JPH01500162A - ペプチドの産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３１、胚子細胞である請求の範囲第３０項に記載の動物細胞。

３２、その遺伝子学的物質が請求の範囲第２９項に記載の遺伝子学的構成体を含 有する動物。

３３、請求の範囲第２９項に記載の遺伝子学的構成体からなるプラスミド。

明細書 ペプチドの産生方法 本発明は、ポリペプチドからなる基質を産生ずる方法に関する。より詳しくは、 本発明は、蛋白質の産生方法に関し、またその形成が酵素蛋白質で触媒される生 物学的物質の産生方法に関する。

組換えＤＮＡ技術は、商業的に重要な生物学的物質の産生に関し過去１０年にわ たってますます使用されてきている。この結果、種々の医学的に重要なヒト蛋白 質をコード化するＤＮＡ配列がクローンされている。これらは、インシュリン、 プラスミノーゲン活性化剤、アルファ１−抗トリプシンおよび凝固第Ｖｌｌｌお よびＩＸ因子を含む。目下、新興組換えＤＮＡ技術をもっても、これらの蛋白質 は、通常血液または組織から純化されＡＩＤＳまたは肝炎類を引き起こすような 怒染性因子の伝達の危険を伴う金および時間を費す過程である。

所望の医学的に重要な蛋白質を産生ずるためのバクテリアにおけるＤＮＡ配列の 発現は、興味ある提案に見えるが、実用には、バクテリア性細胞において異質蛋 白質が不安定でありかつ正確に製造されないのでバクテリアは、しばしば宿主と して不十分であることを証明する。

この問題を実証するため、晴乳類組織媒溶液におけるクローン化遺伝子の発現が 企てられており、または数例において、実現可能な方法を証明している。しかし ながら、動物細胞の回分式醗酵は高価であり、また技術的に厳しい要件のプロセ スである。

従って、正確に修飾された真核生物のポリペプチドのような生物学的基質の産生 に対する高収率および低コストの製法の必要がある。ヒトに対して感染性である 因子の不存在は、このような製法に有利である。

本発明の第１の態様によると、ＤＮＡ配列を成人＃ｉ呻乳類の乳腺中に発現させ るような方法で乳清蛋白質に関してコードする雌呻乳類の遺伝子内にポリペプチ ドに関してコードするＤＮＡ配列を取り込むことからなるポリペプチドからなる 物質を産生ずる方法を提供するものである。該基質は、一般に翻訳後の修飾の前 または好ましくは後のいずれかに成人雌呻乳類のミルクから回収される。

本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、蛋白質として適切に分類 されるのに十分に長いか否かにかかわらず、アミノ酸類の鎖から成る分子を言う 。ポリペプチドは、蛋白質であるのに十分に長いことが好ましい。

「ポリペプチドから成る物質」は、ポリペプチドそれ自身であり得、または修飾 （例えばグリコジル化）ポリペプチドでもあり得る。必要によりまたはさらにこ の物質は、ポリペプチドの翻訳後の修飾で架橋され得る。

本発明は、例えば宿主哺乳類の天然または改質ミルク蛋白質を含む食料用ペプチ ドホルモン、血液凝固因子（特に第Ｖｌ因子および第ｔＸ因子）またはそのサブ ユニット（特に第■因子および第１Ｘ因子）、血液蛋白質（例えばベーターグロ ビン）および血清蛋白（例えば、アルファー抗トリプシン）たは酵素を産生ずる のに使用し得る。

本発明により産生される酵素は、乳腺における本来の位置においてその基質に対 して作用することが出来、そしてそれゆえ、本発明がＤＮＡ配列を成人雌晴乳類 の乳腺中で発現させ、その後それが１以上の酵素の基質からの反応産生物の形成 を触媒するような方法で乳清蛋白質に関してコードするＤＮＡ配列を取り込むこ とからなる酵素の反応産生物である基質を産生ずる方法を含むことを見い出すこ とができる。該反応産生物は、一般に成人哺乳類のミルクから回収される。

ペプチドに関してコードするＤＮＡ配列（「重要なりＮＡ配列」）を好ましくは 融合遺伝子を形成させるために生体外で成人雌明乳類の乳腺に発現可能である乳 漬蛋白質内に取り込みかつ該融合遺伝子を補乳類の受精卵内への接種により胚芽 系統（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）内に取り込み、その後該接種された受精卵を成人雌哺 乳類中にて発育させる。すべての接種された卵子が重要なりＮＡ配列を発現する 成人雌内で発育しないことが予想される。雌が次世代を産むことができることは 別として動物の約半分が雄である。

それによって異質ＤＮＡ配列を明乳類の胚芽系統内に取り込み得る適切な技術は マウスにおいて発達している。目下のところ、最も有効なルートは、受精単細胞 卵の前核内への数百のＤＮＡの線状分子の直接ミクロ接種を必要とし、またこれ は本発明における実施方法である。つづいてミクロ接種卵を７ａ妊Ｍ養育母の卵 管に移し生長させる。プロスナトル　アカド　丈工　殻（１９８５年）第４４３ ８〜４４４２頁（汀匹　ハ旦　卸剣　兆辷　靴（１９８５）４４３８−４４４２ ）にプリンスターら（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ）により発育するマウスの 約２５％が１以上のミクロ接ｆｉＤＮＡの複写を継承することを報告している。

商業的見地より、より多くのミルクを産生ずる傾向にある種を本発明における宿 主晴乳票として使用することが明らかに好ましい。この理由のなめ、ヒツジ、ブ タおよびウシ等の家畜間を以下により詳細に論する。

多数の家畜を伴う作業は、特に必要とされる数の動物およびそのコストにおいて 、相当の投資を要する。１過排卵化マウスに対して３０卵子まで得られるのが正 常であるのに対し、雌ヒツジは、はんの３〜５しか与えない。家畜と直面したさ らなる問題は、卵子が数多くの小胞の存在により不透明であることであり、これ は同定および前核の首尾よい接種を困難にする。それにもかかわらず、ウサギ、 ヒツジおよびブタの卵子内へのＤＮＡのミクロ接種は、金属性チオネイン−生長 （ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−ｇｒｏ＊ｔｈ）ホルモン融合遺伝子を全３ 晴乳顛の胚芽系統に挿入したハマーら、ネイチャー３１５（１９８５年）第６８ ０〜［３８３頁（Ｈａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５（１９８ ５）６８０−６８３）によって報告されている。

１９２頭の子ブタを産み、そのうち２０頭が融合遺伝子を保持し、この結果はヒ ツジにいおてはそれほどもならされなかった。すなわち、１０３２個卵子を接種 し転移したが、７３頭生まれた子ヒツジのうち１頭のみが異質ＤＮＡを含んだ。

胚芽系統内に組み込まれると、異質ＤＮＡは、動物からすでに採取できる官能性 蛋白質を産生ずるために高レベルで選択の組織において発現され得る。これを達 成するため、重要なペプチドに関してコードするＤＮＡ配列を通常ＤＮＡ配列ま たは好適な組織においてその発現を媒体する配列に融合する。マウスにおけるい くつかの初期実例がいくぶんか有益である挿入ＤＮＡの発現に特異な組織を示す が［例えばラセイら、セル３４　（１９８３年）第３４３〜３５６頁（ｔａｃｅ ｙ　ｅｔ　ａｔ、　Ｃｅ１ｌ　３４　（１９８３）３４３−３５６）　］　、今 の一般的コンセンサスは、はとんどの形質転換遺伝子の発現に特異な適正な組織 が達成可能であることである。プリンスターらセル２７　（１９８１年）第２２ ３〜２３１頁（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ　Ｃｅ１ｌ　２７（１９８１）２ ２３−２３１）　：スイットら欠止　競　（１９８４年）第６３９〜６４６頁（ Ｓｗｉｆｔ旦　旦　ｃｅｌｌ、　廷　（１９８４）６３９−６４６）Ｓ口接種に 先立って重要なりＡＮ配列のクローニングに使用されるすべての反核生物ベクタ ー配列を除去することが重要であることが記載されている。［クラムララフらｉ ル。

−ｂｔＬ、−カΔ膨乞止４５　（１９Ｂ５年）第１６３９〜１６４Ｂ頁（ＫｒＵ ｍｌａｕｔｅｔ　ａｌ　ＨＯｌ、ｃｅｌｌ　Ｂ１１１．　５　（１９８５）　１ ６３９−１６４８）Ｊ。

これらの開示は、異なる組織をトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）動 物の構成にターゲットできることを示すけれど、ポリペプチド含有物質の商業的 に関するいずれの所望な特別の！織の提案もない、これらは、ある組織において 発現されまた挿入ＤＮＡの発現をターゲットすることを提供するいずれの特別の 遺伝子も提案するものでもない。

数多くの因子をその発現が誘導されるペプチドおよび組織からなる基質に関して 考慮しなければならない、多くの蛋白質は、十分な生物学的活性を示すために広 範な翻訳後の修飾を必要とする。例えば、第１Ｘ因子は、生物学的活性のために グルタミン酸残基の特定なサブセットのガンマカルボキシル化を必要とするＥデ シビオおよびダビエ、バイオフミストリー第１８巻他第８９９〜９０４頁（１９ ７９年）（ＤｅＳｃｉｐｉｏ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　１８８９９−９０４（１９７９）つ、第ｔＸ因子の本来の合成部位である肝 臓は、この修飾を実施するのに長けている。ＷＡ維芽細胞は不十分であるが第１ Ｘ因子のガンマカルボキシル化を実行することができる；デ　ラシャルルらネイ チャー　３１６　第２６８〜ｚｒｏ（ｔ９ａｓ年）（ｄｅＩａ　５ａｌｌｅ　ｅ ｔ　旦　Ｎａｔｕｒｅ　３１６２６８−２７０　（１９８０）　’］　、　Ｌか しながら、一定の蛋白質は、特定の組織にいおて合成される場合のみ正確に合成 され得、またいくらかの場合においては、発現部位を産生蛋白質の要求に適合さ れることが必要であるかも知れない。発現に対する和讃としての乳腺の使用が困 難なこの可能性を十分にまたは満足できる程度に克服することを確信する。

固体朝顔とは対照的に体液の回収は、このようｆＩ−経路が概して再生可能であ り、また生医学的に重要な蛋白質のほとんどが体液中に分泌されたそれ自身であ るので望ましい。

肝臓またはＢリンパ球のいずれかからの血流中の分泌は、可能経路であるが血液 の凝固蛋白質および生物学的に活性なペプチドおよび抗原性分子の存在は、流れ に沿ったプロセシングを緯けるのを妨害する。

上記の難点は、発現組繊としての乳腺の使用による本発明によって克服し得る。

ミルクは、すぐに回収され、多量に利用できかつ生化学的に十分特徴ずけられて いる。さらに、主要ミルク蛋白質は、高濃度で（約１〜１５ｉｒ／Ｄ）ミルクに 含まれている。

世界の多くの国で４種の共通の家畜がある：ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシ、す なわちイノシシ科、ヒツジ属、ヤギ属、ヒツジ属およびウシ属の一員である。家 畜化ウシは、一般にタウラス（Ｔａｕｒｕｓ）種である。

