JPH01500188A - ヘパトーム由来成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパドーム由来成長因子 技術分野 本発明は、ヘパドーム細胞からの腫瘍由来内皮細胞成長因子（ヘパドーム由来成 長因子）の均一な精製法に関する。本発明は、脈管形成の制御及び癌性肝腫瘍の 検出におけるヘパドーム由来成長因子の用途にも関する。

背景技術 内皮細胞成長因子とは、脈管形成、即ち新しい血管の成長を誘導する拡散性タン パク質分裂促進物質（ミトゲン）である。マシアグら、サイエンス、第２２５巻 、第９３２−９３５頁、１９８４年（Ｍａｃｉａｇ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎ −ｃｅ　２２５：９３２−９３５（１９８４））　、正常な組織にあっては、内 皮細胞分裂促進因子は創傷治癒をはじめとする様々な生理学的機能にとって重要 である。腫瘍の脈管形成は、成長因子が腫瘍細胞によって放出される場合に生じ る。成長因子は、周囲組織から固体腫瘍中への新しい血管の成長を誘導する。腫 瘍中への新血管の増殖によって、その継続的な生育のために必要な栄養を供給す る。

脈管形成現象を解明することができれば、腫瘍の無制限的な増殖の制御及び脈管 系疾患の治療に際して有効に適用することができるようになる。しかも成長因子 は、損傷組織又は移植組織の血管新生のための有効な用途を有している。

脈管形成を解明するために、正常組織から内皮細胞成長因子が単離されている。

１つの単離された内皮細胞成長因子は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）であって、 これは下垂体及び脳双方の細胞中にみられる正常内皮細胞分裂促進物質である。

ＦＧＦは最近になり均一に精製された。ウシ脳由来ＦＧＦのアミノ末端配列は、 デー・ゴスポダロウィクツら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第６９６３頁、１９８４年（Ｄ、Ｇｏ ｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ ｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ　８１：８９６３（１９８４））で報告されている。ヒト脳 由来ＦＧＦの完全アミノ酸配列は、ギメネツーガレゴ（Ｇｌｍｅｎｅｚ−Ｃａｌ 　Ｉｅ−ｇｏ）ら、サイエンス、第２３０巻、第１３８５−１３８９頁、１９８ ５年に記載されている。ウシ下垂体ＦＧＦアミノ末端配列は、ボーレン（Ｂｏｈ ｌｅｎ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル番アカデミーΦオブ・サイエ ンスＵＳＡ、第８１巻、第５３６４頁、１９８４年に記載されている。ウシ下垂 体細胞由来ＦＧＦの完全アミノ酸配列は、エシュ（Ｅｓｃｈ）ら、プロシーディ ング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８２巻、第 ６５０７頁、１９８５年で報告されている。ヒト脳ＦＧＦのアミノ末端配列は、 ボーレンら、ジャーナル・オブ参セルラー豐バイオケミストリー、第９ａ増刊号 、第１３３頁、１９８５年（Ｂｏｈ　Ｉ　ｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃｅ １ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　９ａ：１３ ３（１９８５））に記載されている。ヒト脳ＦＧＦの２種の型のアミノ末端配列 は、ボーレンら、フエデレーション・オブφヨーロピアン・バイオケミカル・ソ サエティーズΦレターズ、第１８５巻、第１７７頁、１９８５年（Ｂｏｈ−Ｉｅ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃ−１ｅｔｉｅｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１８５：１７７（１ ９８５））で報告されている。

シンク（Ｓｈｌｎｇ）ら、サイエンス、第２２３巻、第１２９６−１２９９頁、 １９８４年は、悪性軟骨腫瘍からの軟骨肉腫由来の成長因子の分離及び仮積製に ついて報告している。シンクの研究では、この因子を単離した後、それはバイオ レックス７０　（ＢｉｏＲｅｘ　７０）陽イオン交換カラムに付された。次いで バイオレックス７０クロマトグラフイーにより得られる成長因子活性ピークはヘ パリン・セファロースカラムに付された。

発明の説明 ヘパドーム細胞からヘパドーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）がシンクらの前記の文 献で記載されているように分離され、かつ二工程のバイオレックス７０アフイニ テイークロマトグラフイー及びヘパリン−セファロースカラムに付された。その 場合に本発明者は、二〇二工程プロセスで得られるＨＤＧＦ物質が残念ながら不 完全な純粋であるにすぎないことを発見した。この二工程プロセスにおけるこの 問題を発見した後、本発明者は次いでＨＤＧＦ活性を有しかつ実質上タンパク質 性不純物を含有しない物質を提供するという新たな問題を解決した。

したがって本発明は、ヘパドーム細胞からの腫瘍由来内皮細胞成長因子の均一な 精製法に関し、かかるヘパドーム由来成長因子は分子量約１８，０００ドルトン 未満のいかなるタンパク質性不純物も実質上含有していない。

更に本発明は、ヘパドーム由来成長因子の同定及びその特性づけにも関する。し かも本発明はへパトーム由来成長因子の用途にも関する。

本発明者はへバトーム細胞からの腫瘍由来内皮細胞成長因子を均一に精製した。

均一なヘパドーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ ーにより得られる生物学的活性ピークによって特徴付けられる。本発明者は、ヘ パドーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）が構造上線維芽細胞成長因子（Ｆ　Ｇ　Ｆ） と類似していることを発見した。ＨＤＧＦ及びＦＧＦ間の相同性は、脈管形成及 びある種の脈管系疾患を解明かつ制御する上で密接な関連性を有している。

図面の簡単な説明 第１図は、ＢＡＬＢ　ｃ／３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成（白丸）及び毛細血管 内皮細胞の増殖性（黒丸）の促進能力に関するヘパリン−セファロース精’ＪＪ 　ＨＤ　Ｆ　Ｇの様々な溶出画分についての評価結果のグラフ図である。

インセットは生物学的活性画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色分析の結果を表わ し、活性画分の分子量が約１８．５キロドルトンであることを示している。

第２図は、ＢＡＬＢ　ｃ／３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成（白丸、左縦軸）及び 毛細血管内皮細胞の増殖性（黒丸、左縦軸）の促進能力に関する、０．１％トリ フルオロ酢酢酸中上セトニトリル／イソプロパツール５０／　５０　ｖ／ｖ）の ０〜６０９６直線勾配（右縦軸）による逆相ＨＰＬＣヘパリンーセファロースカ ラムからのＨＤＧＦの１ｍｌ溶出画分（横軸）についての評価グラフ図である。

