JPH0143548B2 - - Google Patents

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JPH0143548B2
JPH0143548B2 JP15985380A JP15985380A JPH0143548B2 JP H0143548 B2 JPH0143548 B2 JP H0143548B2 JP 15985380 A JP15985380 A JP 15985380A JP 15985380 A JP15985380 A JP 15985380A JP H0143548 B2 JPH0143548 B2 JP H0143548B2
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JP
Japan
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enzyme
protopectin
sephadex
dimer
column
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JP15985380A
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Takuo Sakai
Kyonin Gu
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Mitsubishi Chemical Corp
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Mitsubishi Kasei Corp
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロトペクチン可溶化酵素に関する。
ペクチン質を分解する酵素は、果汁の清澄あるい
は植物組織の破砕に利用され実用に供されてい
る。本発明者等は、新規なペクチン質分解酵素を
得るべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。 本発明の要旨は、次の理化学的性質を有するプ
ロトペクチン可溶化酵素に存する。 (イ) 作用および基質特異性 プロトペクチンを可溶化する。とくに植物組
織中のプロトペクチンによく作用する。ガラク
チユロン酸ダイマーには作用せず、トリマーを
ダイマーとモノマーに分解し、テトラマーをト
リマーとモノマーおよび２分子のダイマーの２
形式で分解し、ペンタマーをトリマーとダイマ
ーに分解する。 (ロ) 至適PH 3.5〜5.5 (ハ) 安定PH範囲 ２〜6.5 (ニ) 力価の測定法 プロトペクチン10mg及び0.02M酢酸塩緩衝液
（PH5.0）に検定サンプルの酵素溶液0.5mlを加
え全量2.5mlとし、37℃で30分間反応させたの
ち、濾過し、遊離してくるペクチン質をカルバ
ゾール・硫酸反応によつて定量することによつ
て測定する。 (ホ) 作用適温の範囲 45〜55℃ (ヘ) 分子量 牛血清アルブミン、卵アルブミン、α−チモ
トリプシノーゲンＡ、ミオグリビン、チトクロ
ムＣを内部標準とするSDS−電気泳動によると
約40000、チトクロムＣ、リゾチーム、α−チ
モトリプシノーゲンＡ、卵アルブミン、牛血清
アムブミンを内部標準とするセフアデツクスＧ
−75ゲル（セフアデツクスはフアルマシア・フ
アイン・ケミカル社製ゲル濾過剤、商標）によ
ると約30000、26000rpmでの沈降平衡法による
と約26800である。 (ト) 沈降定数、等電点 沈降平衡法により測定した沈降定数は、
2.99Sであり、焦点電気泳動法により測定した
等電点（PH）は8.4〜8.5である。 (チ) 糖含量 フエノール−硫酸法によつて求めた糖含量は
ペントースとして、3.2重量％である。 (リ) 阻害化 Hg+またはBa2+により阻害化される。 (ヌ) 結晶形 結晶は板状の形状を有するが、不安定でこわ
