JPH01500720A - Ｙ‐染色体特異的ポリヌクレオチドを用いた反芻動物の性別判定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｙ−染色体特異的ポリヌクレオチド を用いた反契動物の性別判定 本発明は性別判定、特に、Ｙ−染色体特異的ポリヌクレオチドを用いた反契動物 の性別判定に関する。

（本明細書に引用した文献は、本明細書の終りにまとめて示しである。） 胎児または胚の性別判定は、益々重要となりつつぁり、特に、胎児移植などの生 殖生物学分野で重要となりつつある。乳牛及び食肉業の分野だけでも、１９８５ 年には凡そｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ例の胎児移植が報告されている。

胎児を母体に移植する前に簡単にその性別を判定できれば、乳牛業において雌の 子孫を多（することが可能とな９極めて有利である。また、胎児の性別が判定で きれば、乳牛業者は、乳を多く出すことができるあるいは子供を多く産むことが できるなどの望ましい特質を持った胎児から、乳牛業のストックのため子孫を選 択することが可能となる。同様に、ヒツジやヤギの場合でも性別の判定ができれ ば、業者は望ましい特質を持った子孫を選択することが可能となる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの胎児または胚の性別判定もまた重要である。胎児移植では なく人工授精または自然受胎の通常の妊娠の場合に、もし胎児または胚の早期の 性別判定が可能となれば、胎児または胚が望む性別を有していない時には妊娠を 止めることができるようになる。

哺乳動物の性別は、全Ｙ−染色体もしくはその機能的部分の存在あるいは不存在 によって根本的に決定される。Ｙ−染色体上に存在する遺伝子が、皇丸の形成及 び雄としての特徴形成の原因となる。従って、個々の哺乳動物の性別は、ある特 定のＤＮＡ配列をそのｒツムが含んでいるか否か、具体的には本丸形成の原因と なる遺伝子をコードするＹ−染色体の部分を有する配列を含んでいるか否かに依 っている。

従って、個々の哺乳動物の性別は、ＤＮＡ中のＹ−染色体特異的遺伝子を分析す ることによって判定できる。

あるいは、性別は、関係はないが遺伝子的には関連した配列、具体的にはＹ−染 色体と関連した配列を分析することによっても判定できる。しばしば起る遺伝子 組換えによって生じる判定の誤りを最小限に減らすためには、本丸決定遺伝子に 密接に関連したＤＮＡ配列について分析を行なうのが最も望ましい。

男性ＤＮＡと優先的にあるいは独占的にハイブリダイズするＤＮＡ配列が、多く の研究者によって同定されている（文献１及び２）。しかしながらこれらのＤＮ Ａ配列は、その機能についての特性は明らかにされていない。更には、これらの ＤＮＡ配列が、人以外の他の種のＤＮＡ配列とハイブリダイズするか否かについ ては知られていない。

オ〜ストラリア判許出願扁５９５６１／８６には、雄性ｊ囲Ａと優先的にハイブ リダイズする牛ＤＮＡプローブが記載されている。このＤＮＡは、胎児及び胚の 性別を判定するためのハイブリダイゼーショングローブとし、て有用であると言 われている。

オーストラリア特許出願、％５９５６１　／８６に記載されたＤＮＡ配列の１つ の欠点は、種物異的、部ち生竹異的であって、ヒツジやヤギなどの他の反部動物 のＤＮＡとはハイブリダイズしないという点にある。従ってこのＤＮＡ配列の種 特異性のムニめに、反部動物の胎児または胚の性別判定用試薬としての用途が制 限されている。

本発明は、はとんどの反部動物において保持されており、これまでの研究で全て の反も動物において見られたＹ−染色体特異的ＤＮＡ配列の発見に基づいている 。

このＤＮＡ配列は、程度の差はあるものの繰返し現われており、血縁関係のない 個々の間ではその繰返し数は相違しているが、安定に子孫に継承されている。

本発明の１つの局面によれば、牛、ヒツジ、ヤギ及び他の反部動物のＹ−染色体 特異的ＤＮＡ配列にのみノ）イブリダイズすることのできる核酸率＝ｍが提供さ れる。

この核酸単離物は、牛のＹ−染色体上に見出されるＤＮＡ配列の全てま１こはそ の１部に対応するものでおり、以後ＢＲＹ、　１と言う。ＢＲＹ、　ｉ　ＤＮＡ 配列は第１図に示されている。このＤＮＡ配列は６０７個のヌクレオチドからな ９、その最靭の２３７個のヌクレオチドは、オーストラリアブロビジョナル特打 出願４ＰＨ０７３８５／８６に記載されている。本出肌はこの特許出願に基づき 優先権主張がなされている。

’　ＢＲＹ、　１　’なる言葉は第１図に示した特異的ＤＮＡ配列を示すもので ある。またこの言葉は、その変換体が第１図の配列の全てまたは１部と特異的に ハイブリダイズし、２５チ以下で相違しているかぎり、ヌクレオチドが置換し、 増加しおるいは除去された変換体も包含する。

これらの変換体は、ＤＮＡ配列の点変異、欠損あるいは挿入などによって個体群 のなかで自然に生じる対立遺伝子変換体でもよい。あるいはまた、これらの変換 体は、特定部位変異誘発、エンドヌクレアーゼもしくは制限酊素を用いたＤＮＡ 　＠片の除去、ＤＮＡ部分を連結することによるＤＮＡ配列の追加などの人工的 な手段によって構築される変換体であってもよい。

本発明は、１２もしくはそれ以上のヌクレオチドであってＢＲＹ、　１の隣接部 分のヌクレオチドにも関し、以後このヌクレオチドを１オリゴヌクレオチドと言 う。

このオリがヌクレオチドはＢＲＹ、　１を検出するためのハイブリダイゼーショ ングローブとして使用することができ、このオリゴヌクレオチドはＡｐＰｌｉθ ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３　Ｑ　Ａ　ＤＮＡ　シンセサイザーなどの商業 的に入手可能なりＮＡシンセサイず−を使用して標準的方法により合成的に構築 することができる。１２よシ少ないヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドで は、ハイブリダイゼーショングローブとしての効果が減少する。

本発明の他の局面によれば、ＢＲＹ、　１の１２もしくはそれ以上のヌクレオチ ドの隣接部分を含む核酸単離物が提供される。

更に本発明は、ＢＲＹ、　ｉに対応するＲＮＡ　（第１図に対応するＲＮＡ配列 は第２図に示されている）及び第２図のＲＮＡ配列の１２もしくはそれ以上のヌ クレオチドの隣接部分に関する。

本発明の他の局面によれは、ＢＲＹ、　１の１本鎖もしくは２本鎖に対応するＲ ＮＡＸあるいはＢＲＹ、１の１２もしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接部分に 対比、するＲＮＡを含む核酸単離物が提供される。

本発明の核酸単離物はハイブリダイゼーションプローブとして使用することがで き、まｙ、　３２　ｐ、１４Ｃ１３Ｈ１１２５工などの放射活性マーカーあるい はビオチン、ブロモデオキシウリジンなどの非放射活性マーカーで、公知の方法 （文献５−８）によりラベル化してもよい。

ＢＲＹ。１の全てまＴ、−はその１部に対応するＲＮＡは、例えばＳＰ　６　Ｒ ＮＡポリメラーゼあるいはＴ　７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ　Ｖｉｔｒ Ｏ転写システムにより製造することができる（文献７及び８）。

本発明の核酸単離物は、Ｙ−染色体特異的ＤＮＡ配列を検出するためのハイブリ ダイゼーションプローブとして使用することができ、従って例えば胎児または胚 の性別を判定するためのハイブリダイゼーショングローブとして使用することが できる。同様に、本発明の核酸単離物は、ＢＲＹ、　１の配列の全体に亘る変換 体及び／又はマイナーな変換体の検出に使用することができる。このような分析 は父系テストに有用なものである。

分画精液を、本発明の核酸単離物を用いてテストすることもできる。特に、本発 明の核酸単離物を用いて、Ｙ−染色体を豊富に含む精液を評価することが出来る 。

胎児、胚または個々の反部動物の性別を判定する場合には、分析用として細胞試 料を採取し、そこからＤＮＡを公知の方法（文献９）により抽出する。次いで単 離したＤＮＡをニトロセルロースおるいはｚｅ　ｔａ−プローブ膜（トレードマ ーク、Ｂｉｏ　−Ｈａｄ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）などの固相支持体に結合 せしめ、またはゲルマトリックスで電気泳動さセてて固相支持体に移す。次いで 、この固相支持体を、後述する如（、検出可能なマーカーでラベル化した本発明 の核酸単離物とハイブリダイズさセる。次いで、固相支持体上のＤＮＡに結合し たラベル化核酸単離物を、例えばオートラジオグラフィーによＶ検出する（文献 １０）。ラベル化単離物が、ＤＮＡ試料中のＢＲＹ、　１遺伝子と結合する場合 には、その試料の性別を雄と判定することができる。