インセットは生物学的活性画分のＳＤＳ　−ＰＡＧＥ及び銀染色分析の結果を表 わし、活性画分の分子量が約１８，５００ドルトンであることを示している。

第２図では溶出画分の２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度も示している。

第３Ａ図は、ＢＡＬＢ　ｃ／３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成（黒丸、左縦軸）及 び免疫ドツトアッセイにおける免疫反応性（白丸、左縦軸）の促進能力に関する 、０．１％トリフルオロ酢酢酸中上セトニトリル／イソプロパツール５０１５０ 　ｖ／ｖ）の０〜６０％直線勾配による逆相ＨＰＬＣヘパリンーセファロースカ ラムからのＨＤＧＦの１ｍｌ溶出画分（横軸）についての評価結果のグラフ図で ある。免疫ドツトアッセイにおいて、“ドツト”の強度は反射濃度測定法により 調べられ、０（免疫反応なし、反射率１００％）〜１（最大免疫反応、反射率０ ％）の任意スケールでプロットされた。

第３Ｂ図は、バイオレックス及びヘパリン−セファロースクロマトグラフィーで 精製された（第１及び３列）及びバイオレックス７０クロマトグラフイー単独で 精製された（第２及び４列）ＨＤＧＦのウェスターンプロット分析図である。第 １及び２列はタンパク質染色されたものであり；第３及び４列は抗ＦＧＦ抗血清 と共にインキュベートされたものであって、第３Ａ図で記載されているような反 射濃度測定法によって視覚化された。

第４図は、ヘパドーム由来成長因子ペプチド断片の配列とウシ線維芽細胞成長因 子及びヒト線維芽細胞成長因子のアミノ末端配列とを比較したものである。

本発明に従い、ヘパドーム細胞由来内皮細胞成長因子が均一に精製された。因子 を含有するものであればいかなる試料も、本発明に記載の方法に従い出発物質と して使用可能である。典型的には、ヘパドーム由来成長因子はヒトもしくは物質 のへパトーム又はヘパドーム細胞系から単離される。

一つの態様において、インビトロにおけるヒト腫瘍細胞（Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏ ｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）　、ジエイ拳フォグ（Ｊ　、　Ｆｏｇｈ） 編集にニーヨーク、１９７５年）、第１１５頁でジェイ・フォグ及びジー・トレ ンプ（Ｇ、Ｔｒｅ−ｍｐｅ）により記載されたヒトへバトーム細胞系５Ｋ−ＨＥ ＰＩが、因子を単離するための出発物質として使用された。他の出発物質源もヘ パドーム由来成長因子を得るために使用可能であることは、当業者であれば理解 しうるであろう。このヒトへバトーム細胞系５Ｋ−ＨＥＰ１は浮遊培養により増 殖せしめられた。大半の増殖因子活性は、条件培地よりもむしろ細胞と関連があ ることが見出された。したがって、ヘパドーム細胞はＨＤＧＦを回収するために 凍結、解凍及びホモゲナイズの連続によって溶解された。

単離された粗製ＨＤＧＦは、バイオレックス７０陽イオン交換及びヘパリン−セ ファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いる組合せクロマトグラフィ 一工程にまず付された。これらの精製工程は、シンクらによりサイエンス、第２ ２３巻、第１２９６−１２９９頁、１９８４年に記載された操作法に従った。粗 製へパトーム溶解物はバイオレックス７０に付され、ＨＤＧＦは０．６Ｍ　Ｎａ Ｃ１で溶出せしめられた。活性画分はプールされ、ヘパリン−セファロースカラ ムに直接材された（第１図）。３Ｔ３細胞ＤＮＡ合成〔トーマス・ケー・ニーら 、ジャーナル・オブ・バイオロジカルφケミストリー、第２５５巻、第５５１７ 頁、１９８０年（Ｔｈｏ−ｍａｓ、に、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＣｈｅｌＩｉｓｔｒｙ２５５：５５１７（１９８ ０））　）及び毛細血管内皮細胞増殖性〔クラゲスプラン・エム（ＫＩａｇｓｂ ｒｕｎ、Ｍ）ら、プロシーディング會オブΦナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンスＵＳＡ、第８２巻、第８０５頁、１９８５年〕を促進させる両分の能力 に関して測定した場合に、成長因子活性の１つのピークは約１．８Ｍ　ＮａＣ１ で溶出した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色による活性画分の分析では、分子量約１８．５００ ドルトンのバンドの存在を示した（第１図、インセット）。ＨＤＧＦは約５単位 ／ｎｇの特異的活性を有し、約１ｎｇ／ｍｌで細胞増殖を促進した。成長因子活 性の単位は、３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成の最大刺激の半分まで促進させるた めに必要な成長因子濃度として規定された。約２〜４Ｘ１０４個のへバトーム細 胞はＨＤＧＦＩ単位を含有することが見出された。ＨＤＧＦ回収率は約３０％で あった。

前記二工程クロマトグラフィーの適用により腫瘍成長因子を精製しうろことが既 に報告されていた（シンクら、前出）。しかしながら、本発明者は、この組合せ 法により得られるＨＤＧＦ物質が均一ではなく、ＨＤＧＦ及びタンパク質性不純 物の混合物であることを発見した。

ＨＤＧＦ　５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに二工程クロマトグラフィーによる物質が充填 された場合に、ゲルブロフィールでは分子量３．０００〜１０，０００ドルトン 間で多量のタンパク質不純物の存在を示した。ＨＤＧＦ物質が二工程クロマトグ ラフィープロセスによって均一に精製されていないことを発見した後、本発明者 はＨＤＧＦ活性を有しかつタンパク質性不純物を真に実質上含有しない物質を提 供しようとする新たな問題に注力した。

ヘパリン−セファロース精製物質は、Ｃ３バツキング装備逆相高圧液体クロマト グラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）カラムに注入され、アセトニトリル勾配下０．１％ トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で溶出させた。逆相クロマトグラフィーの結果 、有機物含有率３２〜３７％（アセトニトリル：イソプロパノール５０　：　５ ０　ｖ／ｖ）で溶出する生物学的活性ＨＤＧＦは２つのピークに部分解離した。

第２図で示されているように、両分３４〜３７の生物学的に活性な右側のピーク は均一なＨＤＧＦを表わす。このように、ヘパリン−セファロース精製後、ＨＤ ＧＦを逆相ＨＰＬＣカラムに付すことによって、ＨＤＧＦは均一に精製される。

当業界で公知のように、上記条件下での逆相ＨＰＬＣの結果、少なくともタンパ ク質が部分的に変性される。

生物学的活性を回復させるために、変性ＨＤＧＦは、中和緩衝液を添加すること によりＨＤＧＦ含有溶出液を中和させる等の、当業界で公知の手段に従い復元さ せることができる。あるいは、逆相クロマトグラフィ一工程中においでＨＤＧＦ の生物学的活性を保護するために、Ｎａ　ＨＰＯ／ＮａＨ２ＰＯ４又は酢酸ナト リウム／酢酸のような二成分緩衝液が使用されてもよい。他の適切な緩衝液も当 業界で公知であり、本発明において使用可能である。ＨＤＧＦの工業的もしくは 大規模な精製又は分離技術の場合にも、同様の条件が有機溶媒濃度の段階的増加 に関して適用しうる。同様の条件下、有機及び水性の組成は、組成を変化させて 勾配をかけることとは対照的に、一定に保たれる。