本発明は、いずれかの特別の暁乳類の動物の種、属および科に制限されたその最 も広い態様内でないがブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシが好ましい。各々本発明に 関連して利益および不利益を有する。これらの考慮は、本発明の好適な態様によ るポリペプチドに関してコードするＤＮＡ配列を融合遺伝子を形成するなめｌこ 生体外で成入雌嘘テＬ類のソＬ涼に発現可能である乳清蛋白質遺伝子内に取り込 みかつ該融合遺伝子を晴乳類の受精卵内に接種し、その後接種受精卵を成人ｔｌ 暖乳類内で発育させるという事実から生しる。

ウシから得られる高ミルク収量は、ウシの使用が好ましいということを示唆する 傾向にある因子であるが、子ウシ胚子を操作することの技術的困難は、例えばヒ ツジ以上である。さらに、ウシを伴う実験の絶対的コストは、他の３つの好適な 家畜の種が選択されるものであることを意味する。下記第１表は、本発明の使用 のなめｔごどのようｌこしてブタ、ヒツジおよびウシをお互いに比較するかを示 す。

第１表 胚子操作およびミルク産生に関する異なる家畜の比較ブタ　ヒツジ　ウシ 小胞成熟の時間の調整　あり　（あり）（をし）の可能性 １動物に対する卵母細胞　１０　１〜３１の数−過剰排卵なし １動物に対する卵母細胞１５〜２０　４〜１０　６種度の数；過剰排卵化 前核の視覚化　（可能）　（可能）　（不可能）季節的繁殖　なし　あり　なし １胚子につく動物の名目　１．０　１．８　１１０コストを含む１胚子移植 の比較コスト 産生ピークにおけるミルク　ｎ、１　１〜３″　５〜３０″収散　リットｌし７ 日 ′繁殖による ｎ、ａ＝有効データなし 前核の可視化の重要性は、ペプチドに関してコードするＤＮＡ配列を含む融合遺 伝子を受精卵の前核内に接種することが本発明の好ましい特徴であるからである 。

ブタに関するミルク産生データは、すぐに利用できないのではなく、ヒツジにお いては、ミルク産生率が繁殖により１日につき１〜３リツトルの範囲内である。

ウシに関しては当然としてヒツジからミルクを回収する専門装置が商業的ｇ＋給 者から役立てられておることを注目する。従ってヒツジは、特にイーストフリー スライズのような路用ヒツジにおいては、選択される動物であるブラックフェー スシープと好適な高ミルク産出系とかけあわせることｌこよって得られる変種は 、実行可能な変更として示される。

授乳腺は、分泌ｍ胞の複合体小葉を排出する管の拡張さｔＬｆ、システムから成 る著しく専門化さｈなり宵である。乳細胞は、多くの方法で高率の分泌に適合さ れる。ＰＡえば、これらは、血液から前駆体の効率的取り込みを確実にする専門 的輸送メカニズムおよび高率の蛋白質合成翻訳前修飾および細胞からの運び出し を可能にする細胞内膜広大なシステム［租肉質性小絹（ｒｏｕＱｈ　ｅｎｄｏｐ ｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）、ゴルノ（Ｇｏｌｇｉ）装置等コを有する 。

乳腺は、その生長および機能の全態様に関してホルモンに依存する。乳腺に関す る論評記事は、例えばトラパーおよびフリーマン、フィジオロジカル　レビュー 第６０巻第１０４９〜１１０６頁（１９８０年）（丁０ｐｐｅｒ　ａｎｄ　Ｆｒ ｅｅｍａｎ、　□オン　ラクーｒ−シーｒ　ン」メ７　ｘム（ｉ）　（”Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒＶ　ｏｆ　Ｌａｃｔａｔｉｏｎ、　Ｈｅｐｈａｍ（Ｅｄ））に おける７ｔ−サイス（［０ｒｓｙｔｈ）のエリセピア−［１９８２年）第３０９ 〜３４９頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８２）３０９−３４９　＞によるものがあ る。乳腺を影響するホルモンは、妊娠および授乳の間に乳腺において生じるきわ だった変化を媒介する。例えは雌ヒツジにおいて、総細胞数を二倍にしまた種々 の細胞タイプの蛋白質の変化および分泌細胞の末端分化を導く。

乳腺は、ミルク中に多くの異なる蛋白質を分泌する。一般的識別がカゼインと可 溶性（乳清）蛋白質との間でなされているが、異なる種からのミルクの成分には 定性的および定量的相異がある［「デベロップメンツ・イン・デアリー・クミス トリー、■」フォックス編エリセピア−（１９８２年）第８１〜１０９頁におけ るジェネス参照のこと（Ｓｅｅ　Ｊｅｎｎｅｓｓ　ｉｎ　”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔｓ　ｉｎ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｉ　”、　Ｆｏｘ（Ｅｄ）Ｅ ｌｓｅｙｉｅｒ（１９８２）８７−１０９）。乳腺にて合成される主要反鏝動物 乳清は、アルファーラクトアルブミンおよびベータラクトアルブミンである。

カゼインの３つの主要なタイプがある。アルファーカゼイン、ベーターカゼイン およびカッパーカゼインであり、特徴種のほとんどに見い出される。ミルクにお いて、カゼインは、これらをミセル形態で凝集するカルシウムと結合するのに役 立つ。反稿動物における主要乳清であるベーターラクトグロブリンの機能は、未 知であるが、カッパーカゼインと相互作用するらしいしプランナー、ジャーナル デアリー　サイエンス第６４巻第１０３８〜１０５４頁（１９８１年）（Ｂｒｕ ｎｎｅｒ、Ｊ、Ｄａｉｒ　Ｓｃｉ、６４　１０３Ｂ−１０５４（１９８１））　 コ　、　アルファーラクトアルブミンは、グルコースおよびガラクトースのラク トースへの転換における必須補助因子である。

第２表は、種々のミルクの蛋白質成分である。

第２表 種々のミルクの蛋白質成分 ｇ／リットル　ウシ　ヒツジ　マウス　ヒトカゼイン想　１ アルフアＳｌ　１０　１２　） アルファ３２　３．４　３．８　）０．４ベータ　１０　１６　３ カツパ　３．９　４．６　１ 主要乳漬蛋白質 アルファラクトアルブミン　Ｉ　Ｑ、８　機銃　１．６ベータラクトグロブリン 　３　２．８　なし　なしじ酸性蛋　と　なし　なし　２　ｔし 他の乳清蛋白質 血清アルブミン　０．４　０．４ リゾチーム　機銃　０．４ ラクトフエリン　Ｑ、１　１．４ 免疫グロブリン　０．７　１．４ （データは種々のソースからまとめな）主要部分に関して、異なるミルク蛋白質 が単一複写Ｉｔ伝子でコード化さ九ることを確信する「「ザ・バイオフミストリ ー・イン・ラクテーションＪメファム絹エリセピア−（１９８３年）第１７１〜 ２２５頁におけるマーシャーおよびゲイ（）ｌｅｒｒｉｃｅｒ　ａｎｄ　ｅａｙ ｅ　ｒｎ　”丁ｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｌａｃｔａｔｉ。

ｎ”、　）ｌｅｐｈａｍ　（Ｅｄ）　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８３）１７７−２ ２５）］　、カゼイン遺伝子は、マウスＥローゼンらバイオケム・ソス・トラン ス、９１１２　（１９Ｂ２年）　（Ｒｏｓｅｎｅｔ　ａｔ　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ ＳｏｃＴｒａｎｓ、　９１１２（１９８２））１およびウシしグロスクラウド　 ７２〜５９頁（１９７９年）　Ｇｒｏｓｓｃｌａｕｄｅ　Ｐｒｏｃ、ＩＢｔｈ　 Ｉｎｔｌ、Ｃａｆン遺伝子が乳清蛋白質遺伝子よりはるかに高いレベルで発現さ れるらしいので、カゼイン遺伝子が発現に関する異質ＤＮＡを取込む選択の遺伝 子であることが自ずと考えられる。しかしながら、−辺的予想とは正反対に、本 発明は、重要なペプチドに関してコードするＤＮＡ配列をγＬ清蛋白質内に取り 込むことを提供する。

ラットアルファーラクトアルブミンに関する遺伝子は、４つのエクソンから成り 、２．５ｋｂの染色体ＤＮＡ　Ｅ力スバおよびサファヤ、ネイチャー３１１第３ １１〜３８０頁（１９８４年）　（Ｑａｓｂａ　ａｎｄ　５ａｆａｙａ　Ｎａｔ ｕｒｅ　３１１３７７−３８０（１９８４）　）　］を含む、ウシアルファーラ クトアルブミンに関する遺伝子は、同様に組織されるらしい、ヒツジベータラク トグロブリンがほぼ確実に単一複写遺伝子であるらしくまた４、９ｋｂ転写単位 内の７エクソンから成ることを見い出しな；この遺伝子は、本発明の使用を実施 する遺伝子である。

