JPH0146112B2

JPH0146112B2 -

Info

Publication number: JPH0146112B2
Application number: JP11559280A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Ogura; Shigeki Hamaguchi; Junzo Hasegawa; Hajime Kawarada; Kyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1980-08-21
Filing date: 1980-08-21
Publication date: 1989-10-05
Also published as: JPS5739787A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、光学活性炭素を有する種々の天然物
または医薬品などの生理活性物質を合成する際に
有用な反応中間体の１つである光学活性なＤ(-)
−β−ヒドロキシイソ酪酸の微生物を利用した工
業的に有利な製造方法に関するものである。従来、光学活性なＤ(-)またはＬ(+)−β−ヒ
ドロキシイソ酪酸類を製造する方法としては、光
学活性アミン類などのような分割剤を用いてDL
（±）−β−ヒドロキシイソ酪酸を光学分割する方
法が知られている。しかしながらこの公知の方法
は、使用される分割剤が高価であるばかりか、そ
の操作が極めて煩雑であるので工業的に有利な方
法でない。本発明方法によれば簡単な操作によつ
て光学的に高純度なＤ(-)−β−ヒドロキシイソ
酪酸が高収率で得られる。即ち本発明は、DL(±)−β−ヒドロキシイソ
酪酸を、このものを立体特異的にＬ(+)−β−ヒ
ドロキシイソ酪酸を分解する能力を有するキヤン
デイダ属、ハンゼヌラ属、ピチア属、ロードスポ
リデイウム属、スポロボロミセス属、スポリデイ
オボルス属、トリコスポロン属、エンドミセス
属、ゲオトリクム属、ムコル属、ペシロミセス
属、ミクロバクテリウム属、ミクロコツカス属、
ノカルデイア属に属する微生物に接触させること
を特徴とするＤ(-)−β−ヒドロキシイソ酪酸の
製造方法に関するものである。本発明に使用される微生物は、キヤンデイダ
属、ハンゼヌラ属、ピチア属、ロードスポリデイ
ウム属、スポロボロミセス属、スポリデイオボル
ス属、トリコスポロン属、エンドミセス属、ゲオ
トリクム属、ムコル属、ペシロミセス属、ミクロ
バクテリウム属、ミクロコツカス属、ノカルデイ
ア属に属し、Ｌ(+)−β−ヒドロキシイソ酪酸を
分解する能力を有する微生物なら何でも良いが、
例えば、キヤンデイダ・パラプシロシス
（Candida parapsilosis）IFO1022、キヤンデイ
ダ・ルゴーザ（Candida rugosa）IFO1542、ハ
ンゼヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）
IFO0146、ピチア・メンブラナエフアシエンス
（Pichia membranaefaciens）IAM4258、ピチ
ア・ブルトニー（Pichia burtonii）IFO0844、ロ
ードスポリデイウム・トルロイデス
（Rhodosporidium toruloides）IFO0559、スポ
ロボロミセス・サルモニコラー
（Sprobolomyces salmonicolor）IAM12249、ス
ポリデイオボルス・ジヨンソニー
（Sporidiobolus johnsonii）IFO6903、トリコス
ポロン・アキユアチル（Trichosporon
aquatile）ATCC22130、エンドミセス・オベテ
ンシス（Endomyces ovetensis）IFO1201、エン
ドミセス・ゲオトリクム（Endomyces
geotrichum）CBS178、71、エンドミセス・レー
シー（Endomyces reessii）CBS179、60、エン
ドミセス・テトラスパーマ（Endomyces
tetrasperma）CBS765、70、ゲオトリクム・ア
ミセリクム（Geotrichum amycelicum）
CBS186、38、ゲオトリクム・キヤンデイドウム
（Geotrichum Candidum）CBS187、67、ゲオト
リクム・ロウビエリ（Geotrichum loubieri）
CBS252、61、ゲオトリクム・バンリエイ
（Geotrichum vanryiae）CBS439、64、ムコ
ル・アルターナンス（Mucor alternans）
HUT1115、ペシロミセス・バリオテイ
（Paecilomyces varioti）HUT4018、ミクロバク
テリウム・ルテウス（Microbacterium luteus）
IFO3064、ミクロコツカス・バリアンス
（Micrococcus varians）IFO3765、ノカルデイ
ア・コラリナ（Nocardia corallina）IFO3338等
が使用される。この培養には、通常これらの菌が
資化しうる栄養源なら何でも使用しうるが、例え
ば炭素源としてグルコース、シユクロース、マン
ニツト、デンプン等の炭水化物、エタノールを始
めとするアルコール、パラフイン・オレフイン類
の炭化水素、酢酸・ソイ酪酸等の有機酸、大豆油
等またこれらの混合物、窒素源として硫酸アンモ
ニウム・リン酸アンモニウム等、有機栄養源とし