画分３４〜３７の、第２図における生物学的活性の右側のピークで表わされるＨ ＤＣＦは次いで濃縮され、アミノ酸配列情報を得るために用いられる。

本明細書で用いられる“実質上純粋な”又は“実質上精製された°とは、天然状 態では通常因子と結合している化合物をいずれも実質上含有していない、即ち他 のタンパク質及び炭水加物もしくは脂質成分を含有していないＨＤＧＦを表現す るために用いられる。この用語は更に、当業者で用いられる１以上の純粋又は均 一特性でもって均一な因子を表現するためにも用いられる。例えば、実質上純粋 なＨＤＧＦとは、以下のようなバラメーター二押ち分子量、クロマトグラフィー 技術、アミノ酸組成、アミノ酸配列、封鎖もしくは未封鎖Ｎ−末端、ＨＰＬＣ溶 出プロフィール、生物学的活性及び他のパラメーターに関して標準的実験偏差内 の一定かつ再現性のある特性を示している。しかしながら、この用語は因子と他 の化合物との人工又は合成的混合物を除外する意味ではない。

特に本明細書で用いられる“実質上純粋な”、“実質上精製された°又は“実質 上含有しない°という語は、ＨＤＧＦと結合するタンパク質性不純物を実質上含 有せず、しかもＨＤＧＦが分子量約１８，０００ドルトン未満のタンパク質性物 質を実質上含有しないように均一に精製されたＨＤＧＦを表現するために用いら れる。

構造相関関係は、腫瘍由来内皮細胞成長因子たる本発明のへパトーム由来成長因 子、及びギメネツーガレゴら、サイエンス、第２３０巻、第１３８５−１３８９ 頁、１９８５年；ビー・ボーレンら、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミ ストリー、第９８増刊号、第１３３頁、１９８５年；デー・ゴスボダロウィクツ ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳ Ａ、第８１巻、第６９６３頁、１９８４年；ピー拳ボーレンら、プロシーディン グψオブ・ナショナル・アカデミ−争オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第５ ３６４頁、１９８４年；エシュ（Ｅｓｃｈ）ら、プロシーディング・オブφナシ ョナル・アカデミ−・オブ拳すイエンスＵＳＡ、第８２巻、第６５０７頁、１９ ８５年に記載された正常組織内皮細胞成長因子たる線維芽細胞成長因子（Ｆ　Ｇ 　Ｆ）の間で比較された。

第４図に示されたウシＦＧＦのアミノ酸１５個のアミノ末端配列に相当する合成 ペプチドが免疫原性担体キーホールカサガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　１１＋１ｐｅｔ ）　ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）と複合化せしめられ、ウサギに注射された。

産生せしめられたポリクローナル抗体は、逆相Ｃ３カラムでのＨＰＬＣ精製後に 、ＨＤＧＦとの交差反応性について試験された（第３Ａ図及び第３Ｂ図）。カラ ムから溶出せしめられた画分は、成長因子活性、及び免疫ドツトプロット試験に よる抗ＦＧＦ抗血清との交差反応性に関して試験された（第３Ａ図）。生物学的 活性ＨＤＧＦを含有する画分のみが抗ＦＧＦ抗血清と交差反応することが判明し た。

ＨＤＧＦに関する抗ＦＧＦ抗血清の交差反応性は、“ウェスターンプロット”ア ッセイの適用によって更に分析された（第３Ｂ図）。ＨＤＧＦの粗製及び均一な 双方の製品が５ＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動に付され、タンパク質は電気泳 動による移動によってニトロセルロース上にプロットされた。移動したタンパク 質はタンパク質染色され（第１列及び第２列）、抗ＦＧＦ抗血清と共にインキュ ベートされた（第３列及び第４列）。精製された分子量１８，５００のＨＤＧＦ 　（第１列）は合成ＦＧＦに対して産生された抗血清との免疫反応性を明らかに 有していた（第３列）。抗血清は、粗タンパク質混合物中のＨＤＧＦを検出しう る効力に関して高度に特異的であることが示された。ＨＤＧＦの粗製品（第２列 ）中に存在する多数のタンパク質の中で、分子量約１８．０００〜１９，０００ のポリペプチドニ量体のみが抗ＦＧＦ抗血清との免疫反応性を明らかに有してい た（第４列）。二量体の性質は明確ではないが、粗製品中に様々な形のＨＤＧＦ が存在していることを示唆している。

ＨＤＧＦはＦＧＦのアミノ末端配列と相同的な配列を有していることは、抗体実 験から結論付けることができる。しかしながら、ＦＧＦのアミノ末端配列がＨＤ ＧＦのアミノ末端と同一であるか否かについては、これらの実験からは定かでは ない。したがって、ＨＤＧＦは大量に精製されて、アプライドφバイオシステム ス４７０Ａ０セクエネータ−（ＡｐｐＨｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ 　５ｅｑｕｅｎａ−ｔｏｒ）によってそのアミノ酸配列を決定する試みがなされ た。ＨＤＧＦ５ｎｓｏｌｅｓ　（約１００μｇ）が配列分析に用いられた場合に 配列データは得られなかったが、ＨＤＧＦがＮ末端アミノ酸で封鎖されているこ とを示唆した。本ケースにおいて得られた結果は、ＨＤＧＦ及びＦＧＦのＮ末端 領域が異なることを示唆した。

即ち、ＨＤＧＦはトリプシンで切断され、断片はＨＰＬＣフェニル逆相カラム〔 セバレーションズ・グループ（Ｓｅｐａｒａｔｌｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）、ヘスペ リア（Ｈｅｓｐｅｒｌａ）、カリフォルニア〕で分離された。いくつかの断片が 配列決定された。配列のうち１つはＩｅｕ−ｐｒｏ−ａｌａ−１ｅｕ−ｐｒｏ− ｇｌｕ−Ｘ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｇｌｙ　（Ｘは未確認 のアミノ酸部分である）であることが判明した。このヒトＨＤＧＦ配列とウシ及 びヒトＦＧＦのアミノ末端配列との比較は、第４図で示されている。その３番目 のアミノ酸残基（ｐ　ｒ　ｏ）からみていった場合に、ＨＤＧＦ断片の配列はウ シＦＧＦのアミノ酸１５個のアミノ末端配列と相同的であることが判明した。Ｈ ＤＧＦ配列は、ヒトＦＧＦがその６位にｇｌｕ残基を有していることを除き、ヒ トＦＧＦと同様の相同性を示している。ＨＤＧＦはその中にＦＧＦのアミノ酸１ ５個の末端配列を有していることが、配列データから結論付けられた。しかしな がらＨＤＧＦにおいて、この配列は内部的なものであって、アミノ末端側に少な くとも更に２個のアミノ酸を有している。しかもＨＤＧＦのＮ末端における封鎖 性は、ＨＤＧＦが、アミノ末端ＦＧＦ配列のＮ末端側に更に２個より多いアミノ 酸を有していることを示唆している。

