JPH01501038A - 発現生成物の細胞内指図された輸送 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９８６年９月２６日に提出された出願番号第９１２．４０８号の一 部継続出願である。

タンパク質性遺伝子生成物の輸送を向けるための技法に関する。

背景 植物細胞は、膜により境界を定められた個々の副細胞室を含む。光合成植物にお いて、最っとも目だったオルガネラは、クロロプラストである。葉の細胞に存在 するクロロプラストは、このオルガネラの１つの成長段階である。プロプラスチ ド、エチオブラスト、アミロブラスト及びクロモブラストは異なった段階である 。本発明の態様は、“クロロプラスト”として言及されるであろうオルガネラに 一般的に適用される。

クロロプラストタンパク質の大部分は、細胞質中において合成された核遺伝子に よりコードされ、そして次にクロロプラスト中に取り込まれる。取り込みは、ア ミノ末端部分、すなわち転移ペプチドの除去に関連する。その転移ペプチドは、 クロロプラストに関連する特定のプロテアーゼにより認識される、通常少なくと も２個のアミノ酸を必要とするアミノ酸配列により熟成ペプチドに結合される。

従って、その熟成ペプチドのプロフオームは、クロロプラストに転位され、そし て１又はそれよりも多くのタンパク質による認識の結果として処理される。

植物細胞に特定の機能を付与するための植物細胞の操作及び形質転換における多 くの目的のために、植物細胞中に導入される遺伝子がクロロプラストに転位され 、そしてそのクロロプラスト中で機能する生成物をもたらすことが所望されるで あろう。従って、植物宿主中に効果的な発現を提供するキメラ構造体を構築し、 植物宿主のクロロプラストに転位され、そしてそこで機能する新規生成物の産生 又は特定の生成物の増強された産生をもたらすことが所望される。

植物宿主に転位することができることが示されるキメラ遺伝子を提供するために 、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子に結合された、エントウの小サブユニットのりブロース− １，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの転移ペプチドの使用を記載する。Ｌｕｂ ｂｅｎ及び［ｅｅｇｓｔｒａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　（１９８６）　８３　：　５５０２〜５５０６は、クロロプラスト への転位のために、ダイズのＳＳＵ転移転移ペプチドフェントウＳＵ熟成タンパ ク質の１３個のアミノ酸＋熱ショックタンパク質の使用を報告する。また、その 第５巻、Ｎα１，９〜１３ページも参照のこと。突然変異化さ引用により本明細 書に組み込まれている。またεＰＡ第２１８．５７１号も参照のこと。

発明の要約 細胞質中に発現されたタンパク質のクロロプラスト中への転位をもたらす、ＤＮ Ａ構造物及びそのような構造物から発現されたその得られたタンパク質性生成物 が、提供される。

その構造物は、発現された細胞質タンパク質をクロロプラストに輸送するために 宿主植物細胞により認識される転移ペプチド、少なくとも２種の陽性に荷電され たアミノ酸を有する短い極性又は親水性領域、及びその短い極性領域に融合され る対象の部分をコードする配列を含む。極性領域は、天然に存在するものか又は 合成のものであってもよく、そして通常、転移ペプチドの効果的なプロセッシン グ及び除去を伴なって、細胞質からクロロプラストへの効果的な輸送を提供する ために作用することができる。

特定の態様の記載 本発明の方法及び組成物は、植物細胞中に異種又は同種の遺伝子を導入し、それ により該遺伝が発現され、そしてその得られたポリペプチド生成物が細胞質から クロロプラストに輸送されることを提供する。その遺伝子構造物は、植物宿主状 された領域及び植物宿主細胞により認識される転写終結領域をセンス鎖又は陽性 の極性鎮の転写の方向に含む。前記翻訳された領域は、細胞質からクロロプラス ト中にポリペプチドを輸送するために宿主により認識される転移ペプチド、普通 、クロロプラスト中に輸送した後、その転移ペプチドを切、断するためにその転 移ペプチドに本来関連するプロセッシングシグナルと同じか又は異なることがで きるプロセッシングシグナル、陽性の荷電を有する少なくとも２種のアミノ酸を 有する極性アミノ酸をコードする配列及び対象の遺伝子を含んで成り、ここで転 移ペプチド、プロセッシング配列、極性領域の配列及び対象の遺伝子は、すべて 正しく読み枠が整合する。