てイーストエキス・麦芽エキス・肉エキス・ペプ
トン等、また微量金属塩、ビタミン等、通常の培
養に用いられる栄養源を適宜混合した培地を用い
ることができる。培養の方法としては、栄養培地のPH3.0〜9.0の
範囲で好気的に20〜40℃の範囲で１〜５日間培養
する。DL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸からＤ
（−）−β−ヒドロキシイソ酪酸製造方法として
は、菌体の培養と並行して行なう方法として、例
えばDL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸を唯一の
炭素源とするか、または上記の炭素源との共存下
でPH3.0〜9.0の範囲で好気的に培養し、培養液中
よりＤ(-)−β−ヒドロキシイソ酪酸を得る方法
があり、また菌体の培養とDL(±)−β−ヒドロ
キシイソ酪酸からＤ(-)−β−ヒドロキシイソ酪
酸を得る反応とを分けて２段階で行なう方法、例
えば菌体の生産を炭素源としてDL(±)−β−ヒ
ドロキシイソ酪酸単独あるいは資化しうる上記の
炭素源、またはこれらの混合物の栄養培地でPH
3.0〜9.0の範囲で好気的に培養し、得られた培養
液にDL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸を添加し、
PHを3.0〜9.0に保持して好気的に反応せしめる方
法、または得られた培養液から遠心分離等で菌体
を集め菌体を適当な組成の液、例えばＭ／15リン
酸緩衝液等に懸濁し、DL(±)−β−ヒドロキシ
イソ酪酸と少量のグルコースを加え好気的にPH
3.0〜9.0の範囲で反応を行なう方法がある。この
場合の菌体は反応速度を早める為にトルエン処理
等の適当な前処理を加えたものも使用できる。培養及び反応で得られたＤ(-)−β−ヒドロキ
シイソ酪酸の採取方法としては、通常の公知の抽
出精製方法が利用しうるが、次の如き方法も使用
しうる。例えば、得られたＤ(-)−β−ヒドロキ
シイソ酪酸含有液のPHを硫酸等で1.0付近まで下
げ、更に飽和となる様に硫酸アンモニウムを加え
る。しかる後２倍容量の酢酸エチルで３回抽出を
行なう。これを低温、減圧下にて溶剤を除き、Ｄ
（−）−β−ヒドロキシイソ酪酸含有物が油状で得
られ、更にこのものを少量のベンゼンに溶解し、
ベンゼン−アセトン混合溶剤で溶出するシリカゲ
ルクロマトグラフイーを行なう事により容易に他
の不純物と分離する事ができる。 β−ヒドロキシイソ酪酸の定量は、ジエーム
ズ・アール・シエーフアー（James Ｒ・
Schaeffer）等の方法（Biotechnology and
Bioengineering）13、208、1971）に準じて行な
つた。次に、本発明を実施例によつて説明するが、本
発明は実施例のみに限定されるものではない。実施例１グルコース２％、イーストエキス0.5％、ペプ
トン0.3％、肉エキス0.3％、Ｌ(+)−β−ヒドロ
キシイソ酪酸0.1％含有する培地（PH6.0）１
に、夫々キヤンデイダ・パラプシロシス
IFO1022、キヤンデイダ・ルゴーザIFO1542、ハ
ンゼヌラ・アノマラIFO0146、ピチア・メンブラ
ナエフアシエンスIAM4258、ピチア・ブルトニ
ーIFO0844、ロードスポリデイウム・トルロイデ
スIFO0559、スポロボロミセス・サルモニコラー
IAM12249、スポリデイオボルス・ジヨンソニー
IFO6903、トリコスポロン・アキユアチル
ATCC22130、エンドミセス・オベテンシス
IFO1201、エンドミセス・ゲオトリクムCBS178、
71、エンドミセス・レーシーCBS179、60、エン
ドミセス・テトラスパーマCBS765、70、ゲオト
リクム・アミセリクムCBS186、38、ゲオトリク
ム・キヤンデイドウムCBS187、67、ゲオトリク
ム・ロウビエリCBS252、61、ゲオトリクム・バ
ンリエイCBS439、64、ムコル・アルターナンス
HUT1115、ペシロミセス・バリオテイ
HUT4018、ミクロバクテリウム・ルテウス
IFO3064、ミクロコツカス・バリアンス
IFO3765、ノカルデイア・コラリナIFO3338を接
種し、３容ミニジヤーフアメンターで30℃、通
気1VVM、撹拌500rpmで20時間培養した。その
後、各培養液にDL(±)−β−ヒドロキシイソ酪
酸30ｇを添加し、カセイソーダでPH6.0調整して
更に48時間反応を行なつた。得られた反応液を濃
硫酸でPH1.0とし硫酸アンモニウムを加え飽和溶
液とした。次に等量の酢酸エチルで３回抽出を
し、抽出液を無水硫酸ソーダで脱水し、これを減
圧下、50℃以下で溶剤を除去し黄色油状物質を得
た。この油状物質を重量５倍のシリカゲル（ワコー
ゲルQ50）を用いベンゼンで調製したカラムにか
けた。その後、ベンゼン：アセトン（３：１）溶
剤でβ−ヒドロキシイソ酪酸を溶出した。得られ
たβ−ヒドロキシイソ酪酸画分を集め、減圧下、
溶剤を除去しシロツプ状の物質を得た。この様に得られたものは、ガスクロマトグラフ
イー、シリカゲル薄層クロマトグラフイー、
NMR分析により高純度なβ−ヒドロキシイソ酪
酸である事が確認された。次に、このβ−ヒドロ
キシイソ酪酸の旋光度をユニオン技研製のデジタ
ル自動旋光度計PM101にて測定した結果は、表
１に示す如くＤ(-)−β−ヒドロキシイソ酪酸で
ある事が確認された。