れ易い。 (ル) アミノ酸組成（分子比） リジン 19、ヒスチジン ７ アルギニン ４、トリプトフアン 11 アスパラギン酸 42、スレオニン 22 セリン 33、グルタミン酸 20 プロリン ７、グリシン 43 アラニン 18、ハーフシスチン １ バリン 20、イソロイシン 24 ロイシン 13、チロシン ７ フエニルアラニン ９、糖質 ８ （ペントースとして） (ヲ) 比活性 3945単位／mg蛋白 (ワ) 吸光度 吸光度Ｅ１％ １cm、280nmは11.93である。 (カ) 精製方法 オニゲナ科（Onygenaceae）に属する（仮
の位置づけ）ガラクトマイセス リーシー
（Galactomyces reessii）Ｌ菌株から得られる。 ガラクトマイセス リーシーＬからプロトペ
クチン可溶化酵素を分離精製するには、培養濾
液を0.02M酢酸塩緩衝液（PH5.0）で平衡化し
たCM−セフアデツクスＣ−50（フアーマシ
ア・フアイン・ケミカル社製のゲル濾過剤、
CM−セフアデツクスは商標）のカラムに加え
て吸着させ、食塩の０〜0.4Mの濃度勾配法に
よつて酵素を溶出する。活性画分を集め濃縮
し、再度CM−セフアデツクスＣ−50のカラム
に加え、カラムクロマトグラフイーにかけれ
ば、精製酵素が得られる。 以下において本発明のプロトペクチン可溶化酵
素をさらに詳細に説明する。 (イ) 作用および基質特異性 プロトペクチンを分解し可溶化する酵素で、
一種のエンド・ポリガラクチユロナーゼであ
る。ガラクチユロン酸オリゴマーに対する作用
様式については、ガラクチユロン酸ダイマーに
は作用せず、トリマーをダイマーとモノマーに
非常に遅い速度ではあるが分解する。また、テ
トラマーを、トリマーとモノマーおよび２分子
のダイマーの２形式で分解する。さらにペンタ
マーをトリマーおよびダイマーに分解する。な
お、本酵素は植物組織中のプロトペクチンによ
く作用する。 (ロ) 至適PH 本酵素の至適PHは、PH3.5〜5.5の範囲にあ
る。 (ハ) 安定PH範囲 本酵素を50℃で30分間処理したときの残存活
性は第１図の通りであり、PH２〜6.5で安定で
ある。 (ニ) 力価の測定法 プロトペクチン10mg及び0.02M酢酸塩緩衝液
（PH5.0）に検定サンプルの酵素溶液0.5mlを加
え全量2.5mlとし、37℃で30分間反応させたの
ち、過し、遊離してくるペクチン質をカルバ
ゾール・硫酸反応によつて定量することによつ
て測定した。酸素活性の１単位は、30分で反応
混合物１mlあたり、ガラクチユロン酸1μmole
に相当するペクチンを遊離する酵素の量で定義
される。 なお、基質のプロトペクチンとしては、温州
ミカンの果皮のアルベト層を集め、細かく砕
き、水洗をくりかえして水可溶性のペクチン質
を完全に除去し、次いでこれを凍結乾燥し、さ
らに100〜200メツシユの大きさに粉砕したもの
をプロトペクチン標品とする。 (ホ) 作用適温の範囲 PH5.0の条件下、種々の温度で30分間反応さ
せ、活性に及ぼす温度の影響を調べたのか第２
図である。第２図から明らかなように、45〜55
℃に至適温度を有する。 また、本酵素を、PH5.0の条件下種々の温度
で30分間処理したときの残存活性は第３図の通
りで、55℃以下で安定である。 (ヘ) 分子量 牛血清アルブミン、卵アルブミン、α−チモ
トリプシノーゲンＡ、ミオグリビン、チトクロ
ムＣを内部標準とするSDS−電気泳動によると
約40000、チトクロムＣ、リゾチーム、α−チ
モトリプシノーゲンＡ、卵アルブミン、牛血清
アムブミンを内部標準とするセフアデツクスＧ
−75ゲル（セフアデツクスはフアルマシア・フ
アイン・ケミカルス社製ゲル過剤、商標）に
よると約30000、26000rpmでの沈降平衡法によ
ると約268000である。 (ト) 沈降定数、等電点 沈降平衡法により測定した沈降定数は、
2.99Sであり、焦点電気泳動法により測定した
等電点（PH）は8.4〜8.5である。 (チ) 糖含量 フエノール−硫酸法によつて求めた糖含量は
ペントースとして、3.2重量％である。 (リ) 阻害化 Hg+またはBa2+により阻害化される。 (ヌ) 結晶形 硫安溶液に対して透析することによつて結晶
化した。 結晶は板状の形状を有するが、不安定でこわ
れ易い。 (ル) アミノ酸組成（分子比） リジン 19、ヒスチジン ７ アルギニン ４、トリプトフアン 11 アスパラギン酸 42、スレオニン 22 セリン 33、グルタミン酸 20 プロリン ７、グリシン 43 アラニン 18、ハーフシスチン １ バリン 20、イソロイシン 24 ロイシン 13、チロシン ７ フエニルアラニン ９、糖質 ８ （ペントースとして） (ヲ) 比活性 プロトペクチン可溶化酵素比活性は3945単