多くの生物学的工程がクロロプラスト中に含まれる。従って、クロロプラスト中 に導入される広範囲の種類のタンパク質を有することに実質的な興味があり、こ こで該タンパク質は生物学的工程の変性をもたらすことができ、クロロプラスト に新しい能力を付与し、又は生物学的工程を妨害から保護する。

クロロプラストは脂肪酸の産生のための部位を有するので、そのクロロプラスト 中に種々のタンパク質を導入することによって、脂肪酸の産生を高め、脂肪酸の サイズ分配を変性し又は数及び部位の両者に関して脂肪酸の不飽和性質を変性す ることができる。そのような機能に関与され得る種々の酵素は、アシルキャリヤ ータンパク質（ＡＣＰ）、アセチル−ＣｏＡ　ＡＣＰ　トランスアシラーゼ、チ オエステラーゼ、マロニル−ＣｏＡ　ＡＣＰ　）ランスアシラーゼ、β−ケトア シルＡＣＰ、シンセターゼ等を含む。

クロロプラストに関連するもう１つの生物学的工程は、スターチ合成である。こ の工程は、種々酵素、すなわちスターチホスホリラーゼ、Ｎ０ＰＧ）ランスグリ コシラーゼ、“Ｄ−酵ルコースビポホスホリラーゼ等を含む。

細胞質に産生され、そしてクロロプラストに転位される他のタンパク質は、リブ ロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット、クロロフィル Ａ及びＢ結合タンパク質、フェレドキシン、シキミ酸経路の酵素及びアミノ酸生 合成酵素を含む。

酵素５−エノールビルビル−３−ホスホシキメートシンセターゼをその経路に含 む芳香族アミノ酸の合成のための生物学的工程が特に興味の対象である。この酵 素は、それが通常に使用される除草剤グリホセートのための目標物であるので特 に興味のものである。

発現生成物は、プロセッシングシグナルとして認識されるペプチド配列により対 象の遺伝子に結合される、細胞質からの転位のために宿主により認識されるリー ダー配列を有する所望のペプチドの前駆体又はプロフオームである。細胞質に産 生されるペプチドのプロフオームは、クロロプラストに転位され、ここでそれは 、ペプチドの分解により処理される。

プロセッシングシグナルのＤＮＡ配列は、ペプダーゼによりｉｔｉ＋識されるオ リゴペプチドをコードする。クロロプラストの膜を通しての輸送及びクロロブラ ストオルガネタ中への侵入に基づいて、発現生成物はペプチダーゼにより切断さ れ、成熟タンパク質としてその予定された機能を果たす。

対象のすべての遺伝子は、極性領域をコードする結合配列を通して転移ペプチド をコードする配列及びプロセッシングシグナルに結合され得る。上記タンパク質 をコードするすべての遺伝子が使用され得る。指摘されたように、これらの遺伝 子は、天然の組成物の組成を変性し、ストレス、たとえば除草剤からの保護を付 与し、特定の機能を増強し、又は同様のことに含まれ得る。

一ルビルビルー３−ホスホシキミ酸への転換を触媒する酵素の発現に含まれる。

その酵素は、５−エノールビルビル−３−ホスホシキメートシンセターゼ（ＥＣ ：　２．５．１．１９＞である；この後、ＥＳ−３−Ｐシンセターゼとして言及 する。天然の遺伝子生成物は、代謝経路の生成物においてシキミ酸の産生を高め ることに有用である。グリホセー）　（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）、すなわ ち重要且つ通常使用される除草剤に耐性である酵素を発現する遺伝子は、構造遺 伝子が発現される、通常グリホセート感受性細胞にグリホセート耐性を付与する ことに有用である。アメリカ特許第４．５３５．０６０号は、そのような突然変 異化された構造遺伝子を記載する。