上記の方法では、胎児、胚などのターゲット遺伝子、即ちＢＲＹ、　１遺伝子を 、５ａｉｋｉらの方法（文献１１及び１２）によシ増幅することができる。

本発明の核酸単離物は、ｉｎ　１ｉｔｕ　ハイブリダイゼーションの標準的技術 （文献１３）を用いて固定化細胞または中期の染色体にハイブリダイズすること もできる。

更に本発明の他の局面によれば、組織もしくは細胞試料の性染色体の構成を判定 する方法であって、組織もしくは細胞試料からＤＮＡを単離し：単離したＤＮＡ を支持マトリックス上に固定化し；固定化されたＤＮＡと、反椙動物のＹ−染色 体特異的ＤＮＡ配列にのみ結合することのできる核酸単離物とを、該核酸単離物 が相補性ＤＮＡ配列と結合可能な条件下でハイブリダイズし； 支持マトリックスから非結合核酸単離物を洗浄除去し；次いで 支持マトリックスに結合したＤＮＡへの該核酸単離物の結合を検出する： 工程からなる上記方法が提供される。

本発明の他の局面によれば、固定化細胞または中期の染色体拡散体（ｓｐｒθａ ｄｓ　）中のＹ−染色体の存在または不存在を判定する方法であって、 固定化細胞または中期の染色体拡散体と、反契動智のＹ−染色体特異的ＤＮＡ配 列にのみハイブリダイズすることのできる核酸単離物とを、該核酸単離物が相補 性ＤＮＡ配列と結合可能な条件下で、ハイブリダイズし；非結合核酸単離物な洗 浄除去し：次いで核酸単離物の結合を検出する： 工程からなる上記方法が提供される。

本発明の他の局面によれば、組織または細胞試料の性染色体の構成を判定する方 法であって、組織または細胞試料からＤＮＡを単離し、コード鎖及び非コード鎖 をそれぞれ分離するために単離しｆＳ　ＤＮＡを変性し： 変性ＤＮＡと、ＢＲＹ、　１の１２もしくはそれ以上のヌクレオチドに対応する 合成オリゴヌクレオチドとをアニーリングし： 組織または細胞試料中にもし存在するならば、アニーリングしたＤＮＡとＤＮＡ ポリメラーゼとをインキユベートシて、オリゴヌクレオチドをＢＲＹ、　１配列 の終りまで延ばし； この配列を望むだけ多（の回数繰返し生ぜしめてＢＲＹ、　１のレベルを増幅し ；次いで増幅された試料中のＢＲＹ、　Ｉ　ＤＮＡを、（ａｌ　ＤＮＡを支持マ トリックス上に固定化し；この固定化ＤＮＡと、反契動物のＹ−染色体特異的Ｄ ＮＡ配列にのみ結合することのできる核酸単離物であって検出可能なマーカーで ラベル化された核酸単離物とを、該ラベル化核酸単離物が相補性ＤＮＡ配列と結 合可能な条件下で、ハイブリダイズし：支持マトリックスから非結合核酸単離物 を洗浄除去し；次いで支持マトリックスに結合したＤＮＡへの核酸単離物の結合 を検出する、あるいは （ｂ）　ラベル化ヌクレオチド前駆体が、ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベー ション中に含まれる場合には、試料をゲルマトリックスで電気泳動することによ り分画し、次いでゲルマトリックスで分画されたラベル化ＢＲＹ、　１配列を検 出する、 ことによって検出する： 工程からなる上記方法が提供される。

核酸ハイブリダイゼーションは、ＲｅｅｄとＭａｎｎ　（Ｄ　方法（文献１４） 及びＭａｎｉａｔｉｓらの方法（文献９）に従い標準的条件下で実施することか できる。

本発明の核酸単離物は、組織または細胞試料中のＹ−染色体特異的ＤＮＡ配列の 存在または不存在を検出するためのキットを構成する、あるいはその１部を構成 することかできる。核酸単離物は、検出可能なマーカーでラベル化されていても よい。キットには、試薬を希釈するための緩衝液、ラベル化合物、分析を実施す る固相支持体などが含まれていてもよい。

更に本発明の他の局面によれば、Ｙ−染色体特異的ＤＮＡ配列の単離方法であっ て、 （１）雄性及び雌性動物から調製された１本鎖牛デノミンクＤＮＡをアニーリン グし； （ｉ）　アニール化ＤＮＡを単離し、複製可能なベクター中に挿入し： （ｍ）　アニール化ＤＮＡを含む複製可能なベクターで宿主細胞を形質転換し： 次いで （ＩＶ）　形質転換した宿主細胞と、雌の反灸動物のゲノミツクＤＮＡから調製 したラベル化ＤＮＡプローブとをハイブリダイズし、ラベル化プローデと結合し ない牛ゲノミツクＤＮＡを含む宿主細胞を同定する：工程からなる上記方法が提 供される。

図面の記述 第１図はＢＲＹ、　１の２本ｇ　ＤＮＡ配列を示し、セしてＣはデオキシシチジ ン−５′−ホスフェート、Ｇはデオキシグアノシン−５′−ホスフェート、Ａは デオキシアデノシン−５′−ホスフェート、Ｔはデオキシチミジン−５′−ホス フェートを嚢わす。

第２図はＢＲＹ、　１のＤＮＡ配列に対応する２重鎖ＲＮＡ配列を示す。Ｃはシ チジン−５′−ホスフェート、Ｇはグアノシン−５−ホスフェート、Ａはアデノ シン−５′−ホスフェート、Ｕはクリジン−５′−ホスフェートを表わす。

略号の定義 ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　：りざ核酸 ＣＤＮＡ　：相補性ＤＮＡ　（ｍＲＮＡ配列から酵素的に合成される） ｍＲＮＡ：メッセンジャー朋Ａ Ｔｒｉｓ　：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＥＤＴＡ　：エチレンジ アミンテトラ酢酸ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム ド１　：１インチ平方当りのボンド数 に、ＭＥＳ　：モルホリノエタン硫酸ナトリウムポリヌクレオチド−１本鎖また は２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ 実施例 畜殺場で雄と雌の牛の肝臓の１部を集め、直ぐに液体窒素中で凍結した。個々の 動物から得た凍結肝臓サンプル（０，８＆　）を、ＨＢ　（０，Ｉ　ＭＮａＣｌ 、１　［１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　＊　１　ｍｕ　ＥＤＴＡ　 ）の３　ｍｌ中でホモジナイズした。それぞれのホモジネートに、０．５ＭＥＤ ＴＡ　２．２　ｍｌ及び２０％（Ｗ、’Ｖ　）サルコシ＃　（ＳａｒＣｏｓ３’ ｌ）１．２２ｍ７を、ゆっくりと混合しながら加えた。得られるサスペンション を、時々ゆっくりと混合しながら６５℃で１５分間加熱し、それぞれのサスペン ションに固型のｃＢａｌｌ　１．６　＆を浴解し、次いでエチジウムゾロミドＣ Ｉ　ＤＨ９／ａｔ　）　１１ＩＩｔを加え混合した。サスペンションを１３．５ １＋ｉｔの遠心チューブに移し、ＢｅＣｋｍａｆｉＴｉ８０ローター中に置き、 Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｌ　８−８０超遠心機で、４５．００Ｏｒｐｍｅ　２５℃で６ ０時間遠心した。

チューブの中間近くの濃縮ＤＮＡのピンク色のバンドをわきの細孔から回収しく １ＸＩＬｔのプラスチックシリンジに取り付けた１８ｇニードルを用いて）、キ ャップの付いたチューブに移した。ブタノール（あらかじめ飽和食塩水で平衡化 した）を用いた抽出を繰返してエチジウムプロミドを除い１こ。得られる透明な りＮＡ浴溶液、ＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉ８−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０，１ｍＭ　 ＥＤＴＡ　）の２１×３に対して４℃で透析した。

異種ハイブリダイゼーションによるクローン化可能な離籍異的配列の富化（文献 １５）： 雌牛の肝臓から単離したＤＮＡ　１　ｒｎ９を、２０，０００ｐｈｉの圧力下で フレンチプレスに繰返しく５回）通すことによって、約５００　ｂｐの平均サイ ズの断片にランダムに切断した。次いで酢酸す）　ＩＪウム（ｐ）１５．０　） を０．２５　Ｍまで、エタノールを７０チ（Ｖ／Ｖ　）まで加えて沈澱せしめ、 −２０’Ｃで１晩冷却した。ＤＮＡを遠心分離により回収し、得られるベレット を７０％（Ｖ／Ｖ　）エタノールでリンスし、真空下に乾燥した。

