JPH01500514A - ８因子フラグメントの凝固活性複合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■因子フラグメントの凝固活性複合物の製造方法端フラグメントの凝固活性複合 物の製造方法に関する。

■因子は血液中に天然に存在するタンパク質である。

それは、ＦＸから活性化Ｆ　Ｘ　（ＦＸａ）への転化に補因子として関与する。

■因子の存在により、　ＦＸａの生成速度は約２００．０００倍に増大される（ シエイジェンら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１５６．　ｐ、３４３３．１９８１）、■因子か欠乏 すると（血友病Ａ）、出血が止らなくなる。

凝固カスケードにおける■因子の役割は以下のように表わすことがてきる。

■因子はトロンビン又はＦＸａにより活性化され、トロンビン、　ＦＸａ又はプ ロティンＣにより不活性化される。

血友病Ａ患者は■製剤を予防的に又は出血の際に緊急的に投与される。

■因子はヒト血漿から回収され、タンパク質の約ｌｐｐ■が■因子である。この 方法では■因子を僅がしか製造することかできない、従って、培養細胞内て■因 子を生合成的に製造することか望ましい。これには３つの研究者グループか成功 している（ウッドら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２゜ｐ、　３３０．１９８４；　トゥ ールら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２．　ｐ、　３４２゜１９８４　；ツルエトら、Ｄ ＮＡ　４．　ｐ、　３３３．１．９８５）。

培養細胞中ては外来タンパク質２■ｇ／ｍｌを製造することかてきる。ｖｌＩ因 子については、これは２０，０００単位／１１に相当する。この濃度は■因子に ついて文献に記載されているものをはるかに超えるものである。その理由の１つ は■因子か分子量約３３０　ｋｄ　（ベーハーら、Ｎａｔｕｒｅ３１２、１９８ ４）の極めて大きなタンパク質であるということである。

血漿又は細胞培養物から精製された■因子は、分子量約８０　Ｍの■因子軽鎖又 はｖＩＩ−ＬＣと呼ばれるフラグメントと１分子量約９２ないし２１０　ｋｄの １重鎖又は■−１（Ｃと呼ばれるフラグメントとを有する。これらのフラグメン トは３：１０　ｋｃｌのタンパク質からタンパク質分解により生成され、８０ｋ ｄの■−ＬＣはＣ末端断片てあり、■−〇〇はその大きさが分解の程度に依存す るＮ末端フラグメントである。

このように、凝固活性■因子は８０　ｋｄのフラグメン）・と９２　ｋ（１以上 のフラグメントとを有することか知られている（フルチャー及びシマーマン、Ｓ ｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ■、スクリップス・クリニック、１９８２）。

もしこれらのフラグメントを生体外て結合して凝固活性■因子にてきるならば、 ■因子をより小さなフラグメントから製造することは有利である。これらのフラ グメントは、■因子そのものよりも大きさか小さいのて。

大量に生合成することかより容易である。さらに、フラグメントは複合物の形成 により電荷及び分子量か変化するのて、後て細胞培養物から精製する場合に有利 である。フラグメントだけでなく複合物も精製することができるのて、より純粋 な最終生産物を得ることがてきる。

実験により、フラグメントを単に結合したのては凝固活性産物か得られないこと が示された０文献にも■因子のフラグメントを凝固活性複合物に転化する方法及 び条件は記載されていない。

この発明は、凝固不活性１重鎖（Ｖｌ！−ＨＣ、Ｎ末端フラグメント）を複合促 進剤の存在下て凝固不活性■軽鎖（ｖｉ−ｔｃ　、　ｃ末端フラグメント）と反 応させる５とにより凝固活性複合物が生成されるという知見に基〈、これは非常 に驚くべきことである。なぜなら、文献は（チンマーク特許出願５３８７／８５ 参照）、結合により活性を創製することか理論上及び実際上非常に重要なことで あるにもかかわらず、試みられた活性創製結合について何も報告していないから である。

プルケら（アブストラクト１４　Ｌ　１１１　’″Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ｎｃｌ ｉｎｉｃ　ａｎｄ　］ａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ　１６．１９８Ｅｉ）は、■−ＬＣ 及び■−ＨＣの両方のＤＮＡでトランスフエフ）へされた細胞から生体内て凝固 活性■因子を製造することに成功した。

