JPH0143908B2 - - Google Patents
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- JPH0143908B2 JPH0143908B2 JP57071080A JP7108082A JPH0143908B2 JP H0143908 B2 JPH0143908 B2 JP H0143908B2 JP 57071080 A JP57071080 A JP 57071080A JP 7108082 A JP7108082 A JP 7108082A JP H0143908 B2 JPH0143908 B2 JP H0143908B2
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Description
本発明は、成人型Ｔ細胞性白血病（ADULT
Ｔ―CELL LEUKEMIA、以下「ATL」と呼ぶ）
に関連する抗体の測定方法、詳しくはATL患者
の血清と特異的に反応する新規な抗原性蛋白
（ATL関連抗原、ATL―associated antigen、以
下「ATLA」と呼ぶ）を不溶性支持体に固定化
した不溶化抗原を用いて螢光もしくは酵素免疫測
定法によつて、上記ATLAの抗体を容易迅連に
測定する新しい方法に関する。 ATLは、成人が罹病する悪性の疾患であるが、
現在その病因は尚解明されていない
〔Takatsuki，K.Uchiyama，T.，Saqawa，K.
and Yodoi，J.，（1977）in Topics in
Hematoloay，、eds.Seno，S.，Takaku，F.，
and Irino，S.（Excepta Medica，
Amsterdam），pp73−77及びUchiyama，T.，
Yodoi，J.，Saqawa，K.，Takatsuki，K.and
Uchino，H.，Blood50，481−492（1977）等参
照〕。 近年上記ATLの診断等を可能とするATLA抗
体の螢光免疫測定法による測定技術が提案された
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.78，No.10，
p6476−6480（1981）〕。この方法は培養ATL細胞
そものものを抗原として、これをガラススライド
上に載置し、該スライド上で被検血清及び螢光標
識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体と反応させて検鏡
下に螢光標識物質の局在を観察・測定するもので
あつた。しかしながら上記方法は、抗原として生
きた細胞自体を用いること及び一検体（被検血
清）ごとに検鏡下観察を行なうことを必須とする
ため、その操作が頻雑であることは勿論のこと、
大量の検体を容易迅連に測定及び診断できないと
いう欠点があつた。また測定法を一般に普及する
場合は、一定条件下で測定を行ない得ることが必
要な要件となるが、上記提案された方法では生の
細胞自体を利用することに基づき、その抗原陽性
率の変動を回避し得く、一定の抗原が常に安定し
て入手困難で、惹いては測定及び診断の誤りを招
く危険があつた。 本発明は、上記ATLA抗体の測定方法に見ら
れる諸問題を悉く解消した新しいATLA抗体の
測定法を提供するものである。 即ち本発明はATL細胞の可溶性細胞質蛋白及
びATLウイルスの可溶化処理蛋白から選ばれた
少なくとも１種を、不溶性支持体に固定化してな
る不溶化抗原を用いることを特徴とする螢光もし
くは酵素免疫測定法によるATLA抗体の測定法
に係る。 本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、培養
ATL細胞の可溶性細胞質蛋白（以下「SCP」と
する）及びATLウイルスの可溶化処理蛋白（以
下「VAP」とする）がATLA抗体と特異的に反
応する抗原となり得ることを見い出し、更にこれ
を不溶性支持体に固定化した不溶性抗原を用いる
時には、大量の検体を容易迅速に且つ常に一定の
条件下に精度良く測定できることを見い出した。
本発明はこの新知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明方法によれば、大量の検体を簡便な操作
で迅速に例えば検鏡下での上記従来法に比し約10
倍以上もの量及び速度で測定することができる。 本発明においてSCPの原料として利用する培養
ATL細胞としては、既に細胞ラインとして確立
されたATL細胞〔Miyoshi，I.，Kubonishi，I.，
Sumida，M.，Hiraki，S.，Tsubota，T.，
Kimura，I.，Miyamoto，K.and Sato，J.，
Gann71，155−156（1980）〕の他、ATL患者の末
梢血或はリンパ節より常法に従い分離したATL
細胞の培養細胞や上記ATL細胞を別個にヒトＴ
細胞と混合培養して得られる培養細胞〔例えば
Nature，294，770−771（1981）〕等を挙げること
ができる。上記混合培養に使用されるヒトＴ細胞
としては特に制限はなく、例えば末梢血、骨髄、
リンパ節、脾臓、扁桃腺、胸腺等に由来する各種
Ｔ細胞をいずれも例示できる。また上記ATL細
胞の培養及び該ATL細胞とヒト細胞との混合培
養は通常の方法により行なうことができる。培地
としては通常の細胞培養に用いられる各種の栄養
培地をいずれも使用できる。好ましい培地として
は例えばRPMI 1640培地（Flow Laboratories
社）、イーグル最低必須培地（MEM培地）等を
ウシ胎児血清（FCS）、仔ウシ血清等の血清補液
を用いて改質した培地等を例示できる。培養条件
は通常の細胞培養に利用される条件と特に異なる
ものではなく、一般には約36〜38℃の温度及び
6.4〜7.6のPHを採用できる。また上記培地にはＴ
細胞増殖因子（TCGF）等の増殖促進剤或は哺乳
類レトロウイルスの誘導剤として知られる各種薬
剤、例えば５―ヨード―2′―デオキシウリジン
（IdUrd）、シクロヘキシイミド（CH）、プロマイ
シン（Puromycin）、フオルボール 12―ミリス
テート 13―アセテート（TPA）、ｎ―ブチレー
ト（ｎ―酢酸ナトリウム）等を適宜添加使用する