転移ペプチド及びプロセッシングシグナルは、細胞質に発現され、そしてクロロ プラストに転位されるいづれかの植物タンパク質に由来され得る。特定のポリペ プチドのためのｍＲＮＡと成熟生成物とを比較することによって、成熟タンパク 質に不在であり、そして開始コドンで始まるメツセンジャーにより普通メチオニ ンをコードするアミノ酸配列は、通常、転移配列であろう。多くの場合、他とは 異なるような１つの転移配列を使用することが所望され得る。典型的な転移配列 は、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳ Ｕ）の転移ペプチド及びアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）からのそれであ る。それらの輸送活性を保持する天然の転移配列からのフラグメントもまた使用 され得る。その転移ペプチドは、転移ペプチドに結合されるペプチドをクロロプ ラストに転位することができる配列であり、そして完全な野生型の転移ペプチド 、その機能的フラグメント又はその機能的な突然変異体であり得る。完全に生来 の配列は天然にも含まれる。大部分、１つの植物からの転移ペプチドは、一般的 に他の植物によりに’ＲＷｉされる。従って、その転移ペプチドは、キメラ遺伝 子が導入される基本的な宿主に対して同種であり又は異種であり得る。転移ペプ チドは、ダイズ、トウモロコシ、ペチュニア、タバコ、アブラナ、トマト、コム ギ、エントウ等から生じる。その転移ペプチドは、普通、少なくとも約２０個の アミノ酸及び約１００個よりも多くないアミノ酸を有するであろう。

翻訳された領域は、３種の成分：（１）転移ペプチド及び通常プロセッシングシ グナル（細胞質からり四〇プラストへの発現生成物の転位及び転移ペプチドの除 去のためのプロセッシングを提供する）；（２）対象の遺伝子の転位及び安定性 の効力をもたらす極性領域；及び（３）クロロプラストの機能に変化を提供する であろう機能的なタンパク質生成物を供給する対象の遺伝子を有するキメラ遺伝 子を提供するであろう。

対象の遺伝子と転移ペプチド及びプロセッシングシグナルとを分けるであろう極 性領域は、特定の例外はあるが、通常少なくとも６個、普通８個のコドン及び約 ２０よりも多くないコドンを含むであろう。その極性領域は、転移ペプチドに自 然に結合された成熟ペプチドの天然に存在する領域であり、転移ペプチドに自然 に関連し、そしてそのような成熟タンパク質のＮ−末端を付与する異なったタン パク質から得られた領域であり、又は天然に存在しないポリペプチド配列をコー ドする合成配列であり得る。

コドンの数の他に、その配列は、親水性であり、そして所望により少なくとも約 ４０％、好ましくは少なくとも約５０％の極性アミノ酸を有することによって、 さらに特徴づけられるであろう。その極性アミノ酸は、その鎖にペテロ原子を有 する荷電された及び中性のアミノ酸を含んで成る。これらのアミノ酸は、荷電さ れたアミノ酸、たとえばリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ ）、グルタミン酸（Ｅ）及びヒスチジン（Ｈ）及び中性の極性アミノ酸、たとえ ばセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）　、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ） を含む。通常、その配列は、少フマクとも２個の陽性に荷電されたアミノ酸、好 ましくは少なくとも３個のアミノ酸を含み、そしてて５個までの陽性に荷電され たアミノ酸を含むことができ、そして普通２５％より多くない、好ましく２０％ よりも多くない配列が陽性に荷電されたアミノ酸であろう。荷電されたアミノ酸 は、６〜１５個のアミノ酸の範囲で存在し、そしてまたプロセッシングシグナル の後の最初のアミノ酸としても存在することができる。また、ａｃｐに関しては 、その極性領域は、成熟ａＣｐのＮ−末端の１２〜３０個のアミノ酸であり得る 。親水性領域を定義するために、タンバタ質領域の親水性又は疎水性性質が、に ｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｊ、Ｍｏ］、Ｂｉｏ、（１９８２）　１５７ ：　１０５〜１３２により記載されているようにして決定され得る。この参照は 、その領域の露出された性質を指摘する。