ＨＤＣＦに関するＮ末端延長配列は次のアミノ酸配列を含む： （ａ　１　ａ／ｓ　ｅ　ｒ）　−（１ｅｕ／ａ　ｒｇ）　−ｐ　ｒｏ　−（ａｌ ａ／ｇｌｙ）−（ｌｅｕ／ｐｒｏ）−ａｌａ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−ｍｅｔ−ａｌａ −（ａｌａ）−ｇｌｙ−ｓｅｒ　−（Ｌｓｏｌｅｕ）−ｔｈｒ−ｔｈｒ−１ｅｕ 。

抗体の交差反応性及びタンパク質配列データは、ＨＤＧＦ及びＦＧＦ間にある程 度の構造的相同性があることを明確にしている。バイオレックス７０及びヘパリ ン−セファ０−スによるクロマトグラフィー的挙動の如き他の性質における強度 の類似性も、構造的相同性を裏付けている。

ＨＤＧＦ及びＦＧＦ間の相同性は、脈管形成及びその制御のメカニズムに関して 密接な関連性を有している。

腫瘍由来内皮細胞成長因子及びＦＧＦの双方は脈管形成を誘導する。ＨＤＣＦ及 びＦＧＦ間の構造的相同性は、構造類似タンパク質が腫瘍誘導性脈管形成及び正 常な増殖中に生じる脈管形成の双方に関与しうろことを示唆している。したがっ て、腫瘍の導管化は天然タンパク質の異常産生に起因している可能性がある。

■、ヘパドーム由来成長因子の用途 実質上精製されたヘパドーム由来成長因子は、いくつかの分野において臨床的利 用性を有している。ＨＤＧＦは抗体産生を促進させるために使用することができ る。

しかも、免疫原性でかつ免疫特異性である実質上精製されたＨＤＧＦのペプチド 断片も、抗体を産生させるために使用しうる。

特に重要なものは下記式のＨＤＧＦペプチドである：〔上記式中、ＲはＣｙｓ− ＣＯ−Ｒ２、ＯＨ１０Ｍ又は−ＮＲ３Ｒ４である； Ｍは薬学上許容される陽イオン又は低級（Ｃ１−０６）分岐状もしくは非分岐状 アルキル基である；Ｒ、Ｒ及びＲ４は同一でも異なっていてもよく、水素及び低 級（Ｃ，−Ｃ６）分岐状もしくは非分岐状アルキル基からなる群より選択される ；及びＸは第４図に記載されているような免疫原性かつ免疫特異性のＨＤＧＦペ プチド断片又はＨＤＧＦの他の免疫原性かつ免疫特異性のペプチド断片である〕 　；２）　その酸付加塩；及び ３）その保護又は部分的保護誘導体。

当業界で公知のように、アミノ酸残基は適切なアミノもしくはカルボキシル保護 基を用いたそれらの保護型であっても又は未保護型であってもよい。

使用される陽イオンＭは、アルカリもしくはアルカリ土類金属陽イオン（即ち、 Ｎａｓ　Ｋ、Ｌ　ｉｘ　１／２Ｃａ。

１　／　２８　ａ等）又はアミン陽イオン〔即ち、テトラアルキルアンモニウム 、トリアルキルアンモニウム（アルキルはＣ１−０１２である）〕である。

様々な鎖長のペプチドは、遊離アミン（Ｎ末端）でもその酸付加塩の形であって もよい。通常の酸付加塩はハロゲン化水素酸塩、即ちＨＢｒ、ＨＩ又は、更に好 ましくはＨＣＩである。

ＨＤＧＦの免疫原性かつ免疫特異性のペプチド断片は、当業界で公知の手段によ り調べることができる。例えば、ＨＤＣＦはペプチド断片に切断されて、ペプチ ド断片のアミノ酸配列が決定される。好まＩ７い態様において、ペプチド断片は 、参考のため本明細書に組込まれるメリフィールド費ジャーナルΦオブ伊アメリ カン−ケミカル・ソサエテー、第８５＠、第２１４９頁、１９６２年（Ｍｅｒｒ ｌｆｉｅｌｄ、ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｌｃａｌ　 ５ｏｃ１ｅｔｙ８５：２１４９（１９８２）　）及びスチコ、ワード及びヤング 、固相ペプチド合成（フリーマン、サンフランシスコ、１９６９年）、第２７− ６２頁［５ｔｅｖａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、ｉｎ　５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　 Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＦｒｅｅＩＩａｎ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎ ｃｉｓｃｏ。

１９８９）ｐｐ−２７−６２）に記載された周知の同相合成法によって合成され る。次いで、様々なペプチド断片は、免疫原性（物質に体液性免疫応答誘起能を 付与する性質及び物質がこの性質を有している度合）及び免疫特異性（免疫応答 によりてＨＤＧＦ又はＨＤＣＦペプチド断片との結合が誘起される抗体の能力） を調べるために評価される。

しかる後これらのペプチド断片は、ペプチド断片の抗体産生促進能を評価するこ とにより、免疫原性及び免疫特異性を調べるために当業者で公知の方法において 使用される。

抗体を産生させるために、ＨＤＧＦ又はペプチド断片は、当業界で周知かつ常用 される方法を適用して、アルブミン又はキーホールカサガイヘモシアニン（Ｋ　 Ｌ　Ｈ）のような担体タンパク質に結合させてもよい。更に、ＨＤＧＦ又はペプ チド断片は免疫学的に不活性又は活性な担体と混合させてもよい。免疫応答を促 進又は誘起する、フロイント完全アジュバントのような担体も使用可能である。

抗原性物質（ＨＤＧＦ又はペプチド断片−担体タンパク質複合体）は、抗体が産 生されるべき動物の免疫系中に導入される。周知の技術により産生せしめられ、 ＨＤＧＦ又はＨＤＧＦの免疫原性ペプチド配列に応答して生ぜしめられたポリク ローナル抗体及びモノクローナル抗体はいずれも様々な方法において使用するこ とができる。

これらの抗体は、ヘパドーム由来成長因子を同定かつ定量するための免疫アッセ イにおいて使用可能である。

本発明の範囲内に属する免疫アッセイには、酵素結合イムノソルベントアッセイ （ＥＬＩＳＡ）の競合アッセイ法及びサンドイツチ法の双方が含まれる。これら のアッセイ法は当業界で周知であって、例えばボラ−ゆニーら、酵素結合イムノ ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、（ダイナチック・ヨーロッパ、１９７９年 ）　（Ｖｏｌｌｅｒ。