しかしながら１種々の条件か試されたか、■−ＬＣ及び■−）ＩＣをそれぞれ含 む培養上清を混合することによっては凝固活性を得ることがてきなかった。

■−ＬＣはヒト血漿から精製することかてき、凝固活性を有さない（Ｗｏ　８６ １０２８３８参照）、■−ＨＣフラグメントもまた。血漿から精製することかて きる（ツルエら、ＤＮＡ　４．　ｐ、　３３３．１９８５）。このフラグメント もまた凝固活性を有さない。

この発明では、１又は２以上の２価の金属イオンか複合促進剤として好ましく用 いられる。この型の適当な剤の例としてＭｎ”、Ｃａ　２　＊及びＧｏ２°を挙 げることがてきる。他の適当な複合促進剤はＦＩＸａ及びＦＸ並びにＲ−Ｓ　Ｈ 及び／又はＲ−Ｓ−５−Ｒに結合性を有する物質である。所望ならば、これらの 剤の混合物を用いることもてきる。

皮製 ■−ＬＣすなわち■軽鎖は、■因子の全長のＣ末端領域からのフラグメントであ る。このフラグメントの分子量は通常的８０　ｋｄであるか、７０　ｋｄ以下で あることもある。　８０　ｋｄの分子量を有するフラグメントは■−ＬＣ抗原に 対する文献記載の分析において免疫反応性を有するが、■−ＨＣ抗原に対する分 析においては免疫反応性を有さない。

■−ＨＣすなわちｖＩ［重鎖は■全長のＮ末端領域からのフラグメントである。

このフラグメントの分子量は通常９２　ｋｄであるか、それ以下又はそれ以上２ １０　ｋｄ以下であることもある。血漿から精製された■−ＨＣは９２ないし２ １０　ｋｄのフラグメントの混合物から成る。　９２　ｋｄ以上の分子量を有す るフラグメントは文献に記載された■−）ＩＣ抗原に対する分析において免疫反 応性を有するか、■−ＬＣ抗原に対する分析においては免疫反応性を有さない。

凝固活性■因子は、凝固試験において血友病Ａ血漿述）においてＦＸａの形成を 促進することがてき、従って色原体の転化を行なうことかてきる。凝固活性はＶ ＩＥ：Ｃとして記載される。

プロトロンビン複合物はγカルボキシグルタミン酎を含む凝固因子、すなわちＦ 　ＩＩ、Ｆ■、ＦＩＸ及びＦＸプロティンＣ又はこれらの凝固因子の活性型であ る（ディビーら、Ａｃ１ｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　４８　ｐ 、　２７７、１９７９）　。

この試験では、Ｆ■：ＣはＦＩＸａ、　ＦＸ、Ｃａ”及びリン脂質（ＰＬ）から 成る系中て測定する（ローゼンら、丁ｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｉｏｓｔａｓ　５４　 ｐ、８１８．　１９８５）　、　ＦＸａ　はＦ■：Ｃに依存する量たけ形成され る。試験は以下に示すようにして行なわれる。

１．５０ｇ１の試料を５０μｌの活性化試薬（Ｆ］Ｘａ／ＦＸとＰＬとの混合物 ）と混合する。インキュベーション時間ｌＯ分、２２℃。

２．２５ｇ１の２５　ｍＭ　ＣａＣＩｔを加え、混合物を２２℃て２０分間イン キュベーションする。

３．５０．１のＦＸａについての色原体（８２２２２）を加える。

４．１５分インキュベーション後、クエン酸を加え、試料のＥ、。、を読む。

了 コープスト試験においてはＦＶｍの酵素的活性化を行なうことばてきない。なぜ なら、この試験において■はＦＩＸａ／ＦＸ、　ＰＬ及びＣａ　２　＋″とのイ ンキュベーションにより完全に活性化されるからである。

Ｆ■−ＬＣの免疫学的定量 Ｆ■−ＬＣ抗原（Ａｇ）は特異的免疫分析（ノートファンら、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈ ａｅｍｏｓｔａｓ　５３．　ｐ、　：１４６．１９８５）により測定される。ヒ ト阻害剤抗体をマイクロプレートにコートし。