位／mg蛋白である。 (ワ) 吸光度 水溶液中１％溶液の１cm厚のセルを用いた28 0nｍの吸光度Ｅ１％ １cm、280nmは11.93 である。 (カ) 精製方法 本発明の酵素は、オニゲナ科
（Onygenaceae）に属する（仮の位置づけ）ガ
ラクトマイセスリーシー（Galactomyces
reessii）Ｌ菌株から得られる。ガラクトマイセ
ス リーシーは、アントニー フアン レーベ
ンフツク、ジヤーナル オブ マイクロバイオ
ロジー アンド セロロジー第25巻458〜464頁
（1959年）、同誌第38巻289−309頁（1972年）お
よびカナデイアン ジヤーナル オブ ボタニ
ー第55巻1701〜1711頁（1977年）に記載されて
いる既知種である。Ｌ菌株の菌学的性質は、こ
れらの文献の記載と合致したので、本菌株をガ
ラクトマイセス リーシー（フアンデルワル
ト）レツドヘツドエトマロツク
〔Galactomyces reessii（van der Walt）
Redhead et Malloch〕と同定した。本菌株の
主要な菌学的特徴を以下に列挙する。 (a) 各培地における生育状態 麦芽汁培地（第４図参照） 25℃で３日間培養した後、隔壁を有する
菌系、子のうおよび分節型分生子を形成す
る。幅2.5〜8μｍ。鈍色、しわのある、乳
白色の皮膜および沈澱物を生ずる。 麦芽汁寒天培地 生育は良好、27℃３日後、集落は乳白
色、平滑、後にわずかに粉状となる。周辺
毛状、隔壁を有する菌糸、子のう（通常、
子のう胞子１個を生ずる）および分節型分
生子を形成する。分芽型分生子を形成しな
い。 バレイシヨ−ブドウ糖寒天培地 生育は良好。27℃３日後毛状、しわのあ
る、乳白色の集落を形成する。周辺毛状。
隔壁を有する菌糸、子のう（通常子のう胞
子１個を生ずる）および分節型分生子を形
成する。分芽型分生子を形成しない。 (b) 子のう胞子の形成（第５図参照） 上記バレイシヨ−ブドウ糖寒天培地を用い
たスライド培養でよく形成する。子のう形成
は配偶子のう合体による。やや長い、分枝し
た、不規則な配偶子のう菌糸上に生じる。配
偶子のう菌糸は先端で合体の後、基部で２〜
３回コイルし、隔壁で菌糸と仕切られる。子
のう胞子は偏だ円形、しわのある、薄い、不
規則な外膜と１個の大きな油体を有する。大
きさは６〜9μｍ×５〜7μｍ (c) 分生子時代（第６図参照） 分節型分生子を生じ、両端は鈍円、幅２〜
7.5μｍ (d) 各生理的性質 硝酸塩または亜硝酸塩の同化：陰性 尿素の加水分解：陰性 エステルの生産：陽性（リンゴの香） NaCl耐性：４〜６％ 37℃での生育：弱陽性又は陰性 醗酵性：なし ビタミンによる生育刺激：ピリドキシン
およびチアミンが生育を刺激する。 炭素化合物の同化 グルコース＋、ガラクトース＋ マルトース−、シヨ糖− トレハロース−、ラクトース− ラフイノース＋、Ｌ−ソリボース＋ キシロース＋、アラビノース− Ｌ−アラビソース−、リボース− Ｌ−ラムノース−、エタノール− グリセリン＋、エリスリトール− アドニトール−、マニトール− ソルビトール＋、セロビオース− サリシン−、グリコネート− ２−ケトグルコネート＋、Ｄ，Ｌ−ラクテ
ート− コハク酸塩＋、クエン酸塩− 酢酸塩−、イノシトール− イヌリン＋、可溶性澱粉− (e) 分離源：日本産ミカン果実より分離した。
ガラクトマイセス リーシー Ｌ菌株は、工
業技術院微生物工業研究所に寄託され、その
微生物受託番号は微工研菌寄第5726号であ
る。 しかして、ガラクトマイセス リーシーＬか
らプロトペクチン可溶化酵素を分離精製するに
は、培養液を0.02M酢酸塩緩衝液（PH5.0）
で平衡化したCM−セフアデツクスＣ−50（フ
アーマシア・フアイン・ケミカル社製のゲル
過剤、CM−セフアデツクスは商標）のカラム
に加えて吸着させ、食塩の０〜0.4Mの濃度勾
配法によつて酵素を溶出する。活性画分を集め
濃縮し、再度CM−セフアデツクスＣ−50のカ
ラムに加え、カラムクロマトグラフイーにかけ