ラット［ナカシおよびカスバ、ジェイ、　パイオル。

ケム、２５４　第６０１６〜６０２５頁（１９７９年）　（Ｎａｋｈａｓｉ　ａ ｄ　ＱａＳｂａ、　Ｊ、Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ　２５４６０１６−６０２５（１ ９７９）＞　１　、ウサギｃｈｅｍ、　１７１９３−１９９（１９７Ｂ））コ　 およびマウス［パラレイらネイチャー２７５第４５５〜４５７頁（１９７８年） 　（Ｐａｕｌｅｙ　ｅｔａｔ　Ｎａｔｕｒｅ　２７５４５５−４５７（１９７Ｂ ））コにおける乳腺の発達の間のミルク蛋白質ｍＲＮＡのレベルの変化は、生体 内翻訳およびｃＤＮＡハイブリッド形成の両方を使用して評価されている。乳腺 は、高率のミルク蛋白質ｍＲＮＡ合成およびこれらの分子の効率的安定化の両者 から成る整合メカニズムより生ずる８０，０００〜ｔｏｏ、ｏｏｏぐらいのミル ク蛋白質−特異ｍＲＮＡの分子を蓄積する［メルセイヤーおよびゲイ、前掲（Ｈ ｅｒｃｉｅｒ　ａｎｄ　Ｇａｙｅ、　ＯＰ、　Ｃｉｔ、）およびギュイッテら欠 ±１１第１０１３〜１０７３頁（１９７９年）　（Ｇｕｙｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｔ 　Ｃｅ１ｌ　１７１０１３−１０７３（１９７９））］　、　Ｌがしながら例外 がある。ヒツジにおいては、ベータカゼンイは、化ミルク蛋白質の４５％を構成 するが、はんの１７％のｃ　ＤＮＡライブラリーから単離さｈたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ クローンしがこの遺伝子に相当しない。［メルセイヤーらバイオヒミ−６７第９ ５９〜９７１頁（１９８５年＞　（）ｌｅｒｃｉｅｒｅｔ　ａｔ　Ｂｉｏｃｈｉ ｍｉｅＢ７９５９−９７１　（１９８５）　）コ、ウサギにおいては、ミクロソ ーム小胞体に分離されたアルファーラクトアルブミンのａｔは、ミクロソーム小 胞体の不存在下の蛋白質合成率より期待されたものより非常に低く、おそらく信 号ペプチドが最適の構造を示さないことを示唆しているしゲイらビオヒミ＝６４ 第１７３〜１８４頁（１９８２年）　（Ｇａｙａ　ｅｔ　ａｔ　Ｂｉｏｃｈｉ鮭 ｅ　６４１７３−１８４（１９８２））コ。多（のミルク蛋白質の主要翻訳産生 物は、広範に修飾される。例えば、アルファラクトアルブミンは、Ｎグルコシル 化され、カッパーカゼインは、０−グルコシル化されまたアルファーおよびベー ターカゼインはホスホリル化される。翻訳後の修飾のその役割に加えて、ゴルジ 複合体（Ｇｏｌｌｌｌｉ　ｃｏｍｐｔｅｘ）はまた、カゼインをミセル中に凝結 し包み込むことにも関わっている。カゼインと乳清蛋白質を異なる経路で細胞か ら運び出すことは可能である。これに関連して、間−および内部特異性比較の両 者において、発生期のペプチドを正しい経路内にターゲツティングする役割りを 果し得ることを示唆するカゼイン信号ペプチドが（高い割合の分子の休止に比べ ると）大いに転換されることを注目するのは重要であるＣメファムら前掲（Ｈｅ ｐｈａｍ　ｅｔ　旦　ｏｐ　ｃｉｔ）ｌ。前述のように、ミルク蛋白質遺伝子は 、授乳乳腺において多く発現する。ヒツジにおいては、例えば、アルファｓ１− カゼインｍＲＮＡは、約３０％のｐｏ　１ｙＡ＋ＲＮＡを示しまたベーターラク トグロブリンは、約５％のｐｏ　１ｙＡ＋ＲＮＡを示す（メルセイヤーら（１９ ８５年）前掲）、これらの転写体が単一複写遺伝子から生ずるならば、ついでこ れらのレベルが高率の転写および有効なｍＲＮＡ安定化しテイソットおよびホウ デビン　ユーロ、　ジェイ、　バイオケム、１１０第２６３〜２１２頁（１９８ ０年）（丁ｅ’ｆｓｓＯｔ　ａｎｄ　）ｌｏｕｄｅｎｂｉｎｅ、　Ｆｕｒ、　Ｊ 。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１０２Ｂ３−２７２（７９＆Ｄ）月。特異のｍＲＮＡ安定 化は、成熟ｍＲＮＡに存在する配列によって媒介されるであろう。

本発明の好適な態様にいおて、ヒツジ胚芽系統内に挿入されたＤＮＡ配列の発現 の同様なレベルが達成され得る。これは、それを高レベルの組織特異発現および ｍ　ＲＮ　Ａ安定化を媒介する乳清蛋白質と関連するＤＮＡ配列に結合すること によって達成される。すなわち、ベーターラクトグロブリンが実施の遺伝子であ る。

新規遺伝子をマウス内に転移することは、操作方法である。高レベルの異質遺伝 子の発現に特異な組織を表わすトランスジェニクマウスにおける外因性ＤＮＡは 、構造的遺伝子のみならず配列の側面に位置する５′および３′から名。多くの 重要な調整成分が５′をｍ　ＲＮ　Ａキャップ部位に配置されるという示唆［例 えば、マツフナイトおよびキックスベリ−、サイエンス　２１７　第３１６〜３ ２４頁（１９８２年＞　（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２１７３１６−３２４（１９８２）　：ペイバーら旦３５　第 ３８１〜３９２頁（Ｐａｙｖａｒ　ｅｔｌ　並旦３５３８１−３９２（１９８３ ））、レンカウィツら叩　３７第５０３〜５１０頁（１９８４年）　（Ｒｅｎハ ａｗｉｔｚ　ｅｔ　ａｔ　Ｃｅ１Ｊ３７５０３−５１０（１９８４））；および カリ７らネイチャー　３０Ｂ　第５１３〜５１８頁（１９８４年）　（にａｒｉ ｎ　ｅｔ　旦　ＮａｔＬｌｒｅ　３０８５１３−５１８（１９８４）　）を参照 のことコの多くの証拠があるが、重要な調整配列、特に発現に特異性組織を媒介 するもがこの楕遣的遺伝子内にあるいはそれに対する３′内にもあり得るという 証拠もある［チャーネイら立生３８第２５１〜２６３頁（１９８４年）　（Ｃｈ ａｒｎａｙ　ｅｔ　ａｌ　Ｃｅ旦　３８２５１−２６３（１９８４））；および ジリースら立±　３３第７１１〜１２Ｂ頁（１９８３年）（Ｇｉｌｌｉｅｓ　ｅ ｔ　ａｔ　Ｃｅ１ｌ　３３７１７−７２８（１９８３））　］　、さらに、エク ソンの配列（すなわち成熟ｍＲＮＡにおける配列である）は、ｍＲＮ八安へ性を 媒介する配列を含む、第３表は、い（つかのマウスにおける異質遺伝子に特異性 組織の細目である。

重要なペプチドに関してコードするＤＮＡ配列の発現を誘導するのに使用される 上記の好適な融合ウィルスが１以上の；プロモータ：翻訳に関する出発部位；１ 以上のミルク蛋白質遺伝子の（推定）末端５′調整配列；構造のミルク蛋白質遺 伝子配列；およびミルク蛋白質の側面にある３′配列から成るという上記の理由 である。最適融合遺伝子は、全てのこれらのタイプの配列から成る。

選ばれる融合遺伝子は、乳清蛋白質の第１エクソン内に挿入される重要なペプチ ドに関してコードするｃＤＮＡ配列から成る。数Ｋｂのミルク蛋白質遺伝子の配 列の側面にある５′がこのような融合遺伝子に含まれることが好ましい、これら の構成体において、重要なペプチドの分泌は、好ましくは、その固有のペプチド で媒介される；従って融合遺伝子が重要なペプチドに関する信号ペプチドである ことが好ましい。しかしながら、信号ペプチドに特異Ｍ１ｍは、発生期のペプチ ドを正しい分泌経路内にターゲラティグするのに重要であり得る（前に議論した とおり）、従って、乳清蛋白質遺伝子の信号ペプチドをコード化するＤＮＡ配列 が成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸をコードする挿入されたＤＮＡ配列に正確に融 合することが特に好ましい、挿入された３′末端は、その停止コドン後、その個 有のメツセージ分裂状態（Ｃ１ｅａｖａｎｃｅ）およびポリアデニル化前に末端 をなすことが好ましい、挿入部位の下流、すなわち構造の遺伝子の休止、並びに 配列の側面にある３′が優待される。

トランスジェニック動物において、このような構造が高レベルの発現に特異な乳 腺の獲得の機会を最大化する。主要転写は、乳清遺伝子において保持された部位 で正確にポリアデニル化およびスプライシングされるべきである。成熟メツセー ジは、ｍＲＮＡの効率的な安定化に関する配列を含むべきである。ミルク遺伝子 信号ペプチドを利用する構成体にいおて、成熟ｍＲＮＡはミルク蛋白質遺伝子か ら誘導される信号ペプチドがｃＤＮＡ挿入によってコード化される成熟ペプチド の分泌を効率的に導く融合プレペプチドを産生ずるために翻訳されるべきである 。

ヒンジベーターラクトグロブリンは、前述のごとく、重要なペプチドに関して、 コード化するｃＤＮＡを「吸収消化するＪ　（ｅｎｔｒａｒｎ）のに選ばれる乳 清蛋白質である。ヒツジにおいて、ベーターラクトグロブリンは、ソＬ腺におい て乳清を最も多く発現しまたそのｍＲＮＡは、約８％の総ｐｏ１ｙＡ＋ＲＮＡか らなる。この遺伝子は、十分に特徴ずけられておりヒト第１Ｘ因子およびヒトア ルファ１抗原をコード化するｃＤＮＡ配列での融合構成体を同化するのに使用さ れる。

本発明の第２の態様によると、成人雌呻乳類の乳腺に発現できるような方法で乳 清蛋白質に関してコードする哺乳類の遺伝子内に取り込まれたペプチドをコード 化するＤＮＡ配列からなる遺伝子学的構成体が提供される。

本発明の第３の態様によると、前記の遺伝子学的構成体を含む動物細胞が提供さ れる。該動物細胞は胚子細胞であり得る。

本発明の第４の態様によると、前記の遺伝子学的構成体からなるプススミドが提 供される。

第２．第３および第４の態様の好ましい特徴は、第１の態様に関して前に記載さ れたとおり、ムスティス　ムタンデイス（ｍｕｔａｔｉｓ　ｍｕｔａｎｄｉｓ） である。

本発明をより理解するために、多（の実施例を挙げる。

次の図面を参照する： 第１図〜第４図は、本発明による方法におけるベーターラクトグリプリン融合遺 伝子の同化の基礎的段階を概略的に示し； 第５図は、ヒツジＤＮＡのサザンプロット分析を示し；第５ａ図は、ヒツジＤＮ Ａのサザンブロッド分析を示しまた現実の発生によるベーターラクトグロブリン 融合遺伝子の遺伝形質を示す。

第６図は、マウスおよびヒツジ乳清蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し；また 第７図は、ヒツジおよびマウスのウェスタンプロッド分析を示す。

第８図は、記載のとおりベーターラクトグロブリン融合遺伝子を保持するトラン スジェニック雌ヒツジーヒツジから得られたミルクのＲＩＡを示す。

且施刀ユ Ａ１組　えＤＮＡ 特に詳述しない場合、組換えＤＮＡ操作は、マニアテイスら（）４ａｎｉａｔｉ ｓ　ｅｔ　旦）［（ｒモレ’ｒｚ−５−・りａ−ユング」コールド・スプリング ・ハーバ−（１９８２年））（”）ｌｏｌｅｃｕｌｏｒ　Ｃｉｏｎｉｎｇ”　Ｃ ｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　（１９８２）月および「メソッズ・イン・ エンザイモロジー」第６８．１（）０および１０１巻（″）ｌｅｔｂｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”　Ｖｏｌｓ　ｆ３８．１００　ａｎｄ　１０耳ダブ リユーアール、グロスマンおよびモルダーブ１（Ｗｒ、　ＧｒＯ５Ｓｍａｎ　ａ ｎｄ　ＨＯＩｄａＶｅ　Ｅｄｓ、月、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ）の方法後であり；まな特にことわりのない限り全化学薬品は、Ｂ ＤＨ・クミカルズ・リミテッド、英国、ドーセット　プール（ＢＨＤ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ、　ＰＯＯＩｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）ｔた けシグマ・ケミカル・カンパニー英国ドーセット　プール（ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐａｎｙ　ｐ。

ｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）から屑入した。

ヒツジベーターラクトグロブリン６虫／′逍−の　、　ヒラ区脛盪旦ΣΔΩ側ｌ Ｉ！！？！組織を層膜したばかりのブラックフェース／サンフォーク（Ｂｌａｃ ｋｆａｃｅ／５ｕｆｆｏｌｋ）：ｒヒツジから入手し、核を基本的にはバーチよ おびウニイントララブ　立生３３　第６５頁（１９８３年＞　（Ｂｕｒｃｈ　ａ ｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｃｅ１ｌ　３３６５　（１９８３）　）に記数さｈ なとおりに単離した。核を０．３Ｍ　ＮａＣＬ。