試料を加え、結合した■−ＬＣをヒト阻害剤１ｇＧのパーオキシダーゼてラベル したＦ（ａｂ“）２て検出する。正常ヒト血漿は対照として用いる。

Ｆ■−ＨＣの免疫学的定量 Ｆ■−ＨＣ抗原（Ａｇ）は特異的阻害分析により測定する。イヌの阻害剤抗体を 、解放された（ｌｏｏｓｅ）ウェルを有するマイクロプレー１−にコートする。

試料及び１２５Ｊ−Ｆ■〜ＨＣを加える。試料中のＦＶｆｆｌ−ＨＣは結合され る＋２５１−Ｆ■−ＨＣの量を決定する。対照は１単位のＦ■：Ｃ当たりに１単 位のＦ■−ＨＣを含むように設定されたＦ■濃厚Ｔｈ（Ｆ■ノルディスク）であ る。

免疫分析により測定されたＦ■−ＬＣ及びＦ■−ＨＣの量は相対的に記載される 。すなわち、種々の型のＦ■についてのユニッ）−Ｆ■：Ｃ、ユニットＦ■−Ｌ ＣＡｇ　、ユニットＦ■−＋Ｉ　ＣＡ　ｇは１　：　］、　：　１てはない。し かしながら１種々の分析のユニットは類似するものと推定される。しかし、コー プスト試験において全てのタンパク質が凝固活性であるＦ■試料についての■： Ｃユニット、　ＦＶＩ−ＬＣＡｇユニッｌ〜及びＦ■−ＨＣＡｇユニットの間に は何らかの相違点かあるのかもしれない。

外迂ｊしλ延亙 分子量は還元５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する（ラエムリ、Ｎａｔ、ｕｒｅ　２ ２７　ｐ、　６８０．１９７０）。

■因子の製造 対照試験のための■試料はヤギ抗フォン・ウィレブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅ ｂｒａｎｄ）因子セファロース（ツルエら、ＤＮＡ　４　ｐ、　３３３．１！１ ８５）上てのアフィニティクロマトグラフィーによりＦ■儂厚物（Ｗｏ　８４１ ０３６２８参照）から製造Ｆ■−ＬＣは数種類の方法（例えばＷｏ　８６１０２ ８３８）により血漿から精製することかてきる。ごこては、オー・ノートファン クら、Ｔｈｒｏｎｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　Ｖｏｗ。

５４、　ｐ、　５８Ｂ−５９０，１９８５によりに記載された方法により製造さ れた、ノルディオクト（ｎｏｒｄｉｏｃｔｏ）のモノクローナル４７　ＩｇＧ上 てのアフィニティクロマトグラフィーによって単離された、高度に’ａ１ｉｌｉ されたＦ■−ＬＣを用いる。　２００　ｍｌの緩衝液Ａ　（［１，０２Ｍイミダ ゾール、０．１５　ＭＮａＣＩ、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，４）中ニＶ ｆｌｌ−ＬＣＡｇ濃度１１０単ファロース（’］　Ｂ／ｍｌのＩｇＧと結合）と 共にインキュベートした。インキュベーション混合物をカラム上に注ぎ、溶離物 を回収した。ゲルを４０１の緩衝液Ａ及び０．６５　Ｍ　ＮａＣｌを自む緩衝液 Ａて洗った。ＦＶｆｆｌ−１，ｃは４０ｍ１の２０　ｍＭイミダゾール１０．５ ５　Ｍ　ＮａＣｌ／１０　ｍＭＥＤＴＡ１５０１ｊ−チｌｚ　ンク”）　ニア　 −ル／ｌ）８７．４で溶離シ’／’＝、４ｍｌのピーク画分を５０　ｍＭイミダ ゾールバ、１５　Ｍ　ＮａＣｌ／１０％グリセロール１０．０２χＮａＮ：＋／ ｐｌ＋７．４に対して透析した。透析した試料中のＦ■酸成分第１表に示しであ る。

Ｆ■−ＨＣ（試料Ｂ）の調製 Ｆ■−ＨＣは、モノクローナル５６１ｇＧセファロース（オー◆ノートファンら 、Ｔｂｒｏｌｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅ＋ｍｏｓｔａｓｉｓ。

