JPH01500993A - ジスコルハブジン化合物およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ジスコルハブジン化合物およびそれらの使用方法発明の分野 この発明は新規のジスコルハブジン（ｃｌｆｓｃｏｒｈａｂｄｉｎ）化合物に関 する。これらの化合物は有用な抗腫瘍、抗菌および抗真菌活性を有する。加えて 特に、この発明は、海洋生物、すなわちラトルンキニリア（Ｉａｔｒｕｎｃｕｌ ｉａ　）属の海綿、に由来する新規の抗腫瘍、抗菌および抗真菌ジスコルハブジ ンとそれらの使用方法に関する。

発明の背景 人間は腫瘍が関与する種々の病気にかがる。多くの研究が腫瘍学および抗腫瘍手 段に当てられている。腫瘍は種々の哺乳動物において普通に存在し、哺乳動物に おける腫瘍の予防、成長の抑制および退行は人間にとって重要である。腫瘍とい う用語は、本来の組織または宿主の生体全体の体系と調和しない新しい組織増殖 物の異常な塊を意味する。

腫瘍は、さまざまな形態の癌および結果としておこる癌性悪液質を含む種々の病 気および状態を哺乳動物および人間に課する。癌性悪液質とは、哺乳動物が腫瘍 を患うことに伴う徴候の苦痛を意味する。これらの徴候は、例えば体重の減少に よって明らかな患った哺乳動物が弱った状態を含む。癌の重大性はよく知られて おり、例えば、人間において死因としては心臓血管疾患に劣るだけである。

多くの研究および資産が、腫瘍学および化学療法を含む抗腫瘍手段に当てられて いる。腫瘍の増殖の阻止、緩和または抑制を助けるある方法および化合物が開発 されてはいるものの、さらなる抗腫瘍方法および化合物が必要とされている。

細菌は、人間にとって実用的な重要性のあるものである。

ある細菌は産業においておよび土地を肥沃にするために有用であり、他のものは 有害である。細菌は人間、他の動物および植物において、例えば人間における、 ボツリヌス菌中毒、ジフテリア、破傷風および結核を含む病気の原因となる。細 菌は、また、種々の食物、例えば乳製品の腐敗による大規模な経済的損失を引き 起こす。

重大な資産およびエネルギーが、細菌が引き起こす疾病に係わる細菌学および免 疫学に当てられている。多くの方法および化合物が病気を引き起こす細菌の抑制 に利用されているが、新規の抗菌方法および化合物が必要である。

真菌の増殖の阻止および哺乳動物と植物に起こる感染と疾病の阻止もまた人間に とって重要なことである。真菌の存在は、人間において、真菌症、例えば肺カン ジダ症および肺プラストミセス症を含む疾病および感染の原因となることがあの 重大な感染を引き起こすことがある。より一般に知られている人間および哺乳動 物の真菌感染には、皮膚の抵抗性感染の他に、毛髪および爪の部位の真菌感染で ある輪瘤が含まれる。他の多くの真菌は、人間および哺乳動物の皮膚、粘膜、腸 管、膣周辺および肺に感染する。

植物もまた種々の真菌に冒される。真菌感染によって農業に与えられる損害は、 毎年総額１０億ドルに達する。さまざまな無機および有機の静真菌剤および殺真 菌剤が試みられているが、限られた成功しか得られていない。もちろん、真菌は 殺すが植物は殺さず、かつその植物から製造した食物に毒性残渣を残さないこと は静真菌剤および殺真菌剤にとっては重要である。農業においては、真菌感染に 対抗するために、植物を天候に耐性を有する予防用の殺真菌剤でコートするフォ ウリイッジ・ファンジャビサイド法（ｆｏｌｉａｇｅ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ　） を含むさまざまな方法が利用されている。種子の処理および土壌の処理は、種子 にとって安全でありかつ土壌および土壌微生物による減成に抵抗する抗真菌剤を 必要とする方法である。化学療法剤は、植物に行きわたって新たな成長を保護し 、またはすでに植物体内に発生した感染を排除する殺真菌剤である。農業用の静 真菌剤および殺真菌剤およびそれらの適用は、例えば米国国内で公表されている 非常に厳しい要求および規制に応じなければならない。

多くの研究および資産が、哺乳動物と植物の両者における真菌感染との戦いに当 てられている。哺乳動物と植物の両者における真菌および真菌に起因する疾病の 蔓延の阻止および感染した哺乳動物と植物の治療を援助するある抗真菌剤および 方法が開発されてはいるが、新規の方法および抗真菌化合物が必要である。

ラトルンキュリア属の海綿の抽出物に由来するある有機化合物が、有用な抗腫瘍 、抗菌および抗真菌活性を有することが見出されている。ラトルンキュリア属は 、強靭海綿目（Ｈａｄｒｏｍｅｒｉｄａ）　、ラトルンキュリイダエ・ドブセン トに属する２９種（１種は３亜種を有する）が記述されている。