１０ｍＭトリスＨ（１，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％５ＤＳｐＨ７，４および４０ ０　ｍＣＱ／ｍＪプロティンアーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋｌ　［シグマ ・カンパニー、英国　ドーセットＢＨ１７７ＮＨ、プール・ファンシーロード（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、。

Ｆａｎｃｙ　Ｒｏａｄ、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ　Ｂ）１１７７ＮＨ月に 溶解し３７℃で２時間培養しな。調製物を完全に脱蛋白賀化（ｄｅｌ）ｒｏｔｅ ｊｎｉｓｅｄ）するまでフェノール／クロロホルノ１抽出を繰り返し行った。Ｄ ＮＡをエタノール沈澱し、ガラス棒を使用し巻き出し、７０％エタノール／３０ ％ＴＥ　（ＴＥ＝ｌＯｍＭトリス、ＨＣｊ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０）で 洗浄し、空気中で乾燥しＴＥ中に１■／　ｍｌの濃度に再懸濁した。

ヒツジ牌　−ムダ　人通−の ラムダファージＥＭＢＬ３［フリスカウフらジェイ、モ少工２シ仁土匹４１７０ 第８２１頁（１９８３年）　（ＦｒｉｓｃｈａｕＲｅｔａｌ　Ｊ、　Ｈｏｔ、　 Ｂｉｏｌ、１７０８２７（１９８３））１を利用して遺伝子のライブラリーを構 成した。３ａｍｃｇのバクテリオファージＤＮＡを製造者の推ぬる条件を使用し て５倍過剰の制限酵素Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩおよびＢａｍＨＩ［アマ−ジャム・イン ターナショナル・パブリック・リミテッド・カンパニー、英国パツキンガム、エ イレスベリー、グリーン　エンド、リンカーン　プレース（Ａｍｅｒｓｂａｍ　 ＩｎｔＱｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ、　Ｌｉｎｃ。

Ｉｎ　Ｐｌａｃｅ、　Ｇｒｅｅｎ　Ｅｎｄ、　Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、　Ｂｕｃｋ ｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）　）より供給コで消化しな、消化 後、塩酸スペルミンを５ｍＭの濃度になるまで加えラムダＤＮＡを沈澱しな。

氷上で１時間培養後、ＤＮＡを卓上ミクロフユージ（ｍｉｃｒｏｒｕｇｅ）中１ ５分間１０．０ＯＯｉｒでペレット化し、７０％ＥｔＯＨ１３００ｍＭ　ＮａＡ ｃ、１００ｍＭ　ＭｇＣ】中で洗浄し再ペレット化し最終的に１■／　ｍｌの濃 度でＴＥ中に再懸濁した。

ヒツジＤＮＡを制限酵素５ａｕＢＡ　（アマ−ジャム）で部分的に消化した。１ ｏｏｍｃｇアリコートのヒツジＤＮＡを３７℃で２０分間種々の量の５ａｕ３Ａ （５〜４０単位）で消化した０反応を１５ｍＭまでのＥＤＴＡの添加により停止 した。消化度を０．６％、アガロースゲル上での電気泳動で評価した。好適に消 化した試料をプールしｐＨ８゜０でＬＭ　ＮａＣＱ、２０ｍＭ）リス、ＨＣＱ、 ５ｍＭＥＤＴＡ中に調合された３８．０ｍｌの１０〜４０％ショ糖勾配上に負荷 した。これらの勾配を２４時間２６，０００ｒｐ＠でベック？　７　（Ｂｅｃｋ ｍａｎｎ）　Ｓ　Ｗ　２８　Ｑ−ター中遠心分離した。ショ糖勾配を頂部から分 別し、１ｍｌフラクションを回収した。各フラクションにおけるＤＮＡ分子のサ イズ分布をアガロースゲル電気泳動で評価し、１４〜２１ｋｂサイズのＤＮＡ分 子を含むフラクションをプールした。ＴＥ中２倍希釈後、２容皿のＥｔａ）（を 加え、ＤＮＡを一２０℃で一昼夜沈澱した。ＤＮＡをつづいて３００　ＩｃＱ　 ／　ｍｌの濃度までＴＥ中に再懸濁した。

７．５ｍｃｇのＥＭＢＬ３をカットしたＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩおよび２．５ｍ ＣＱの５ａｕ３Ａ″′Ｃ部分的に消化されたヒツジｌ１１臓ＤＮＡを６０ｍＭ） リス、ＨＣＱ、６ｍＭＭ　ｇ　ＣＤ　２　、１０　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、０．０ １％ゼラチン、０゜２５ｍＭ　ｒＡＴＰおよび２５車位のＴ４ＤＮＡリガーゼ［ ベーリンガー・カンパニー、英国、ウェスト　サゼックス、リュース、ベル　レ ーン、ベーリンガー　マンハイムハウス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｂｅｉｍ　Ｈｏｕｓｅ、　Ｂｅ１ｌ　Ｌａ ｎｅ、　Ｌｅ＊ｅｓ、　Ｅａｓｔ　５ｕｓｓｅｘ）を含有する５０ｍ１の溶液中 に混合し、１４℃で一昼夜培養した。　結紮後、１！ＩＣｇアリコートのＤＮＡ を製造者の推ぬる方法に従ってアマ−ジャムより屑入したキットを使用して生体 外にパッケージした。パッケージライブラリーをエシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）株ＥＤ８６５４上に滴定した。ライブラリーの概算サイズは５．７Ｘ１０ Ｂプラ一ク形成単位（ｐｆｕ）であった。滴定後すぐに、未増幅ライブラリーの アリコートを約５０．０００ｐｆｕ／プレートの密度でエシェリキア・コリ株Ｅ Ｄ８６５４を使用して１０Ｘ２２−ペトリ皿（メガプレート）上に覆った。

ラムダ遺云子ライブラリーのスクリーニングメガグレートからのプラーク隆起を ２０ｃｄニトロセルロース膜［シュライヒャー　アンド　シュル、西独、Ｄ−３ ３５４、ボスタファッチ　４、（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ 。

Ｐｏ５ｔ４ａｃｈ　４．　Ｄ、　３３５４．　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ月上に ベントンおよびデービ、；Ｚ、　（Ｂｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ）　［サ イエンス１９６　第１８０頁（１９７７年）　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６１８０　 ［１９７７））　］の方法に従って実施した。ベーターラクトグロブリンｃＤＮ Ａクローン［ｐ９３１−ジェイ、シイー９マーシャー、アイエフアールエイ、ジ ョウエイーエンージョサス、パリ（Ｊ、Ｃ，Ｈｅｒｃｉｅｒ。

ＩＮＲＡ、　ＪＯＩＪｅｙ−ｅｒ＞−ＪＤＳａＳ、　ＰａｒｊＳ）の贈与コをリ グビイら（ＲｊΩｂｙ虹　１）（ジェイ、　モル、　づΔしｔルユ月３第２３１ 頁（１９７７年＞　（Ｊ、　ＨＯ［、Ｂ１１１．１１３２３７（１９７７））］ による記載の方法で特異活性＞　１０８　ｄｐｍ／ｍｃｇまで３２Ｐ　ｄＣＴＰ でニック翻訳した。ベーターラクトグロブリンｃＤＮＡのとおりクローンしたで あろう、　ｐ９３１クローンの配列をビオシミー　６８．第１０９７〜１１０７ 　（１９８６年）　（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ６Ｂ、　１ｏ９７−１１０７（１９８ ６）　’）におけるゲイら（Ｇａｙｅ　ｅｔ　ａり（１９８７））におけるマニ アティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の方法に従ってプレハイブリッド形成し、ハイ ブリッド形成しかつ洗浄した。最終洗浄は、６８℃においてｌＸ５ＥＴ　（ＳＥ ＴはＯ，ＬＭ　ＮａＣＡ、２Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０３ｍトリス、ＨＣｆＪ　ｐＨ ８，０である）　中であった。フィルターをプロット、乾燥および３２ｐでスポ ットしＸ！！フィルムへ照射する前にこれらを標定した。絶対的ハイブリッド形 成プラークを含む領域をパスツールピペットの無菌状の丸い先端を使用して突か ｈな３２ｐスポツトへの寄託によってメガプレート上に位置を定めた。初期プラ ーク隆起をエシェリキア・コリＥＤ８６５４上で滴定し、約５００／プレートの プラーク密度で直径１５Ｌ２＋のへトリ田土に覆った。

こｈらのプレートを前記方法で再スクリーンし個々の絶対的ハイブリッド形成プ ラークを１．０ｍｌのファージ−Ｍ街液（ファージ−Ｍ街液は１０Ｊ７）Ｍ）リ ス、Ｈ（１，１０ｍＭ　ＭｇＣＬ２．０．０１％ゼラチン、ｐＨ７，４である） 中ににトウースビックを使用してつついた。

クローンベーターラクトグロブリンＤＮＡの；０．４ｍｌの再懸濁ファージ溶液 をＥ、コリＥＤ８６５４［ボルダらモル、　ジエン、　ジェネティクス１４６第 １９９〜２０１頁（１９７６年＞　（Ｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ　Ｈｏｔ、Ｇｅｎ、 ＧｅｎｅｔｉＣ３１４６１８９−２０７（１９７６））ｌに加え、直径９Ｑのベ トリ皿に覆い出しバクテリアローンの融合性の溶解産物を得た。！１合性のプレ ートを１０ｍ１フアージＭ衝液中に棄て数滴のクロロホルムで一昼夜培養するこ とにより得た。バクテリア片を５分間５．００Ｏｒｐｍでの遠心分離でペレット 化し、ファージストックを４℃で保存した。ストックをエシェリキア・コリＥＤ ８６５４上で滴定しｐｆｕ／ｍｌを決定した。

８Ｘ１０７ｐｆｕを３７℃で１０ｍ１の’ＬＯｍＭ　ＭｇＳＯ４中の７Ｘ１０９ エシエリキア・コリ細胞上に吸収した。

１５分後、２．５ｍｌアリコートを１リツトルフラスコ中の１０ｍ１しブロス（ Ｌ　Ｂｒｏｔｈ）／　ｔ　ＯｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４に加えた。バクテリア懸濁 液を数時間はげしく振盪し、０Ｄ５４０を１時間ごとに検査した。０Ｄ５４０内 にあることによって決定さｈｆＳとおりの溶解産物は、数時間後に生じた。完結 時、０．２ｍｌクロロホルムを各１００ｍ１培地に加え、培地を一昼夜４℃で放 置しな。