ことができる。培養は通常３〜５日毎に液交換を
行なうことにより有利に実施され、これにより所
望細胞を良好に増殖させ得る。 また上記SCPは例えば上記培養ATL細胞を生
理食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水等の適当な緩衝
液中でホモジネートした後、遠心分離等の適当な
手段により上清として採取することができる。 本発明においてVAPの原料として利用する
ATLウイルスとしては、例えば上記ATL細胞の
培養液より、常法により分離されたものを挙げる
ことができる。上記ATLウイルスの分離は、通
常の遠心分離法等により行なわれ、本発明では特
に、密度勾配法等に従い更に精製されたATLウ
イルスを用いるのが好ましい。VAPは上記ATL
ウイルスを可溶化することにより収得できる。該
可溶化は通常の可溶化剤を用いて容易に行ない得
る。可溶化剤としては各種の界面活性剤例えば
「トリトンＸ−100」（和光純薬社製）、「NP−40」
（シエル社製）、ジキトニン、尿素等の非イオン性
界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等
の陰イオン性界面活性剤等を例示できる。可溶化
方法としては特に制限はないが、より好ましくは
可溶化剤を0.01％〜臨界ミセル成形点程度使用し
て、約０〜100℃程度の温度下に数分〜６時間程
度を要して行なわれる。かくして得られるVAP
は、好ましくは例えば遠心分離法、透折法等の通
常の方法に従い更に精製され、更に例えばDEAE
−セルロース、DEAE−セフアデツクス等の陰イ
オン交換カラムに付し、残存するか又はそのおそ
れのあるウイルス核酸を吸着除去するのがよい。 本発明に用いる不溶化抗原は、上記SCP及び
（又は）VAPを、不溶性支持体上に固定化させる
ことにより製造される。用いられる不溶性支持体
としては特に制限はなく、物理的吸着法に常用さ
れる通常のもの、具体的には例えばポリスチレ
ン、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン
等の多孔性担体を挙げることができる。之等不溶
性支持体上へのSCP及び（又は）VAPの固定は、
通常の方法に従い行なうことができる。例えば生
理食塩水、リン酸塩緩衝液等の各種液中に不溶性
支持体とSCP及び（又は）VAPを入れ、０〜37
℃程度で約２〜24時間を要して反応させればよ
い。上記反応は、好ましくは減圧条件下に実施さ
れる。反応終了後は、使用した不溶性支持体に残
存する吸着部位を常法に従い、例えば0.2％ゼラ
チン、0.2％ウジ血清アルブミン（BSA）等を用
いて飽和させる。 かくして得られる不溶性抗原は、水洗後乾燥状
態で、又は上記緩衝液中で保存される。 本発明方法は、上記の如くして得られる不溶性
抗原を用いて通常の螢光もしくは酵素免疫測定法
に従い標識された抗原−抗体複合体の標識活性を
測定することにより実施される。より詳細には、
上記不溶性抗原に、必要に応じて希釈された被検
血清を加えて免疫反応させ、これを洗浄後得られ
る抗原−抗体反応物に標識作因剤を反応させて標
識し、この標識された複合体の標識活性を常法に
従い測定する。殊に本発明によれば、上記不溶性
抗原を用いることによつて、一度に大量の被検血
清を一定条件下に容易且つ迅速に精度良く測定で
きる。上記において被検血清としては、例えば
ATLA抗体の測定を所望する被検者より常法に
従い採血した血液から分離された血清、又はこれ
を適当な緩衝液で希釈したものを使用できる。こ
こで用いられる緩衝液は特に制限はないが、通常
リン酸塩緩液（PH7.4）を用いるのが適当である。
また上記被検血清と不溶性抗原との免疫反応は、
単に両者を混合接触させるのみで行ない得る。該
反応は通常約４〜37℃下に約0.5〜16時間で終了
し、反応終了後は適当な緩衝液好ましくは生理食
塩水又は被検血清の希釈に用いた緩衝液で充分に
洗浄するのが望ましい。 上記反応に引き続く、得られる抗原−抗体反応
物の標識作因剤による標識化は、上記と同様の緩
衝液で予め希釈した標識作因剤を上記抗原−抗体
反応物と混合して約４〜37℃下に約0.5〜16時間
反応させることにより行なわれ、反応終了後は上
記と同様にして得られる複合体を充分に洗浄する
のが望ましい。上記において標識作因剤として
は、抗体と特異的に結合する能力を有する物質と
各種の酵素標識物質又は螢光標識物質との結合体
をいずれも使用できる。代表的酵素標識物質とし
ては、例えばパーオキシダーゼ（POX）、キモト
リプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、
グリセロアルデヒド―３―リン酸脱水素酵素、ア
ミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ―Nase、Ｐ―
Nase等の各種酵素試薬を例示できる。螢光標識
物質としては、例えばフルオレツセイン・イソチ
オシアナート（FITC）、テトラメチルローダミ
ン・イソチオシアナート（TRITC）、置換ローダ
ミン・イソチオシアナート（XRITC）、ローダミ
ンＢ・イソチオシアナート、ジクロロトリアジン
フルオレツセイン（DTAF）等を例示できる。
また之等との結合により標識作因剤となる、抗体
と特異的に結合する能力を有する物質としては、
例えば、「プロテインＡ」（ProA、フアルマシア
社）やヒツジ抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、ウサ
ギ抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、ヤギ抗ヒト免液
グロブリンＧ抗体、マウス抗ヒト免疫グロブリン
Ｇ抗体、ラツト抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体等の
抗ヒト免液グロブリンＧ抗体等を挙げることがで
きる。 上記抗体と特異的に結合する能力を持つ物質と
標識物質との結合体は、既に種々作成され市販さ
れており、本発明では標識作因剤として市販の各
種結合体を用いてもよく、また通常知られている
方法〔B.F.ERLANGERら、Acta.Endocrinol.