れば、精製酵素が得られる。 さらに、好ましい精製法としては、ペクチン
を不溶化したゲルによるアフイニテイ−クロマ
トグラフイーを用いる方法が挙げられる。ペク
チンを不溶化したゲルとしては、デンプンとペ
クチンの混合物を固定化したものがとくに好ま
しい。固定化するには、可溶性デンプンとペク
チンを例えば２：１の重量比で混合し、希
NaOH水溶液に溶解し、次いでエピクロルヒ
ドリンを加えて反応させればよい。精製は次の
ようにして実施される。即ち、培養液を
0.01M酢酸塩緩衝液PH5.0に対し透析し、同じ
緩衝液で平衡化した上記ペクチン不溶化ゲルの
カラムに通塔し、カラムを洗浄し、非吸着タン
パク質を除去した後、食塩濃度０〜0.2Mの濃
度勾配によつて酵素を溶出すれば、プロトペク
チン可溶化酵素は、食塩濃度0.1Mで溶出され
る。この方法によれば、酵素の収率が約90％と
高い利点を有する。 以上のような本発明のプロトペクチン可溶化酵
素は、公知のプロトペクチン可溶化酵素と異な
る。例えば酵母の１種である。トリコスポロン
ペニシレイタム（Trichosporon penicillatum）
SNO−３株から得られるプロトペクチン可溶化
酵素（発酵と工業、第37巻928〜939頁、1979年に
記載されている。これを以下においてＳ−酵素と
いう。）とは、沈降定数、等電点、糖含量、比活
性、アミノ酸組成などにおいて異なる。また、本
発明のプロトペクチン可溶化酵素は、植物組織中
のプロトペクチンによく作用するという特徴を有
する。 以下、本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。 実施例 １ (1) ガラクトマイセス リーシーＬの培養 前記のような性質を有するガラクトマイセス
リーシーＬ、グリコース0.5ｇ、カゼイン酸
分解物（日水製薬株式会社製のものを使用）
0.4ｇ、KNO30.11ｇ、MgSO4・7H2O、0.05ｇ、
CaCl20.01ｇ、チアミン−HCl50μｇ、ピリドキ
シン−HCl50μｇおよび100mlの水からなる培地
（PH5.0）で、30℃で24時間培養した。培養液
20には、6450mgのタンパク質が含まれ、735
×103単位のプロトペクチン可溶化酵素活性が
認められた。 (2) プロトペクチン可溶化酵素の分離・精製 (イ) ペクチン不溶化ゲルの調製 可溶性デンプンとペクチンの２：１（重量
比）の混合物３ｇを3.5N NaOH水溶液に溶
解し、60℃で30分間撹拌した。次いでエピク
ロルヒドリン15mlを加えて60℃で60分間撹拌
してのち、同じく60℃で60分間放置した。得
られたゲルを粉砕し35メツシユとした。この
ゲルを十分に水洗し精製に用いた。 (ロ) 分離・精製 (1)で得られた培養液を0.01M酢酸塩緩衝
液PH5.0に透析し、同じ緩衝液で平衡化した
(イ)のペクチン不溶化ゲルのカラムに通塔し
た。0.01M酢酸塩緩衝液（PH5.0）を通塔す
ることにより、カラムを洗滌し、非吸着タン
パク質を除去した後、食塩濃度０〜0.2Mの
濃度勾配の0.01M酢酸緩衝液PH5.0によつて
酵素を溶出した。食塩0.1Mの濃度で電気泳
動的に均一なプロトペクチン可溶化酵素が90
％の収率で溶出された。タンパク質含量は
150mg、プロトペクチン可溶化酵素活性は594
×103単位、比活性は3945単位／mg蛋白であ
つた。得られた酵素溶液を50％硫安0.02M酢
酸緩衝液PH5.5に対して透析すると、板状の
形状を有する結晶が得られたが、結晶は形状
が不安定でこわれやすかつた。 (ハ) 種々のペクチンに対する溶解作用の測定 マンダリンオレンジ、ゴボウ、大根、スイ
カ、ニンジンを用い、本酵素の作用を測定し
た。即ち温州ミカンの場合と同様にして各種
の植物組織よりプロトペクチン標品を調製
し、これを0.01M酢酸塩緩衝液（PH5.0）１
ml当り10mgの割合で懸濁し、(ロ)で得られた酵
素単位を添加して37℃で30分間反応させた。 比較のために、前述のＳ−酵素についても
試験した。その結果を第１表に示した。 【表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のプロトペクチン可溶化酵素
の安定PH範囲を示す曲線、第２図は、その至適温