Ｖｏｌ、　５４．　り、　５８６−５９０．１９８５　に記載された方法により 製造）上てアフィニティクロマトクラフィーによりＦｖＩＩＩ試料から製造した 。５６１．、Ｇセファロースは、ＦＶＩｉ−ＬＣを介してＦ■−ＬＣ／Ｆ■−Ｈ Ｃ複合物を結合した。４０５Ｆ■−ｔｌｃＡｇ　弔イＱ／ｍｌを有する２５ｍ１ のＦＶｌｉｌ試料を１．５１の５６１８Ｇセフアロース（４ｔａｇの５６１ｇＧ 　／　ｍｌと結合）と共に一夜インキユベートした。インキュベーション混合物 をカラムに注ぎ、溶ｇｌ物を回収した。ゲルを。

０．３５　Ｍ　ＣａＣＬを含む５１の緩衝液Ｂ（２０ｍＭイミダゾール１０．１ ５　Ｍ　ＮａＣ１／１０　＄　グリセロール１０．１　Ｍリシン／ｐＨ７，４） て洗った。次いてゲルを総ＮａＣＩ含量０．６５　Ｍの１５１の緩衝液Ｂて洗い 、さらにｌ　ＯｍＭＥＤＴＡ及ヒ０．０２　＄ＮａＮ３を含む緩衝液Ｂ（ＥＤＴ Ａ緩衝液）て洗った。ゲルを脱水し、室温下て５１のＥＤＴＡ緩衝液と共に１時 間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆ■−Ｈｃを５ｍｌのＥＤＴＡ 緩衝液て溶離した。２１のピーク画分を５ｈＭイミダゾール１０．１５１１ＩＮ ａＣ］／］−０Ｘ　グリセロール１０．０２＄　ＮａＮｆｆ／ｐＨ７，４に対し て透析した。透析試料中のＦＶＩＨ１＆分の含量は第１表に示されている。

第１表 透析されたＦ■−１，Ｃ試料及びＦ■−ＨＣ試料中のＦ■Ｆ■−ＬＣ（試料Ａ） 　＜０．０１　７７０　１．８ＦＶＩＷ−）１ｃ（試料Ｂ）　＜０．［ｌ］　０ ．１　２０００試料Ａ及びＢは５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。添付の図面参 照のこと。図面において、レーン１は試ネ１Ａ（Ｆ■−ＬＣ）、４Ｆ■−ＬＣＡ ｇ単位に対応し、レーン２は分子量マーカーを含み、レーン３は試料Ｂ（Ｆ■− ＨＣ）、８Ｆ■−ＨＣＡｇ単位に対応する。

以下、この発明の方法をいくつかの実施例により例示する。

例１ 試料Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｃ（５０ｍＭ　イミダゾール、０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃｌ、０．１咎％ＢＳＡ。

ｐＨ７，４）で１０＠に希釈した。２０μ２のＡ（１′１０に希釈）を２０ｕＱ のＢ　１：１ｏ、、３μｃの０．１５Ｍ　ＭｎＣ１ｚ、及び４０ｕＱのＭ防液Ｃ ど混合した。２２℃で４８時間のインキュベーション後。

インキュベーション混合物はコアテストで測定して１２００ｍ単位のＶｌｌｌ： Ｃ／−を含んでいた。

次の実験を比較のために行った。

友凰Ａ この実験は例に記載したように繰返したが、３μ２の０．１５Ｍ　ＭｎＣｌ２の 代りに３μ２の緩衝液Ｃを加える変更をした。２２℃で４８時間のインキュベー ション後、このインキュベーション混合物はコアテストで測定して５ｍ単位未満 のＶｌｌｌ：Ｃ／−を含試料Ａを緩衝液Ｃで４０侶に希釈した。８０μａのＡ（ １：４０に希釈）を３μｇの０．１５ＭＭ　ｎ　ＣＩ　２と混合した。４８時間 のインキュベージ」ン後、インキュベーション混合物は５単位未満のＶｌｌｌ： Ｃ／−を含んでいた。同碌に試料Ｂどのインキュベーション混合物は５ｍ単位未 満のＶｌｌｌＣ／ｄを含んでいた。