Suppl.，168，206（1972）、及びM.H.KAROLら、
Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，57，713（1967）〕に
従い、新たに結合体を作成して用いてもよい。上
記作成方法として例えば酵素標識物質を用いる場
合は、これと、上記ProA又は抗ヒト免疫グロブ
リンＧ抗体とを適当な酸化剤例えばNaIO4等の存
在下にPH４〜６の緩衝液中で室温付近で２〜５時
間カツプリング反応させ、次いで適当な還元剤例
えばNaBH4等で還元することにより実施される。
各試薬の使用割合としては、ProA又は抗ヒト免
疫グロブリンＧ抗体１モルに対して、酵素標識物
質を約１〜３モル程度、酸化剤を約100〜300モル
程度とし、還元剤は酸化剤の約１〜２倍モル程度
とするのが適当である。 また螢光標識物質を用いて螢光標識作因剤を作
成する場合、螢光標識物質をPH６〜８の水又は生
理食塩水中に入れ、０℃乃至室温付近で、これを
ProA又は抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体と約0.5〜
３時間反応させればよい〔螢光抗体法、医化学実
験法講座、No.４，263〜270頁、1972年第１刷発
行、中山書店〕。ProA又は抗ヒト免疫グロブリン
Ｇ抗体に対する螢光標識物質の使用量は、一般に
約1/50重量倍前後とするのが適当である。 本発明における不溶性抗原−被検血清
（ATLA抗体）−標識作因剤から成る複合体の測
定は、用いられた標識作因剤における標識物質に
応じて常法に従い、該複合体の標識活性（酵素活
性又は螢光活性）を求めることにより行なわれ
る。かくして本発明によれば多量の被検血清の
ATLA抗体を容易迅速に測定できる。 以下本発明を更に詳細に説明するため実施例を
挙げるが本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ （不溶化抗原の製造） ATL患者（50才、男性、長崎市在住）よりヘ
パリン採血して得た血液20mlを「フイコールパツ
ク」（フアルマシア・ジヤパン株式会社製）で遠
心分離して、末梢血リンパ球細胞５×107個を得
る。 これを10％仔ウシ血清加RPMI1640培地（フロ
ー ラボラトリーズ社）で、３×105個／mlの細
胞濃度で、37℃下に３日間培養する。この６×
108個を30mlの0.05Mリン酸緩衝液（0.14M NaCl
含有、PH7.4、以下「PBS」という）中で、ホモ
ジナイズし、次いで１時間遠心分離（105000×
ｇ）する。上清を採取し、PBSで蛋白量を120μ
ｇ／ml（この蛋白量は、大塚アツセイ研究所製の
総蛋白定量試薬であるトネイン−TP」を用い
た発色法により測定したものである）に調整し
て、SCP液を得る。 次いで上記SCP液の140mlに、予め0.1N―HCl
水溶液、0.1N−NaOH水溶液及びエタノールに
て順次洗浄したポリスチレンビーズ（直径6.4mm、
Precision Plastic Co.，Ltd.，USA）700個を加
え、アスピレーターによる減圧下に室温で６時間
放置後、過して不溶化抗原を得る。これは0.2
％ゼラチンを含む0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）
中に４℃で保存される。 実施例２ （不溶化抗原の製造） (1) ATL細胞（Kyo−Ya cell、京都大学ウイル
ス研究所より入手）を、10％仔ウシ血清
（FCS）及び50μｇ／ml５−ヨード―2′―デオキ
シウリジン（IdUrd）加RPMI1640培地で、３
×155個／mlの細胞濃度で37℃下に４日間培養
する。培養液を遠心分離（1500rpm、10分）
し、細胞と培養液とを分離収得する。 (2) 上記(1)で得た培養ATL細胞５×109個に、生
理食塩水30mlを加えてホモジナイズし、次いで
１時間遠心分離（105000×ｇ）して上清を採取
し、以下実施例１と同様にして蛋白量120μ
ｇ／mlのSCP液を調整し、これから同様にして
不溶化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）を
得る。これは0.2％ゼラチンを含む0.05Mリン
酸塩緩衝液（PH7.4）中に一夜放置後、水洗、
乾燥して保存される。 (3) 上記(1)で得た培養液500mlを遠心分離（40000
×ｇ、１時間）して、沈殿成分を採取する。こ
れを25〜60％シヨ糖密度勾配超遠心に付し、密
度1.15〜1.16の画分を採取する。これを0.5％ト
リトンＸ―100を含む0.8M NaCl水溶液1.5mlに
て可溶化処理（４℃、60分）後、遠心分離
（35000rpm、１時間）して、上清を採取する。 上記で得た上清を0.3M NaClを含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5）で５時間透析（セロフア
ン膜）して、可溶化剤の除去及び塩濃度の調整を
行なう。かくして得られるVAP液を上記緩衝液
で平衡化したDEAE―セルロースカラムに付し、
素通り画分を得る。該画分に蒸留水を加え蛋白量
を2.8μｇ／mlに調製し、この40mlに予め前記と同
様にして洗浄したポリスチレンビーズ（実施例１
と同じもの）80個を加え、室温で６時間放置し
て、不溶化抗原を得る。これは0.2％ゼラチンを
含む0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）中に一夜放
置後水洗、乾燥して保存される。 実施例３ （被検血清の調製） ATL患者及び健康人より採血し、室温下に３
時間静置し、その上清をとり、これを2000rpmで
10分間遠心分離後、その上清をとり、被検血清と
する。 実施例４ （ATLA抗体の測定） 実施例３で調製した各被検血清を0.2％ゼラチ
ン加0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）で80，160，
320，640，1280倍と倍々希釈して希釈血清を作成
する。この希釈血清0.5mlに実施例１で得た不溶
化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）１個を加
え、37℃で２時間放置する。アスピレーターで反
応液を吸引除去し、生理食塩水２mlを加えてビー
ズを洗浄し、洗浄液を吸引除去する。この操作を
３回繰返す。 また上記と同一の緩衝液で44000倍に希釈した
パーオキシダーゼ標識プロテインＡ（E.Y.ラボラ
トリーズ社製）の0.55mlに、上記で処理したビー
ズ１個を加え、37℃で２時間放置した後、同様に
して充分に洗浄する。 一方ｏ―フエニレンジアミン60mgの0.2M―マ