【表】

【表】実施例２ DL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸2.0％、グル
コース2.0％、リン酸二アンモニウム1.3％、リン
酸一カリウム0.7％、塩化ナトリウム0.1％、硫酸
亜鉛0.006％、硫酸第一鉄0.009％、イーストエキ
ス0.3％、（PH6.5）１に、夫々キヤンデイダ・
パラプシロシスIFO1022、キヤンデイダ・ルゴー
ザIFO1542、ハンゼヌラ・アノマラIFO0146、ピ
チア・メンブラナエフアシエンスIAM4258、ピ
チア・ブルトニーIFO0844、ロードスポリデイウ
ム・トルロイデスIFO0559、スポロボロミセス・
サルモニコラーIAM12249、スポリデイオボル
ス・ジヨンソニーIFO6903、トリコスポロン・ア
キユアチルATCC22130、エンドミセス・オベテ
ンシスIFO1201、エンドミセス・ゲオトリクム
CBS178、71、エンドミセス・レーシーCBS179、
60、エンドミセス・テトラスパーマCBS765、
70、ゲオトリクム・アミセリクムCBS186、38、
ゲオトリクム・キヤンデイドウムCBS187、67、
ゲオトリクム・ロウビエリCBS252、61、ゲオト
リクム・バンリエイCBS439、64、ムコル・アル
ターナンスHUT1115、ペシロミセス・バリオテ
イHUT4018、ミクロバクテリウム・ルテウス
IFO3064、ミクロコツカス・バリアンス
IFO3765、ノカルデイア・コラリナIFO3338を接
種し、３容ミニジヤーフアメンターにて30℃、
通気1VVM、撹拌500rpmで24時間培養、その後
PHを6.0〜7.0にコントロール（カセイソーダ及び
硫酸）し、さらに48時間培養を続けた。表２に示す如く、この培養液を実施例１と同様
に処理し、Ｄ(-)−β−ヒドロキシイソ酪酸を得
た。