バクテリア片を１５分ｍ１０．００Ｏｒｐｍでの遠心分離にて除去した。この培 養後、Ｎａ（１）を４０　ｔｒ／リットルまで加えポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）を１０％まで加えた。調製物を４℃まで冷却し、少なくとも２時間放置し てファージを沈澱した。ファージペレットを１５分間１０．００Ｏｒｐｍでペレ ット化し１６．０ｍ１ｆ）７’！−ジ綬衝液に再懸濁した。８．０ｍＪのこの懸 濁液を１４．０Ｊ７）Ｊ超遠沈背中１．５ｍＪ５６％　ＣｓＣΩ、１．５ｍ１４ ５％Ｃ５ＣＪ）および２．５ｍ１３１％　ＣｓＣ，Ｑ　（ファージ緩衝液中に溶 解〉からなる段階勾配上で層分離しな。段階勾配を２０℃にてスウィングアウト 管中１．５時Ｉ′ｊｆｆ　３５゜ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍ′″Ｃ遠心分離した。ファ ージバンドを針および注射器で除去し、ファージ粒子の純化を完結するなめ、第 ２段階勾配遠心分離を行った。純化ファージ粒子をＯ，ＩＭＮａＣＡ、１０ｍＭ 　トリス、ＨＣＡ、１ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ８，０中に透析しついでフェノールお よびクロロホルムでの連続抽出で脱蛋白質化した。Ｎ　ａ　ＣＡを加え０゜３Ｍ の最終濃度とし、ついでファージＤＮＡを２容量のＥｔＯＨの添加にて沈澱しな 。ＤＮＡを２０分間１０．００ｏ　ｒｐｍにて遠心分離し７０％ＥｔＯＨ，３０ ％ＴＥで洗浄し、乾燥しついで２００〜４００　ｍＣＱ／ｍＩの最終濃度にまで ＴＥ中に再懸濁した。

親　えベーターラクトグロブリンの特′づけ０．５１１１ＣＱアリコートの前記 ＤＮＡ１Ｆｌ製物を種々の制限酵素で制限し単一および二重消化の産生物を０． ６％および１％アガロースゲル上での電気泳動で分析した。上記ゲル上でのＤＮ Ａをスーザン（Ｓｏｕｔｈｒｎ）　［ジェイ１モル、パイオル、９８第５０３頁 （１９７５年）　（Ｊ、　）（ｏｆ、　Ｂｉｏｌ、　９８５０３（１９７５）） １の方法でハイボンド＠［アマ−ジャム・インターナショナル、パックス、リト ル　キャルファント（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｌｉｔ ｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ、　Ｂｕｃｋｓ）ｌ上のニトロセルロースフィルター に転移し３２ｐ標識化ｐ９３１にハイブリダイラド形成した。方法は、基本的に は前述のとおりでありオートラジオグラフィにて分析した。種々の制限酵素およ びｐ９３１の末端の５′および３′からの特定のプローブを使用してベータラク トグロブリン遺伝子のサイズおよび位置を決定した制限マツプを作成した（第１ 図参照のこと。

ベーターラクトグロブリンクローンの同定および遺伝子の５′および３′末端の 正確な位置をＤＮＡを配列することによって直接確認した。好適な制限部位を使 用して、フラグメントをプラスミドベクター中におよびＭ１３ベクター中にサブ クローンした。配列化をサンガーら（ｓａｎｇｅｒ旦　１）のデオキシ法［パナ ス７４第５４６３頁（１９７７年）（罠Ａｓ　７４５４６３（１９７７月を使用 して実行した。

ベーターラクトグロブリン凋ム遺−子の土工げべ一タークラトグロブリンレおよ び礼服中に発現される重要な遺伝子からなる融合遺伝子を仕上げるのに使用した 方法を第１図〜第４図に要約する。このアプローチは、その単離と特徴づけを前 述したラムダクローンから誘導された配列を利用する。この方法は、ベーターラ クトグロブロリンｍＲＮＡの５′末端翻訳領域に相当する領域内への重要なりＮ Ａ配列の挿入を含む。この遺伝子のｍＲＮＡ転写から翻訳される蛋白質は、ター ゲット蛋白質の分泌ペプチドを含有する。− サブクローンｐｓｓ−１ｔｇＳＥを第１図に示すとおり旦且上Ｉ　＋　Ｅ　ｃ　 ｏ　ＲＩおよびハナハンおよびメセルソンの方法（Ｈａｎａｈａｎ　ａｎｄ　Ｈ ｅ５ｅｌｓｏｎ）　［ジー７１０第６３頁（１９８０年）（飢ｎｅ　１０６３　 ［１９８０））］で受容能力をもならされた形質斬換エシェリキア・コリ株ＤＨ Ｉて゛カットし、さらにベクタープラスミドｐＰｏｌｙ内にラムダファージ５Ｓ −ｔの１゜４ｋｂＳｐｈ−ＥｃｏＲＩフラグメントを結紮することにによって構 成した。アンピシリン耐性クローンを単離しこれによりＤＮＡをビアンボイムお よびトーチイー（Ｂ　ｉ　ｒｎｂ。

ｉｎ　ａｎｄ　ｏｏｔｙ）の方法［ヌク、’７”、−Ｆニ　レス、７第１５１３ 頁（１９７９年）（胆虹　閃割　耽Ｓ、　７１５１３　（１９７９）月で調製し た。第１図にいおて、ラムダＳＳ１内部に存在するベーターラクトグロブリン転 写単位の方向および範囲を定める一寸法はすべて同一である。より一般的に第１ 図〜第４図にいおて適切な制限部位のみを示していることに注意すべきである。

広い開口ボックスはラムダＥＭＢＬ３を示し、狭い開口ボックスはｐＰｏｌｙを 示し、狭い影つき開口ボックスは、発現されるべきターゲット配列を示し、また 直線は、ベーターラクトグロブリン遺伝子に相当するクローン化ヒツジ配列およ びその側部配列を示す。

ｐｓｓ−１ｔｇＳＥをベーターラクトグロブリンの５′末端翻訳ｍＲＮＡ配列に 相当するＤＮＡの領域におけるプラスミド内の唯一の部位でカットする制限エン ドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ（第２図）での消化により直線化した。５ｍＣ９の完 全に消化されたプラスミドを０．５Ｍ　トリス。

ＨＣＱ、１０ｍＭ　ＭｇＣＯ２，１ｍＭ　ＭｎＣΩ２．１０ｒｎＭ　スペルミン ｐＨ９，０に溶解し、５６℃にて３０分間０．０１〜０．０４単位のウシ腸管ホ スホターゼ（べ。

−フリンガー）で処置した。このウシ腸管ホスホターゼは、０．５％ＳＤＳ抽出 不活性化しＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出およびＥｔＯＨ沈澱で回収し た。

第■因子ＤＮＡクローンｐ５’　Ｇ３’　ＣＶＩをジー、ブロンジー博士、サー 、ウィリアム・ダン・スクール・オプ・バタロジイー、ユニバージティー・イン ・オックスフォード、オ・ｙクスフォード（叶、　Ｇ、　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、　 Ｓｉｒ　ＷｉｌｌｉａｍＤｕｎｎ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　０ｘｆｏｒｄ、　０ｘｆｏｒｄ）より手に入れ た。このクローンは、ｐＡＴ１５３から誘導されたプラスミド内に挿入の１５７ ９を含んだ［サイズらネイチャー２８３．第２１６〜２１８頁（１９８０年）　 （Ｔｗｉｎｇｅｔ　ａｔ　Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂ３．２１６−２１８（１９８０） 月、これは、推定ｍＲＮＡ部位から２８３，２１６−２１８（１９８０））１　 、これは、推定ｍＲＮＡ部位から＋１５７２までの−７における工ｕＩ部位より より繰作しヒト第１Ｘ因子に関する配列をコードする全てを含有する［アンソン らエンボ　ジエイ、３．第１０５３〜１０６０頁（１９８４年＞　（Ａｎｓｏｎ ｅｔ　ａｔ　Ｅｍｂｏ　Ｊ、３１０５３−１０６０（１９８４）月。

１５５３ｂｐの第■因子からなるＮｈｅ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄＩＩＩを以下に記載の 方法にてベクター配列から切除し純化した。

このＨｉｎｃＨＨおよびＮｈｅＩ末端をマニアティスら（）ｌａｎｉａｔｒＳ　 ｅｔ　ａｌ）により記載の技術［「モレキュラー・クローニング」コールド・ス プリング・ハーバ−（１９８２年）（”）（ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２））ｌによ゛るクレノー （にｔｅｎｏｒ）ポリマラーゼを用いて鈍化させフラグメントをＰ　ｖ　ｕ　Ｉ Ｉ制限され、ホスファターゼ処置された（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｄ）　ｐ　Ｓ 　Ｓ　１　ｔ　ｇ　Ｅ　（前述）に結紮してエシェリキア・コリＤＨ−１をアン ピシリン耐性に形質転換した後ｐｓｓ１ｔｇｓＥ−第■因子を形成した。

第ｔＸ因子ｃＤＮＡ配列を第２図に示し得るとおり、以下ＴＡＲＧを示す。

プラスミドＤＮＡを前述のごとく調製し、好適な制限酵素での消化でチェックし た。このプラスミドＤＮＡを５ｐｈＩ＋ＥｃｏＲＩで消化し、０．５ｍｃｇエチ ジウムブロマイド（シグマ）を含有する１％アガローズゲル上電気泳動した。適 当な５ｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＵＶランプ［ウルトラ−バイオレット ・１０ダクツ、インコーホレーテッド、米国、カリフォルニア州、サン・カプリ エル）での照射にて位置決定した。−片の透析膜をバンドの前に挿入し、ＤＮＡ をつづいてこの膜上で電気泳動した。ＤＮＡをこの透析膜より溶出させ製造者の 推める方法を利用して「エル−チップ（°“Ｅｌｕ−ｔｉｐ”）」［シュライヒ ラシャー・アンド・シュル、西独、ダセル、Ｄ−３３５４、ポストファッハ４　 （Ｓｃｈｌｃｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ、　Ｐｏ５ｔｒａｃｈ　４．　 Ｄ−３３５４，Ｄａｓｓｅ＋、　Ｗ、　ｃｅｒｍａｎｙ月の使用により単離しな 。

プラスミドｐｓｓ１ｔｇＸＳ　（第３図）をラムダＳＳ−ローンを単離し、プラ スミドＤＮＡを前述のごとく調製した。２つのＤＮＡフラグメントを、別々にこ のプラスミドまたはそれから誘導されるより小さいサブクローンから単離した。

すなわちＬｏ、５ｋｂ　旦ｄＴ（部分的）旦１トを前述のごと（ゲル電気泳動で 単離した。

旦旦上Ｉ　−Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　、　Ｓ　ｐ　ｈ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ および旦ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントをほぼ等しい割合で互いに結紮 し、このＤＮＡを使用してＤＨ−１を形質転換した。プラスミドＤＮＡ　（ｐｓ ｓＩｔｇχ５−ＴＡＲＧ）を前述のごとく調製し、Ｘｂａｌおよび５ａｌｌでし 消化してこのベクターからベーターラクトグロブリン融合遺伝子を切り放した。

このフラグメントをゲル電気泳動、つづいてエル−チップ」の使用により純化し た。エタノール沈澱ＤＮＡをペレット化し、ＴＥ中に再懸濁し、フェノール／ク ロロホルム抽出しそして再沈澱した。ＤＮＡを最終的にＴＥ中に再懸濁しミクロ 接種に直接利用した。