雄牛の肝臓から単離したＤＮＡ　９μ夕を、標準的条件下で制限酵素Ｓａｕ　５ 　Ａ　Ｉにより完全に消化し、次すでフェノールとエーテルで抽出した。酢酸ア ンモニウムを２Ｍまで、エタノールを７０チ（Ｖ／Ｖ　）まで加えてＤＮＡを回 収し、十分に混合し、液体窒素中で凍結し、溶解し、次いで４℃で１５分間遠心 した。消化された雄ＤＮＡのベレットを７０％（Ｖ／Ｖ　）エタノールでリンス し、次いで真空下に乾燥した。

か（して調製したＤＮＡ試料（ランダムに切断した雌牛デノミツクＤＮＡ、　１ 　＃と制限酵素で消化されγこ雄牛デノミツクＤＮＡ　９μｙ）をＰ　Ｅ　（５ Ｑ　ｍＭリン醗ナナトリウムｐＨ６，８Ｌ　ｓｍＭＥＤＴＡ　）　０．１ｍＺ中 に加え、１００℃で５分間加熱することによって変性した。次いで直ぐに氷／水 に移し、４１ｖｉ硫酸アンモニウムのＰ］ｌＪｇ液と混合し１こ。この浴液な６ ８℃で２４時間インキュベートし、Ｃｏｔ値が１，３２０　ｍｏｌｅｓ、　１− １　、　ｓｅａとなるまでＤＮＡの再アニーリングを行なっπ。この値は、２Ｍ 硫酸アンモニウムによって再アニーリングが５０倍促進され１こことによる６　 ６．００　Ｑ　ｍｏｌｅ８　、１−１　、　ＢｅＣに相当するＣｏｔ値である（ 　Ｃｏｔ一時間ゼロでの１本鎖ＤＮＡのモル濃度（ヌクレオチド／ｌ）Ｘ時間（ ｓｅａ）；実際のＣｏｔ値は、０．１２Ｍリン酸ナトリウム、ｐ）（６，８での 相当する再アニーリング速度を参照して標準化されたものである）。

混合物をヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ　）カラムに通すことによって、再アニ ール化ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡから分離した。カラムマトリックスは、ヒドロキシ アパタイト（Ｂｉｏ　−Ｒａｉ　ＤＮＡ　ＧＲＡＤＥ　）　５　ｇをｐＢ（０， １２Ｍリン酸ナトリウム、　ｐＨ６−８）　２０　［１ｍ１Ｖｃ＠濁し、１５分 間ゆっくりと煮沸することによジ調製した。スラリーを、その１７．がボイルし た砂でおる床の上に置かれた（カラムの底面に焼結ガラスディスが詰まるのを防 ぐため）、水で被覆したカラムに注入し、静置した。

Ｅ（ＡＰカラムを６０℃にずっと維持した。ＨＡＰカラムをカラムの２５倍容の ＰＢであらかじめ洗浄した後、再アニール化ＤＮＡ溶液をＦＢで５１＋＋６に希 釈し、ＨＡＰカラムに付した。次いでカラムを、カラムの５倍容のＰＢで溶出し 、更にカラムの５倍容の０．６　Ｍ　’）ン酸ナトリウム、ｐＨ６，８で溶出し た。ＰＢで溶出したフラクション中に、全ＤＮＡの約９５チが回収され、これら は２本鎖（再アニール化）　ＤＮＡである。このフラクションをＴＥに対して透 析し、ブタノールによる抽出を繰返して濃縮し、次いでエーテルで抽出しく水洗 し）、遠心して微粒子物質を除去した。上記したと同様にして、酢酸ナトリウム ／エタノールで沈澱セしめて、溶液からＤＮＡを回収した。

クローニングベクター（プラスミドｐＵＣ９）の調製（文献１６）ニ プラスミドＰＵＣ９の１００μ夕を制限酵素Ｂａ１ｌｌＨＩで消化し、ｓｐｓ　 ′ｔｔＯ，５％　（Ｗ／ｖ　）までそしてＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ａｃｌ、　ＦＪ′ （９，３をｌ／６容量加えて、次いで牛腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ　ＥＬＩＳＡ　グレード）とともに！１７℃で１時間インキュベーシ ョンすることによりクローニングベクターを調製した。得られる溶液を７エノー ルで処理し、次いで上記したと同様にして酢酸ナトリウム／エタノールで沈澱さ せてＤＮＡを回収した。制限酵素で処理されたＤＮＡをＴ　Ｅ　／　０．２％（ Ｗ／Ｖ）デルコシルに溶解し、　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓ　Ｗ　４１超遠心チユーブ に入れた。　ＴＥ１０．２Ｊ　（ｗ／ｖ　）デルコシルに溶解された２−２５チ （Ｗ／Ｗ　）シュクロースの冷却（４℃〕りニア−グラジェント上に、重層した 。チューブをＢｅｃｋｍａｎ　Ｌ　８−８０超遠心分離機で５６．００　Ｏｒｐ ｍ。

４℃で２０時間遠心し、次いでグラジェント７ラクシヨネーター（ｌ５ＣＯ）を 用いて０．５１１１ｔの７ラクシヨンを集めた。

それぞれのフラクションの試料（１０μりを、エチジウムプロミド（０，５１１ １１／ＩＲｔ）を含む１．５　％　（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルで電気泳動し、次 いで紫外線（３０２ｎｍ　）を照射して影像化し、線状化プラスミドを含むフラ クションを視覚的に同定し７Ｌ　６コンビテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　）細胞 の調製：コンビテントバクテリア細胞（Ｅ、Ｃｏ１１株ＪＭ８３）を、２ｙＴ培 地（ａｍ菌１．６　％　（Ｗ／”　）バクトートリプトン、１　％　（Ｗ／Ｙ　 ）　ｉｌ’ｊ’母抽出物、［１，５％　（Ｗ／ｆｆ　）Ｎａ（１、ｐ）１７．４ ）にＪＭ８３細胞を接種し次いで激しく振とうしながら６００　ｎｍでの吸光度 が０．４になるまでインキュベートすることによって調製した（文献１７）。培 養フラスコを氷／水中で５分間冷却し、遠心分離によって細胞を採取した。得ら れるペレットを５０　ｍＭ　ＣａＣｌ２　５　Ｑ　ａｔに再懸濁し、氷上に２０ 分間放置し次いで再び遠心しに０得られるペレットを冷却した５　０　ｍＭ　（ ａｑ１２５　ｍに再懸濁し、形質転換分析に使用する前の２４時間氷上に放置し た。

上記した如き酢酸アンモニウム／エタノールを用いた沈澱により、上記したそれ ぞれのグラジェントフラクションの試料２０μ）からＤＮＡを回収した。この試 料にコンビテン）ＪＭ８３　５０μｌを加え、得られるサスペンションを氷上に ３０分間放置し、次いで４２℃で９０秒間加熱し、２ＹＴ培地Ｑ、１ｍｊと混合 し、３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収し、２ＹＴ 培地Ｑ、２ｍｔに再懸濁し、５０μｉ　Ａｔアンピシリンを含む２ＹＴ寒天（１ ，５チ（ｗ／ｖン寒天を含む２ＹＴ培地）上にプレートし、３７℃で１晩インキ ユベートした。それぞれのプレート上のコロニー数を計測して、環状（非切断〕 プラスミドを含むグラジェントフラクションを同定した。

ホスファターゼ処理された線状のプラスミドを主として含み、環状のプラスミド （形質転換能から評価した）をわずかに含むグラジェントクラクション＃１３− １６（）ツブのグラジェントから番号を付した）を集め、上記した酢酸ナトリウ ム／エタノールを用いた沈澱によりＤＮＡを回収した。

離籍異的ＤＮＡ配列を豊富に含む部分ライブラリーの調製 再アニール化ゲノミツクＤＮＡの試料（２００μｇ）とグラジェント精製法によ シ精製した線状ベクターＤＮＡの試料（１０μ９）とを、リゲーションバツ７ア −（６６ｍｕ　Ｔｒｘａ−ａｃｘ、　ｐＨ７，ｓｔ　６．６　ｍＭＭｇｃ１２゜ １　ｍＭ　ＡＴＰ　＊　１　［１０Ｉ’１ｉ／　Ｍ　ＢＳＡ　（牛血清アルブミ ン。

Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製、ヌクレアーゼフリー）、１０ｍＭジチオスレイトー ル及びＴ、　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（Ｎｅｖｒ　ＥｎｇｌａｎａＢｉＯＬａｂｓ　 ）　）　中で混合し、１４℃で１晩インキユベー　ト　し　１こ、。