この属は、水深２０メートルをこえ、１２００メートル未満の寒冷、温和および 温暖な海（北極、南極、ケルゲレン諸島、ニューシーラント、リオデラブラータ 、アゾレス諸島、地中海および紅海）に存在する。

ある化合物は、以前に海綿ラトルンキュリア・マグニフィ力（ｍａｇｎｉｆｉｃ ａ　）から単離されている。ラトルンキュリンス（Ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎｓ　 ）　Ａ％　８％　ＣおよびＤと命名されたこれらの化合物は２−チアゾリジノン マクロライドであり、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓｓ　２１　３Ｂ ２９頁（１９８０）　ｒラトルンキニリンス；新規２−チアゾリジンマクロライ ド」およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　４ｉ、１９０５−１９ １４　（１９８５）　ｒラトルンキュリンスＮＭＲ研究、２種の新しい毒および 合成の試み」およびそれらに引用されている参考文献に、カシュマン（Ｋ　ａｓ ｈｒＡａｎ）らによって報告されている。これらの参考文献のすべての開示は、 このように参考文献によってこの中に組み込まれている。ラトルンキニリンスは 培養細胞中のミクロフィラメント器官を分裂させる非常に有力な化合物の新しい 種類として報告されている。このように海綿および他の海洋生物は、人間にとっ て有用な原料の供給源になり得る。

発明の要約 したがって、抗腫瘍、抗菌および抗真菌剤として有用な新規化合物およびそのよ うな新規化合物の製造方法を提供することがこの発明の目的である。

新規抗腫瘍、抗菌および抗真菌化合物を使用して、腫瘍、細菌および真菌の増殖 および結果として生じた感染および疾病を阻止する方法を提供することはこの発 明の追加の目的である。

この発明の追加の目的および利点は、一部は以下の詳細な説明において説明され 、一部はこの詳細な説明から明らかになるであろうし、またこの発明の実施によ って学ばれることもある。この発明の目的および利点は、特に係る請求におｔｌ て指摘した化合物、製法、方法および組み合わせによって実現し、かつ得られる 。

この発明の目的を達成するために、ここに具体化し、かつ充分に記述したように 、この発明は一般式Ｉ−Ｈの化合物を含む。

（ここで　Ｘｉ　、Ｘ２　、Ｘ３およびＸ４は同じかもしくは異なっており、ハ ロゲン、水素もしくはヒドロキシである。）この発明の好ましい態様においては 、化合物は実質的に純粋であって、ＸｌもしくはＸ２が臭素であり、かつＸ３も しくはＸ４が水素である。この発明のさらに好ましい態様においては、この発明 は式ＩＶ−ＶＩの化合物を含む。

ここに具体化しかつ充分に記述したように、この発明はまた、活性成分として抗 腫瘍、抗菌または抗真菌に有効な量の式１−ＶＩに相当する化合物の１種以上お よび非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する抗腫瘍、抗菌ま たは抗真菌剤組成物を含む。

ここに具体化しかつ充分に記述したように、この発明はまた、式Ｉ−ＶＩの化合 物の製造方法を含む。この方法は、二上ルンキニリア属の海綿を採集し、この海 綿を適当な有機溶媒系と接触させて抽出物を得、そして分画した抽出物から式Ｉ −ＶＩに相当する化合物を単離する工程を含む。

ここに具体化しかつ充分に記述したように、この発明は、抗腫瘍に有効な量の式 Ｉ−ＶＩの化合物の１種以上を腫瘍細胞に接触させることからなる腫瘍阻害のた めの方法をさらに含む。

ここに具体化しかつ充分に記述したように、この発明は、抗菌に有効な量の式Ｉ −Ｖｌの化合物の１種以上を細菌に接触させることからなる細菌阻止のための方 法をさらに含む。

ここに具体化しかつ充分に記述したように、この発明は、抗真菌に有効な量の式 Ｉ−Ｖｌの化合物の１種以上を真菌に接触させることからなる真菌の増殖阻止の ための、および真菌を死滅させるための方法をさらに含む。

前述の一般的な、および以下の詳細な記述は共に典型的かつ説明的なもののみで あり、請求した発明の制限を意図するものではないことは理解されるであろう。

発明の好ましい態様の詳細な説明 ここでは、この発明の好ましい態様について詳細な説明を行ない、その実施例を 以下の実施例の部分で説明する。

この発明の目的を達成するために、この発明に従って新規の化合物が提供され、 ここに具体的かつ充分に記述されているように、この発明は以下の一般式Ｉ−Ｈ の化合物を含む。

（ここで、Ｘｌ、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は同じかもしくは異なっていて、ハロゲ ン、水素もしくはヒドロキシである）この発明の好ましい態様においては、化合 物は実質的に純粋であり、またＸｌまたはＸ２は臭素であり　Ｘ３およびＸ４は 各々水素である。