クレビン緩衝液（PH5.8）20ml溶液にH2O2を最終
濃度0.02V／Ｖ％となるように撹拌混合して発色
試薬を調製する。 試験管に生理食塩水２ml及び上記発色試薬0.5
mlを入れ、次いでこれに上記で作成処理したビー
ズ１個を加え、室温で30分間放置した後、3N塩
酸１mlを加えて酵素反応を停止させ、反応液の
492nmでの吸光度を測定する。結果を下記第１表
に示す。
Ｔ―CELL LEUKEMIA、以下「ATL」と呼ぶ）
に関連する抗体の測定方法、詳しくはATL患者
の血清と特異的に反応する新規な抗原性蛋白
（ATL関連抗原、ATL―associated antigen、以
下「ATLA」と呼ぶ）を不溶性支持体に固定化
した不溶化抗原を用いて螢光もしくは酵素免疫測
定法によつて、上記ATLAの抗体を容易迅連に
測定する新しい方法に関する。 ATLは、成人が罹病する悪性の疾患であるが、
現在その病因は尚解明されていない
〔Takatsuki，K.Uchiyama，T.，Saqawa，K.
and Yodoi，J.，（1977）in Topics in
Hematoloay，、eds.Seno，S.，Takaku，F.，
and Irino，S.（Excepta Medica，
Amsterdam），pp73−77及びUchiyama，T.，
Yodoi，J.，Saqawa，K.，Takatsuki，K.and
Uchino，H.，Blood50，481−492（1977）等参
照〕。 近年上記ATLの診断等を可能とするATLA抗
体の螢光免疫測定法による測定技術が提案された
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.78，No.10，
p6476−6480（1981）〕。この方法は培養ATL細胞
そものものを抗原として、これをガラススライド
上に載置し、該スライド上で被検血清及び螢光標
識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体と反応させて検鏡
下に螢光標識物質の局在を観察・測定するもので
あつた。しかしながら上記方法は、抗原として生
きた細胞自体を用いること及び一検体（被検血
清）ごとに検鏡下観察を行なうことを必須とする
ため、その操作が頻雑であることは勿論のこと、
大量の検体を容易迅連に測定及び診断できないと
いう欠点があつた。また測定法を一般に普及する
場合は、一定条件下で測定を行ない得ることが必
要な要件となるが、上記提案された方法では生の
細胞自体を利用することに基づき、その抗原陽性
率の変動を回避し得く、一定の抗原が常に安定し
て入手困難で、惹いては測定及び診断の誤りを招
く危険があつた。 本発明は、上記ATLA抗体の測定方法に見ら
れる諸問題を悉く解消した新しいATLA抗体の
測定法を提供するものである。 即ち本発明はATL細胞の可溶性細胞質蛋白及
びATLウイルスの可溶化処理蛋白から選ばれた
少なくとも１種を、不溶性支持体に固定化してな
る不溶化抗原を用いることを特徴とする螢光もし
くは酵素免疫測定法によるATLA抗体の測定法
に係る。 本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、培養
ATL細胞の可溶性細胞質蛋白（以下「SCP」と
する）及びATLウイルスの可溶化処理蛋白（以
下「VAP」とする）がATLA抗体と特異的に反
応する抗原となり得ることを見い出し、更にこれ
を不溶性支持体に固定化した不溶性抗原を用いる
時には、大量の検体を容易迅速に且つ常に一定の
条件下に精度良く測定できることを見い出した。
本発明はこの新知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明方法によれば、大量の検体を簡便な操作
で迅速に例えば検鏡下での上記従来法に比し約10
倍以上もの量及び速度で測定することができる。 本発明においてSCPの原料として利用する培養
ATL細胞としては、既に細胞ラインとして確立
されたATL細胞〔Miyoshi，I.，Kubonishi，I.，
Sumida，M.，Hiraki，S.，Tsubota，T.，
Kimura，I.，Miyamoto，K.and Sato，J.，
Gann71，155−156（1980）〕の他、ATL患者の末
梢血或はリンパ節より常法に従い分離したATL
細胞の培養細胞や上記ATL細胞を別個にヒトＴ
細胞と混合培養して得られる培養細胞〔例えば
Nature，294，770−771（1981）〕等を挙げること
ができる。上記混合培養に使用されるヒトＴ細胞
としては特に制限はなく、例えば末梢血、骨髄、
リンパ節、脾臓、扁桃腺、胸腺等に由来する各種
Ｔ細胞をいずれも例示できる。また上記ATL細
胞の培養及び該ATL細胞とヒト細胞との混合培
養は通常の方法により行なうことができる。培地
としては通常の細胞培養に用いられる各種の栄養
培地をいずれも使用できる。好ましい培地として
は例えばRPMI 1640培地（Flow Laboratories
社）、イーグル最低必須培地（MEM培地）等を
ウシ胎児血清（FCS）、仔ウシ血清等の血清補液
を用いて改質した培地等を例示できる。培養条件
は通常の細胞培養に利用される条件と特に異なる
ものではなく、一般には約36〜38℃の温度及び
6.4〜7.6のPHを採用できる。また上記培地にはＴ
細胞増殖因子（TCGF）等の増殖促進剤或は哺乳
類レトロウイルスの誘導剤として知られる各種薬
剤、例えば５―ヨード―2′―デオキシウリジン
（IdUrd）、シクロヘキシイミド（CH）、プロマイ
シン（Puromycin）、フオルボール 12―ミリス
テート 13―アセテート（TPA）、ｎ―ブチレー
ト（ｎ―酢酸ナトリウム）等を適宜添加使用する
ことができる。培養は通常３〜５日毎に液交換を
行なうことにより有利に実施され、これにより所
望細胞を良好に増殖させ得る。 また上記SCPは例えば上記培養ATL細胞を生
理食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水等の適当な緩衝
液中でホモジネートした後、遠心分離等の適当な
手段により上清として採取することができる。 本発明においてVAPの原料として利用する
ATLウイルスとしては、例えば上記ATL細胞の
培養液より、常法により分離されたものを挙げる
ことができる。上記ATLウイルスの分離は、通
常の遠心分離法等により行なわれ、本発明では特
に、密度勾配法等に従い更に精製されたATLウ
イルスを用いるのが好ましい。VAPは上記ATL
ウイルスを可溶化することにより収得できる。該
可溶化は通常の可溶化剤を用いて容易に行ない得
る。可溶化剤としては各種の界面活性剤例えば
「トリトンＸ−100」（和光純薬社製）、「NP−40」