細胞試料をＬＭ寒天（滅菌１チ（ｗ／ｖ　）バクトートリプトン、０．５チ（ｗ ／ｖ　）　酵母抽出物、１０　ｍＭＮａｃｌ。

１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ　ｅ　１．５　’Ｊｒ　（Ｗ／ｖ）寒天）上に希釈塗付 し３７℃で１晩インキユベートすることによって、ＪＭ８３細胞のストックを調 製した。単離したわずかのコロニーを、あらかじめ加温しｆ、：、　ＳＯＢ培地 （？Ｉｓ、菌２％　（ｗ／ｖ　）　ｔ４１　ト−）　！ｊプトン、０．５　％　 （Ｗ／Ｖ　）酵母抽出物、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１＊　２−５　ｍＭ　ＫＣＩ　 ｅ　２０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ４）２０鮮に接種し、激しく通気しながら、５５０　 ｎｍでの吸光度が０．５になるまで生育せしめ、次いで滅菌ＳＯＢ　：グリセロ ール（６０：４０、容量比）　２０　ｍＡで希釈した。試料（０，１ｍｔ）をｉ 、５ｍｔの密封できるチューブに移し、氷上で１０分間冷却し次いでドライアイ ス／エタノールで凍結し、−７０℃で保存した。

最初に凍結したストック細胞のサスペンションをＬＭ寒天上にこすり付け、次い で希釈塗付し、３７℃で１晩イ／キユベートシタ。２．５　ｎ　（直径〕のコロ ニー１０個を、あらかじめ温めたＳＯＢ培地１１ＩＬｔ中にポルテックスミキサ ーによって懸濁し、３７℃で激しく通気しながら、ｓ　ｓ　ｏ　ｎｍでの吸光度 が０．５になるまでインキュベートした。培養物を５０耐遠心チユーブ（×２） に移し、氷／水上で１５分間冷却し、次いで４℃で遠心すること（２，５０Ｏｒ ｐｍ、１２分間）により細胞を採取した。細胞ベレットを氷で冷却したＴＥＢ（ 滅菌１０　ｍＭ　Ｋ−ＭＥＳ　（Ｓｉｇｍａ　）ｔ　ｐＨ６，３，１０ＤｍＭ　 ＲｂＣ１ｙ　４５　”Ｍ　ＭｇＣｌ２　ｖ　１０　ｍＭ　ＣａＣｌ２　、３　ｍ ｉ　ヘキサミンコバルトトリクロライド（Ｆｌｕｋａ　）　）　３３　ｍＡ中に 再懸濁し、氷上に１５分間放置した。サスペンションを４℃で遠心しく２ｔ５０ ０ｒｐｍ、１０分間〕、得られるベレットを氷で冷却したＴＦＢ　８ｍｌに再懸 濁しγこ。

サスペンションにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｍｅｒｃｋ社製、分光分析 グレード）０−２８ｍｔを加え、得られる混合物を渦動セしめ、氷上に５分間放 置し、次いで２．２５　Ｍジチオスレイトール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　；４０ 　ｍＭ酢酸カリウムの滅菌溶液、ＰＨ６）　０−２８ｍＡを加え、再び細胞な渦 動ゼしめ、氷上に更に１０分間放置した。最後にＤＭＳＯＯ，２８ｍｌを加え、 ゆっくりと混合し、細胞を再び氷上に５分間放置した。

形質転換： 連結し！、＝　ＤＮＡ　１０μｌとともに細胞試右（２１０μｌ）を、２４個の 冷却したポリプロピレンチューブに移し、チューブをゆっくりと混合し、氷上に ３０分間放５．シ１こ。チューブを４２°Ｃの水浴中に６０分間置き、次いで氷 ／水に２分間移し、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコースを含む滅菌ＳＯＢ培地）０ ．３ｍＡを加え、サスペンションをゆっくりと振とうしながら６７℃で１時間イ ンキュベートシた。４個のチューブ中のサスペンションを集め、改良プフナーロ ートの真空濾過により、細胞を直径８２ｊｆｌのニトロセルロースフィルターテ ィスフ（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｕ１．１　）上に均一に分散しに。ディ スクを、アンピシリン（５０部ｇ　／ｍｔ　）を含む２ＹＴ寒天上に置き、３７ ℃で１晩インキユベー）　Ｌ　ｖ：。この操作を全ての試料について実施し、６ 個のブレーティングフィルターを得り。

１晩インキユベート後、それぞれのフィルター上に形質転換細胞の１．５００個 のコロニーが存在していることが明らかとなジ、形質転換に用い１ニアニール化 デノミンクＤＮＡ　２４０μｌについて約９．［Ｉ　Ｃ１０個の形質転換体を含 む混合ライブラリーが得られＴ二（これは、リゾ−ジョン混合物５　ｍｔについ て１８７，５００個の形質転換体を含む全混合ライブラリーに相当するン。６個 のフィルター上の細胞を、アンピシリン（５０μり／　ｌｌ１ｔ　）を含むＳＯ Ｂ培地１０ｍＡＫｋ濁し、次いでサスペンションを２０チ（Ｖ／’Ｉ　）含むグ リセロール溶液を得、そのｌ　ｍｌアリフートをシールしたチューブに分散し、 液体窒素中で凍結し、増幅された部分ライブラリーとして一７０℃で保存した。

約２，０００個の形質転換細胞をそれぞれ含む増幅された部分ライブラリーの４ 個の試料を、６７℃で２ＹＴ寒天／アンピシリン４１１ｔで希釈した。次いで、 フィルター（“マスター′）を用いて、それをフィルターペーパー（Ｂｃｈｌｅ ｉｃｈｅｒと５ｃｈｕｌｌ　３　ＭＭ　）の２つのシートのパッド上に、そのコ ロニー表面を上にして置き、新たなニトロセルロースディスク（２ＹＴ寒天／ア ンピシリン上に置くことによってあらかじめぬらしであるン次いで３ＭＭフィル ターベーパーの２つのシートで覆うことによって、レプリカスクリーニングフィ ルターを調製した。得られる゛サンドイッチ”を、なめらかなベルベットでカバ ーしたアルミニウムブロックでプレスし、次いで３ＭＭフィルターペーパーの上 の２つのシートを取り除いた。２つのニトロセルロースディスクのサンドインチ （マスターとレプリカ）を、防水性の黒インクを含むシリンジに取り付けられた ２２ｇニードルで何回も刺すことによってざらざらにした。次いでフィルターを 注意深（はぎと９、マスターフィルターを２ＹＴ寒天／アンピシリングレートに もどし、４°Ｃで保存した。レプリカフィルターをコロニー表面を上にして、２ ＹＴ寒天／アンピシリン上に置き、３７℃で約４−７時間（コロニーの直径が約 ３．５ｍｍになるまで）インキユベートシ、次いでクロラムフェニコール（２０ ０ｔｔｊＪ／ａｔ）を含む２ＹＴ寒天に移し、プラスミド複製（プラスミドコピ ー数のクロラムフェニコール増＠）を抑制することなく細胞の生育を阻止するた め、３７℃で１晩インキユベートシタ。

次いで、あらかじめ０．５　Ｍ　ＮａＯＨ、１，５Ｍ　ＮａＣ１で均一にぬうし １こ３ＭＭフィルターに一パーの４つのシートのパッド上に、レプリカフィルタ ーを５分装置いた。

７（ルターを乾燥しム二３　Ｍ　Ｍフィルターペーパーニ移して、過剰の液体を フィルターから除き（アルカリ処理でコロニーから遊離し、たプラスミドＤＮＡ が分散するのを最小限に抑えるため、常にフィルターを水平に保つように注意し 、１−）、次いでアルカリ処理を繰返しに０フイルターを、上記と同様にして５ 分間０．５　Ｍ　Ｔｒｉ日−ＨＣｌ（ＦＪ″１７．５）、及び１．５　Ｍ　Ｎａ Ｃ１で２回処理した。

過剰の液体を簡単に除いた後、フィルターを５ＭＭフィルターペーパー上に３０ 分間置いた。コロニーから遊離したＤＮＡを、真空オーブン中で８０℃で２時間 加熱することによって、中和したフィルターに固定し１こ。

ゆっくりと振とうしながら５０℃で１時間、５ＸＳＳＣ（１ｘｓｓｃはＯ−１５ Ｍ　ＮａＣ１、１５ｍＭクエン酸６ナトリウム）　、Ｃｌ３　％　ＳＤＳでフィ ルターを洗浄して、フィルターから細胞の破片を除いた。