この発明のさらに好ましい態様においては、この発明は以下の式ＩＶ−Ｖｌの化 合物を含む。

この発明に従うことにより、非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤中 に存在する、上述のおよび式Ｉ−Ｖｌで識別される化合物の１種もしくはそれ以 上の抗腫瘍有効量を活性成分として含む抗腫瘍剤組成物が提供される。抗腫瘍剤 組成物を使用する条件が変化するので有効量は変化するが、活性に必要な最少投 与量は、一般に腫瘍細胞１０５個に対して０．０５ないし１００μ９である。非 毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤の有用な例にはエタノール、ジメ チルスルホキシドおよびグリセリンが含まれるが、これに限定されるものではな い。

この発明に従うことにより、腫瘍を式１−ＶＩの化合物の１種またはそれ以上の 抗腫瘍有効量と接触させることを含む、宿主体内での腫瘍阻害のための方法が提 供される。この発明の化合物の腫瘍阻害に対する効果は、哺乳類を含む宿主体内 での腫瘍の抑制および癌性悪液質の治療に対するそれらの有用性を示している。

この発明に従うことにより、上述の式１−ＶＩで示される化合物の１種またはそ れ以上の抗菌有効量を活性成分として、および非毒性の薬理学的に許容し得る担 体または希釈剤を含む抗菌剤組成物が提供される。有効量は変化することがあり 、抗菌剤組成物が使用される条件も変化するが、活性に必要な的に許容し得る担 体または希釈剤はエタノール、ジメチルスルホキシドおよびグリセリンを含むが 、これに限定されるものではない。

この発明に従うことにより、細菌を式１−Ｖｌの化合物の１種またはそれ以上の 抗菌量と接触させることを含む、宿主体内での細菌の阻止方法が提供される。細 菌の阻止に対するこの発明の化合物の効果は、哺乳類を含む宿主体内での細菌お よび細菌が関連する病気の抑制に有用であることを示している。さらに、そのよ うな化合物は、細菌の存在および増殖による食物の腐敗を妨げるために利用する ことができる。

この発明に従うことにより、非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤中 に存在する上述の式Ｉ−ＶＩで示される化合物の１種またはそれ以上の抗真菌有 効量を活性成分として含む抗真菌剤組成物が提供される。有効量は変化すること があり、抗真菌剤組成物が使用される条件は変化するが、活で１ないし１０μｇ ／ｒｄである。非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤の有用な例は、 エタノール、ジメチルスルホキシドおよびグリセリンを含むが、これに限定され るものではない。

この発明に従うことにより、真菌を式Ｉ−ＶＩの化合物の１種またはそれ以上の 抗真菌量と接触させることを含む、宿主体内での真菌を阻止するための方法が提 供される。この発明の化合物の真菌の阻止についての効果は、哺乳類を含む宿主 体内での真菌および真菌が関連する病気の抑制についてのそれらの有用性を示し ている。さらに、そのような化合物は農業用殺真菌剤として有用である。

この発明に従うことにより、式！−ＶＩの化合物の製造方法が提供される。この 方法は、ラトルンキュリア属の海綿の試料を採集し、海綿を適当な有機溶媒系と 接触させて抽出物を得、この抽出物を逆層クロマトグラフィーによって分配して いくつかの分画を得、および分画した抽出物から式Ｉ−Ｖｌの化合物を単離する 工程を含む。

この発明の好ましい態様において、適当な有機溶媒系は、メタノール、トルエン 、塩化メチレン、アセトン、メチルエチルケトン、エチルアセテート、エタノー ル、メチルイソブチルケトンおよびそれらの混合物からなる溶媒の群から選ばれ る。特に好ましい溶媒系は、メタノールとトルエンまたは塩化メチレンのいずれ かとの混合物である。

上に挙げた溶媒は、この発明に有用な溶媒にとして現在のところ好ましい選択で はあるが、他の適当な溶媒に置き換えることもできる。適当な溶媒系は、海綿の 他の成分から式Ｉ−ＶＩのうちの１つに相当する化合物を抽出することができる ものである。当業者に知られているように、この発明の溶媒系では異なった割合 の溶媒および組み合わせが用いられることもある。

この発明による化合物は、得られた分画から様々な合成およびクロマトグラフィ ーの技法によって合成および／または単離される。当業者に公知の適当な分別お よび単離法を、この発明に従って、用いることができる。適当な分別法は、当業 者に公知の適当なカラムを用いた逆層フラッシュクロマトグラフィー　（ｒｅｖ ｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｆｌａｓｈ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＲＰＦＣ） または逆層液体クロマトグラフィー（ＲＰ　Ｌ　Ｃ）（例えば、アルチック（Ａ ｌｌｔｅｃｈ）　Ｃ８カラムまたはメルク・ローバー・リクロブレップ（Ｍｅｒ ｃｋ　Ｌ　ｏｂａｒ　Ｌ　１Ｃｈｒｏｐｒｅｐ　）　ＲＰ　−８（カラム）を用 いて、適当な溶媒、例えばメタノール：　Ｈ２０＋０．０５％トリフルオロ酢酸 が１：４ないし４：１であるもので溶出する）のような様々なりロマトグラフィ ー技法を含む。