＾、ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｌｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ ｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ（ＥＬＩＳＡ）　、（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｅｕｒｏｐｅ　 １９７９））に記載されている。

当業者であれば理解しうるように、これら免疫診断アッセイの適用に際しては、 ＨＤＧＦ又はＨＤＧＦの免疫原性ペプチド断片に応答して産生された抗体を必要 とする。

更にアッセイでは、ペプチド断片及び抗体を検出可能に標識しておくことを要す る。抗体を産生させかつペプチド断片及び抗体を検出可能に標識しておくための 技術は当業界で周知であって、当業者であれば知っているであろう。

しかも、本発明のアッセイにおいて使用される物質は、キット製造のためにも理 想的に適している。このようなキットは、バアイル、試験管等のような１以上の 容器手段を緊密に収容しうるように仕切られた運搬手段からなる。上記の各容器 は前記方法で使用される別々の要素のうち１種を含有している。

例えば、上記容器手段の１つは上記ＨＤＧＦに対する抗体を含有することができ る。このような断片は、別の固相免疫吸着剤に又は直接容器内壁に結合せしめら れている。第二の容器は、検出可能に標識された抗−抗体を凍結乾燥された形で 又は溶液として含有していてもよい。

運搬手段は更に、各々が異なる既知量の抗体を含有した複数個の容器を収容して いてもよい。この場合にこれら後者の容器は標準曲線を作成するために使用され 、未知量のＨＤＧＦを含有する試料から得られた結果はこの標準曲線にあてはめ られる。

これらの抗体は、治療有効量のポリクローナル抗体又は好ましくはモノクローナ ル抗体を患者に投与することによって、肝腫瘍癌細胞（ヘパドーム）の脈管形成 に病む患者を治療するためにも使用することができる。

ＨＤＧＦ又はその治療用断片は、損傷組織又は移植組織をもつ患者を治療するた めに使用することができる。

これらのタイプの組織は、治癒を促進させるために導管化が必要な代表例であろ う。したがって、ＨＤＧＦ又はその治療用断片は、新鮮な血液の供給量の増大を 促進させるために投与することができる。典型的にはＨＤＧＦ又はその治療用断 片は、中性もしくは不活性の担体及びＨＤＧＦもしくはＨＤＧＦの治療用断片を 含んでなる医薬組成物として投与される。ＨＤＧＦの治療用断片は、新血管成長 を促進させうるものであれば、いかなる断片であってもよい。好ましくは、これ らの断片は、第４図に示されているようなＨＤＣＦペプチド断片である。

下記例は、本発明を実施するために用いられる物質及び方法について記載してい る。下記例はいかなる態様においても本発明を制限するようなものではない。

例　１ 第１図は、ヘパドーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）の単離及び部分的精製について 示している。ヒトへパトーム５Ｋ−ＨＥＰ−１細胞を、ダブル−アール・トルバ ートら、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング、第２４巻、第 １６７１頁、１９８２年（Ｗ、Ｒ，Ｔｏｌ−ｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｔ ｅｃｈｎｏＩｏｇ）’　ａｎｄ　Ｂｌｏｅｎｇ１ｎｅｅｒ１ｎｇ、２４：１６７ １（１９８２））で記載されているように懸濁状態で増殖させた。約５Ｘ１０１ １個の細胞を遠心分離によって回収した。ペレット約１５０ｍ１を凍結し、解凍 し、ＩＭＮａＣｌ、０．ＯＩＭ）リスＭＣＩ、ｐＨ７，５，１５００ｍｌに再懸 濁させた。ヘパドーム細胞をウェアリング（Ｗａｒｌ　ｎｇ）ブレングー中室温 で１分間ホモゲナイズすることにより破砕した。ホモゲネートを４℃で一夜撹拌 し、しかる後２５，０００ｇで３０分間遠心分離して清澄化させた。清澄な上澄 を０．０１５Ｍ　ＮａＣ１゜０、ＯＩＭ）リスＥｅｌに対して透析し、同様の緩 衝液で平衡化されたバイオレックス７０〔バイオラッド（ＢｌｏＲａｄ）　、２ ００−４００メツシーＬ）１７５０ｍｌと４℃で一夜撹拌することにより混合さ せた。バイオレックス７０を回収し、カラム（５Ｘ１００ｃｍ）中に注ぎ、平衡 化用緩衝液２０００ｍ１次いで０．６Ｍ　ＮａＣ１，０、ＯＩＭ）リスＨＣＩ、 ｐａ７．５．２０００ｍ１により４℃において流速６０ｍ１／ｈｒで洗浄した。

画分を回収し、ケー・ニー・トーマスら、ジャーナル・オブーバイオロジカル・ ケミストリー、第２５５巻、第５５１７頁、１９８０年及びエム拳クラゲスプラ ンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ ＳＡ、第８２巻、第８０５頁、１９８５年で前記したように、ＢＡＬＢ／ｃ　３ Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成及び毛細血管内皮細胞の増殖性を促進させる能力に ついてモニターした。ＨＤＧＦ含有Ｉｉ分をプールしくエム争クラゲスプランら 、プロシーディング・オブφナショナル舎アカデミーΦオブ・サイエンスＵＳＡ ％第８２巻、第８０５頁、１９８５年の定義によると１．５×１０６成長因子活 性単位：約３００ｍ１）０．６Ｍ　ＮａＣｌ、０．ＯＩＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ７ ，５、で平衡化されたヘパリン−セファロースカラム〔ファルマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）、２Ｘ１３ｃｍ、４０ｍ１）に直接材した。平衡化用緩衝液２００ ｍ１で洗浄後、０．６Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，ＯＩＭ）リスＭＣＩ、ｐＨ７，５、勾 配液４００ｍ１を４℃にて流速４０ｍ１／ｈｒでカラムに供した。両分（７ｍｌ ）を回収し、３７３細胞におけるＤＮＡ合成及び毛細血管内皮細胞の増殖性を促 進させる能力及び導電性に関して試験した。

結果は第１図に報告されているが、黒丸はカウント数（Ｘ　Ｉ　Ｑ−’）　／ｇ ＋ｉｎで測定されたＤＮＡ合成について示しており、白丸は内皮細胞数（ＸＩＯ ’）として測定された毛細血管内皮細胞増殖性について示している。第１図によ れば、両分２８−３２がＨＤＣＦ生物学的活性のピークを証明していることがわ かる。

第１図のインセットは、両分の分子量について示している。各活性画分（２８〜 ３１）の約１０％が蒸留水に対して透析され、凍結乾燥され、ＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル電気泳動〔レムリ、ネーチャー、第２７７巻、第６８０頁、１９７ ０年（Ｌａｅ＋ｎ１１．Ｎａｔｕｒｅ、２７７：６８０（１９７Ｇ））　）及び 銀染色〔オークレーら、アナライティカル・バイオケスミトリー、第１０５巻、 第３６２頁、１９７５年　（Ｏａｋｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、＋Ａｎａｌｙｉ１ｅａ ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１０５：３Ｂ２（１９７５）））により分析された。生物学的活性なタンパク質 は約１８．５００の分子量を有している。