洗浄したフィルターを、ゆっくりと撹拌しながら４２℃でハイブリダイゼーショ ン溶液（５０ｑｂ（ｖ／／ｖ）ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ　（Ｉ　Ｘ５ＳＰＥ は０．１８ＭＮａＣ１，１３ｍＭリン酸ナトリウム（ＦＪ（７，７Ｌ　１　ｍＭ ＥＤＴＡ　）、Ｉ　Ｓ　（ｗ／ｖ　）　ｓｐｓ　、　０．５ｍ９／射の、加熱し て変性し切断されたサケ精液ＤＮＡ　ＣＳｉｇｍａ社、蒸留水に１０■／ＩＩＩ ｔの割合いで溶解しオートクレーブしたもの）、０．５１　（Ｗ／Ｖ　）スキム ミルクバクダーツ中でブレハイブリダイゼーションした。次いでプレハイゾリダ イズしたフィルターを、放射活性グローブＤＮＡを１０部ｇ／ｒ１１ｔの濃度で 含む新たなハイブリダイゼーション溶液に移し、ゆっくりと撹拌しながら４２℃ で１晩インキユベートした。

プローブの調製 ６匹の関係のない牛の肝臓からＤＮＡを単離して等量のＤＮＡを集め、ニックト ランスレーションによって１部をラベル化することにより、放射活性プローブＤ ＮＡを調製した。５０　ｍＭ　Ｔｒｉｔ３−ＨＣＩ　（ｐ）（７−５ハ　７．５ ｍＭＭｇＣ１□、５　ｍＭゾチオスレイトール、０．Ｉ　Ｍ９／ＪｌｔＢＳＡ。

２０部ＭｄＡＴＰ、２０μＭ　ａｃ、ｒｐ、２０部Ｍ　＋１ＴＴＰ及び１００μ （Ｊ（α−”２Ｐ）　ｄｃＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社；約３，０００Ｃ１／　 ｍｍｏｌ　）を含むトータル童４０μｊ中の２５　ｐｇ　／ｒｎｔ　ＤＮアーゼ ｌ　（Ｅ、　ｃｏｌｉデオキシリボヌクレアーゼＩ）と、混合ＤＮＡ試料（０， ２μ９）とを１５℃で２０分間ブレインキュベートした。この間、わずかの試料 （約０．２μりを取、９．ＰＥｌ−セルロース薄層クロマトグラフィー用材料（ Ｍｅｒｃｋ社）の少さなシート（約４Ｘ８ｃｍ）上にオリジンマークした。ブレ インキュベーション後、ＤＮＡポリメラーゼｌ　（Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ社：約 ５単位）を加え、１５℃で２０分間インキュベートした。ＳＤＳを１　％　（Ｗ ／Ｖ　）まで、ＥＤＴＡを２　Ｑ　ｍＭまで加えてニックトランスレーションを 止め、次いで第２のわずかな試料を取り、これをＰＥＩセルロースシート上の最 初の試料のスポットの隣りにオリジンマークした。薄層クロマトグラフィーな０ ．７５　Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ３，５で展開し、ＤＮＡからａＣＴＰを分離 した。

クロマトグラムをＸ線フィルム（Ｆｕｊｉ　ＲＸ　）のシートに１５分間さらし た。Ｘ線フィルムを現像し、〔α−３２ｐ）　ａｃ’ｒｐのＤＮＡへの取り込み を視覚的に評価できるようにした。次いでクロマトグラムの適当な領域ヲシンチ レーションカウンターで計測して〔α−３２Ｐ〕ａｃＴＰの取り込みを定量した 所、９部チ以上が取り込まれておジ比活性約１０’　ｄｐｍ（”Ｐ）　／μＩで ラベル化された混合雌牛デノミンクＤＮＡが得られた。ラベル化ＤＮＡをハイブ リダイゼーション溶液に加える前に、上記しり如り酢酸アンモニウム／エタノー ルによる沈澱でラベル化ＤＮＡを回収し、次いで蒸留水に溶解し、１００９Ｃで ５分間加熱して変性し７．：０部％イブリダイゼーション後、ニトロセルロース フィルターを室温で２　Ｘ　ＳＳＣで簡単にリンスし、適度に撹拌しながら室温 で１５分間２　Ｘ　ＳＳＣ、０，１％（ｗ／ｖ　）　ＳＤＳで洗浄し、更に適度 に撹拌しながら６８℃で１５分間０−５　ｘ　ｓｓｃ　。

１　ｆｙ　ＳＤＳで洗浄した。フィルターを室温で０−５　Ｘ　ｓｓｃで最後に リンスし、乾燥させてブラッドラップ（（）ｌａｄｗｒａｐ　）で包み、デュポ ンクロネツクス１ライトニングプラス”（トレードマーク）増度スクリーンで一 ７０℃で３日間Ｘ線フィルムにさらした。

現像されたＸ線フィルム上のオートラジグラフイーシグナルは、ニックトランス レーションを受ケた雌テノミツクＤＮＡを有するそれぞれのコロニー中の組換え プラスミドのハイブリダイゼーションに対応している。

プローブの比活性は約１　ａｐｍ　／　（デノミツクＤＮＡの１０’　ｌ）Ｐ　 ）に相当するので、このようなコロニーは、雌（従って雄）デフミックＤＮＡ中 に多くのコピー数で存在するＤＮＡ配列を保持している。オートラジオグラムを もとのマスターフィルターと比較することにより、ハイブリダイゼーションを与 えないコロニーｔｖ　同定−１ｔｓ可能となる。このようなコロニー中の細胞は 、（１）バックグランド（弁組換え）プラスミド；　（ｌｉｉ）雄牛及び雌牛の 両者のグラム中に比較的低いコピー数で存在する配列を含む組換えプラスミド； 　（ｉｉ）雄牛のグラム中に独占的に存在する配列を含む組換えプラスミド；を 保持しているものと考えられる。更に分析を進める前に（最後に述べたものか興 味のあるコロニーである〕、ネガティブ形質転換体を精製した。

ハイゾリダイゼーションシグナルを与えないコロニー（約８０個、全体の１％） を２ＹＴ寒天／アンピシリン上に希釈塗付し、３７℃で１晩インキユベートした 。滅菌トウースピツクを用いて、それぞれのプレートから単離した８個のコロニ ー試料を、２ＹＴ寒天／アンピシリンのレプリカグリッドパターン上に（第２の マスター〕及び２ＹＴ寒天／アンぎシリンのニトロセルロースディスク上に（第 ２のレプリカ）移した。

マスタープレートを３７℃で１晩インキユベートし、保存用に４６Ｃとした。レ プリカを６７℃で約６時間インキユベートシ、次いでフィルターディスクを２Ｙ Ｔ寒天／クロラムフエニコールに移して６７°Ｃで１晩インキユベートした。次 いでフィルターを、上記と同様にして処理し、ハイブリダイズし、水洗し次いで オートラジオグラフィーに付した。

最初のスクリーニングでネガティブでめったコロニーの１つから誘導した８個の 精製形質転換体のうち２個またはそれ以上が、第２のスクリーニングにおいても ネガティブであった場合に、そのネガティブなコロニーの１つについてプラスミ ドを分析した。滅菌したトウースピックで、そのようなコロニーの１部をリシス バソファ−（ＮＩＬＯＨ、ＥＤＴＡ　、　ＳＤＳ　、グリセロール、ブロモクレ ゾールグリーン）２０μＥに移した。得られる混合物を６５℃で６０分間加熱し 、次いで公知のサイズのインタクト環状プラスミドとともに１％アガロースゲル で電気泳動させた。ゲルをエチジウムプロミドで発色せしめ、紫外線を照射して 特定の形質転換体中のプラスミドの大きさを視覚的に評価した。次いでゲルを２ 倍量のＯ−２５Ｍ　ＨＣｌに１５分間浸し、０．４Ｍ　ＮＩＬＯＨを含むキャピ ラリーに移し、ゲル中のＤＮＡを切断し、変性して、次いで移し、アルカリサず ンゾロツテイング（文献１４〕により改良されたナイロン膜（Ｂｉｂ−Ｒａａ　 Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ　）に固定しに０次いでこの膜を２　ｘ　ｓｓｃ中で簡単 にリンスし、ハイブリダイゼー’／−３７ｍ液（２Ｘ　５ＳＰＥ、１％（ｗ／ｖ 　）　ＳＤＳ　、０．５　％（ｗ／ｖ　）　スキムミルクパウダー、１０％（Ｗ ／Ｖ　）デキストランスルフニー）、０．５ｍ？／ｒａｔの、切断し変性したサ ケ精液ＤＮＡ　）中で６８℃で４時間プレハイゾリダイゼーションを行なった。

次いで、放射活性プローブ（上記の如くして調製した混合雌デノミツクＤＮＡ　 ）を含む新たなハイブリダイゼーション溶液にこの膜を移し、６８℃で１晩ハイ ブリダイズさせ、その後、洗浄し、上記した如くにしてオートラジオグラフィー に付した。オートラジオグラムにより、多くのネガティブなコロニーが次ぎの分 析対象から除かれた。