個々の例外として、植物のアシルキャリヤータンパク質のＮ−末端領域が使用さ れ得、そして３５個までのコドン、好ましくは約３０個よりも多くないコドンを 含み、そして約１２個〜３０個のコドンの範囲に及ぶことができる。その極性領 域は、疎水性領域の前に普通予定され、これは、最後の陽性に荷電されたアミノ 酸のすぐ後のアミノ酸に、少なくとも約５０％の疎水性アミノ酸、好ましく少な くとも約６０％の疎水性アミノ酸を有するであろう。特定の疎水性アミノ酸は、 グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）及びより特定にはロイシン（ Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及び芳香族アミノ酸、たとえばフェニ ルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙｏ）及びトリプトファン（Ｗ）を含む。所望に より、極性領域の最後の陽性に荷電されたアミノ酸に続く５個のアミノ酸、より 好ましくは、１０個のアミノ酸は、陽性に荷電されたアミノ酸ではないであろう 。この疎水性領域は、対象の遺伝子の一部として天然に存在する適切なアミノ酸 、転移ペプチドに関連する野生型配列、合成配列又はその組合せを有する極性領 域を使用することによって達成され得る。

所望する転位の効率を得るためには、より少ないアミノ酸を使用することが所望 される。最終生成物は、極性領域及び対象の遺伝子を含んで成る融合タンパク質 であるので、その極性領域は、その安定性、活性、クロロプラスト中での位置又 は他の特性に関して、対象の遺伝子に影響を及ぼすことができる。従って、大部 分、その極性領域は、クロロプラスト中において対象の遺伝子の役割に対する逆 効果を最少にするように選択されるであろう。

極性領域の性質に依存して、種々の方法が、キメラ遺伝子を合成するために使用 され得る。転移ペプチドに通常関連する成熟タンパク質の天然に存在するＮ−末 端コドンが使用される場合、対象の遺伝子は、適切な読み枠を整合して極性領域 に結合されるであろう。その極性領域の末端で便利な制限部位が存在する場合、 転移ペプチドを含む遺伝子がその部位で切断され、そして対象の遺伝子に結合す るために操作され得る。他方、便利な制限部位が存在しない場合、他の制限部位 が使用され、そしてアダプターが欠失されたコドンを再生するために使用され得 る。多くの場合、切断が堕ユ３１により行なわれ、プラント末端化された対象の 遺伝子に結合され得るプラント末端が付与され得る。

配列が結合及び連結される特定の態様は、本発明で臨界ではない。極性領域が転 移ペプチドに天然において連結されない場合、それは、合成され又はいずれか便 利な源から得られ、そして対象の遺伝子に転移ペプチドを連結するためにアダプ ター又はブリッジとして使用され得る。転移ペプチド及びプロセッシングシグナ ル部分並びに／又は対象の遺伝子における便利な制限部位の不在下において、極 性領域は、制限することによって欠失されたコドンを再生するアダプターとして 作用することができる。

転移ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、プロセッシングシグナルを含む、完全 な転移ペプチドをコードする配列又は約１〜１０個のコドン又は３′−末端から のコドンの一部を欠失する、切断された転移ペプチドをコードする配列であり得 る。さらに、多数の変化が、転移ペプチド及びプロセッシングシグナルにおける 突然変異、欠失又は挿入により生ぜしめられ、ここでそのような変化は、構成に おいて便利さを提供することができ、すなわち便利な制限部位を付与し又は都合 の悪い制限部位を除去することができる。突然変異は、保存的又は非保存的であ り、その結果転移ペプチドは、野生型の転移ペプチドと同じか又は異なることが できる。

個々の配列は、天然に存在する源から得られ、天然に存在する源から変性された 配列であり得、天然に存在する配列及び合成の配列の組合せであることができ及 び同様のものであり得る。種々の技法が、これらの配列を変性するために、たと えばイン　ビトロでの突然変異誘発、プライマー修復、再切断、連結、末端化、 等を用いることができる。それらの種々の技法は、従来の方法に従って行なわれ 得る。