友里工 緩訂液Ｃで１０００倍に希釈した８０μ２のＦＶＩＩＩ試料を３μ℃の０．１５ Ｍ　ＭｎＣｌ２と混合した。４８時間インキュベーションの後、１７０ｍ単位の Ｖｌｌｌ：Ｃ／−を測定した。緩衝液Ｃで１０００１に希釈したＢＯｕＱ（１） ＦＶＩ　Ｉ　＋試料を３μ２の緩衝液Ｃと混合した。４８時間インキュベーショ ンの後、１４０ｍ単位のＦＶＩ　Ｉ　Ｉ　：Ｃ／ｍ＠測定し　１こ　。

例２ 試料Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｃで１０＠に希釈し１２０μ１７）Ａ　１　：　 １０ヲ２０ｃｌ（７）Ｂ　（１／１０に希釈＞、３ｕＱの２．２Ｍ　ＣａＣｌ２ 及び４０μ２の緩衝液Ｃと混合した。２２℃で１２日間のインキュベーションの 後、インキュベーション混合物は１３００ｍ単位のＶ　［Ｉ　Ｉ　：　Ｃ／ｄを 含んテイタ。

次の実験は比較のために行った。

この試験は上記の方法を繰返したが、３μ２の緩衝液を２．２Ｍ　ＣａＣｌ２の 代りに加えた。２２℃で１２日間のインキュベーションの後、インキュベーショ ン混合物は５ｍ中位未満のＶ　Ｔ　Ｉ　Ｉ　：　Ｃ／ｄを含ん試料Ａ及びＢをそ れぞれ緩衝液Ｃで１００＠に希釈した。１００μａのＡ及び１００μａのＢを混 合した。

５０μβの混合物を上記のようにコアテストで試験した。１．５ｍ単位／−が混 合物中に測定された。５０μβの混合物をＰＬの添加前Ｆ　ＩＸａ／ＦＸで１時 間ブレインキュベーションの変形コアテストでさらに試験した。これによって、 コアテスト活性は３．０ｍ単位／ｄに上昇した。

次の実験を比較のために行った。

ＦＶＩＩＩ試料を緩衝液Ｃで３０，０００倍に希釈した。５０μ党の希釈試料を 上記のようにコアテストで試験した。３．４ｍ単位／ｄが測定された。

５０μ２の希釈ＦＶＩＩＩ試料をＰＬの添加前ｔｌＸａ／ＦＸで１時間ブレイン キュベーションの変形コアテストでさらに試験した。希釈ＦＶＩＩＩ試料につい て３．８ｍ単位／ｄが測定され１〔。

［ 例１に記載したように実験を行った場合、２４時間インキュベーション後１００ ０ｍ単位のＶｌｌｉ：Ｃ／ｄが測定された。４０ｕＱのＦＩＸａ／ＦＸを／１． ０μ℃の緩衝液Ｃの代りに添加した場合、１６０Ｑｍ単位／−が２４時間インキ ュベーションの後に測定された。

次の実験を比較のために行った。

実験は例１．第１比較実験に記載したように行った。

２４時間インキュベーション後、５ｍ単位未満／ｄがインキュベーション混合物 で測定された。

比較のために他の実験を次のように行った。

緩衝液Ｃで５００倍に希釈した４０μ２のＦＶＩＩＩ試料を４０μｇのＦＩＸａ ／ＦＸ及び３μ２の０．１５Ｍ　Ｍｎ２”と混合した。２ＪＦＴｆ間インキュベ ーション後、１２０ｍ単位／ｄが測定された。

４０ｕ／ｌのＦＩＸａ／ＦＸを４０ＡｔＲの緩衝液Ｃで置換えると、１７０ｍ単 位／−が測定された。さらに３μＸの０．１５Ｍ　Ｍｒ１２　’″を３μ２のＭ 耐液Ｃで置換えると、１４０ｍ単位／ｒｄが測定された。

皿上 試１．Ａ及びＢをそれぞれＭ耐液Ｃで２０倍に希釈した。２０μ℃のＡ　１／２ ０を２０μ２の８　１／２０．４０Ｊｉｌｌ）Ｆ　ＩＸａ／ＦＸ及び３μｆｆ１ （１）０．１５　Ｍ　Ｃａ　ＣＩ　２と混合した。２２℃で４時間のインキュベ ーションの後インキュベーション混合物は１９９ｍＵのＦＶＩＩＩ：Ｃ／−を含 んでいた。混合物のＦＩＸａ／ＦＸを４０μ２の緩衝液Ｃで置換すると。