このように感度が上昇した条件下においても依然としてハイブリダイゼーション を示さなかった組換えコロニー（そこに含まれているプラスミドの大きさから明 らかである）を用いて、２ＹＴ培地／アンビシリン２ｍｌに接種し、３７℃で１ 晩培養した。遠心分離によって細胞を回収し、アルカリ／　ＳＤＳリシス法Ｃ文 Ｍ　９）によりプラスミドを単離した。

それぞれのプラスミド調製物の試料を、ニックトランスレーションによりラベル 化し、制限酵素処理した雄牛及び雌牛デノミツクＤＮＡのアルカリサザンプロッ トのプローブに用いた。２匹の血縁関係のない雌牛と２匹の雄牛のそれぞれの肝 臓から単離したデノミックＤＮＡ　４μＩを、制限酵素Ｂａｎ　ＨＩで完全に消 化し、１チ（ｗ／ｖつアガロ−スミニブ／ｌ／　ＣＰｈａｒｍａｃｉａ社　ＧＮ Ａ　−１００〕で電気泳動した。発色して写真化した後、デルを酸で処理し、Ｄ ＮＡを移してＺｅｔａ　−ｐｒｏｂθ膜に固定しいブレハイブリダイズさせり（ これらすべての方法は上記したと同様である）。これらの膜（それぞれのランス ルフェート及び放射ラベル化プラスミドＤＮＡ（２０ｎｇ／ｍＡ）をそれぞれ含 む新１こなハイブリダイゼーション溶液に移した。プラスミド調製物の試料（約 ０．２μｇ）をニックトランスレーションによりラベル化して比活性が約２　ｘ 　１０”　ｄｐｍ　［””Ｐ：）　／ｌｔｇ（プラスミドＤＮＡ　）となるよう にしＬ０次いで膜を洗浄し、乾燥してオートラジオグラフィーに付した。

２匹の雄牛の両者のＤＮＡとハイブリダイズし雌牛とはいずれもハイブリダイズ しないバンドを与える１つのプラスミドが現われた。このプラスミド（ＰＢＲＹ 、　１　）は約３００　ｂｐの挿入配列（プラスミド調製物の制限酵素による消 化物を電気泳動により分析して測定した）を含んでいた。

ＰＢＲＹ、　１調製物試料（０，２μｇ）をニックトランスレーションによりラ ベル化し、血縁関係のある多くの雄牛及び雌牛の末梢血リンパ球から単離しＢａ ｍＨＩで消化したデノミツクＤＮＡのアルカリサデンプロットにハイブリダイズ させた。この実験のために、父親の牛と、それと交尾した６匹の母親の牛及びこ れらの交尾で産まれた子供の牛のそれぞれから、末梢血５０Ｉｌｌｔを採取した （抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いた〕。ｐｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｓ　（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ社）で遠心し、急激な浸透圧ショックを与え（残存している赤血球の 大部分を溶解するため）、次いで遠心してリンパ球をペレット状とすることによ って、リンパ球を豊富に含む細胞フラクションを血液試料から得た。肝臓から単 離する上記したと同様の方法により、リンパ球調製物からＤＮＡな単離した。Ｄ ＮＡ試料（４μＩ）を制限酵素ＢａｍＨＩで完全に消化し、次いで上記したと同 様にして、電気泳動に付し、ニックトランスレーション化Ｉ）ＢＲＹ、　１　ト のアルカリサデンプロットハイプリダイゼーション、次いでオートラジオグラフ ィーに付した。父親の牛及びその子供の雄牛から単離し７．、　ＤＮＡは全て同 じハイブリダイゼーションバンドを示した。これに対して、母親の牛及びその子 供の雌牛から単離し１こＤＮＡは全てｐＢＲ￥、　１とのハイブリダイゼーショ ンを示さなかった。

血縁関係のない多くの雄牛及び雌牛の肝臓及び腎臓から単離したＤＮＡ試料を用 いて、アルカリドツトプロットを調設した。この実験のため、それぞれの動物か ら得たケ９ノミツクＤＮＡ　８μりな、０．４　Ｍ　ＮａＯＨ、２０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　１　ｍｔに希釈し、１００℃で１０分間加熱した。

この試料の半分（０，５１ｉ１を０．４　Ｍ　ＮａＯＨ、２Ｑ　ｍＭＥＤＴＡ　 Ｏ，５ｍｔに移し、この希釈液０．５ｍｔを混合後、再び０．４　Ｍ　ＮａＯＨ 、２０ｍＭ　ＥＤ’ｒＡ　Ｏ，５ｍｔに移し、コノ希釈法を繰り返してそれぞれ のサンプルについて７個の希釈液を調装した。第１．第６．第５及び第７試料（ それぞれ０．５ｍｌであり、それぞれ４．１．０．２５．０．０６２５μｌのＤ ＮＡを含む９を、ドツト・プロット・マイクロ・フィルトレージョン・マニホル ）”　（Ｂｕ、０−Ｂ（ａｄ社〕を用いてｚｅｔａ　−ｐｒｏｂｅ膜のシートに 付した。

真空濾過後、試料ウェルを［１，４Ｍ　ＮａＯＨＱ、４　ｍｌでリンスし、膜を 中和し、上記と同様にしてニックトランスレーション化ｐＢＲＹ、　１とハイブ リダイズさせた。オートラジオグラフィーにより、雌牛から得７．：　ＤＮＡ試 料のいずれもプローブとハイブリダイズセず、他方雄牛から得７Ｑ　ＤＮＡ試料 は全てハイブリダイズすることか示された。オートラジオグラム上のドツトの強 さは、雄牛の間で変動しており、これはデノミツクＤＮＡでのＢＲＹ、　１のコ ピー数が雄牛の間で変動していることを示している（約２０倍の強度変化が観察 され、このことは、デノミツクＤＮＡでのＢＲＹ、　１のコピー数が血縁関係の ない雄牛との間で２０倍変動することを示唆し盲検テストに用いるため、多くの 子牛（上記の牛とは血縁関係がない〕から血液試料を採取した。それぞれの血液 試料２０μｌを０．４　Ｍ　ＮａＯＨ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡに希釈し、１００℃ で１０分間加熱し、順次２倍希釈を実施した。３個の希釈液（それぞれ０．５ｍ ｌであり、それぞれ１０．５．２．５μｌの血液を含む〕を用いて、上記と同様 にしてドットブロットハイプリダイゼーシ　゛ヨンを行なった。オートラジオグ ラフィーにより、前回のｐＢＲＹ、　ｉとのハイブリダイゼーションに基づき雄 牛と雌牛とを明確に識別することができに０ヒツジＤＮＡ　： ２匹の雄のヒツジと１匹の雌のヒツジの肝臓から単離したＤＮＡ試料を、同様に して、アルカリドツトプロット及びサデンブロットハイプリダイゼーション分析 に付しに０プラスミドＢＲＹ、　１は雄ヒツジのＤＮＡとはハイブリダイズし、 雌ヒツジのＤＮＡとはハイゾリダイズしないことが判った。

これらのデータから、プラスミドｐＢＲＹ、　１にクローン化された配列が牛及 びヒツジの雄に特異的なものであり、従ってこれらの種におけるＹ（雄性決定） −染色体の成分であることが判る。

プラスミドＰＢＲＹ、１の挿入配列を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄＩＩＩ による消化によって切り出した。消化物を低融点（ＬＭＴ　）アガロース（Ｍａ ｒｉｎｓ　（ｏｌｌｏ１ｄｓ’　Ｓｅａ　−ｐｌａｑｕθ”〕で電気泳動し、上 記と同様にしてエチジウムプロミドで発色させて紫外線照射により視覚化し、挿 入配列ＤＮＡのバンドを含むアガローススライスを切り出して、挿入配列（約３ ００　ｂｐ　）を精製した。アガロースを６５°Ｃで１０分間溶解し、再蒸留フ ェノールで２回抽出し、この溶液をブタノールで繰返し抽出することによって＊ ｉし、次いで酢酸アンモニウム／エタノールにより沈澱させて（上記と同様〕、 ゲルスライスよりＤＮＡを単離した。

制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ及びＨｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化し、次いでアルカリホス ファターゼで処理（上記と同様りして調設したプラスミドベクターｐＴＺ　１３ 　ｕ及びｐＴＺ１９ｕ（１３１０−Ｒａｄ　）に、回収した上記挿入配列を連結 した。

連結反応によって得られる試料を用いて、ｇ、ｃｏｌｉ株、ｒｐＡｌｏｌ（上記 と同様にして（：ａＣ１□処理によりコンピテント細胞としたンを形質転換し、 得られる細胞を２ＹＴ寒天／アンピシリン上にプレー）Ｌ、３７℃で１晩インキ ユベートシタ。制限酵素分析、電気泳動、アルカリサザンプロッテインク及びハ イブリダイゼーションによって（上記と同様〕、目的とする組換えプラスミドを 保持するコロニーを同定した。