（シエル社製）、ジキトニン、尿素等の非イオン性
界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等
の陰イオン性界面活性剤等を例示できる。可溶化
方法としては特に制限はないが、より好ましくは
可溶化剤を0.01％〜臨界ミセル成形点程度使用し
て、約０〜100℃程度の温度下に数分〜６時間程
度を要して行なわれる。かくして得られるVAP
は、好ましくは例えば遠心分離法、透折法等の通
常の方法に従い更に精製され、更に例えばDEAE
−セルロース、DEAE−セフアデツクス等の陰イ
オン交換カラムに付し、残存するか又はそのおそ
れのあるウイルス核酸を吸着除去するのがよい。 本発明に用いる不溶化抗原は、上記SCP及び
（又は）VAPを、不溶性支持体上に固定化させる
ことにより製造される。用いられる不溶性支持体
としては特に制限はなく、物理的吸着法に常用さ
れる通常のもの、具体的には例えばポリスチレ
ン、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン
等の多孔性担体を挙げることができる。之等不溶
性支持体上へのSCP及び（又は）VAPの固定は、
通常の方法に従い行なうことができる。例えば生
理食塩水、リン酸塩緩衝液等の各種液中に不溶性
支持体とSCP及び（又は）VAPを入れ、０〜37
℃程度で約２〜24時間を要して反応させればよ
い。上記反応は、好ましくは減圧条件下に実施さ
れる。反応終了後は、使用した不溶性支持体に残
存する吸着部位を常法に従い、例えば0.2％ゼラ
チン、0.2％ウジ血清アルブミン（BSA）等を用
いて飽和させる。 かくして得られる不溶性抗原は、水洗後乾燥状
態で、又は上記緩衝液中で保存される。 本発明方法は、上記の如くして得られる不溶性
抗原を用いて通常の螢光もしくは酵素免疫測定法
に従い標識された抗原−抗体複合体の標識活性を
測定することにより実施される。より詳細には、
上記不溶性抗原に、必要に応じて希釈された被検
血清を加えて免疫反応させ、これを洗浄後得られ
る抗原−抗体反応物に標識作因剤を反応させて標
識し、この標識された複合体の標識活性を常法に
従い測定する。殊に本発明によれば、上記不溶性
抗原を用いることによつて、一度に大量の被検血
清を一定条件下に容易且つ迅速に精度良く測定で
きる。上記において被検血清としては、例えば
ATLA抗体の測定を所望する被検者より常法に
従い採血した血液から分離された血清、又はこれ
を適当な緩衝液で希釈したものを使用できる。こ
こで用いられる緩衝液は特に制限はないが、通常
リン酸塩緩液（PH7.4）を用いるのが適当である。
また上記被検血清と不溶性抗原との免疫反応は、
単に両者を混合接触させるのみで行ない得る。該
反応は通常約４〜37℃下に約0.5〜16時間で終了
し、反応終了後は適当な緩衝液好ましくは生理食
塩水又は被検血清の希釈に用いた緩衝液で充分に
洗浄するのが望ましい。 上記反応に引き続く、得られる抗原−抗体反応
物の標識作因剤による標識化は、上記と同様の緩
衝液で予め希釈した標識作因剤を上記抗原−抗体
反応物と混合して約４〜37℃下に約0.5〜16時間
反応させることにより行なわれ、反応終了後は上
記と同様にして得られる複合体を充分に洗浄する
のが望ましい。上記において標識作因剤として
は、抗体と特異的に結合する能力を有する物質と
各種の酵素標識物質又は螢光標識物質との結合体
をいずれも使用できる。代表的酵素標識物質とし
ては、例えばパーオキシダーゼ（POX）、キモト
リプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、
グリセロアルデヒド―３―リン酸脱水素酵素、ア
ミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ―Nase、Ｐ―
Nase等の各種酵素試薬を例示できる。螢光標識
物質としては、例えばフルオレツセイン・イソチ
オシアナート（FITC）、テトラメチルローダミ
ン・イソチオシアナート（TRITC）、置換ローダ
ミン・イソチオシアナート（XRITC）、ローダミ
ンＢ・イソチオシアナート、ジクロロトリアジン
フルオレツセイン（DTAF）等を例示できる。
また之等との結合により標識作因剤となる、抗体
と特異的に結合する能力を有する物質としては、
例えば、「プロテインＡ」（ProA、フアルマシア
社）やヒツジ抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、ウサ
ギ抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、ヤギ抗ヒト免液
グロブリンＧ抗体、マウス抗ヒト免疫グロブリン
Ｇ抗体、ラツト抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体等の
抗ヒト免液グロブリンＧ抗体等を挙げることがで
きる。 上記抗体と特異的に結合する能力を持つ物質と
標識物質との結合体は、既に種々作成され市販さ
れており、本発明では標識作因剤として市販の各
種結合体を用いてもよく、また通常知られている
方法〔B.F.ERLANGERら、Acta.Endocrinol.
Suppl.，168，206（1972）、及びM.H.KAROLら、
Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，57，713（1967）〕に
従い、新たに結合体を作成して用いてもよい。上
記作成方法として例えば酵素標識物質を用いる場
合は、これと、上記ProA又は抗ヒト免疫グロブ
リンＧ抗体とを適当な酸化剤例えばNaIO4等の存
在下にPH４〜６の緩衝液中で室温付近で２〜５時
間カツプリング反応させ、次いで適当な還元剤例
えばNaBH4等で還元することにより実施される。
各試薬の使用割合としては、ProA又は抗ヒト免
疫グロブリンＧ抗体１モルに対して、酵素標識物
質を約１〜３モル程度、酸化剤を約100〜300モル
程度とし、還元剤は酸化剤の約１〜２倍モル程度
とするのが適当である。 また螢光標識物質を用いて螢光標識作因剤を作
成する場合、螢光標識物質をPH６〜８の水又は生
理食塩水中に入れ、０℃乃至室温付近で、これを
ProA又は抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体と約0.5〜
３時間反応させればよい〔螢光抗体法、医化学実
験法講座、No.４，263〜270頁、1972年第１刷発
行、中山書店〕。ProA又は抗ヒト免疫グロブリン
Ｇ抗体に対する螢光標識物質の使用量は、一般に
約1/50重量倍前後とするのが適当である。 本発明における不溶性抗原−被検血清
（ATLA抗体）−標識作因剤から成る複合体の測
