JPH0143267B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は血液サンプル中の網状赤血球の検出と
計数に関する。本発明はさらに螢光性組成物に関
する。

（従来技術） PNAまたはRNA含有物質の検出は、多くの場
合に必要とされる。網状赤血球はRNAを含有す
ることが知られている物質の１例であり、血液サ
ンプル中の網状赤血球の検出と計数は臨床家にと
つて重要である。血液サンプルの網状赤血球数は
赤血球生成活性の指標として用いられ、急性出血
及び溶血性貧血の場合に診断的及び予後的価値を
有し、鉄、ビタミンB₁₂及び葉酸療法の尺度でも
ある。技術上周知のように、網状赤血球は成熟し
た赤血球の前駆体であるので、網状赤血球なる用
語は成熟した赤血球を生ずる赤血球の発生と成長
を意味する。

今まで、血液サンプル中の網状赤血球は、ニユ
ーメチレンブルー（NMB）、ブリリアントクレ
シル青（BCB）、アクリジンオレンジ及びピロニ
ンＹのような適当な染色法を用いて、手動及び自
動の両方法によつて検出されてきた。

ニユーメチレンブルー染料による生体染色法は
網状赤血球検出の基準方法であると考えられ、こ
の染料を使用した場合には、RNAが沈澱する。
この方法は手動であり、多量（例えば、500〜
1000個）の赤血球の顕微鏡による計数を必要とす
るため、非常に遅速であり、100％近くまでの誤
りを生じやすい。ニユーメチレンブルーは非螢光
性であり、実際に沈降したRNAを沈降した染料
から区別することはしばしば困難である。

アクリジンオレンジは手動及び自動の両方法に
よつて網状赤血球の検出に今までにも幾らか用い
られている。アクリジンオレンジもRNAを沈降
させるが、これは消光を生ずる可能性があるた
め、RNA含量の定量を妨げることになる。さら
に、アクリジンオレンジは染色赤血球の拡散した
螢光分布を生じない。RNA含量が螢光に比例す
ることに基づく赤血球の成熟度のプロフイルは信
頼できない。アクリジンオレンジはフローサイト
メータ内のプラスチツク管に対して大きな親和性
を有しているため、バツクグランド値が増加し、
フローサイトメータ管からの染料の除去に時間の
かかる処置が必要になる。さらに、アクリジンオ
レンジ染色赤血球は自己螢光性赤血球ピークから
分離することが困難であり、網状赤血球数はニユ
ーメチレンブルーによつて得られた値よりも通常
低い。

ピロニンＹを用いると、ホルマリンによつて赤
血球を予め固定することが必要になるため、面倒
であり、時間を要し、一般に不充分な結果が得ら
れる。その上、ピロニンＹは非常に低い量子効率
を有するため、生ずる螢光シグナルも非常に低
い。

従つて、血液サンプル中の網状赤血球を正確に
検出する方法を提供するような、新しい網状赤血
球染色方法が必要とされている。

（発明の効果） 本発明の１態様では、網状赤血球をチオフラビ
ンＴ染料（塩基性イエロー＃ １、カラーインデツ
クス49005）によつて、またはクリサニリン染料
（塩基性オレンジ＃ 15、カラーインデツクス
46045）によつて染色する網状赤血球の改良検出
方法を提供する。「染料」なる用語は以後、上記
染料のいずれかを意味する。

本発明の他の態様では、本発明の方法によつて
染色した網状赤血球をフローサイトメーターで検
出する。

本発明のさらに他の態様では、チオフラビンＴ
またはクリサニリンによつて染色した網状赤血球
から成る組成物を提供する。

チオフラビンＴとクリサニリンが網状赤血球を
染色するために効果的な染料であること、及びこ
れらの染料の使用は、これらの染料がリボ核酸と
結合しない場合には殆んどまたは全く螢光を発し
ないが、これらの染料が網状赤血球内のリボ核酸
と結合した場合には螢光を発するという利点を有
することを出願人は発見した。