例　２ 第２図はＨＤＧＦの逆相クロマトグラフィーについて示している。バイオレック ス７０及びヘパリン−セファロースクロマトグラフィーの組合せによって単離か つ部分精製されたＨＤＧＦ　（例１）は、ベックマン（Ｂｅｃｋ園−ａｎ）モデ ル３３４ＨＰＬＣ勾配系を用いた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ 　Ｃ）により脱塩された。

ＨＤＧＦ　（約４００，０００単位、８０ｕｇ、６０ｍ１）を室温で流速１．０ ｍｌ／ａ＋ｉｎにて別個のミニポンプ［ＬＤＣ／ミニロイ（Ｍｉｎｉｒｏｙ）ポ ンプ〕を介してＲＰＳＣＣＢカラム（０，４６ｘ　７．５　ｃ　ｍ、ベックマン ・インストルメン゛ソ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕｓｅｎｔｓ））　ｌこ供 した。０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で洗浄後、０．１％ＴＦＡ中ア セトニアセトニトリル／２−プロパツール／　５０　ｖ／ｖ）の０〜６０％直線 勾配液６０ｍ１を流速０．５ｍｌ／ｗｉｎでカラムに供し、画分（１ｍｌ）を回 収した。生物学的活性の測定のために、各画分の一部を、ｐＨを中性化させるた めに血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを補充したリン酸緩衝液で約２０倍に直ちに希 釈した。結果は第２図に報告されている。黒丸は３７３細胞におけるＤＮＡ合成 の促進性を示している。白丸は毛細血管内皮細胞の増殖促進性を示している。第 ２図のインセットは、生物学的活性画分の分子量が約１８．５００ドルトンであ ることを示している。かかる分子量１１ＰＪ定を行なうために、画分３２〜３７ をプールし、スピードバック・コンセントレータ−（Ｓｐｅｅｄｖａｃ　ｃｏｎ ｃ−ｅｎｔｒａｔｏｒ）　（サバント・インストルメンツ（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎ −５ｔｒｕｓｅｎｔｓ））中で乾燥した。ＨＤＧＦ約８００ｎｇを５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ及び銀染色によって分析した。

例　３ 第３図は、ウシＦＧＦのアミノ末端配列に対して産生された抗体によるＨＤＧＦ の免疫検出について示している。ウシＦＧＦのアミノ末端側の１５個のアミノ酸 （デー・ゴスボダロウィクツら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ争すイエンスＵＳＡ、第８１巻、第６９６３頁、１９８４年）に相当 するペプチドを、自動アプライド・バイオシステムス４３０を用いてメリフィー ルドの固相法〔アール・ビー・メリフィールド、ジャーナル・オブ争アメリカン ・ケミカル番ソサエテー、第８５巻、第２１４９頁、１９６３年（Ｒ，Ｂ。

Ｍｅｒｒｌｆｉｅｌｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｌｃａｎ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、８５　：２１４９（１９６３））　）によって合成し た。ペプチド合成されたｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏａ）−ｇｌｙをヒドロキ シメチル−フェニルアセドアミツドメチル（ｐｈｅｎｙｌａｅｅ−ｔ、ａｉｉｎ ｏｄｏｌｌｅｔｈｙ＋）　（Ｐａｍ）　−ポリスチレン樹脂に結合させ、ペプチ ドの組立てをＢｏａ−アミノ酸〔ベニンシュラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓ ｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行ない、Ｂｏｃ−ｐｒｏ−ａｌａ −１ｅｕ−ｐｒ。

−ｇｌｕ−ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）−ｇｉｙ　ｇｌｙ−ｓ　ｅ　ｒ　−（ＯＢｚ　 ｌ）　−ｇ　１　ｙ−ａ　１　ａ−ｐｈｅ　−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ＯＣＨ ２−Ｐａｍ−樹脂１ｇを製造した。樹脂（０，９７ｇ）をｐ−クレゾール１．０ ｒｎｌ及びｐ−チオクレゾール１．０ｇの存在下０℃で１時間無水フッ化水素１ ．０ｍｌで処理し、ジエチルエーテル及び３０％氷酢酸で抽出した。ペプチドを １Ｍ氷酢酸で平衡化されたセファデックスＧ−２５カラム（２，５Ｘ９０ｃｍ） で脱塩し、０．１％ＴＦＡ中０〜６０％アセトニトリルの直線勾配をかけＨＰＬ Ｃヴイダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４逆相カラム（０，４６Ｘ　２５　ｃ　ｍ）で 分別した。合成ペプチドのアミノ酸組成はウシＦＧＦのアミノ末端配列の組成と 一致した。合成ＦＧＦペプチドを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミドを用いてキーホールカサガイヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）と 複合させた。ウサギを、完全フロインドアジュバントで乳化されたＫＬＨ−ペプ チド複合体（５００μｇ）の複数部位皮内注射、次いで３及び６週間後における 不完全フロインドアジュバントで乳化されたＫＬＨ−ペプチド複合体２００μｇ の皮下注射によって免疫した。二次追加免疫注射後におＣ′ｊる抗血清の力価は 、抗原として未複合化Ｆ　Ｇ　Ｆペプチドを用いたＥＬＩＳＡアッセイで測定し たところ、約１：４０００〜１　：　９０００であった。

Ａ、免疫ドツトアッセイ：ＨＤＧＦは、例１に記載されたバイオレックス７０及 びヘパリン−セファロースクロマトグラフィー並びに例２に記載されたＣ３逆相 クロマトグラフイーの組合せによって精製した。逆相クロマトグラフィー後に回 収された各画分を、３Ｔ３における成長因子活性及び免疫ドツトアッセイにおけ る免疫反応性に関して試験した。結果は第３Ａ図に報告されているが、黒丸はＢ ＡＬＢｃ／３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成を表わし、白丸は免疫反応性を表わし ている。免疫ドツトアッセイにおいて、各カラム画分２μｌを蒸留水１００μｍ で希釈し、９６ウエル微量ン濾過マニホールド（バイオドツト装置、バイオラッ ド・ラボラトリーズ）ヲ介しＢＡ−８３０，２μｍニトロセルロース紙〔シュラ イヒア・アンド・シスエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕ−ｅｌ＋ ））上でン濾過した。タンパク質“ドツト“をアフィニティー精製抗ＦＧＦ抗血 清と共に（１：１５００）インキュベートし、結合した免疫グロブリンをビオチ ニル化ヤギ抗ウサギ抗体、ペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジン及び４− クロロ−１−ナフトール基質との連続的インキュベートにより視覚化させた。“ ドツト′の強度を反射濃度測定法により調べ、０（免疫反応なし、反射率１００ ％）〜１（最大免疫反応、反射率０％）の任意的スケールでプロットした。