４３ｍＵのＦＶＩＩＩ：Ｃ／Ｉ！Ｉｉ！が４時間インキュベーションの後に測定 された。

鯉及 それぞれ８００単位のＦＶＴ　Ｉ　ｌ−１−Ｃ：Ａ（Ｊ／ｍｅ及び８５０単位の ＦＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＨＣ：　Ａｑ／ｄを含むＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣ及びＦＶＩＩ Ｉ−ＨＣ試料を３倍に希釈した。２Ｃ１ｆｆｉのＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣ１／３を ２０μ℃のＦＶＩ　Ｉ　ｌ−ＨＣ１／３および１０μλのＭｅ”と混合した。混 合物ＡでＭ　ｅ　２４−は２５ｍＭｎ２＋であった。混合物ＢではＭｅ”は２５ ０ｍＭＣａ　２４−であり、混合ｓ＃ＣではＭｅ”は２５ｍＭＭｎ２”及び２５ ０ｍＭ　Ｃａ２　”であった、２４時間インキュベーション後、混合物Ａは１０ ．３単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｄを含み、混合物Ｂは４．０単位。

混合物Ｃは１２．９単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｄを含んでいた。１４４時間インキ コベーション後、混合物Ａ。

Ｂ及びＣはそれぞれ６．６単位、６．５単位及び１１゜９単位のＦＶＩＩＩ：Ｃ ／ｄを含んでいた。

例７ ＣＯ５細胞は８０ｋＤ鎖を発現するプラスミドｐＳＶＦ８−８０で移入された。

テンマーク特許出願０４２８／８７参照、８７０単位のＦＶＩＩＩ−ＬＣ：Ａｇ ／−を含む培養からの上澄みをブラスマ稍製ＦＶＩＩＩ−ＨＣで補充し最終濃度 ２０ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＨＣ：　Ａｇ単位／−及びＭｎ”をＲ終濃度５ｍＭとした 。２２℃で２４時間インキュベーション後、混合物は１３７単位のＦＶＩＩＩ： Ｃ／−を含む、１０００ｍ単位のＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣ：Ａｇ／ｄｌ激度でブラ スマ精製ＦＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　−ＬＣヲＦＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＨＣ及（、（Ｍｎ２” で同様に補充すると、インキュベーション混合物は３３ｍ単位のＦＶＩｉｌＣ／ ｄを２４時間インキュベーション後に含んでいた。培養上澄みをＦＶＩ　Ｉ　Ｉ −ＨＣなしでＭｎ２”のみで補充すると混合物は２４時間インキュベーション後 ２．５ｍ単位未満のＦ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　：　Ｃ／ｄを含んでいた。

性溢 ２５μｎ□）ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣを２５．ｃｌのＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＨＣ，７μ ｇのＭｎＣ１２及びｉ　０μｒのレドックス剤とｕｊ液液Ｃ中混合して表２に示 ′ＴＪ個々の成分の最終濃度を冑た。ＦＶＩＩＩ：Ｃは２０’Ｃで５時間インキ ュベーション後に測定した。

レドックス剤の存在下のＦｉｌｌ−ＬＣ及びＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＨＣの組換えＦＶ ＩＩＩ　ＦＶＩＩＬ　ｍＭ　しＦｙクス５１Ｌ１１ＦＪＩＱ−ＬＣ：ＡＧ　−Ｈ Ｃ：Ａｇ　剤　ＦＶＩ　１−１−Ｃ：ＡＧ　。

単位／ｄ　単位ｉ＊　ＭｎＣｌ２　に対する％ＦｖＩ　Ｉ： １１　１１　５　無　４．９ １１　１１　５　１５ＭＭ　ＤＴＴ　１６．８１１　１１　５　１５０μＭＭＥ 　１８．８１１　１１　５　３０μＭＣｙｓ１７．４１１　１１２　５　１５Ｍ ＭＣｙｓ６Ｂ、８１１　１１　０　１１！Ｉ　＜０．５ ＤＤＴ　（ジチオトレイトール）、ＭＥ（メルカプトエタノール）及びＣｙｓ　 （システィン）の上記１１１Ｎで、水性ＭＩｌｉ液中で酸化及び還元形態の間に 平衡が存ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＨＣを上記のようにし、かつＥＤＴＡ溶出Ｎ衝液及び 透析緩衝液を５０μｍのメルカプトエタノールと混合する変形をして製造した。