式Ｉ−Ｖｌの化合物を製造するための、この発明の方法の好ましい態様のより詳 細な記述および説明は、実施例の項にある。

したがって、この発明の化合物、この発明の化合物の製造方法およびこの発明の 化合物の使用方法は、この発明の目的が達成して腫瘍、細菌および真菌の阻害お よび死滅に効果的であり、それ故そのような腫瘍、細菌および真菌によって起こ る、またはこれらに関連する疾病、感染症および損傷の抑制に効果的であること は明らかである。

実施例 発明を実施例によって説明する。実施例はこの発明の範囲を制限することを意図 するものではない。上述した詳細および一般的な記述に加えて、実施例はこの発 明のより深い理解を与え、かつこの発明の化合物の製造方法の概要を述べる。

以下の実施例は、この発明の上記目的を果たすための、この発明の化合物、製法 および方法の好ましい態様を表わす。

実施例において、調製方法が示されていない出発物質および試薬は、化学品問屋 のような当業者に公知の源から入手した市販品である。

ニューシーラント、カイコウラ（Ｋ　ａｉｋｏｕｒａ　）半島性の２０ないし７ ５メートルの深さで、トローリングおよびスキューバダイビングによって、ラト ルンキュリア属デュボカージ（ｄｕ　Ｂｏｃａｇｅ　）の赤褐色の海綿を採集し た。海綿の１５０ｇを細分し、凍結乾燥し、粉砕して粉末にし、そしてメタノー ル／トルエン（３：１．１））でパーコレートすることによって抽出した。溶媒 を除去することによって逆層（ＲＰ）物質（メルク・リクロブレップＲＰ−８， ４４０−６３ｔｔ、約１０ｇ）上を覆う赤褐色ペースト（９，７ｇ）を得、水性 スラリーとして同じ物質（約４０ｇ）を充填したクロマトグラフィーのカラムの 頂部に導入した。

まず水で、次いでメタノールからジクロロメタンまでの段階的な勾配を有する浸 漬液で溶出することによって１２の分画が得られた。細胞傷害性分画５ないし９ を合わせ（０，７７ｇ）　、ＲＰ物質上（６ｇ）に塗布し、そしてプレカラム（ ｐｒｅｃｏｌｕａ＋ｎ　）に充填した。これを調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　 ）ＲＰカラム（メルク−ローバー・リクロブレップＲＰ−８，２５１＋！ＩＸ　 ２５０ｍｍ）に接続し、４０％のＭｅＯＨと６０％のＨ２０十０．０５％トリフ ルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を用いて９ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。主要成分を含有 する分画を合わせ、蒸発させた（０．２８ｇ）　、この物質の粗製試料（ｓｕｂ ｓａａｐｌｅ　）　（２０Ｂ）を、７０％のＭ　ｅ　ＯＨと３０％のＨ２０＋０ ．０５％ＴＦＡを用いて５１１１／ｗｉｎで溶出する半調製（ｓｅ口ｉ　−ｐｒ ｅｐａｒａｔｌｖｅ　）ＲＰＬＣ（アルチック０８カラム、２５０ｍｍ　Ｘ　１ ０ｍｇ）によってさらに精製した。

これによって、塩酸塩として特徴付けられた、ＭｅＯＨ。

Ｈ２ＯおよびジメチルスルホキシドＣＤＭＳＯ）に可溶の赤色固体であるジスコ ルハブジンＣ（１２ωｇ）が得られた。

ｕｐ、＞　３６０＠ ［α］　ｏ　Ｏ（ｃＯ，０５゜ＭｅＯＨ）ＩＲ（ＫＢｒ）　３７００−２５００ ．１６７５．１５８５．１５４０．１３２５．１０２０．６９５ｉ−” Ｕ　Ｖ　ＣＭ　ｅ　ＯＨ）　２４５　（ｔ　２８５００）、３５１　（ε１００ ００）、５４５ｎｏ＋　（ε　５００） ＵＶ　（ＭｅＯＨ／ＫＯＨ）　３３７　Ｃｔ　１３０００）、４ｇ１ｎｉ（ε１ ５００） １ＨＮＭＲ（ｄ　４−Ｍ　ｅ　ＯＨ，８０ＭＢＺ）　６７．７０（ｓ。

