薬剤に耐性であつたコ
ロニーをKSf2−２株とした。 (2) KSf2−２株からのプラスミドDNAの分離 KSf2−２株をBHI培地10mlに接種し、一夜
静置培養した。この培養液をCY培地（リン酸
二カリウム0.7％、リン酸一カリウム0.3％、硫
酸アンモニウム0.1％、クエン酸ナトリウム
0.05％、デイフコカザミノ酸0.2％、デイフコ
酵母抽出物0.1％、硫酸マグネシウム0.025％、
ブドウ糖0.5％、PH7.0）10mlに吸光度0.1（600n
ｍ）になるように加えた。37℃で振とう培養
し、吸光度0.3（600nｍ）の時にデオキシアデノ
シンを最終濃度250μｇ／ml）になるように加
えた。３分後トリチウムチミジンを最終濃度
10μCi／mlになるように加えた。 吸光度0.8（600nｍ）で氷にて発育を停止し、
10000×ｇで15分間４℃に於てブロスから菌体
を分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜で除い
た。ペレツトをTES緩衝液（0.05M塩化ナトリ
ウム、0.005M EDTA含有トリス−塩酸緩衝液
（PH8.0））によつて再懸濁した。次に、
0.5MEDTA液0.2ml、10mg／ml濃度のリゾチー
ム液0.1mlを加え、混合物を10分間37℃で培養
した。ブリジー58を最終濃度0.5％となるよう
に加え、37℃、10分間培養した。次にＮ−ラウ
ロイルサルコシンナトリウムを最終濃度2.5％
になるように加え、50℃、30分間培養し溶菌を
行つた。溶菌液をピペツトにて粘性をとり、軟
化させたのち、塩化セシウム、臭化エチジウム
と混合し密度1.553の溶液とした。この溶液を
126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠心した。 遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各
分画ごとに10μをワツトマンろ紙GF／Ａに吸
着させ、このろ紙に吸着されたトリチウムの放
射活性を液体シンチレーシヨンカウンター（パ
ツカード3300）にて測定し、cpmにて表わす。
染色体DNAに由来する高活性を示す分画の大
きなピークとプラスミドDNAに由来する小さ
なピークの２つを与える。この小さなピークを
示した分画をとり、ｎ−オクタノールで２回処
理することにより、臭化エチジウムを抽出除去
した。次に水層をSSC（0.15M塩化ナトリウム、
0.015Mクエン酸ナトリウム、PH7.0）の10倍希
釈液に対して透析してプラスミドを分離した。
分子量37.5Md (3) KSf2−２株から得られたプラスミドDNAに
よる枯草菌RM125株の形質転換 一次培養培地を次のようにして作成した。 K2HPO4・3H2O 18.3ｇ KH2PO4 6.0ｇ クエン酸ナトリウム・2H2O 1.0ｇ 硫酸アンモニウム 2.0ｇ カザミノ酸 0.5ｇ 蒸留水 80 ml 以上を溶解後121℃、15分間滅菌する。本溶
液に別滅菌したマグネシウム溶液（20％
MgSO4・7H2O）10mlとグルタメイト溶液
（100mg／ml）１ml、トリプトフアン溶液（５
mg／ml）10mlを加える。本混合液10mlをとりロ
イシン溶液（５mg／ml）１ml、アルギニン溶液
（５mg／ml）１ml、ブドウ糖溶液（50％）１ml、
滅菌蒸留水87mlを加え一次培養培地とした。こ
れに枯草菌の制限骸欠損−修飾欠損株である
RM125株を接種する。 一次培養培地の菌接種時の濁度はクレツト単
位10（クレツトサマーソン吸光度計、フイルタ
ー番号54）になるようにした。接種後、37℃で
振とう培養し、クレツト単位100となつたとき
にグリセリン0.1mlが入つた小試験管に２mlず
つ分注し、ドライアイス・アセトンにより急速
に凍結して−80℃で保存した。保存した一次培
養全量を10mlの下記組成の二次培養培地に接種
した。 二次培養培地は次のようにして作成した。 K2HPO4・3H2O 18.3ｇ KH2PO4 6.0ｇ クエン酸ナトリウム・2H2O 1.0ｇ 硫酸アンモニウム 2.0ｇ 蒸留水 80 ml 溶解滅菌後、本混合液８mlに別滅菌したマグ
ネシウム溶液（20％MgSO4・7H2O）１ml、グ
ルタメイト溶液（100mg／ml）0.1ml、トリプト
フアン溶液（５mg／ml）0.1ml、ヒスチジン溶
液（５mg／ml）0.1ml、５％カズアミノ酸溶液
0.2ml、滅菌蒸留水0.5mlを加える。本混合物１
mlに別滅菌したロイシン溶液（５mg／ml）0.1
ml、アルギニン溶液（５mg／ml）0.1ml、ブド
ウ糖（50％）0.1ml、滅菌蒸留水8.7mlを加え二
次培養培地とした。この10mlに保存した一次培
養全量を接種した。37℃で振とう培養後クレツ
ト単位110となつたコンピテント培養0.9mlに
KSf2−２株より得られたプラスミドDNA溶液
0.1mlを加え、さらに37℃１時間静置培養する。 次にBHI培地４mlを加え37℃、24時間振と
う培養する。本培養0.1mlをクロラムフエニコ
ール6.25μｇ／ml含有のBHI寒天平板に塗布し、
37℃、24時間培養し、109〜1010株に１株の頻
度でクロラムフエニコール耐性株を得た。 得られたクロラムフエニコール耐性株を
KBS14株とした。KBS14株は分子量9.1、18.4