度範囲を示す曲線、第３図はその安定温度範囲を
示す曲線である。第４図は、本発明の酵素の取得
源であるガラクトマイセスリーシーＬ菌株を27℃
で３日間麦芽汁培地で培養したときの細胞の図で
あり、第５図は該菌株の子のう形成における種々
のステージを示す図であり、１は初期の子のう、
２は１個の子胞子を含む成熟した子のう、３は子
のう胞子を示す。第６図は、該菌株の分節型分生
子を示す図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有するプロトペクチン可
    溶化酵素。 (イ) 作用および基質特異性 プロトペクチンを可溶化する。とくに植物組
    織中のプロトペクチンによく作用する。ガラク
    チユロン酸ダイマーには作用せず、トリマーを
    ダイマーとモノマーに分解し、テトラマーをト
    リマーとモノマーおよび２分子のダイマーの２
    形式で分解し、ペンタマーをトリマーとダイマ
    ーに分解する。 (ロ) 至適PH 3.5〜5.5 (ハ) 安定PH範囲 ２〜6.5 (ニ) 力価の測定法 プロトペクチン10mg及び0.02M酢酸塩緩衝液
    （PH5.0）に検定サンプルの酵素溶液0.5mlを加
    え全量2.5mlとし、37℃で30分間反応させたの
    ち、濾過し、遊離してくるペクチン質をカルバ
    ゾール・硫酸反応によつて定量することによつ
    て測定する。 (ホ) 作用適温の範囲 45〜55℃ (ヘ) 分子量 牛血清アルブミン、卵アルブミン、α−チモ
    トリプシノーゲンＡ、ミオグリビン、チトクロ
    ムＣを内部標準とするSDS−電気泳動によると
    約40000、チトクロムＣ、リゾチーム、α−チ
    モトリプシノーゲンＡ、卵アルブミン、牛血清
    アルブミンを内部標準とするセフアデツクスＧ
    −75ゲル（セフアデツクスはフアルマシア・フ
    アイン・ケミカルス社製ゲル濾過剤、商標）に
    よると約30000、26000rpmでの沈降平衡法によ
    ると約26800である。 (ト) 沈降定数、等電点 沈降平衡法により測定した沈降定数は、
    2.99Sであり、焦点電気泳動法により測定した
    等電点（PH）は8.4〜8.5である。 (チ) 糖含量 フエノール−硫酸法によつて求めた糖含量は
    ペントースとして、3.2重量％である。 (リ) 阻害化 Hg+またはBa2+により阻害化される。 (ヌ) 結晶形 結晶は板状の形状を有するが、不安定でこわ
    れ易い。 (ル) アミノ酸組成（分子比） リジン 19、ヒスチジン ７ アルギニン ４、トリプトフアン 11 アスパラギン酸 42、スレオニン 22 セリン 33、グルタミン酸 20 プロリン ７、グリシン 43 アラニン 18、ハーフシスチン １ バリン 20、イソロイシン 24 ロイシン 13、チロシン ７ フエニルアラニン ９、糖質 ８ （ペントースとして） (ヲ) 比活性 3945単位／mg蛋白 (ワ) 吸光度 吸光度Ｅ１％ １cm、280nmは11.93である。 (カ) 精製方法 オニゲナ科（Onygenaceae）に属する（仮
    の位置づけ）ガラクトマイセス リーシー
    （Galactomyces reessii）Ｌ菌株から得られる。 ガラクトマイセス リーシーＬからプロトペ
    クチン可溶化酵素を分離精製するには、培養濾
    液を0.02M酢酸塩緩衝液（PH5.0）で平衡化し
    たCM−セフアデツクスＣ−50（フアーマシ
    ア・フアイン・ケミカル社製のゲル濾過剤、
    CM−セフアデツクスは商標）のカラムに加え
    て吸着させ、食塩の０〜0.4Mの濃度勾配法に
    よつて酵素を溶出する。活性画分を集め濃縮
    し、再度CM−セフアデツクスＣ−50のカラム
    に加え、カラムクロマトグラフイーにかけれ
    ば、精製酵素が得られる。
JP15985380A 1980-11-13 1980-11-13 Enzyme to make protopectin soluble Granted JPS5783285A (en)

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