Ｂ、トランスジェニック動物の構成 受精卵の回収 方法は、［メソッド・イン・エンザイモロジ−Ｊ　（１９８３年）第１０１巻（ ダブリュー、グロスマンおよびモルデーブ編）アカデミツク・プレス第４１１〜 ４３２頁［’１（ｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｌｌｌｏｌｏｇｙ”（１９８３） Ｖｏｌ　１０１（Ｗ、Ｇｒｏｓｓｍａｒｉ　ａｎｄ　Ｈｏ［ｄａｖｅ、Ｅｄｓ、 ）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐａｔｔ　ｔｏ　ｐｐ４３２１におけるゴ ートンおよびルドル（Ｇｏｒｄｏｎ　ａｎｄ　Ｒｕｄｄｌｅ）におけるマウスに 関して記載のものと類似した方法で行った。

胚子をプロゲスターゲンでの処置により調節される発情において過排卵化を導か れた雌ヒツジから回収する。受精能力の実証された成熟雌ヒツジを６０■酢酸メ ドロゲプロキシエステロン［ベロミックス、アップ　ジョン、リミテッド、クロ ウレイ（Ｖｅｒｏｍｉｘ、　Ｕｐｊｏｈｎ　Ｌｔｄ、　Ｃｒａｗｌｅｙ）１で受 胎される膣内スポンジで１２〜１６日処置した。ウマ小胞刺激ホルモンし３．５ 〜４．３■水溶液／雌ヒツジ〕を、プロダレスターゲン処置の終りおよびスポン ジ取り出しの時の２８時間前２回の同等の筋肉的接種を与えた。雌ヒツジを、ス ポンジ除去後２０〜７２時間生じた発情時にに数回交配させる。雌ヒツジを、毎 日０８．００．１２．００゜１６．００および２０．００時に発情の至り来に関 して観察する０発達の第１〜４．！！ＩＩ胞段階における胚子を発情の到来後３ ６〜７２時間の外科手術の間に回収！−た。

無感覚状態（ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）をチオベントンナトリウム［イントラパ ル、メイ　アンド　ベーカー（Ｉｎｔｒａｖａｆ、　Ｈａｙ　ａｎｄ　Ｂａｋｅ ｒ）］の静脈内接種にて導き、半閉回路システム中に酸素と酸化窒素との混合物 で保持した。胚子回収をハンターら（）ｌｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ）の方法［ジ エイ、二ｌ旦ヱＬ　＋ｉＡ、４６第１４３〜１４９頁（１９５５年）（ム　Ｍロ Ｌジ日１４Ｅ）　１４３−１４９（１９５５）月にて行った。生殖管を中央切゛ 開により露出しナイロンカテーテルを采により卵管内に挿入した。媒体を先端の 丸い１８ケージ針により子宮管腔に挿入し、子宮の接点を通して卵管にそってつ め込んだ、胚子をエネルギー源および蛋白質含有リン酸緩衝液［卵培地フロウ　 ラブズ、スコツトランド、アービタ（Ｆ［ＯＷ　ＬａｂＳ。

Ｉｒｖｉｎｅ、　５ｃｏｔｌａｎｄ）ｌ中に回収した。卵子の保存およびミクロ 接種の間、この培地を２０％胎児コウシ血漬で補足した。

見ＮΔ塁豊腫 Ｄ　Ｎ　Ａ　（１〜２１ｎＣｇ／　ｍｌ　）を単細胞卵子の１つの前核内にまた は２および４ＭＡ胞卵子の１以上の前核内に接種した。

この卵子を卵培地で満たされたチャンバ内で操作した。このチャンバは、スライ ドの長手方向にガラス支持体（２５ｘｍ　Ｘ　２　ｍ　Ｘ　３　ｒｕｍ　）を有 するシリコン被覆された（ｓｉｌｉｃｏｎｉｓｅｄ）顕微鏡スライドから成る。

カバースリップは、該支持体の頂部に取りつけられており、接点はシリコングリ ースで封止されている。該チャンバの開口部は、ダウ−コーニング（Ｄｏｖ−Ｃ ｏｒｎｉｎＱ）２００流体（５０ｃｓ）Ｅビーディーエイチ、ケミカルズ（ＢＤ ）ｌ　ＣｈｅｌｌｌｉＣａｌＳ月で満されている。

接種さ九る卵子を先の丸いガラスピペット上の吸引によって保つ。前核または核 をニコン・ダイアマェット（ＮｉｋＯｎ　Ｄｉａｐｈｅｔ）反転顕微鏡［ニコン （英国）リミテッド、シュロブシャー、チルフォード、ハレスフィールド　９、 ハイブル−ク（Ｎｉｋｏｎ（ＩＪＫ）Ｌｔｄ、　Ｈａｙｂｒｏｏｋｅ、　Ｈａｌ ｅｓｆｉｅｌｄ　９．　丁ｅ１ｆｏｒｄ、　５ｈｒＯｐｈｉｒｅ）］を使用して 視覚化しな。ＤＮＡをミクロ電極引取装置［キャンプデン・インストロメンツ、 ロンドン、キャンプテン。ヒル、ロード　１８６（Ｃａｍｐｄｅｎ　Ｉｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔｓ、　１８６　Ｃａｍｐｄｅｎ旧ＩＩ　Ｒｏａｄ、　Ｌｏｎｄｏｎｌ 上の毛管「ホウケイ酸ガラス−外径１履フイラメントを有する肉薄−クラーク、 エレクトロメディカル・インストロメンツ、アールジー　８．７エイチユー、リ ーディング、パンクボーラン、ビーオー　ボックス８　（Ｃ１ａｒｋ　Ｅｌｅｃ ｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　ＰＯＢｏｘＢ、　Ｐａｎｇ ｂｏｕｒｎｅ、　Ｒｅａｄｉｎｇ、　ＲＧ８７）１υ）コより引き出されるマイ クロピペットを使用して前核または核内に接種する。２つのミクロ装置の位置を ミクロ操操作具（ｍｉｃｒｏ　−ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒｓ）　［レイツ・メカ ニカル・マニプレイクーズ、イー、レイツ（インストロメンツ）リミテッド、英 国、ルートン、パーク・ストリート４Ｂ（Ｌｅｉｔｚ　ＭｅｃｈａｎｉｃａｌＨ ｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒｓ、　Ｅ、　Ｌｅｉｔｚ　（Ｉｎｓｔｒｕｍｅ ｎｔｓ）Ｌｔｄ、　４８　Ｐａｒｋ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｌｕｔｏｎ、　Ｅｎｇｌ ａｎｄ月を使用して調節した。接種すべきＤＮＡを含有するマイクロピペットを 気密管を介して１００ｍＪガラス注ガラス支持体る。接種は、注射器を使用して 圧縮することにより実施される０首尾よい接種は、前核または核の明らかな膨張 によって示される。該接種卵子は、最低３０分間室温にて培養して損傷卵子の明 らかな退化を与える。

接種を耐えぬいたことを判定された胚子は、その発情サイクルをブロゲスターゲ ンしベロミックス、アップジョン・リミテッド（Ｖｅｒｏｍｉｘ、　Ｕｐｊｏｈ ｎ　Ｌｔｄ）ｌでの処置による卵・子宿主のものと同時進行させた未交配の受領 雌ヒツジに移植される。胚子を良質引抜き（ｆｉｎｅ−ｄｒｏｗｎ）マウスピペ ッタ−を使用して卵管に移植する。各雌ヒツジに４胚子まで移植する。胚子を卵 管の間に分散させる。

雌ヒツジの体−壁を可溶性フィラメント［デスコン、デービス・アンド・ブレツ ク（Ｏｅｓｃｏｎ、　０ａｖｉｓ　ａｎｄ　Ｇｒｅｃｋ）１で閉じ、皮膚をミシ ェル（Ｈｉｃｈｅｌ）クリップで閉じる。各雌ヒツジは、外科手術時、抗生物質 ［デュファペン　エル。

エイ、（Ｄｕｐｈａｐｅｎ　Ｌ、　Ａ、　）およびデ、：ｚ、７７　（アマ−ジ ャム）（Ｄｕｐｈａｒ、　Ａｍｅｒ’ｓｈａｍ）コを与えられる。ミシエルクリ ップを手術後１０〜２０日に除去する。

北互ａより生月 無感覚状態からの回復後、雌ヒツジは、妊娠の間中とどまる小放牧地に帰される 。ｍ足の千草、カブおよび凝縮物を必要により提供する。妊娠の第３ケ月の間胎 児の数を実際の超音波操作にて決定する。［ホワイトらベト、レフ。

１１５、第１４０〜１４３頁（１９８６年＞　（Ｗｔ＋１ｔｅｅｔ　ａｌ　Ｖｅ ｔ、ＲｅＣ，１１５，１４０−１４３（１９８６）月。ついでＨ娠雌ヒツジの測 定を胎児数の変化を考慮するため調整する。出産間近の予想日に、雌ヒツジを収 容してコヒツジが生まれる間監視および補助を促進する。

トランスジェニックコヒツジの 誕生後少なくとも２週間、１０ｍ１の血液試料を皮膚注射器での静脈穿刺により 除きヘパリン添加した管に回収する。

ＤＮＡを次のとおり血液試料より調製した。３０ｍ１の溶解産生物溶液（１５ｍ Ｍ　ＮＨ４ＣｆＪ、１０ｍＭ　ＫＨＣＯｓ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ＞を１０ｍ１血 液試料に加え、この混合物を氷上で１５分間培養した。白血球を４０℃にて１０ 分間１５００ｇで回転降下させ（ｓｐｕｎ　ｄＯＷｎ）、１０ｍｌ　ＳＥ’（７ ５Ｊ７）Ｍ　Ｎａ（１）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ＞中に懸濁し、ついでＳＥ中で１度 洗浄した。プロテナーゼＫを１００ｍｃＱ／ｍｌになるまで加え、つづいて１ｍ ｌの２０％ＳＤＳを加えこの調製物を４時間培養した。調製物を完全に説蛋白質 化するまでフェノール／クロロホルム抽出を繰り返し実施した。１／３０容量の ０．３Ｍ　ＮａＡｃ−１容量イソプロパツールを水相に加えＤＮＡを沈澱し、そ してそれをかき出し、７０％ＥｔＯＨですすぎ、ＴＥ中に再懸濁した。

１０ｍＣＱアリコートのＤＮＡ調製物を好適な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ）で 消化し、０．８％ゲル上で電気泳動した。これらのゲルをサザンブロツテイング で分析し、ハイブリッド形成を基本的に述べられたとおり実施した。

陽性ハイブリッド形成動物、すなわち融合遺伝子（おそらく染色体部位にて完成 されたと推定）を含有するものを成熟するまで生長させる。雌を交配し、ひとた び授乳したならそのミルクを重要な成分に関して分析する（実施例７）陽性雄を 交配し、その娘を外因性ＤＮＡ配列に関してスクリーンし、そのミルクをつづい て重要な成分に関して分析アルファ１−抗トリプシンをコード化する重要なポリ ペプチドをコードするＤＮＡ配列（ＴＡＲＧ配列）をアール。