メガダルトンのプラスミドDNA2種を持つてい
た。 枯草菌KBS14株からのプラスミドDNAの抽
出方法はストレプトコツカス・フエカリス
KSf2−２株からのプラスミドDNAの分離方法
と同様にして行つた。 (4) 枯草菌KBS14株より得られたプラスミド
DNAによる枯草菌LMAH株の形質転換 枯草菌LMAH株（Bacillus
subtilis168LMAH761222）は枯草菌RM125株
と同一の方法によつてコンピテンス培養した。
ただし、一次培養培地のアルギニン溶液の代り
にメチオニン溶液（５mg／ml）１ml、ヒスチジ
ン溶液（５mg／ml）１ml、アデニン溶液（２
mg／ml）１mlを加え蒸留水は85mlとした。また
二次培養培地も同様にアルギニン溶液の代りに
メチオニン溶液（５mg／ml）0.1ml、ヒスチジ
ン溶液（５mg／ml）0.1ml、アデニン溶液（５
mg／ml）0.5mlを加え蒸留水は８mlとした。こ
れに枯草菌KBS14株より得たプラスミドDNA
を加えて(4)と同様にして培養し、クロラムフエ
ニコール耐性コロニーのKBS15株を得た。 (5) ストレプトコツカス・フエカリスKSf2−２
株由来のクロラムフエニコール耐性プラスミド
を所有する枯草菌KBS15株からのプラスミド
pTP62の単離 枯草菌KBS15株をデイフイコ・ラボラトリ
ーズ製ブレインハートインフユージヨン
（BHI）培地100mlに接種する。この培地の組
成は次に示す。 カーフブレイン インフユージヨン 20.0 ％ ビーフハート インフユージヨン 25.0 ％ プロテオース ペプトン 1.0 ％ バクト−デキストロース 0.2 ％ 塩化ナトリウム 0.5 ％ リン酸二ナトリウム 0.25％ 蒸留水 1000 ml PHが7.4±0.2であることを確認する。培地を
500ml坂口フラスコ中で予め滅菌する。接種後
フラスコを37℃、約18〜24時間振とう培養す
る。 この細胞懸濁液を１％の率で同培地の20本の
フラスコに接種するのに使用する。37℃で18〜
24時間振とう培養後、10000×ｇで約15分間４
℃に於てブロスから分離し、上澄を菌体ペレツ
トから傾斜で除く。上澄を捨てペレツトを
TES緩衝液によつて２回洗浄後、100mlの25％
蔗糖含有TES緩衝液に再懸濁する。次に0.5M
−EDTA溶液40ml、10mg／ml濃度のリヅチー
ム溶液20mlを加え混合物を30分間37℃で培養す
る。次に50mg／ml濃度のブリジ−58 20mlを加
え、混合物を37℃、10分間培養する。さらに
250mg／ml濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナ
トリウム20mlを加え、50℃で10〜30分間培養す
る（細胞破壊）。溶解物を26000×ｇ、30分間冷
却遠心後、上澄に5M濃度の塩化ナトリウム溶
液50mlを加え一夜放置後、ポリエチレングリコ
ール6000を最終濃度10％となるように加え、さ
らに一夜４℃にて放置した。この混合物を
10000×ｇ、15分間遠心し、ペレツトをTES緩
衝液に溶解した。この溶液を塩化セシウム、臭
化エチジウムと混合し、密度1.553の溶液を与
える。この溶液を126000×ｇで平衡まで（約40
時間）遠心する。紫外線照射下で（365nｍ）
線状染色体及びプラスミドDNAは強い螢光を
発するバンドとして遠心機チユーブの中に見ら
れる。このプラスミドDNAを密度勾配から取
り出し、ｎ−オクタノールで２回抽出すること
により臭化エチジウムを除き、次に水層を10倍
希釈SSC緩衝液に対して透析してpTP62を得
た。 (6) 制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動 すべての使用制限酵素はベゼスタ・リサー
チ・ラボラトリーズ・インク製のものを使用し
た。 プラスミドDNAの消化は次の条件により行
なつた。 Hinc 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.9）、
60ｍＭ塩化ナトリウム、6.6ｍＭ塩化マグネ
シウム、１ｍＭジチオスレイトール
（DTT）、37℃ Tac 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
10ｍＭ塩化マグネシウム、0.1ｍＭ DTT、
60℃ EcoR 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）、
５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭメルカプト
エタノール、50ｍＭ塩化ナトリウム、37℃ Hpa 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ DTT、
37℃ Hind 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
７ｍＭ塩化マグネシウム、60ｍＭ塩化ナトリ
ウム、37℃ Pst 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
10ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ硫酸アンモ