２Ｈ）　、７．２８　（ｓ、ＩＨ）、４．０−３．７　（ｍ、　４Ｈ）、３．０ 　（ｔ　ＳＪ　−８Ｈｚ、　２Ｈ）、２．２ｐｐｍ　（ｔ、　Ｊ−６Ｈｚ、２Ｈ ） １３ＣＮＭＲδ　１７１．５　（Ｓ　）、１８５．５　（ｓ　）、１５３．３（ ｓ）、１５１．９　（Ｓ　）、１５１．４　（２ｘ　ｄ）、１２７−８　（ｄ　 ）、１２３．７　（Ｓ　”）、１２３．３　（ｓ　）、１２２．７　（２Ｘ　ｓ 　）、１２０．０（ｓ）　、９１．８（ｓ）　、４４．８（ｓ）　、４３．８（ ｔ）　、３８（ｔ）、３３．８　（ｔ）　、１８．２　（ｔ）ＦＡＢＭＳ　（グ リセリンマトリックス）　ｍ／ｚ　４６２／４８４／４８Ｂ　（ＭＨ＋） 実施例２ １９８２年１２月にニューシーラント、カイルコウラ（Ｋ　ａｌ　１ｋｏｕｒａ ）半島沖の１１０ないし１４５メートルの深さで、トローリングおよびスキュー バダイビングによって、ラトルンキュリア属デュボカージの緑色海綿を採集した 。緑色海綿１６８　ｇを混合し、Ｍ　ｅ　ＯＨとＣＨ２ｃノ２で抽出することで 、溶媒を除去した後に緑色抽出物を得た（１１．３９）。これを逆Ｊｉｆｆ（Ｒ Ｐ）カラムで分配することで、ジスコルハブジンＡを豊富に含むいくつかの細胞 傷害性分画を得た。半調製ＲＰＬＣ（アルチック０８カラム、２５０ｍｍ　Ｘ　 １０ｍｍ、６５％のＭ　ｅ　ＯＨと３５％のＨ２０＋０．０５％トリフルオロ酢 酸を用い５ｍ／ａ＋ｉｎで抽出、２１０ｎｍで検出）によって純粋ジスコルハブ ジンＡを得た。

性質（塩酸塩として）：緑色固体、Ｄｐ、　＞　３６０”、ＭｅＯＨＳＨ２０お よびＤＭＳＯに可溶［ａ］　Ｄ　＋４００　（ｃｏ、０５、ＭｅＯＨ）ＢｒＳＣ ノおよびＳを含有する（蛍光Ｘ線分析による）燃焼分析：　Ｃ４５，０９％、Ｈ ３，０８９６、Ｎ８．５１％、Ｃｆ−２５２Ｍ５　：　４１６／４１ｇ　（ＭＨ ＋）ＦＡＢＭＳ　：　４１Ｂ／４１８　ＣＭＨ”　’）Ｅ　ＩＭＳ　：　３８３ ／３８５　（Ｍ−Ｓ）Ｉ　Ｒ（ＫＢ　ｒ）　：　３７００−２４００．１６８０ ．１６２０．１５８５．１５３０．１４１０．１３８５、５３０ｉ−１ ＵＶ　（Ｍｅ　ＯＨ）　２４９　（ε２９５００）、　３５１　（ε１０５００ ）、５６７ｎｍ　（ε　９００） ＵＶ　（ｈｉｅ　ＯＨ／ＫＯＨ）　３３５　Ｃｅ　１４０００）、　４７３ｎｍ （ε１０００） １０００）１ＨＮ　ＭｅＯＨ−８０ＭＨｚ）　６７．６４（Ｓ、ＩＨ）　、７． ２４　（ｓ、ＬＨ）　、５．４０　（ｄｄＳＪ　−１，０，３，８Ｈｚ。