定は、用いられた標識作因剤における標識物質に
応じて常法に従い、該複合体の標識活性（酵素活
性又は螢光活性）を求めることにより行なわれ
る。かくして本発明によれば多量の被検血清の
ATLA抗体を容易迅速に測定できる。 以下本発明を更に詳細に説明するため実施例を
挙げるが本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ （不溶化抗原の製造） ATL患者（50才、男性、長崎市在住）よりヘ
パリン採血して得た血液20mlを「フイコールパツ
ク」（フアルマシア・ジヤパン株式会社製）で遠
心分離して、末梢血リンパ球細胞５×107個を得
る。 これを10％仔ウシ血清加RPMI1640培地（フロ
ー ラボラトリーズ社）で、３×105個／mlの細
胞濃度で、37℃下に３日間培養する。この６×
108個を30mlの0.05Mリン酸緩衝液（0.14M NaCl
含有、PH7.4、以下「PBS」という）中で、ホモ
ジナイズし、次いで１時間遠心分離（105000×
ｇ）する。上清を採取し、PBSで蛋白量を120μ
ｇ／ml（この蛋白量は、大塚アツセイ研究所製の
総蛋白定量試薬であるトネイン−TP」を用い
た発色法により測定したものである）に調整し
て、SCP液を得る。 次いで上記SCP液の140mlに、予め0.1N―HCl
水溶液、0.1N−NaOH水溶液及びエタノールに
て順次洗浄したポリスチレンビーズ（直径6.4mm、
Precision Plastic Co.，Ltd.，USA）700個を加
え、アスピレーターによる減圧下に室温で６時間
放置後、過して不溶化抗原を得る。これは0.2
％ゼラチンを含む0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）
中に４℃で保存される。 実施例２ （不溶化抗原の製造） (1) ATL細胞（Kyo−Ya cell、京都大学ウイル
ス研究所より入手）を、10％仔ウシ血清
（FCS）及び50μｇ／ml５−ヨード―2′―デオキ
シウリジン（IdUrd）加RPMI1640培地で、３
×155個／mlの細胞濃度で37℃下に４日間培養
する。培養液を遠心分離（1500rpm、10分）
し、細胞と培養液とを分離収得する。 (2) 上記(1)で得た培養ATL細胞５×109個に、生
理食塩水30mlを加えてホモジナイズし、次いで
１時間遠心分離（105000×ｇ）して上清を採取
し、以下実施例１と同様にして蛋白量120μ
ｇ／mlのSCP液を調整し、これから同様にして
不溶化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）を
得る。これは0.2％ゼラチンを含む0.05Mリン
酸塩緩衝液（PH7.4）中に一夜放置後、水洗、
乾燥して保存される。 (3) 上記(1)で得た培養液500mlを遠心分離（40000
×ｇ、１時間）して、沈殿成分を採取する。こ
れを25〜60％シヨ糖密度勾配超遠心に付し、密
度1.15〜1.16の画分を採取する。これを0.5％ト
リトンＸ―100を含む0.8M NaCl水溶液1.5mlに
て可溶化処理（４℃、60分）後、遠心分離
（35000rpm、１時間）して、上清を採取する。 上記で得た上清を0.3M NaClを含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5）で５時間透析（セロフア
ン膜）して、可溶化剤の除去及び塩濃度の調整を
行なう。かくして得られるVAP液を上記緩衝液
で平衡化したDEAE―セルロースカラムに付し、
素通り画分を得る。該画分に蒸留水を加え蛋白量
を2.8μｇ／mlに調製し、この40mlに予め前記と同
様にして洗浄したポリスチレンビーズ（実施例１
と同じもの）80個を加え、室温で６時間放置し
て、不溶化抗原を得る。これは0.2％ゼラチンを
含む0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）中に一夜放
置後水洗、乾燥して保存される。 実施例３ （被検血清の調製） ATL患者及び健康人より採血し、室温下に３
時間静置し、その上清をとり、これを2000rpmで
10分間遠心分離後、その上清をとり、被検血清と
する。 実施例４ （ATLA抗体の測定） 実施例３で調製した各被検血清を0.2％ゼラチ
ン加0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）で80，160，
320，640，1280倍と倍々希釈して希釈血清を作成
する。この希釈血清0.5mlに実施例１で得た不溶
化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）１個を加
え、37℃で２時間放置する。アスピレーターで反
応液を吸引除去し、生理食塩水２mlを加えてビー
ズを洗浄し、洗浄液を吸引除去する。この操作を
３回繰返す。 また上記と同一の緩衝液で44000倍に希釈した
パーオキシダーゼ標識プロテインＡ（E.Y.ラボラ
トリーズ社製）の0.55mlに、上記で処理したビー
ズ１個を加え、37℃で２時間放置した後、同様に
して充分に洗浄する。 一方ｏ―フエニレンジアミン60mgの0.2M―マ
クレビン緩衝液（PH5.8）20ml溶液にH2O2を最終
濃度0.02V／Ｖ％となるように撹拌混合して発色
試薬を調製する。 試験管に生理食塩水２ml及び上記発色試薬0.5
mlを入れ、次いでこれに上記で作成処理したビー
ズ１個を加え、室温で30分間放置した後、3N塩
酸１mlを加えて酵素反応を停止させ、反応液の
492nmでの吸光度を測定する。結果を下記第１表
に示す。
【表】
また上記において実施例１で得た不溶化抗原に
代え、実施例２―(2)及び実施例２―(3)で得た各不
溶化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）の夫々
を用い、80倍又は100倍希釈血清について同様の
試験を繰り返した結果を、下記第２表（実施例２
―(2)の不溶化抗原使用）及び第３表（実施例２―
(3)の不溶化抗原使用）に夫々示す。
代え、実施例２―(2)及び実施例２―(3)で得た各不
溶化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）の夫々
を用い、80倍又は100倍希釈血清について同様の
試験を繰り返した結果を、下記第２表（実施例２
―(2)の不溶化抗原使用）及び第３表（実施例２―
(3)の不溶化抗原使用）に夫々示す。
【表】
【表】
実施例 ５
不溶化抗原として、前記実施例２―(2)で得た抗
原吸着ポリスチレンビーズを、また標識作因剤と
して600倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗ヒト免疫グロブリンＧ（E.Y.ラボラトリーズ社