２つのタイプの組換えプラスミドを保持するそれぞれのコロニーから１つのコロ ニーを取り、これを用いて２ＹＴ培地／アンピシリン（５０μｉ／Ｒｔ）のカル チャー５　ｍｌに接種した。バクテリオファージＭ１３株Ｋ　０７　（１０８１ ）ｆｕ　（プラーク・７オーシ７グｅユ＝ツト）を含むファージストック２５μ Ｅ）でバクテリアを感染し、６７℃で１時間インキュベートシタ。カナマイシン を加え＜７０ｐ９／ｒａｔ）、激しく通気しながら３７℃でインキュベーション を続けた。次いでカルチャーを遠心分離し、上清みを除き、りざヌクレアーゼＡ Ｃ５μｇ／ｍｌ〕で３７℃で３０分間処理した。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）　６．０００　（ＫＯＣｋ　−Ｌｉｇｈｔ 　）の２．５　Ｍ　Ｎａｃ１溶液を加エテ、ハッケーシサれた１本鎖プラスミド ＤＮＡを沈澱させた。十分に混合し、室温で１５分間放置後、遠心分離により沈 澱物を回収し、上清みを完全に除いた。得られるベレットをＴ　Ｋ　Ｏ，１−に 再懸濁し、簡単に遠心して微粒子を除き、次いでフェノールで抽出し、上記と同 様にして酢酸ナトリウム／エタノールによる沈澱によりＤＮＡを回収した。ベレ ットをリンスし次いて乾燥してこれを、サンガージデオキシ配列決定反応（文献 ２０）の鋳型として用いた。

配列決定された挿入配列から得た、両者の配位におけるＢＲＹ、　１の相補性配 列（ｐＴＺ　１８ｕ及びｐＴＺ　１９　ｕでの相補性組換え体から得た〕は完全 に一致し、第１図に示す配列を与えた。

第１図のヌクレオチド配列は、スタンダード法によ＃）１文字コードで示されて おり、Ｃはデオキシシチジン−５７−ホスフェート、Ｇはデオキシグアノシン− ５′−ホスフエート、Ｔはデオキシチミジン−５′−ホスフェ−１−１Ａはデオ キシグアノシン−５′−ホスフェートを示している。

第２図は、第１図のＤＮＡ配列に対応する２本鎖ｍＲＮＡ配列を示している。

引　用　文　献 １、Ｋｕｎｋ８１ら、５Ｃ１Ｑｎｃｅ　１９１．１１８９−１１９０　（１９７ ６）２、１３１ｓｈｏｐら、Ｎａｔｕｒｅ　３０３．８３１　（１９８３）３、 　Ｂａｒｏｎｓ　、　Ａ、Ｄ、　、Ｔａｎｇ、Ｊ　、＋　Ｙ、及びｃａｒｕｔｈ ｅｒｓＭ、Ｈ，（１９８４）　ＮｕＣ１６１ＣＡｃ１ａｓ　Ｂｅｓ、　１２　： 　４０５１−４、　”１Ｎ７ｅ　ｐ、Ｊ、ｗ、　、　Ｉ）ｉｅｃｌｃｍａｎｎ、 　Ｍ、　、　Ｒｈｏｄｅｓ　。

Ｃ８，及びＢｅｒｌ　Ｐ−（１９７７）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ。

１１３　：　２３７−２５１ ５、　Ｔａｙｌｏｒ　、　Ｐ、　Ｍ、　、Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ　、　Ｒ，、及び ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｊ、（１９７６）　ＢｉＯｃｈｉｍ、１３１ｏｐｈｙｓ、ＡＣ ｔ＆促２　：　３２４−３！１０ ６、（ａｒｕｔｈｅｒｅ　、Ｍ、Ｈ，、Ｂａａｕｃａｇｅ　、Ｓ、Ｌ、　。

Ｅｈｅａｖｉｔｉｍ、Ｊ、Ｗ、　、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｅ、Ｆ、　、Ｇｏｌｄｍａｎ 。

Ｒ，ａ、、６ｅ　Ｈａｓｅｔｕ　、Ｐ、Ｌ、　、Ｍａｎｃｈｅｃｋｉ　、Ｗ、　 。

Ｍａｔｔｋｕｃｃｉ、　Ｍ、Ｄ、　、　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、　Ｍ、Ｓ、及び５ ｔａｂｉｕｌ！に７．　＆、（１９８２）　Ｃ０１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ６ｙｍ、ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏ、　４７　：　４１１−４１８ＺＭｓｌｔｏ ｎ、Ｄ、Ａ、、Ｋｒｉｅｇ、Ｐ、Ａ、、Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉ。

Ｍ、Ｒ，、Ｍａｎｉａｔｉｓ　、Ｔ、　、Ｚｉｎｎ、Ｋ、　、Ｇｒｅｅｎ。

Ｍ、Ｒ，（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｐ、ｅａ、１２　：　７ ０３５−ｆ３．　Ｌｏｖａｒｙ、ｐ、　、３Ａｍｐ８０ｎ、Ｊ、　、Ｍｉｌｌｉ ｇａｎ、Ｊ、＃Ｇｒｏｅｂｅ　、　Ｄ、及びｏｈｌｅｎｂｅｃｋ、ｏ、Ｃ，（１ ９８６）”　３ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｔＬ　Ｄ７ｎａｍｉＣ８ｏｆ　ＲＮＡ　 、ＮＡＴＯＡＳＩＢｅｒｌｅｓ　１１［］　”　ｐＩ）、６９−７６＋　８＋１ −　”ｎＫｎｌｐｐｅｕｂｅｒｇ　、Ｐ、Ｈ，ａｎｄ、　Ｈｌｌｂｅｒｓ　、Ｃ ，Ｗ、　。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒ８ｓｓ　、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋｇＭａｎｉａｔｉＳ　（１９８ ２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＣｌ０ｎｉｎ　、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ　、（ｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １０゜３ｗａｎｓｔｒＯｍ　、Ｒ，及び３ｈａｎｋ　、Ｐ、Ｒ，（１９７８）　 Ａ”１゜Ｂｌｏｃｈｅｍ、旦６，１８４−１９２゜１１、　５ａｉｋｉ、Ｒ，Ｈ ，、５ｃｈａｒｆ、Ｓ、、ＦａｌＯｏｎａ、Ｆ、。

Ｍｕｌｌｌｓ、Ｋ、Ｍ、、Ｈｏｒｎ、Ｇ、Ｔ、、Ｅｒ１ｉｃｈ、Ｈ，Ａ。

及びＡｒｎｈｅｉｍ、　Ｎ、　、（’１９Ｂ６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　： １２、　５ａｉｋｉ、Ｒ，Ｈ，、Ｂｕｇａｗａｎ、Ｔ、Ｌ、、Ｈｏｒｎ、ｃｏ’ ｒ、ｔＭｕｌｌｉｓ　、　Ｋ、Ｂ、及びＥｒ：ｕｃｈ　、　Ｈ，Ａ、　、（１９ ８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４　：　１６３−１６６１３、　Ｌｅａｅｒｍａｎ　 、Ｌ、　、ＫａＷＩＬ５１ａｋｉ　、Ｅ、Ｓ、及び３ｚａｂＯ。

Ｐ−（１９８１）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、月７．　１５８−１６３１４ 、　Ｒｅｅａ　、　Ｋ、Ｃ，及びＭａｎｎ、　Ｄ、Ａ、　（１９８５）　ＮｕＣ ｌ−Ａｃｉａｓ　Ｒθｓ、１３．　７２０７−７２２１゜１５、　Ｌａｍａｒ　 、Ｅ、Ｅ、及びｐａｌｍａｒ　、Ｆ、＋（１９８４）　Ｃｅ１１３７、　１７１ −１７７゜ １６、　Ｎｏｒｇａｒｄ９Ｍ、Ｖ、　、　Ｔｏｃｃｉ、　Ｍ、Ｊ、及びＭＯｎａ ｈａｎ　。

Ｊ、Ｊ、（１９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５．　７６６５−７６７２ −Ｉ　Ｚ］）ａｇｅｒｔ　、　Ｍ、及び　Ｅｈｒｌｉｃｈ　、Ｓ、Ｄ、　（１９ ７９）Ｇｅｎｅ　６．　２３−２８゜ １８、Ｈａｎａｈａｎ　、Ｄ、（１９８３）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ１０１−　１ ６６．５５７−５８０゜ １９、Ｈａｎａｈａｎ　、Ｄ、及びＭｅｓｅｌｓｏｎ　、　Ｍ、（１９８０）　 （）”ｎ”１０、　６３−６７゜ ２Ｑ、Ｓａｎｇｅｒ　、Ｆ、　、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　、Ｓ　、及びＣｏｕｌｓｏ ｎ　。