希釈後ＦＶｌｌｌ−ＨＣ試料との組換えが、メルカプト　エタノールを３５μＭ に、ＭｎＣｌ２を５ｍＭに。

ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣを２２ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣ：Ａｃｘ単位／−に添加して 室温で緩衝液Ｃ中で２０時間インキュベーションで行われた。

表３ 紺換え混合物中 ＦＶＩＩＩ−ＨＣ：Ａｇ　２０ｏ、１間接ＦＶＩＩＩ　−ＨＣ１！（Ｑ／ａｔ　 ＦＶＩＩＩ−ＨＣ：ＡＱにｔ　Ｖる％ＦＶＩ　Ｉ　１−ＨＣ 上記で製造した 例１　２．５９　３１ 上記で製造した 例２　３．３１　２７ この例で述べた ＭＥで製造した 例３　３．００　８９ え１没 次の組成のインキュベーション混合物を分離ＦＶＩＩＩフラグメントから緩衝液 Ｃ中で製造した。

６０単位／ｄのＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ＬＣ，６０単位／−のＦＶＩ　１１−ＨＧ、５ ０ｍＭのＱａＣ１２，２単位／−のＦＸ。

室温で２０時間インキュベーション後、６．９ＦＶＩＩＩ：Ｃ単位／−を測定し た。ＦＸを含まない対応インキコベーション混合物中、２０℃２０時間イ’、ｚ ｌｒ＝ｔベージ−ａンａｏ、５９ＦＶＩＩＩ：Ｃ単位／艷を測定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　２のフラグメントをコンプレックス促進剤の存在下で互いに反応させること を特徴とする，分子量９２〜２１０ｋＤの因子ＶＩＩＩのＮ末端フラグメント及 び分子量８０〜７０ｋＤの因子ＶＩＩｌのＣ末端フラグメントの凝固活性コンプ レックスの製造方法。 ２　該Ｎ末端フラグメントが分子量約９２ｋＤの重鎖であり，該Ｃ末端フラグメ ントが分子量約８０ｋＤの軽鎖である請求項１記載の方法。 ３１　のフラグメント又は両フラグメントが誘導される請求項１又は２記載の方 法。 ４　該誘導が他のアミノ酸，好ましくはセリンによる１以上のｃｙｓアミノ酸の 置換を包含する請求項３記載の方法。 ５　ＦＶＩＩＩ重鎖及び／又はＦＶＩＩＩ軽鎖を−ＳＨ及び／又は−Ｓ−Ｓ−基 を含む化合物に対する反応性を有する物質で処理する請求項３記載の方法。 ６　１のフラグメント又は両フラグメントをバイオ合成的に製造する請求項１〜 ５に記載の方法。 ７　コンプレックス促進剤が１以上の２価金属イオンである請求項１〜６に記載 の方法。 ８　該コンプレックス促進剤がＭｎ２＋，Ｃａ２＋又はＣｏ２＋である請求項７ 記載の方法。 ９　該コンプレックス促進剤がプロトロンビンコンプレックスの成分である請求 項１〜６のいずれかに記載の方法。 １０　該コンプレックス促進剤がＦＩＸ，ＦＩＸａ，ＦＸ，ＦＸａ又はこれらの 成分の２以上の混合物である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 １１　該コンプレックス促進剤がフォンウイレブランド因子である請求項１〜６ のいずれかに記載の方法。 １２　該コンプレックス促進剤が２価金属イオン及びプ口トロンビンコンプレッ クスの成分，好ましくはＦＸである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 １３　該コンプレックス促進剤が−ＳＨ及び／又は−Ｓ−Ｓ−基を含む成分に対 する反応性を有する物質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 １４　該コンプレックス促進剤が２価金属イオン及び−ＳＨ及び／又は−Ｓ−Ｓ −基を含む化合物に対する反応性を有する物質の混合物である請求項１〜６のい ずれかに記載の方法。 １５　該コンプレックス促進剤が，グルタールアルデヒド，ヒドラジン，ビスエ ボオキシラン，エビクロロヒドリン，ジビニルスルフォン，ベンゾキノン，カル ボニルジイミダゾール又はカルボジイミドのような蛋白縮合剤である請求項１３ 記載の方法。