製）を使用する以上は、上記実施例４と同様にし
てATLA抗体を測定した。各血清希釈倍率での
吸光度（492nm）を求めた結果を第１図に示す。
図中１はATL患者を、また２は健康人を夫々示
す。 上記第１表乃至第３表及び第１図より明らかな
通り、本発明方法によれば吸光度測定により
ATLA抗体を簡便に測定でき、ATL患者の診断
及びスクリーニング法として極めて有効であるこ
とが判る。
原吸着ポリスチレンビーズを、また標識作因剤と
して600倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗ヒト免疫グロブリンＧ（E.Y.ラボラトリーズ社
製）を使用する以上は、上記実施例４と同様にし
てATLA抗体を測定した。各血清希釈倍率での
吸光度（492nm）を求めた結果を第１図に示す。
図中１はATL患者を、また２は健康人を夫々示
す。 上記第１表乃至第３表及び第１図より明らかな
通り、本発明方法によれば吸光度測定により
ATLA抗体を簡便に測定でき、ATL患者の診断
及びスクリーニング法として極めて有効であるこ
とが判る。
第１図は本発明方法（実施例５）に従い、
ATLA抗体を測定した結果を示すグラフである。
ATLA抗体を測定した結果を示すグラフである。
Claims (1)
- １ 成人型Ｔ細胞性白血病細胞の可溶性細胞質蛋
白及び成人型Ｔ細胞性白血病ウイルスの可溶化処
理蛋白から選ばれた少なくとも１種を、不溶性支
持体に固定化してなる不溶化抗原を用いることを
特徴とする螢光もしくは酵素免疫測定法による成
人型Ｔ細胞性白血病関連抗体の測定法。
Priority Applications (13)
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|---|---|---|---|
| JP57071080A JPS58187861A (ja) | 1982-04-26 | 1982-04-26 | 成人型ｔ細胞性白血病関連抗体の測定法 |
| SE8302329A SE8302329L (sv) | 1982-04-26 | 1983-04-25 | T-cell-leukemiantigener, sett for framstellning derav och for analys av antikroppar |
| DK181883A DK181883A (da) | 1982-04-26 | 1983-04-25 | Autigener ved t-celleleukaemi hos voksne og fremgangsmaader til deres fremstilling og til paavisning af antistoffer for dem |
| NL8301464A NL8301464A (nl) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Geimmobiliseerd adult t-cel leukemie antigen, werkwijze voor het bereiden daarvan en methode voor het bepalen van een antilichaam daarmee. |
| PH28819A PH19194A (en) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | A dult t-cell leukemia antigens and method for assaying antibodies thereto |
| GB08311373A GB2122343B (en) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Adult t-cell leukemia antigens methods for their preparation and for assaying antibodies thereto |
| DE19833315081 DE3315081A1 (de) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Insolubilisiertes adult-t-zellen-leukaemieantigen, verfahren zu dessen herstellung und bestimmung des entsprechenden antikoerpers hierzu |
| ES522186A ES522186A0 (es) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Metodo de ensayo de anticuerpos. |
| IT48154/83A IT1197633B (it) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Antigenti di leucemia da cellula t in adulti,metodi per la loro produzione per saggiare anticorpi per questi |
| CA000426688A CA1197776A (en) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Adult t-cell leukemia antigens, method for their preparation and for assaying antibodies thereto |
| BE0/210632A BE896571A (fr) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Antigenes de leucemie a lymphocytes t adultes procedes pour leur preparation et pour doser des anticorps avec ceux-ci |
| CH2219/83A CH652033A5 (fr) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Antigene de la leucemie de la cellule t adulte, et methode de determination d'un anticorps de cet antigene. |