本発明では、血液サンプル中の網状赤血球を染
色する場合に、染料を水溶液として、特にエタノ
ールを少量含み得る等張性食塩水溶液として用い
ることができる。全血または血球混合物である血
液サンプルを染料の等張性溶液と混合することに
よつて染色する。チオフラビンＴとクリサニリン
が生体染料であり、固定は必要でないことを出願
人は発見した。さらに、チオフラビンＴまたはク
リサニリンによる染色によつて全血サンプル中の
網状赤血球の検出と計数が可能であることを出願
人は発見した。

チオフラビンＴとクリサニリンを網状赤血球の
染色に用いた場合に約415nｍと488nｍにそれぞ
れ強い吸収ピーク（非結合）が現れることを出願
人は発見している。しかし、この非結合状態で、
いずれの染料も検出可能な励起ピークまたは発光
ピークを示さない。これらの染料が網状赤血球内
のRNAを染色する場合には、その光学的性質が
著しく変化する。特に、吸収曲線は長汲長側に移
動し、染料は強い螢光を示す。最大励起はチオフ
ラビンＴでは約455nｍであり、クリサニリンで
は約488nｍである。最大発光は約485nｍと505n
ｍであり、それぞれ約30nｍと17nｍのストー
ク・シフト（Stokes shift）を示す。結合チオフ
ラビンＴの励起ピークが約450nｍ程度であるこ
とから、自動フローサイトメータを用いる場合
に、光源は約436nｍに主要エネルギー線を有す
る水銀燈、457nｍに強い発光を示すアルゴンイ
オン・レーザーまたは441nｍに強い発光を示す
ヘリウム−カドミウム・レーザーであり得る。結
合クリサニリンを励起させるためには、アルゴン
イオン・レーザーからの488nｍ励起線を用いる
のが好ましい。

染料が核酸と結合しない場合には螢光が生じな
いことから、バツクグランド値は低く、操作者は
非染色対照を測定するだけで自動フローサイトメ
ータ用の螢光限界値（または「ゲート」）を選択
することができる。他の波長において励起を行う
こともできるが、チオフラビンＴ染色網状赤血球
は420nｍ〜480nｍの波長において励起させるの
が好ましく、クリサニリン染色網状赤血球は
440nｍ〜500nｍにおいて励起させるのが好まし
い。

いずれの染料もRNAを沈降させないので、そ
の結果として、染色した網状赤血球は比較的均一
に分布した細胞内RNAを維持するため、個々の
網状赤血球の螢光シグナル測定値とそのRNA含
量との間にはほぼ直線的な関係が存在することに
なる。このことは、RNA含量が網状赤血球年令
の関数であるという点で、網状赤血球数の他に付
加的な情報を臨床的や医師に与えることになる。
従つて、チオフラビンＴまたはクリサニリンを用
いることによつて、臨床家は網状赤血球成熟度の
プロフイルと単なる網状赤血球数の両方を知るこ
とができることになる。

血液サンプル中の網状赤血球の染色にチオフラ
ビンＴまたはクリサニリンを用いることによつ
て、染色された網状赤血球からの螢光シグナルが
成熟赤血球の螢光シグナルから良好に分離される
ため、広範囲なデータを処理することなく、自動
フローサイトメータにおいて結果を直接読み取る
ことができるという利点もある。

染色した網状赤血球は自動フローサイトメータ
において計数するのが好ましいが、手動方法によ
つて計数することも可能である。

自動フローサイトメータは技術上周知であり、
本発明は特定のフロサイトメータに限定されない
ものとする。従つて、例えばチオフラビンＴ染色
網状赤血球またはクリサニリン染色網状赤血球を
FACSIV^TMフローサイトメータまたはFACS
Analyser^TMフローサイトメータ〔両方ともベク
トン、デイキソンアンドカンパニー（Becton、
Dickinson and Company）から販売〕によつて
検出及び計数することができる。このような自動
フローサイトメータを用いる場合には、染色しな
い対照サンプルを用いて螢光ゲートを設定し、こ
の螢光ゲートを染色したサンプルに適用する。