Ｒ，（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４ ゜５°−ＧＧＡＵＣＣＧＡＧＡ　ＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧ３°−ＣＣＵＡＧＧＣＵ ＣＵ　ＧＵＧＵＣＵＵＧＵＣＧＧＧＵＧＡＣＣＣＣＡＣＧＧＣＣＣＵＵＵＣＣＣ ＡＣＵＧＧＧＧ　ＵＧＣＣＧＧＧＡＡＡｌｌｏ　１２０ ＵＣＵＡＧＡＡＣＡＣＵＧＧＧＣＵＵＵＣＵＡＧＡＵＣＵＵＧＵＧ　ＡＣＣＣＧ ＡＡＡＧＡＣＣＵＵＧＣＣＵＵＵ　ＵＵＵＣＵＧＡＧＧＵＧＧＡＡＣＧＧＡＡＡ 　ＡＡＡＧＡＣＵＣＣＡＣＡＣＣＵＧＣＵＡＣＣＵＧＣＡＵＡＧＵＣＧＵＧＧＡ ＣＧＡＵＧ　ＧＡＣＧＵＡＵＣＡＧＵＵＵＧＡＡＧＡＡＧ　ＧＣＡＵＡＵＡＵＵ ＣＡＡＡＣＵＵＣＵＵＣＣＧＵＡＵＡＵＡＡＧＣＵＵＧＡＵＧ−３゜ ＧＡＡＣＵＡＧ−５゜ ；　ＧＣＵＧＣＡＡＵＵＣＣＡＡＵＡＣＡＣＡＧ　ＡＧＧＵＣＡＵＧＧＵ：　Ｃ ＧＡＣＧＵＵＡＡＧ　ＧＵＵＡＵＧＵＧＵＣＵＣＣＡＧＵＡＣＣＡ７　ＧＧＡＣ ＧＵＧＣＡＧ　ＣＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＵＵＣＵＡＵＣＣＵ＞　ＣＣＵＧＣＡＣ ＧＵＣＧＡＵＧＵＵＣＣＣＧ　ＡＡＡＧＡＵＡＧＧＡＦ　ＵＵＣＣＣＵＧＵＣＣ ＵＵＧＣＣＣＵＧＡＧ　ＣＡＵＧＡＧＣＡＣＣ＝　ＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧ　ＡＡ ＣＧＧＧＡＣＵＣＧＵＡＣＵＣＧＵＧＧｌ　１８０　１９０　・　２００ Ｉ　ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧ　ＧＡＣＣＡＧＣＡＣＵ　ＧＣＡＧＣＡＵＡＡＧ、Ａ ＡＧＵＣＵＵＵＡＣＣＵＧＧＵＣＧＵＧＡ　ＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣｌ　２３０　 ２４０　２５０ ：　ＵＵＣＣＡＧＵＵＵＧ　八ＡＡＡＡＵＣＡＣＵ　ＣＵＵＵＧＵＡＣＵＣ：　 ＡＡＧＧＵＣＡＡ、ＡＣＵＵＵＵＵＡＧＵＧＡ　ＧＡＡＡＣＡＵＧＡＧｌ　２８ ０　２９０　３００ ：　ＧＧＡＧＵＡＡＧＧＡ　ＣＵＡＵＡＧＧＡＵＧ　ＧＡＵＧＧＡＵＵＡＧ；　 ＣＣＵＣＡＵＵＣＣＵ　ＧＡＵＡＵＣＣＵＡＣＣＵＡＣＣＵＡＡＵＣＦＩＧＵＲ Ｅ　２ 手続補正書（自船 昭和６３年５月

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．牛、ヒツジ、ヤギ及び他の反芻動物のＹ−染色体特異的ＤＮＡ配列にのみハ イブリダイズすることのできる核酸単離物。
2. ２．ＢＲＹ．１の１本鎖もしくは２本鎖、あるいは１２もしくはそれ以上のヌク レオチドのＢＲＹ．１の隣接部分を含む請求の範囲第１項記載の核酸単離物。
3. ３．ＢＲＹ．１の１本鎖もしくは２本鎖あるいは１２もしくはそれ以上のヌクレ オチドのＢＲＹ．１の隣接部分に対応するＲＮＡを含む請求の範囲第１項記載の 核酸単離物。
4. ４．検出可能なマーカーでラベル化されている、請求の範囲第１項から第３項の いずれか１項記載の核酸単離物。
5. ５．検出可能なマーカーが、３２ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、ビオチン及びブ ロモデオキシウリジンから選ばれる請求の範囲第４項記載の核酸単離物。
6. ６．ＢＲＹ．１あるいは１２もしくはそれ以上のヌクレオチドのＢＲＹ．１の隣 接部分をコードする核酸単離物を含む複製可能なベクター。
7. ７．組織もしくは細胞試料の性染色体の構成、従つて該試料の性別を判定する方 法であつて、組織もしくは細胞試料からＤＮＡを単離し；単離したＤＮＡを支持 マトリックス上に固定化し；固定化されにＤＮＡと、請求の範囲第４項記載の核 酸単離物とを、該核酸単離物が２つの相補性配列と結合可能な条件下で、ハイブ リダイズし； 支持マトリックスから非結合核酸単離物を洗浄除去し；次いで 支持マトリックスに結合したＤＮＡに更に結合している該核酸単離物を検出する ； 工程からなる上記方法。
8. ８．固定化細胞または中期の染色体拡散体（ｓｐｒｅａｄｓ）中のＹ−染色体の 存在または不存在を判定する方法であつて、 固定化細胞または中期の染色体と、請求の範囲第４項記載の核酸単離物とを、該 核酸単離物が相補性ＤＮＡ配列と結合可能な条件下で、ハイブリダイズし；非結 合核酸単離物を洗浄除去し；次いで固定化細胞または中期の染色体への該核酸単 離物の結合を検出する； 工程からなる上記方法。
9. ９．組織または細胞試料の性染色体の構成を判定する方法であって、 組織または細胞試料からＤＮＡを単離し、コード鎖及び非コード鎖をそれぞれ分 離するために単離したＤＮＡを変性し； 変性ＤＮＡと、ＢＲＹ．１の１２もしくはそれ以上のヌクレオチドに対応する合 成オリゴヌクレオチドとをアニーリングし； 組織または細胞試料中にもし存在するならば、アニーリングしたＤＮＡとＤＮＡ ポリメラーゼとをインキュベートして、ポリヌクレオチドをＢＲＹ．１ＤＮＡ配 列の終りまで延ばし； この前列を望むだけ多くの回数繰返し生ぜしめてＢＲＹ．１のレベルを増幅し； 次いで 増幅された試料中のＢＲＹ．１ＤＮＡを、（ａ）ＤＮＡを支持マトリックス上に 固定化し；この固定化ＤＮＡと、請求の範囲第４項記載の核酸単離物とを、該核 酸単離物が相補性ＤＮＡ配列と結合可能な条件下で、ハイブリダイズし；支持マ トリックスから非結合核酸単離物を洗浄除去し；次いで支持マトリックスに結合 したＤＮＡへの核酸単離物の結合を検出する、あるいは （ｂ）ラバル化ヌクレオチド前駆体が、ＤＮＡポリメラーゼとのインキユブーシ ヨン中に含まれる場合には、試料をゲルマトリックスで電気泳動することにより 分画し、次いでラベル化ＢＲＹ．１ＤＮＡ配列を検出する、 ことによつて検出する； 工程からなる上記方法。
10. １０．組織または細胞試料が、胎児、胚、精液あるいは精液のフラクションから 得られるものである、請求の範囲第６項から第８項のいずれか１項に記載の方法 。
11. １１．核酸単離物が検出可能なマーカーでラベル化されている、請求の範囲第７ 項から第１０項のいずれか１項に記載の方法。
12. １２．検出可能なマーカーが、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、ビオチン及び ブロモデオキシウリジンから選ばれる請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項記載の核酸単離物を含む、組 織または細胞試料中のＹ−染色体特異的ＤＮＡ配列の存在または不存在を検出す るためのキット。
14. １４．更に、試薬希釈のためのバツフアーを含む、請求の範囲第１３項記載のキ ット。
15. １５．Ｙ−染色体特異的ＤＮＡ配列の単離方法であつて、（ｉ）雄性及び雌性動 物から調製された１本鎖牛デノミツクＤＮＡをアニーリングし； （ｉｉ）アニール化ＤＮＡを単離し、複製可能なベクター中に挿入し； （ｉｉｉ）アニール化ＤＮＡを含む複製可能なベクターで宿主細胞を形質転換し ；次いで （ｉｖ）形質転換した宿主細胞と、雌の反芻動物のデノミツクＤＮＡから調製し たラベル化ＤＮＡプローブとをハイブリダイズし、ラベル化プローブと結合しな い牛のゲノミックＤＮＡを含む宿主細胞を同定する；工程からなる上記方法。