Ｂ、ウェスターンプロット分析：タンパク質を１８％５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル上で電気泳動に付し、ＢＡ−８３ニトロセルロ一ス紙〔トランス−プロッ トセル（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ　ｃｅｌｌ）、パイオーラッド〕に電気泳動で移 動させた。ニトロセルロース紙の各部分をタンパク質に関し“オーロダイ（Ａｕ ｒｏｄｙｅ）金コロイド試薬″　〔ジャンセン・ライフ・サイエンシス・プロダ クツＵａｎｓｓｅｎＬｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｒ０ｄｕｃｔｓ）　）で染 色するか又は抗ＦＧＦ抗血清と共にインキュベートし、例３Ａの免疫ドツトアッ セイで記載されているようにして視覚化させた。結果は第３Ｂ図で報告されてい る。バイオレックス及びヘパリン−セファ０−スクロマトグラフイーにより精製 されたＨＤＧＦの同型試料をタンパク質染色しく第１列）かつ抗ＦＧＦ抗血清で 染色した（第３列）。バイオレックス７０クロマトグラフイー単独で部分的に精 製された粗ＨＤＧＦの同型試料をタンパク質染色しく第２列）かっ抗体染色した （第４列）。

例　４ 第４図は、ＨＤＧＦペプチド断片の配列とウシ及びヒ）ＦＧＦのアミノ末端配列 とを比較している。ＨＤＧＦは、例１及び２で記載されているバイオレックス７ ０、ヘパリン−セファロース及びＣ３逆相クロマトグラフイーの組合せによって 精製した。逆相クロマトグラフィー後、ＨＤＧＦ　（約２７μｇ）をスピードバ ックコンセントレータ−中で乾燥し、０．２Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液０． ５ｍｌに再懸濁し、トリプシン［クーパー・バイオメディカル（Ｃｏｏｐｅｒ　 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）］で消化し、３７℃で８時間ＴＰＣＫ処理した（酵素対 基質比１／４０　ｖｔ／ｗｔ）。消化物をスピードバックコンセントレータ−中 で乾燥し、６ＭグアニジンＨＣ１，０，１％ＴＦＡ０．２ｍｌに溶解し、ヴイダ ックＨＰＬＣ逆相フェニルカラム（セパレーションズ書グループ、０．４６×２ ５ｃｍ）に供した。トリプシン断片を流速１ｍ１／ｇｉｉｎで０．１％ＴＦＡ中 ０〜６０％アセトニトリル直線勾配液１２０ｍ１により分離した。ペプチドビー クを回収し、スピードバックコンセントレータ−中で乾燥し、０．５％ＴＦＡ１ ０．１％５ＤＳＯ，１ｍｌに溶解し、ポリブレン処理カートリッジフィルターに 供し、エム・ダブル・バンカピラーら、メソッズ・イン・エンサイモロジー、第 ９１巻、第４８６頁、１９６８年［ＭＪ、Ｈｕｎ−ｋａｐ目ｆａｒ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ、９１：４８Ｂ（１９８ｇ） ）に記載されているようにして配列分析のためにアプライド・バイオシステムス ４７０Ａセクエネーターに供した。

ＨＤＧＦの１７個のアミノ酸断片の配列は第１列に示されている。（３文字に省 略された）アミノ酸残基を囲む括弧は、残基がエドマン分解サイクルにおいて優 勢的な残基であったことを示している。含まれるアミノ酸残基のない括弧は、ア ミノ酸残基が明確に確認できないことを示している。第２列は、公表されたウシ ＦＧＦのアミノ末端配列を示している〔デー・ゴスポダロウィクツら、プロシー ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻 、第６９６３頁、１９８４年及びエシュら、プロシーディング・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８２巻、第６５０７頁、１９８５ 年〕。第３列は、公表されたヒトＦＧＦのアミノ末端配列を示している〔ビー・ ボーレンら、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（アブストラク ト）、第９ａ増刊号、第１３３頁、１９８５年〕。

以上十分に本発明を説明してきたが、当業者であればその精神又は範囲に影響を 与えることなく多くの変更及び改良が本発明に加えられうることは容易に明らか となるであろう。

ｃｐｍ　ｘ　１０−４　（−） （−一−）有り◆ｎ４ン灯」ジ％ ミ　避　ご　さ く）　６　−、　−− −　９　９　ゆ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１功昭和　６２年　１２月　８ 　日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０００７９３ ２、発明の名称 〜くドーム由来成長因子 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチ５（ツツ州、ボストン、フルーツ、ストリート、 （バー−３）（番地ない 名　称　ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 ５、　補正書の提出年月日 １９８７年９月７日 ６、　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１　通 浄仕”（″ｒ′−ビ：二亡Ｙ；なし） 補正された請求の範囲 １３、分子量１８．０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も実質上 含有しないヘパドーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）の製造方法であって、１）へパ トームから粗製へバトーム由来成長因子ＣＨＤＧＦ）を回収し； ｉｆ）　３Ｔ３細胞においてＤＮＡ合成を半最大刺激に促進させるために必要な 成長因子濃度として規定される部分精製されたＨＤＧＦ活性画分を得るために、 工程（１）力Ｓらの上記粗製ＨＤＧＦを陽イオン交換に付し； １１ｉ）ＨＤＧＦを得るために、工程（ＩＩ）からの上記部分精製されたＨＤＣ Ｆ活性画分をヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーに付し ：１ｖ）　分子量約１８，０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も 実質上含有していないＨＤＧＦを得るために、工程（１１１）からの上記ＨＤＧ Ｆを逆相高圧液体クロマトグラフィーに付すことによって均一にＨＤＧＦを精製 する；ことからなることを特徴とする方法。

１４、ＨＤＧＦが約１８，５００ドルトンの分子量を有する、請求の範囲第１３ 項記載の方法。

１５、最初の１６個のアミノ酸が： ｌｅｕ−ｐｒｏ−ａｌａ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｇｌｕａｌ）−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｘ −ｇｌｙ−ａｌａ　−ｐｈｅ−ｐ　ｒｏ−ｐ　ｒｏ−ｇ　１　ｙ（Ｘは未確認ア ミノ酸部分である） であるＮ末端アミノ酸配列を有するＨＤＧＦペプチド断片の製造方法であって、 ＨＤＧＦをトリプシンで切断し、かつ断片をＨＰＬＣフェニル逆相カラムで分離 することを特徴とする方法。