Ｉ　Ｈ）　、４．５５　（ｄｄ、Ｊ　−６，８，１２，２七、ＩＨ）、　３．８ −４．１（ｍ、２Ｈ）、　３．２−２．８　（ｍ、　５Ｈ）　、２．６０ｐｐｍ 　（ｂｒｄ。

Ｊ　−１２，６Ｅ！ｚ、Ｉ　Ｈ） １３ＣＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ１２０ＭＨｚ）　６　１８６．７Ｃ５）、　１６ ５．８　（Ｓ　）、　１５３．８　（ｓ　）、　１５０．２　（Ｓ　）、１４８ ．０　（ｄ　）　、　１２７．３　（ｄ　）　、　１２５．９　（ｓ　）、　１ ２３．３（２Ｘｓ）、　１１９．８　（ｓ　）、　１０３．８　（ｓ　）　、５ ８．８　（ｄ）、５３．８　（ｄ）　、４９．６　（ｓ）　、４４．５　（ｔ） 　、４４．４　（ｔ）、４２　（ｔ）　、１ｇ、１ｐｐｆｌｌ（ｔ）実施例３ ニューシーラント、カイコウラ半島沖の２０ないし７５メートルの深さで、トロ ーリングおよびスキューバダイビングによって、ラトルンキュリア属デュボケー ジの緑色海綿を採集した。海綿試料（１７ｇ９）を凍結乾燥して粉砕した後、メ タノールおよびトルエンで抽出することによって、溶媒を除去した後、緑色抽出 物（１２，７ｇ）を得た。これを逆層（ＰＲ）カラムで分配することで、ジスコ ルハブジンＢを豊富に含有するいくつかの細胞傷害性分画を得た。調製ＲＰＬＣ （メルク・ローバーＲＰ−８カラム；　２５０ｍｍ　Ｘ　２５ｍｍ　；　３５％ Ｍ　ｅ　ＯＨｓ６５％［Ｈ２０＋０．０５％トリフルオロ酢酸］を４ｍ／ａ＋ｉ ｎで用いた）を使用した工程をさらに２回行なうことによって純粋ジスコルハブ ジンＢを得た。

塩酸塩としての性質は、Ｍ　ｅ　ＯＨおよびＨ２Ｏに難溶でＤＭＳＯに可溶の緑 色固体である。

蛍光Ｘ線分析によるとＢｒ５ＣＪおよびＳを含有する。

Ｉ　Ｒ（ＫＢ　ｒ）　：　３７００−２４００．１７４０．１６５０．１６２０ ．１５２０．１４１０、５３０ｃｍ１ １ＨＮＭＲ（ｄ４−ＭｅＯＨ，３００ＭＨｚ）　６７．８７（ｓ。

ＩＨ）　、７．２１（ｓ、ＩＨ）　、６．２４（ｓ、ＩＨ）　、５．７２（ｄ。

Ｊ　−４，０Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）　、３．７２−４．００　（ｍ、２Ｈ）　、２．９ ０−２．９５（ｍ、２Ｈ）　、２．８１　（ｄＳＪ　−１１，５Ｈｚ、Ｉ　Ｈ） 　、２．５４　（ｄｄ。

Ｊ　−４，０，１１，５七、ＩＨ） １３ＣＮＭＲ（ｄ６　ＤＭＳｏ、２０ＭＨｚ）　６　１７３．４（ｓ）　、１６ ９．２　（ｓ）　、１６４．５　（ｓ）　、１５３．６　（ｓ）　、１５０．４ 　（ｓ）　、１４５．４　（ｄ）　、１２７．６　（ｓ）　、１２７．２　（ｄ ）、１２３．０　（ｓ）　、１２２．６　（ｓ）　、１１９．８　（ｓ）　、１ １８．８　（ｄ）、９６．７　（ｓ）　、６０．８　（ｄ）　、５０．７　（ｓ ）　、４４．８　（ｔ）　、ｃａ　４１　（ｔ）　、１７．８　（ｔ）　ｐｐｒ ｎ抗微生物および細胞傷害作用アッセイ工程ＢおよびＣのふるい分けを、事前に 植えつけた８５ｇのペトリ皿を用いて行なった。バイオアッセイディスク（６Ｍ ）に試験溶液の一定量を染みこませ、風乾してプレートに貼った。

これらを３５℃で１８時間インキュベートし、阻止域の直径を記録した。

バイオアッセイディスクに適用され、上述の標準アッセイに使用される各希釈剤 の溶液４０ｕｌを用いた、標準溶液の連続ｌ：２希釈によって、ディスク希釈濃 度（ＤＤＣ）が得られた。最終点は、依然として阻止域を示す最も希釈した溶液 である。その溶液の濃度がＤＤＣである。

最少阻止濃度（ＭＩＣ）を以下の手順によって得た。

ＭＩＣ手順 試料を適当な溶媒（例えばメタノール）中に分っている濃度（＋ｎｇ／ｍ）で調 製する。連続に２希釈を以下のように行なう。ラックに１０本のチューブ（１２ Ｘ７５ｍｍ）を置き、溶媒１．０ｇを＃２から＃工Ｏまでのチューブに入れる。

出発溶液２．０１ｎ！！をチューブ＃１に入れ、その１がを＃２に移し、よく混 合した後チューブ＃２の１．０ａｉ７を＃３に移し、よく混合した後チューブ＃ ３のｉ、ｏｍを＃４に移し、など＃１０まで続ける。

一定量、通常４０ｕ１を、各チューブから別々のろ紙ディスクに移し、乾燥させ 、適度に植えつけた寒天プレート上に置く。

そのプレートを微生物に適当な温度で一晩インキユベートし、１ｇ−２４時間後 に読取る。依然として阻止域を作る最も希釈した溶液によって最終点が与えられ る。この溶液の濃度がＤＤＣである。比較のために、これを重量／ディスクに変 換することができる。