ニウム、100μｇ／mlBSA、30℃ Hinf ６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
６ｍＭ塩化マグネシウム、100ｍＭ塩化ナト
リウム、６ｍM2−メルカプトエタノール、
37℃ Taq 10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.4）、
６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍM2−メルカ
プトエタノール、65℃ Sma 15ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）、
６ｍＭ塩化マグネシウム、15ｍＭ塩化カリウ
ム、32℃ Hpa 20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
10ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ DTT、
６ｍＭ塩化カリウム、37℃ 消化混合物はシヤープ等によつてつくられた
１％アガロースゲル中で分析した。（J.Sharp
et al「アガロース−臭化エチジウム電気泳動分
析法を用いたヘモフイルスパラインフルエンザ
菌における２種の制限酵素活性の反応」
Biochemistry、12、3055〜3063（1973））
EcoRI消化λDNAを分子量対照として使用し
た。（トーマス（Thomas）ら、1975「EcoRI制
限酵素によるバクテリオフアージラムダDNA
の解裂の研究」J.Mol.Biol.、91、315〜328） pTP62の制限酵素開裂点の数および開裂断
片の分子量は先に示した通りである。 実施例 ２ (1) 実施例１の(4)の枯草菌LMAH株の代りに枯
草菌168AG株〔Bacillus subtilis405−113−B6
（ATCC No.19163）〕を使用し、同様に培養し
てKBS15b株を得た。 ただし、培地としては、一次培養培地のロイ
シン溶液及びアルギニン溶液の代りにアデニン
溶液（２mg／ml）１ml及びグアニン（５mg／
ml）１mlを加えたもの、二次培養培地のロイシ
ン溶液及びアルギニン溶液の代りにアデニン溶
液（５mg／ml）0.5ml及びグアニン（５mg／ml）
0.1mlを加えたものを使用した。 (2) 上記(1)で得た枯草菌15b株を実施例１の(4)と
同様に処理して実施例１と同一のプラスミド
pTP62を得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトコツカス・フエカリスから分離し
たプラスミドを枯草菌に移入し、これから分離さ
れた、分子量が約9.1×106ダルトンであつて制限
酵素による切断個所数および得られるフラグメン
トの分子量が次の通りであるプラスミドpTP62。 【表】 ２ ストレプトコツカス・フエカリスからプラス
ミドを分離し、これを枯草菌の制限欠損、修飾欠
損株に移入し、次いでこれからプラスミドを分離
し、さらにこのプラスミドを枯草菌に移入して増
殖させ、これからプラスミドを分離することを特
徴とするプラスミドpTP62の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55163054A JPS5786299A (en) | 1980-11-19 | 1980-11-19 | Plasmid and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55163054A JPS5786299A (en) | 1980-11-19 | 1980-11-19 | Plasmid and its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5786299A JPS5786299A (en) | 1982-05-29 |
| JPH0139751B2 true JPH0139751B2 (ja) | 1989-08-23 |
Family
ID=15766292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55163054A Granted JPS5786299A (en) | 1980-11-19 | 1980-11-19 | Plasmid and its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5786299A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
| US4656132A (en) * | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
-
1980
- 1980-11-19 JP JP55163054A patent/JPS5786299A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5786299A (en) | 1982-05-29 |
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