| FR8306843A FR2525475B1 (fr) | 1982-04-26 | 1983-04-26 | Antigenes de la leucemie des cellules t de l'adulte, procedes pour leur preparation et pour le dosage d'anticorps contre ces antigenes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57071080A JPS58187861A (ja) | 1982-04-26 | 1982-04-26 | 成人型ｔ細胞性白血病関連抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH0143908B2 true JPH0143908B2 (ja) | 1989-09-25 |
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|---|---|
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| DE (1) | DE3315081A1 (ja) |
| DK (1) | DK181883A (ja) |
| ES (1) | ES522186A0 (ja) |
| FR (1) | FR2525475B1 (ja) |
| GB (1) | GB2122343B (ja) |
| IT (1) | IT1197633B (ja) |
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| PH (1) | PH19194A (ja) |
| SE (1) | SE8302329L (ja) |
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| JPS59151885A (ja) * | 1983-02-18 | 1984-08-30 | Eisai Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病関連細胞株 |
| US4743678A (en) * | 1983-04-27 | 1988-05-10 | President And Fellows Of Harvard College | Method and products for detection of human T cell leukemia virus |
| JPS6044870A (ja) * | 1983-08-22 | 1985-03-11 | Fujirebio Inc | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体検出用試薬 |
| JPS60249058A (ja) * | 1984-05-25 | 1985-12-09 | Eisai Co Ltd | Ａｔｌウイルス抗体の測定方法および試薬 |
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| US5614366A (en) * | 1986-12-31 | 1997-03-25 | Genelabs Technologies, Inc. | HTLV-I peptide antigens and kit |
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| GB2016687B (en) * | 1978-03-20 | 1982-09-08 | Abbott Lab | Sugar coated reagents for solid phase immunoassay |
| FR2435715A1 (fr) * | 1979-01-31 | 1980-04-04 | Sanyo Chemical Ind Ltd | Nouveaux produits conjugues substance a activite immunologique-verre |
| CA1148859A (en) * | 1979-06-14 | 1983-06-28 | Lacy R. Overby | Simultaneous assay of two hepatitis viruses using a solid phase |
| DE3005495C2 (de) * | 1980-02-14 | 1983-03-31 | Institut Pasteur, 75724 Paris | Herstellung von Fragmenten von Viren mit Lipidhülle und sie enthaltende Arzneimittelzubereitungen |
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1982
- 1982-04-26 JP JP57071080A patent/JPS58187861A/ja active Granted
-
1983
- 1983-04-25 DK DK181883A patent/DK181883A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-04-25 SE SE8302329A patent/SE8302329L/ not_active Application Discontinuation
- 1983-04-26 CA CA000426688A patent/CA1197776A/en not_active Expired
- 1983-04-26 PH PH28819A patent/PH19194A/en unknown
- 1983-04-26 CH CH2219/83A patent/CH652033A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1983-04-26 FR FR8306843A patent/FR2525475B1/fr not_active Expired
- 1983-04-26 DE DE19833315081 patent/DE3315081A1/de not_active Ceased
- 1983-04-26 NL NL8301464A patent/NL8301464A/nl not_active Application Discontinuation
- 1983-04-26 GB GB08311373A patent/GB2122343B/en not_active Expired
- 1983-04-26 IT IT48154/83A patent/IT1197633B/it active
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