細胞傷害作用アッセイ １５關のウェル（ｖｅｉｌ）に、５％子ウシ血清（ＥＭ５Ｃ）を含有するイーグ ルＭ　Ｅ　Ｍ中にＢＳＣ（サル腎臓）細胞を３、ＯＸ　１０４細胞／ｍｊ７懸濁 させた懸濁液１ｇを植えつけることによってアッセイウェルを調製した。このウ ェルを、８５−９０％が融合するまで、増湿ＣＯ２インキユベータ−（ｈｕＩｌ ｌｄｌｆｉｅｄ　ＣＯ２１ｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７　でインキユベート した。この培地をウェルから無菌的に吸引し、２％二ユニーＮｕ　）血清および ２９６４　Ｋ　ＣＰ　Ｓメチルセルロースを含有するイーグルＭＥＭ１ｍｆを被 せた。バイオアッセイディスク（６ｕ）に試験溶液の所望量を染みこませ、風乾 し、被覆層を通してディスクを押すことによって単層に貼り付け、さらにウェル を５％Ｃｏ２濃厚雰囲気において３７Ｃで２４時間インキュベートした。細胞傷 害作用域を倒立顕微鏡を用いて測定した。細胞傷害作用の測定は、以下に示す領 域の直径で評価した。

十６−　８ｍｍ ＋＋８−１０關 十＋＋１０−１２關 ＋＋＋＋　１２−１５關 発明の化合物の抗腫瘍活性 以下のアッセイ法は、この発明のジスコルハブジン化合物の抗腫瘍効果を説明す るために用いた。

Ｌ　１２１０およびＰ３８８マウス白血病細胞アッセイ細胞系の保持 Ｌ　１２１０およびＰ３８８マウス白血病細胞を、１０％ウマ血清、４　ｉＭグ ルタミン、および２０關ｇ／ｌ！Ｊゲンタマイシン（バイオロゴス（Ｂ　ｉｏｌ ｏｇｏｓ　）社）を用いたダルベツコ（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ　）ＭＥＭ培地で培 養する。細胞は１０％ＣＯ２中でインキュベートし、１週間に２回継代培養する 。

手順 １．２４ウエルプレートの各ウェルまたはチューブに化合物を添加し、溶媒を蒸 発させて乾燥させる。

２、各ウェルまたはチューブに２ｍ　（１，２Ｘ１０５）の細胞を添加して混合 する。

３．１０％Ｃ０２において３７　で４８時間インキュベートする。

４、倒立顕微鏡を用いてプレートを読取り、以下のように１＋から４＋まで活性 を評価する。対照の増殖に対して９０％をこえるものをＮＤ（検出不可能）　、 ７５−９０％を１＋、５０−７４％を２＋、２５−４９％を３＋、２５％未満を ４＋とする。

細胞の計数は各チューブごとに行ない、結果は対照に対する百分率として記録す る。

５、抗腫瘍活性は、代わりに、プレートにおける腫瘍細胞の増殖の５０％阻止を 達成するに必要な最少濃度であるＩＣ９゜とじて表わす。

発明の化合物の抗真菌活性 以下のアッセイ法は、第１表に報告したように、この発明のジスコルハブジン化 合物のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗真菌効果を示すために用いた。

Ｃ，アルビカンス（ＣＡ）をサブロー・デキストロース寒天培地上で培養し、単 一のコロニーを形成させ、そのうちの一つをサブロー・デキストロース・ブロス に接種する。そのブロスを２０Ｏｒｐｍで振とうさせながら３７Ｃで１８時間イ ンキュベートし、１０％（容量／容量）グリセリンと共に一８０Ｃで凍アッセイ の工程 一ス寒天培地に接種し、細胞濃度を約１０００細胞／ＩＬＩ！とする。

１００１×１０ｃ１１のペトリ皿内に植えつけた寒天１０１Ｌｌを用いたプレー トを調製する。これらのプレートをアッセイに必要となるまで４Ｃで保存する。

ベーパーディスク（６，３５ｍ）に試験物質を染みこませ、乾燥させる。その後 、それらを上述したように調製した試験プレートの表面に置く。プレートを３７ Ｃで一晩インキユベートする。この後増殖阻止域を読み取ることができ、これら は領域の直径としてミリメートルで表わされる。

２、最少阻止濃度（ＭＩＣ） ９６ウエルマイクロタイタープレートを用いて、サブローデキストロースブロス ５０ｕｌ中に薬剤の２倍希釈剤を調製する。

Ｃ，アルビカンスの接種物を小容量添加し、細胞濃度を約１０００細胞／ｇとす る。プレートを３７Ｃで一晩インキユベートする。その後、各ウェルに塩化トリ フェニルテトラゾリウム（１％重量／容量）を添加する。さらに２時間インキュ ベートすることによって微生物が濃く着色される。ＭＩＣは、増殖を完全に阻止 する、薬剤の最も低い濃度である。