コルテーゼ、イーエムビーエル、西独、ハイデルベルグＤ−６９００、メイルホ フストラーセ１　（Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ、　ＥＭＢＬ、　）ｌｅｙｅｒｈｏｆｓ ｔｒａｓｅ　１．　Ｄ−６９００Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍ ａｎｙ）がら得た以外実施例１を繰り返しな。１２９４ｂｐの挿入がら成る１且 ３１−　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｎ　ＩフラグメントＥシリバートら土庄４１第５３１〜５ ４０頁（１９８５年）　（Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ　ｅｔ　旦　並Ｉ＋　４１５３１ −５４０（１９８５））参照コを切りとり、実施例１に記載の方法によりクロー ンから純化しｐＳＳＩｔｇＳＥのＰｖｕ　１１部位内にクローンした。

来旌凹旦 プラスミドｐＰｏ　１　ｙの代わりにプラスミドｐＵｃ１８［ファーマシア・リ ミテッド、英国、ミルトンキイネス”。

ミツドサマー・ボウレバード、ファーマシア・ハウス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ ｔｄ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｈｏｕｓｅ、　Ｍｉｄｓｕｍｍｅｒ　Ｂｏｕｌｅ ｖａｒｄ、　）ｔｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ”、Ｅｎｇｌａｎｄ）ｌを代用した 以外実施例１の方法を繰り返した。

夾旌刺Ａ プラスミドｐＰｏ　１　ｙの代わりに１ラスミドｐＵｃ１９（ファーマシア・リ ミテッド、英国、ミルトンキイネス”。

ミツドサマー・ボウレバード、ファーマシア・ハウス）を代用した以外実施例１ の方法を繰り返した。

寒旌透ｊ トランスジェニックヒツジの、生 プラスミドｐｓｓＩ　ｔｇＸｇ−ＦＩＸから切り取られた（消化ｐＳＳＩ　ｔｇ Ｘ−ＴＡＧＬまた実施例１参照）ＳａＩ−ＸｂａＩフラグメントをヒツジ卵子内 に接種した。約２００個の複写／受精卵を接種した。２５２個の受領誌ヒツジ中 に接種され再移植された１細胞卵子から、５２頭の生存コヒツジが生まれな。血 液試料から調製されたＤＮＡの分析に基いて、これらの動物のうち４頭が外因性 ベーターラクトグロブリン第１Ｘ因子配列を保持することが見い出された（第４ 表）。

第４表 トランスジェニックヒツジの概要 コヒツジ番号　性　別　構　成　複写数（約）６ＬＬ２２５　雄　ＢＬＧ−ＦＩ Ｘ　４０６ＬＬ２３１　雌　ＢＬＧ−ＦＩＸ　１０６ＬＬ２３９　雄　ＢＬＧ− ＦＩＸ　１６ＬＬ２４０　雌　ＢＬＧ−ＦＩＸ　１０これらの卵子はすべて前核 段階で接種されまた全て遠心分離されなかった。

複写数を定量的操作濃度測定装置にて決定。

第５図は、ヒツジＤＮＡのサザンブロ・ノド分析である。

ヒツジＤＮＡを前述のごとく調製し前記制＠酵素で消化し、０．８％アガロース ゲル上で電気泳動し１．Ａイボンド膜（アマ−ジャム、インターナショナル、英 国、）（・ンクス、リトルキャルフォント）に転移した。フィルターを、３２ｐ 標識化プラスミドｐｓｓ１ｔｇＸｓ−ＦＩＸ（レーン　１〜７）で堆積しひきつ づいて（膜をはがした後）プラスミド（レーン１′〜７′）で堆積した。ｐＳＳ ｌｔｇＸＳ−ＦＩＸの複写対照を上記ゲル上に含んだ。レーン１．対照（非トラ ンスジェニック）ヒツジＤＮＡ、レーン２および３、対照ＤＮＡプラスｐ５’　 Ｇ３’　ＣＶＩの１および５複写等価物およびレーン４〜７、トランスジェニッ クヒツジ６ＬＬ２２５．６ＬＬ２３１．６ＬＬ２３９および６ＬＬ２４０からの ＤＮＡ。各トランスジニックヒツジは、トランスジン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ） の５′未満が損われていないことを示すｐｓｓｌ　ｔｇＸＳ−ＦＩＸから誘導さ れたものとサイズにおいて全く同一である５、９５ｋｂ　（ＥｃｏＲＩ）および ６．０５ｋｂ　（ＢａｎＩＩ＞のハイプツト形成バンドの第１Ｘ因子をらたらす 。ヒツジの第■因子での明らかなハイブリッド形成は観察されなかった。ｐ９３ １でのハイブリッド形成は、予測された４、４ｋｂ　ＥｃｏＲｌおよび２．１ｋ ｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを明らかにした。外因性ヒツジベーターラクトグロ ブリン遺伝子がこれらのバンドにおけるハイブリッド形成を与えるが、６ＬＬ２ ２５゜６ＬＬ２３１および６ＬＬ２４０からの試料における増加した強さは、こ れらのバンドが主に接種ベーターラクトグロブリン因子ＩＸに由来することを示 し、構成体の３′未満の完全な状態を確認する。ＨｉｎｄｌＩＪ分割ＤＮＡ　： レーン１、ｐｓｓｌｔｇＸＳ−ＦＩＸから切り取られた１２．ｌｋｂ純化Ｓａ］ 　Ｉ−ＸｂａＩフラグメント、レーン２〜５．６ＬＬ２２５，６ＬＬＬ２３１， ６ＬＬ２３９および６ＬＬ２４０からのＤＮＡ。プローブは、ｐ５’　Ｇ３’　 ＣＶＩであった。接種フラグメントとサイズにおいて同一であるハイブリッド形 成１２．１ｋｂＨ４ｎｄＩＩＩフラグメント（６ＬＬ２２５．６ＬＬ２３１およ び６ＬＬ２４０）は、頭−尾配列を示し、同一ヒツジに共通の１５．６ｋｂフラ グメントは、尾−尾繰り返しも存在することを示す。これらのデータは、ヒツジ ６ＬＬ２２５．６ＬＬ２３１および６ＬＬ２４０＆、：いおてｐｓｓｌｔｇＸｓ −ＦＩＸ（ベーターラクトグロブリン第ｔＸ因子融合遺伝子）から誘導されたフ ラグメントが縦列配置における検知可能な再配列なしに完成していることを示す 。ヒツジ６ＬＬ２３９においては、データは、このフラグメント 適合する。

夾旌偲互 ゛世尤への第１Ｘ　酉　の−゛ 実施例５からの雄トランスジェニックヒツジ６ＬＬ２２５　（ＰＳＳｌｔｇＸＳ −ＦＩＸから調製された約４０個の複写のＳａｌ　Ｉ−ＸｂａＩを保持）を多く のフインードーセット（Ｆｉｎｎ−Ｄｏｒｓｅｔ）およびイースト・フリースラ ンド（Ｅａｓｔ　Ｆｒ１ｅｓｌａｎｄ）雌ヒツジと首尾よく交配しな、この子孫 を前述のごとくヒト第１Ｘ因子プラスミドプローブｐ５’Ｇ３’　ＣＶＩを使用 して血液試料から調製さ九たＤＮＡのサザンブロッティングにて分析した。いく らかの子孫におけるこの分析のサザンプロットを第５ａ図［子孫６ＬＬ２２５　 （ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ６１１２２５月に示す、レーン番号１．３．４゜５．６． ７．９．１１．４３．４５．４８および４９．６ＬＬ２２５の子孫からのＤＮＡ 　（消化７Ｒ１，７Ｍ３等〜７Ｒ４９）、レーンｃ２１１、対照（非トランスジ ェニック）ヒツジ６ＬＬ２１１からのＤＮＡ、レーン５−２１１および１−２１ １、ヒツジ６ＬＬ２１１プラスｐｓｓ１ｔｇＸＳ−ＦＩＸの５および１複写等価 物からのＤＮＡ、このデータは、トランスジェニックヒツジ６ＬＬ２２５が１２ 頭のこの子孫のなかから６Ｍに第１Ｘ因子配列を伝達していることを示し、従っ てこれらの第１Ｘ因子■配列を胚芽系統内に取り込まれていることを示している 。

衷旌丹ｌ トランスジェニックマウスにおけるヒツジベーターラクトロブリン　コード　遺 −の トランスジェニックマウスを本質的にはメソッズ・イン・エイザイモロジー第１ ０１巻（１９８３年）、（ダブリューニー、グロスマンおよびモルデーブ編）、 アカデミツク・プレス第４１１〜４３２頁［）ｔｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　１０１（１９８３）、（Ｅｄｓ、　Ｗｕ、　Ｇｒｏｓｓ ｍａｎ　ａｎｄ　）ｔｏｌｄａｖｅ）　、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓｐｐ４ １１−４３２１におけるゴートンおよびルドル（ＧＯｒｄＯｒｌ　ａｎｄＲｕｄ ｄｌｅ）に記載の技術により発生させた。クローンラムダ５Ｓ−ｔの５ａｌＩフ ラグメント（第３図）を保持するいくつかのトランスジェニックマウスを産生じ た。これらのうち１匹、Ｂ−Ｌａｃ７．雌は、１５〜２０複写のＳａｌ■フラグ メトンを保持することを示される。Ｂ−Ｊａｃ７を何度も交配させ５Ｓ−Ｉ配列 を受け継ぐ多くの子孫を産み出した。同腹子の誕生後８〜１２日、ミルクをマウ スから得た。これを４時間の間予を除き、２０分待ち、手で個々の乳腺をマツサ ージした後０．３１Ｕオキシトシン（シグマ）および７ｍＣＣ／ｇ動物のヒプノ ーム／ヒプノーベル（）ｌｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌ）　［７レツクネイ ル、ベト、　レス。

１９８３年１２月１０日第５７４頁（Ｆｌｅｃｋｎｅｉｌ、Ｖｅｔ、Ｒｅｃ、　 Ｄｅｃ　１０．１９８３．　ｐ５７４）　］の腹膜内接種によって達成しな。ミ ルクを５０１１１ＣＪ）毛細管中に回収した。

マウスミルクを蒸留水中に１：５に希釈し、卓上遠心機内で簡単に遠心分離して 脱脂し、カゼインを４．６の最終ｐＨまでのＩＮ　ＨＣＪ）の添加にて沈澱した 。卓上遠心機における遠心分１４７＆、乳清を除去した、５％トリクロロ酢酸で 沈澱しラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）　［ネイチャー　２７７、第６８０〜６８ ４頁（１９７０年＞　（Ｎａｔｕｒｅ　２７７、６８０−６８４（１９７０）） コによるポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。（第６図は、ヒツジおよ びマウスの浮漬蛋白質のＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１、マーカー蛋白 質、２．正常マウス乳清、３．ヒツジ乳清、４．正常マウス乳清：５．Ｂ−Ｌａ ｃ７乳清；および６．Ｂ−Ｌａｃ７乳清（２，５ｘ５）。

マーカー痕跡およびヒツジ乳清におけるベーターラクトグロブリンに相当するバ ンドを矢印で示す。）ヒツジベーターラクトグロブリンに対してウサギに生じた 抗血清を使用してゲル電気泳動で再溶解した試料上のウェスタンブロッティング ［バーネット、アナル、バイオチェス、　、　１１２．第１９５〜２０３頁、（ １９８１年）　（Ｂｕｒｎｅｔｔ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、、　１１２ 、１９５−２０３（１９８１）月によってヒツジベーターラクトグロブリンを検 出した。第７図は、ウェスタンプロット分析を示す。このウェスタンプロットを ウサギ抗ベーターラクトグロブリン血清および抗つサギＩｇベルオキシターゼ血 清で反応しな。（レーン１、マーカー蛋白質；２．ヒツジ乳清；３．Ｂ−Ｃａｃ ７乳清；４．正常マウス乳清；５．純化ベーターラクトグロブリン；および６． クマシー染色しツジ乳清（平行に操作））。