１６、ペプチド断片が、下記の配列を含むＮ末端アミノ酸延長配列： （ａｌａ／５ｅｒ）−（ｌｅｕ／ａｒｇ）−ｐｒ。

−（ａｌａ／ｇｌｙ）−（Ｉｅｕ／ｐｒｏ）−ａｌａ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−ｍｅｔ −ａｌａ−（ａｌａ）−ｇｌｙ−ｓｅｒ−（ｉｓｏｌｅｕ）−ｔｈｒ−ｔｈｒ− １ｅｕ を有する、請求の範囲第１５項記載の方法。

１７、請求の範囲第１３項もしくは第１４項記載に従い得られるＨＤＧＦ又は請 求の範囲第１５項もしくは第１６項記載に従い得られる断片を免疫原として用い ることからなる抗体の製造方法。

１８、請求の範囲第１５項又は第１６項記載に従い得られるＨＤＧＦの免疫原性 かつ免疫特異性ペプチド断片が使用される、請求の範囲第１７項記載の方法。

１９、試料中のＨＤＧＦの検出方法であって、ＨＤＧＦを含有していると推測さ れる上記試料を上記ＨＤＣＦに対する抗体と接触させ、かつ免疫診断アッセイ法 を用いて抗原−抗体複合体の形成を測定することによりＨＤＧＦを検出すること からなる方法。

手続補正書（方式） 昭和６３年１０月フ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分子量約１８，０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も実質上 含有していないヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）であって、 上記ＨＤＧＦが約１８，５００ドルトンの分子量を有することを特徴とするヘパ トーム由来成長因子。 ２．最初の１６個のアミノ酸が： 【配列があります】 （上記式中、Ｘは未確認アミノ酸部分である）であるＮ末端アミノ酸配列を有す るヘパトーム由来成長因子ペプチド断片。 ３．分子量約１８，０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も実質上 含有していないヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）であって、 上記ＨＤＧＦが： ｉ）ヘパトームから粗製ヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）を回収し； ｉｉ）３Ｔ３細胞においてＤＮＡ合成を半最大刺激に促進させるために必要な成 長因子濃度として規定される部分精製されたＨＤＧＦ活性面分を得るために、工 程（ｉ）からの上記粗製ＨＤＧＦを陽イオン交換に付し； ｉｉｉ）ＨＤＧＦを得るために、工程（ｉｉ）からの上記部分精製されたＨＤＧ Ｆ活性面分をヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーに付し ；及び ｉｖ）分子量約１８，０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も実質 上含有していないＨＤＧＦを得るために、工程（ｉｉｉ）からの上記ＨＤＧＦを 逆相高圧液体クロマトグラフィーに付すことによって均一にＨＤＧＦを精製する ；ことからなるプロセスによって得ることができることを特徴とするヘパトーム 由来成長因子。 ４．請求の範囲第１項記載のヘパトーム由来成長因子を含んでなる免疫原を用い ることにより誘導される抗体。 ５．請求の範囲第１項記載のヘパトーム由来成長因子の免疫原性かつ免疫特異性 ペプチド断片を用いることにより誘導される抗体。 ６．請求の範囲第２項記載のペプチド断片を含んでなる免疫原を用いることによ り誘導さる抗体。 ７．標識された形の請求の範囲第４項、第５項又は第６項に記載の抗体。 ８．中性担体及び請求の範囲第１項記載のヘパトーム由来成長因子を含んでなる 医薬組成物。 ９．中性担体及び請求の範囲第２項記載のヘパトーム由来成長因子ペプチド断片 を含んでなる医薬組成物。 １０．下記式を有するペプチド： １）Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｒ１ 〔上記式中、Ｒ１はＣｙｓ−ＣＯ−Ｒ２、ＯＨ、ＯＭ又は−ＮＲ３Ｒ４である； Ｍは薬学上許容される陽イオン又は低級（Ｃ１−Ｃ６）分岐状もしくは非分岐状 アルキル基である；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一でも異なっていてもよく、水素及 び低級（Ｃ１−Ｃ６）分岐状もしくは非分岐状アルキル基からなる群より選択さ れる；及びＸは請求の範囲第１項記載のヘパトーム由来成長因子の免疫原性かつ 免疫特異性のペプチド断片又は請求の範囲第２項記載のペプチド断片である〕； ２）その酸付加塩；及び ３）その保護又は部分的保護誘導体。 １１．試料中のヘパトーム由来成長因子の検出方法であって、 ヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）を含有していると推測される上記試料を上 記ＨＤＧＦに対する抗体と接触させ、かつ免疫診断アッセイ法を用いて抗原−抗 体複合体の形成を測定することによりＨＤＧＦを検出することからなる方法。 １２．下記の配列を含むＮ末端アミノ酸延長配列：【配列があります】 を有するヘパトーム由来成長因子ペプチド断片。 １３．分子量１８，０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も実質上 含有しないヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）の製造方法であって、ｉ）ヘパ トームから粗製ヘパトーム由来成長因子（ＨＤＧＦ）を回収し； ｉｉ）３Ｔ３細胞においてＤＮＡ合成を半最大刺激に促進させるために必要な成 長因子濃度として規定される部分精製されたＨＤＧＦ活性面分を得るために、工 程（ｉ）からの上記粗製ＨＤＧＦを陽イオン交換に付し； ｉｉｉ）ＨＤＧＦを得るために、工程（ｉｉ）からの上記部分精製されたＨＤＧ Ｆ活性画分をヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーに付し ；及び ｉｖ）分子量約１８，０００ドルトン未満のいかなるタンパク質性不純物も実質 上含有していないＨＤＧＦを得るために、工程（ｉｉｉ）からの上記ＨＤＧＦを 逆相高圧液体クロマトグラフィーに付すことによって均一にＨＤＧＦを精製する ；ことからなることを特徴とする方法。 １５．ＨＤＧＦが約１８，５００ドルトンの分子量を有する、請求の範囲第１４ 項記載の方法。 １６．最初の１６個のアミノ酸が： 【配列があります】 （Ｘは未確認アミノ酸部分である） であるＮ末端アミノ酸配列を有するＨＤＧＦペプチド断片の製造方法であって、 ＨＤＧＦをトリプシンで切断し、かつ断片をＨＰＬＣフェニル逆相カラムで分離 することを特徴とする方法。 １７．ペプチド断片が、下記の配列を含むＮ末端アミノ酸延長配列： 【配列があります】 を有する、請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．請求の範囲第１３項もしくは第１４項記載に従い得られるＨＤＧＦ又は請 求の範囲第１６項もしくは第１７項記載に従い得られる断片を免疫原として用い ることからなる抗体の製造方法。 １９．請求の範囲第１６項又は第１７項記載に従い得られるＨＤＧＦの免疫原性 かつ免疫特異性ペプチド断片が使用される、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．試料中のＨＤＧＦの検出方法であって、ＨＤＧＦを含有していると推測さ れる上記試料を上記ＨＤＧＦに対する抗体と接触させ、かつ免疫診断アッセイ法 を用いて抗原−抗体複合体の形成を測定することによりＨＤＧＦを検出すること からなる方法。