自動フローサイトメータを用いる場合には、等
張性食塩水溶液中染料（0.2mg／ml）の25μアリ
コートをエチレンジアミン四酢酸によつて凝血予
防した全血10μと混合することによつて、全血
サンプルを効果的に染色することができる。この
混合物を室温において約７分間インキユベート
し、サンプルを等張性食塩水溶液によつて10mlに
なるまで希釈する。次に、希釈したサンプルを自
動フローサイトメータで分析する。本発明がここ
に述べる染色法に限定されないことを理解する必
要がある。

出願人は、チオフラビンＴまたはクリサニリン
によつて染色した網状赤血球の検出及び計数に自
動フローサイトメータを用いると、ニユーメチレ
ンブルーを用いる公知の標準的な、網状赤血球計
数方法によつて得られた結果と密接相関する結果
が生ずることを発見した（FACSIV^TMとFACS
Analyzer^TMの両フローサイトメータでのランに
よつて、総相関係数は47チオフラビンＴサンプル
に対して0.93、13クリサニリンサンプルに対して
0.99である）。FACSIV^TMフローサイトメータで
分析した78サンプルに対する染料としてアクリジ
ンオレンジを用いる場合には、相関係数は0.75で
あつた。

チオフラビンＴ染色網状赤血球またはクリサニ
リン染色網状赤血球を自動フローサイトメータに
用いると、螢光バツクグランド値が低く、染色し
ない対照を用いることによつて螢光ゲートを容易
に選択できるという点で、特に有利である。さら
に、網状赤血球の細胞内RNAが沈降しないので、
細胞を固定する必要がない。その上、個々の網状
赤血球の螢光シグナルとそのRNA含量との間に
直線的関係があり、網状赤血球成熟度に関する情
報が得られる。

本発明のさらに他の利点は、感度の比較的低い
自動フローサイトメータにチオフラビンＴ染色網
状赤血球を用いることができることであり、例え
ばアルゴンレーザーに代るものとして水銀アーク
燈を用いることができる。

メラメド（Melamed）等、ジヨーン・ウイリ
ーアンドサンズ（John Wiley and Sons）によ
つて編集されたフロー・サイトメトリー・アン
ド・ソーテイング（Flow Cyomety and
Sorting）457〜58頁は生存細胞のRNAを染色す
るためのアクリジンオレンジとチオフラビンＴの
両方の使用を述べているが、この刊行物は自動フ
ロー・サイトメーターでの網状赤血球検出と計数
のための染料としてチオフラビンＴまたはクリサ
ニリンを用いる可能性及び／または実行可能性を
示唆していない。実際に、チオフラビンＴとクリ
サニリンの螢光発生効率が周知のように低く、網
状赤血球のRNA含量も周知のように低いために、
これらの染料のいずれかを自動フローサイトメー
タでの網状赤血球染色法として効果的に使用でき
ること、すなわちチオフラビンＴまたはクリサニ
リンによる染色がチオフラビンＴまたはクリサニ
リンのいずれよりも高い螢光発生効率を有するこ
とがわかつているアクリジンオレンジによる染色
よりもすぐれた改良であることは全く予想されな
かつたことである。

上述の開示から考えると、本発明の多くの変更
及び変化が可能であるため、本発明を上記で特に
説明した以外のやり方で実施することも可能であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ クリサニリン（chrysaniline）によつて網状
   赤血球を染色し、クリサニリンによつて染色した
   該網状赤血球を検出することから成る網状赤血球
   の検出方法。 ２ フローサイトメータにおいて該検出を行う特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 該クリサニリン染色網状赤血球が該フローサ
   イトメータ内でアルゴンイオンレーザーからの光
   によつて励起される特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４ 該網状赤血球が全血から成るサンプル中に存
   在する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５ 該網状赤血球を固定せずに検出する特許請求
   の範囲第２項記載の方法。