この分析は５Ｓ−１をＢ−Ｊａｃにおいて高レベルで発現することを示す多量の ベーターラクトグロブリンがマウスミルク中に分泌されたことを示す。このクロ ーンは、おそらくトランスジェニックマウスの乳腺における高レベルの発現を引 き起こす必須配列すべてを含有しまたそれ故それほどではないにしても（ｉｆ　 ｎｏｔ　ｍｏｒｅ　ｓｏ）相同性の種において、すなわちトランスジェニック種 において効率的に機能することが期待され得る。従って、このクローンから誘導 される融合遺伝子は、ヒツジ乳腺において（効率的に）発現されることも期待し 得る。

衷旌豊旦 トランスジェニック雌ヒツジのミルクにおけるヒト第ｔＸ因五〇ｘ男 ２頭の雌ヒツジ、６ＬＬ２３１および６ＬＬ２４０　（各々ｐｓｓ１ｔｇχ５− Ｆ１χより調製された約１０複写の５ａｌＩ−ＸｂａＩを保持する）をイースト ・リースランド雄ヒツジに首尾よく交配させた。誕生後、仔ヒツジを約２週間自 然に乳を飲ませ授乳を刺激した。ミルク（各動物から約２５ｍ１）を無直プラス チック容器に回収した。対照（非トランスジェニック）授乳雌ヒツジからのミル クも回収した。これらの試料を一２０℃で凍結し、ヒト第１Ｘ因子に関するラジ オイムノアッセイ（ＲＩＡ’　ｓ）を実行したニシンバラ、ロイヤル・インファ ーメリー（ｔｈｅ　Ｉ？ｏｙａｌ　Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｂ ）におけるスコツティシュ・ナショナル・ブラッド・トランスフュージョン・サ ービス（ＳｃｏｔｔｉｓｈＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｌｏｏｄ　丁ｒａｎｓｆｕｓｉ ｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）に輸送した。

トランスジェニックおよび対照ミルクを４℃で一昼夜蒸留水に対して透析し、つ いで凍結乾燥しな、凍結乾燥試料を蒸留水に再懸濁しついで遠心分離して血清を 分離し以下のとおりのヒト第１Ｘ因子の存在に関するＲＩＡによって試験した。

ＲＩＡｉ衝液（５０ｍ　Ｍ　）リス７８００．０．２５％ゼラチン、１％ツイー ン２０．１０ｍＭ　ＨＣＱ、ｐＨ７゜２）に希釈した正常ヒトプール血漿を用い た標準曲線を１／１０〜１／１２８０の希釈液を用いて作図したく第８図参照） 。

検定におけるミルクによるいずれの妨害も除（ため、正常プール血漿を対照ミル クに同様に希釈し標準曲線を作図した。６ＬＬ２３１および６ＬＬ２４０からの 凍結ミルクの試料の希釈液を検定した。ＲＩＡにおける容管は、以下より構成さ ｈた。すなわち５ＯｍＣＡ　ＲＩＡＭｍ液、５０ｍｃｐ試料希釈液、５０ｍＣＪ ウサギポリクローナル抗第１Ｘ因子抗体「ダコーパッツ（Ｄａｋｏ−Ｐａｔｔｓ ）コ、１／３０．０００希釈においてはさらに１１２’Ｊｉｍ化第ＪＸ因子であ る。最大結合に関する対照は、１００１ｎｉ　ＲＩＡＭｍ液、５０ｍＣり抗体お よび５０ｍＣＡの１１２５第■因子からなる構成であった。非特異的結合に関す る対照もまた１５０１１１ＣＮ　ＲＩＡ緩街液および５０１１１Ｃ！０１１２５ 痕跡からなる構成であった。

一昼夜培養後、５０ｍ１のロバ抗ウサギＩｇＧと接合されたセファロース−３１ ００（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　−３１０００）を管内に混合し、ビーズをショ糖分 離によって回収した。ＲＩＡ検定は、約０．１２５国際単位（ｉｕ）／ｄΩに感 知する。このレベルを越える第１Ｘ因子を含有するいずれの試料もＲＩＡにおけ る最大結合を抑制するであろう。

ＲＩＡにおける％結合を、次の試料に関する希釈因子の逆数に対してプロットし た： １、正常プール血漿 ２、正常プール血漿プラスミルク ３．６ＬＬ２３１からの凍結乾燥ミルク試料（Ｔ１）４．６ＬＬ２４０からの凍 結乾燥ミルク試料（Ｔ２）。

これらの結果を第８図に示す。

６ＬＬ２３１　（Ｔｌ）および６ＬＬ２４０　（Ｔ２）の両者からのミルクは、 各／ｚ２．５ｉｕ／ｄｊ）および８．０ｉｕ／ｄ！Ｊにおいて第１Ｘ因子の検出 可能レベルを示した。検定の感度のレベルにおいて対照ミルクにおける活性は、 検出れさなかっな。これらのデータは、ベーターラクトグロブリン第１Ｘ因子融 合遺伝子（特にＰＳＳｌｔｇＸＳ−ＦＩＸから誘導された５ａｌＩ−ＸｂａＩフ ラグメント（また一般的には消化ｐＳＳ１ｔｇＸＳ−ＴＡＲＧ））を保持するト ランスジェニック雌ヒツジがこの遺伝子を発現しまたミルクにおけるヒト蛋白質 を分泌することを示す、これはこの方法におけるヒト蛋白質の基礎を確立する。

Ｆ／Ｇ、５ａ。

−−一− ク― 一■― 一一一　；Ｌ昇れ煉眠１すＴ２ 林フクーｊしｆｆ１　隻／）４！、１タ　ｄ汗−ヰ久、ＦｔＧ、８゜ 国際調査報告

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ配列を成人雌哺乳類の乳腺中に発現させるような方法で乳清蛋白質に 関してコードする雌哺乳類の遺伝子内にポリペプチドに関してコードするＤＮＡ 配列を取り込むことからなるポリペプチドからなる物質を産生する方法。
2. ２．該物質が実質的に該成人雌哺乳類のミルクから回収される請求の範囲第１項 に記載方法。
3. ３．該物質が転写後の修飾後のミルクから回収される請求の範囲第１項に記載の 方法。
4. ４．ポリペプチドからなる該物質が蛋白質である請求の範囲第１項に記載の方法 。
5. ５．ポリペプチドからなる該物質がヒト血液蛋白質である請求の範囲第１項に記 載の方法。
6. ６．ポリペプチドからなる該物質がペプチドホルモンである請求の範囲第１項に 記載の方法。
7. ７．ポリペプチドからなる該物質が血液凝固因子または血液凝固因子のサブユニ ットである請求の範囲第１項に記載の方法。
8. ８．ポリペプチドからなる該物質が酵素であるである請求の範囲第１項に記載の 方法。
9. ９．ＤＮＡ配列を成人雌哺乳類の乳腺中で発現させ、その後それが１以上の酵素 の基質からの反応産生物の形成を触媒するような方法で乳清蛋白質に関してコー ドする哺乳類の遺伝子内に酵素に関してコードするＤＮＡ配列を取り込むことか らなる酵素の反応産生物である基質を産生する方法。
10. １０．該反応産生物が成人哺乳類のミルクから回収される請求の範囲第９項に記 載の方法。
11. １１．ポリペプチドに関してコードする該ＤＮＡ配列を融合遺伝子を形成するた めに生体外で成人雌哺乳類の乳腺に発現可能である乳清蛋白質内に取り込みかつ 該融合遺伝子を受精卵または哺乳類の胚子内への接種により胚芽系統内に取り込 み、その後該接種された受精卵または胚子を成人雌哺乳類内で発育させる請求の 範囲第１項または第９項に記載の方法。
12. １２．接種が２細胞胚子の核内になされる請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．ＤＮＡの線状分子を卵子の前核または核内に接種する請求の範囲第１１項 に記載の方法。
14. １４．哺乳類が家畜哺乳類である請求の範囲第１項または第９項に記載の方法。
15. １５．哺乳類がイノシシ科の一員、ヒツジ属の一員、ヤギ属の一員およびウシ属 の一員から選ばれる請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．哺乳類が酪用ヒツジである請求の範囲第１項または第９項に記載の方法。
17. １７．乳清蛋白質がベーターラクトグロブリンをコード化する請求の範囲第１項 または第９項に記載の方法。
18. １８．融合遺伝子がプロモータからなる請求の範囲第１１項に記載の方法。
19. １９．融合遺伝子が転写に関する出発部位からなる請求の範囲第１１項または第 １８項に記載の方法。
20. ２０．融合遺伝子が１以上のミルク蛋白質遺伝子の末端５′調整配列からなる請 求の範囲第１１項または第１８項に記載の方法。
21. ２１．融合遺伝子が必要により内部調整配列を含有する構造のミルク蛋白質遺伝 子配列からなる請求の範囲第１１項または第１８項に記載の方法。
22. ２２．融合遺伝子がミルク蛋白質の側面に位置する３′配列からなる請求の範囲 第１１項または第１８項に記載の方法。
23. ２３．融合遺伝子がミルク蛋白質をコード化する遺伝子の第１エクソン内に挿入 された重要なペプチドに関してコードするｃＤＮＡ配列からなる請求の範囲第１ １項または第１８項に記載の方法。
24. ２４．融合遺伝子がミルク蛋白質をコード化する遺伝子の配列の側面に位置する 数個の５′からなる請求の範囲第１１項または第１８項に記載の方法。
25. ２５．融合遺伝子が重要なペプチドに関する信号ペプチドを含有する請求の範囲 第１１項または第１８項に記載の方法。
26. ２６．乳清蛋白質遺伝子の信号ペプチドをコード化する配列が産生物質における 成熟ポリペプチドのＮ末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配のその部分に正確に融 合する請求の範囲第１項または第９項に記載の方法。
27. ２７．ＤＮＡ配列の３′末端がその停止コドン後、それ自身固有のｐｏｌｙＡ添 加部位の前に末端をなす請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１つに記載の 方法。
28. ２８．実質的に本明細書に記載されたポリペプチドらかなる物質の産生方法。
29. ２９．ＤＮＡ配列が成人雌哺乳類の乳腺中に発現できるような方法で乳清蛋白質 に関してコードする哺乳類の遺伝子内に取り込まれたポリペプチドをコード化す るＤＮＡ配列よりなる遺伝子学的構成体。
30. ３０．請求の範囲第２９項に記載の遺伝子学的構成体を含有する動物細胞。
31. ３１．胚子細胞である請求の範囲第３０項に記載の動物細胞。
32. ３２．その遺伝子学的物質が請求の範囲第２９項に記載の遺伝子学的構成体を含 有する動物。
33. ３３．請求の範囲第２９項に記載の遺伝子学的構成体からなるプラスミド。