【表】

【表】実施例３グルコース4.0％、リン酸二アンモニウム1.3
％、リン酸−カリウム0.7％、塩化ナトリウム
0.01％、硫酸亜鉛0.006％、硫酸第一鉄0.009％、
イーストエキス0.3％、含有培地（PH6.5）１
に、夫々キヤンデイダ・パラプシロシス
IFO1022、キヤンデイダ・ルゴーザIFO1542、ハ
ンゼヌラ・アノマラIFO0146、ピチア・メンブラ
ナエフアシエンスIAM4258、ピチア・ブルトニ
ーIFO0844、ロードスポリデイウム・トルロイデ
スIFO0559、スポロボロミセス・サルモニコラー
IAM12249、スポリデイオボルス・ジヨンソニー
IFO6903、トリコスポロン・アキユアチル
ATCC22130、エンドミセス・オベテンシス
IFO1201、エンドミセス・ゲオトリクムCBS178、
71、エンドミセス・レーシーCBS179、60、エン
ドミセス・テトラスパーマCBS765、70、ゲオト
リクム・アミセリクムCBS186、38、ゲオトリク
ム・キヤンデイドウムCBS187、67、ゲオトリク
ム・ロウビエリCBS252、61、ゲオトリクム・バ
ンリエイCBS439、64、ムコル・アルターナンス
HUT1115、ペシロミセス・バリオテイ
HUT4018、ミクロバクテリウム・ルテウス
IFO3064、ミクロコツカス・バリアンス
IFO3765、ノカルデイア・コラリナIFO3338を接
種し、30℃、通気1VVM、撹拌700rpmで20時間
培養し、得られた培養液を遠心分離により菌体を
集め、更に0.9％食塩水で２回洗浄した菌体を得
た。これをＭ／15リン酸緩衝液（PH6.0）に懸濁
し、DL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸30ｇ、グ
ルコース２ｇ添加し、PH6.0に調整し培養と同一
条件で48時間反応させた。その後実施例１と同様
な方法で抽出精製を行ない表３の如くＤ(-)−β
−ヒドロキシイソ酪酸を得た。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ DL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸を、キヤ
ンデイダ属、ハンゼヌラ属、ピチア属、ロードス
ポリデイウム属、スポロボロミセス属、スポリデ
イオボルス属、トリコスポロン属、エンドミセス
属、ゲオトリクム属、ムコル属、ペシロミセス
属、ミクロバクテリウム属、ミクロコツカス属、
ノカルデイア属に属し、かつＬ(+)−β−ヒドロ
キシイソ酪酸分解能を有する微生物に接触させる
ことによりＬ(+)−β−ヒドロキシイソ酪酸を分
解し、残存するＤ(-)−β−ヒドロキシイソ酪酸
を採取する事を特徴とするＤ(-)−β−ヒドロキ
シイソ酪酸の製造方法。２ DL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸を添加し
た培地中で微生物を培養することにより、DL
（±）−β−ヒドロキシイソ酪酸と微生物とを接触
させる特許請求の範囲第１項記載の製造方法。３微生物を栄養培地で培養して得た培養液を
DL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸に作用させる
特許請求の範囲第１項記載の製造方法。４微生物を栄養培地で培養して得た培養液から
微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し、それ
をDL(±)−β−ヒドロキシイソ酪酸に作用させ
る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。５微生物がキヤンデイダ・パラプシロシス、キ
ヤンデイダ・ルゴーザ、ハンゼヌラ・アノマラ、
ピチア・メムブラナエフアシエンス、ピチア・ブ
ルトニー、ロードスポリデイウム・トルロイデ
ス、スポロボロミセス・サルモニコラー、スポリ
デイオボルス・ジヨンソニー、トリコスポロン・
アキユアチル、エンドミセス・オベテンシス、エ
ンドミセス・ゲオトリクム、エンドミセス・レー
シー、エンドミセス・テトラスパーマ、ゲオトリ
クム・アミセリクム、ゲオトリクム・キヤンデイ
ドウム、ゲオトリクム・ロウビエリ、ゲオトリク
ム・バンリエイ、ムコル・アルターナンス、ペシ
ロミセス・バリオテイ、ミクロバクテリウム・ル
テウス、ミクロコツカス・バリアンス、ノカルデ
イア・コラリナである特許請求の範囲第１項記載
の製造方法。６微生物の炭素源としてDL(±)−β−ヒドロ
キシイソ酪酸単独または、これに資化しうる炭水
化物、アルコール、有機酸または炭化水素の１種
または２種以上を共存せしめたものを使用する特
許請求の範囲第１項〜５項記載の製造方法。