第１表 ＢＳＣ細胞、０．０５ｕｇ／ｍｊ７、十十域Ｌ　１２１０細胞、ＩＣ５ｏ、０． ０３ｕｇ／Ｉｎ１ＥＳＣ細胞、０．０５ｕｇ／Ｒ１，＋　＋千載Ｌ　１２１０細 胞、ＩＣ５ｏ、０．０５ｕｇ／Ｒ１！Ｐ３８８細胞、ＩＣ５ｏ、０，０５ｕｇ／ ｍｊ７上の結果は、ジスコルハブジンＡ、Ｂ、およびＣがＵｖｉｔｒｏで活性な 抗菌、抗真菌、およ、び抗腫瘍剤であることを報告している。これらの結果は、 式Ｉ−ＶＩのジスコルハブジン化合物が、宿主体内で細菌、真菌および腫瘍の増 殖を阻害し、そのような細菌、真菌および腫瘍によって引き起こされる疾病を阻 止することに有用であることを示している。

この発明の範囲は、この中の記述、実施例および示唆された用途、およびこの発 明の精神から離れることなくなされる修正によって限定されることはない。この 発明のジスコルハブジン化合物は新規の分子骨格を有しており、これから多くの 誘導化合物または化合物の系列を調製することができる。

この発明は、そのような誘導体を、この発明の修正および発明の範囲内にあると 考える。例えば、上述の好ましい態様に類似した抗腫瘍、抗菌および抗真菌活性 を有する可能性のある、ヒドロキシまたはフッ素置換誘導体のような実施例１お よび２の化合物の誘導体を調製することができることが注目される。さらに、こ こに記述した化合物は、例えば、鎮痛性の適用または他の化合物の調製のための 出発物質として、というように他の有用な適用を持つ可能性がある。この発明の 化合物を治療に使用することは、現時点でまたは将来を見通して当業者に公知の 適切な治療法および技術によって成し遂げることができる。このように、かかる 請求およびそれらの同等物の範囲内に入るこの発明の修正および変形を、この発 明が保護することが意図されている。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の一般式のいずれか一つの化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は同じか または異なっており、ハロゲン、水素またはヒドロキシである）２．Ｘ１および Ｘ２の少なくとも一つがＢｒであり、かつＸ３およびＸ４がそれぞれ水素である 請求の範囲第１項に記載の化合物。 ３．以下の式で表わされる請求の範囲第１項に記載の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼または ▲数式、化学式、表等があります▼４．前記化合物が実質的に純粋である請求の 範囲第１項に記載の化合物。 ５．前記化合物が実質的に純粋である請求の範囲第３項に記載の化合物。 ６．活性成分として、抗腫瘍有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以 上および非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する抗腫瘍剤組 成物。 ７．腫瘍を抗腫瘍有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触さ せることを含む、宿主体内での腫瘍阻止方法。 ８．腫瘍を抗腫瘍有効量の請求の範囲第３項に記載の化合物の１種以上と接触さ せることを含む、宿主体内での腫瘍阻止方法。 ９．腫瘍を抗腫瘍有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触さ せることを含む、哺乳動物の宿主体内での腫瘍阻止方法。 １０．活性成分として、抗菌有効量の請求の範囲第１項記載の化合物の１種以上 および非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する抗菌剤組成物 。 １１．細菌を抗菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触さ せることを含む細菌阻止方法。 １２．細菌を抗菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触さ せることを含む、宿主体内での細菌阻止方法。 １３．細菌を抗菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触さ せることを含む、哺乳動物の宿主体内での細菌阻止方法。 １４．活性成分として、抗真菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種 以上と非毒性の薬理学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する抗真菌剤組成 物。 １５．真菌を抗真菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触 させることを含む真菌増殖阻止方法。 １６．真菌を抗真菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触 させることを含む、宿主体内での真菌増殖阻止方法。 １７．真菌を抗真菌有効量の請求の範囲第１項に記載の化合物の１種以上と接触 させることを含む、哺乳動物の宿主体内での真菌増殖阻止方法。 １８．請求の範囲第１項に記載の化合物の製造方法であって、 ラトルンキュリア属の海綿を採集する工程、前記海綿を適切な有機溶媒系と接触 させる工程海綿から溶媒抽出物を得る工程 および 抽出物から請求の範囲第１項に記載の化合物を単離する工程 を含む化合物の製造方法。 １９．化合物が、化合物の単離の前に少なくとも一つの追加合成工程を要するも のである請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０．宿主体内で腫瘍の存在によって起こる癌性悪液質の処置のための治療方法 であって、前記腫瘍の細胞を請求の範囲第１項に記載の化合物の抗腫瘍有効量と 接触させることを含む方法。 ２１．宿主体内で腫瘍の存在によって起こる癌性悪液質の処置のための治療方法 であって、前記腫瘍の細胞を請求の範囲第３項に記載の化合物の抗腫瘍有効量と 接触させることを含む方法。