対象の構造遺伝子は、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡに由来し、又は完全に又は一部合 成され得る。構造遺伝子のすべて又は一部は、野生型のペプチドをコードする天 然に存在する配列又は野生型のペプチド又は点突然変異、挿入又は欠失の結果と しての突然変異体を完全に又は一部コードする合成配列であり得る。いくらかの 情況においては、コドンのすべて又は一部を変性し、たとえば宿主に好ましいコ ドンを用いて発現を高めることが所望される。植物源以外の、たとえば微生物、 たとえば細菌及び菌類、非を推動物、たとえば昆虫、及びを推動物、たとえば哺 乳類及び魚からの異種遺伝子が興味の対象である。

キメラ遺伝子の種々のセグメントは、種々の方法で連結され得、通常、１又はそ れよりも多くのフラグメントがベクター中に挿入され、クローン化され、そのク ローン化されたプラスミドが制限され、次に適切に操作され、そして隣接するフ ラグメントをクローン化されたフラグメントに連結することを含んで成る。これ らの段階は、完全なキメラ遺伝子が完結されるまでくり返えされ得る。

本発明の特に好ましいキメラ遺伝子は、リブロース−１゜５−ビスリン酸カルボ キシラーゼの小サブユニット　（ＳＳＵ）からの転移ペプチドと、耐グリホセー トを付与することかでって形成される。多くの出版物は、ＳＳＵ転移ペプチドが 、どのようにして構造遺伝子に結合されるかを考慮しないで、それが一般的に有 用であろうことを指摘して来たけれども、これは、そのＳＳＵ転移ペプチド遺伝 子がａｒｏＡ遺伝子及び他の遺伝子に連結される場合、真実でないことが判明し た。

成熟ＳＳＵタンパク質をコードする配列の５ＳＵ５’−末端の１０〜２０個のコ ドン及び２０個よりも多くないコドン、好ましくは１４〜１８個のコドン、より 好ましくは１６個のコドンを使用することが特に興味の対象である。

たとえばＶａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋなど、　、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５） 　３１３　：　３５８〜３６３は、キメラ遺伝子を記載し、ここで小サブユニッ ト遺伝子がＮＰＴ−ＩＩｎ遺伝子細菌のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ ■をコードする）に連結される。その文献に記載された両プラスミドにコードさ れた融合タンパク質は、成熟小サブユニットポリペプチドの５７個のアミノ酸転 移ペプチド及び第１メチオニン、７個のアミノ酸リンカ−フラグメント及び第１ メチオニンを欠＜ＮＰＴ−ＩＩから成る。明らかにこの特有な融合生成物は、Ｎ ＰＴ−ＩＩｎ遺伝子クロロプラストにトランスファーすることができた。類似す る結果が５ｃｈｒｅ　ｉｅｒなど、　、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　（１９８５） 　４　：　２５〜３２に記載されたが、しかし使用された構造物は、Ｖａｎ　ｄ ｅｐ　Ｂｒｏｅｃｋにより記載された同じＮＰＴ−ｎ遺伝子に、６個の人工的な コドンを通して結合された、成熟小サブユニット遺伝子からの５７個のアミノ酸 転移配列及び追加の２２個のアミノ酸を含んでいた。

ペプチド及びエントウのＳＳＵ成熟ペプチドのＮ−末端の１３個のアミノ酸と共 に切断されたダイズの熱シヨツクタンパク質（１７，５にドルトン）を使用した 。熱シヨツクタンパク質の代わりにエントウのＳＳＵ成熟ペプチドを有する構造 物を比較すれば、熱シヨツクタンパク質の転位は、実質的に効果は少なかった。

Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋなど、の方法がａｒｏＡ遺伝子により試みられる 場合、その遺伝子生成物は植物のクロロプラスト中に輸送されなかった。従って 、小サブユニットの転移ペプチドが一般的にペプチドをクロロプラストに輸送す るために使用され得る、Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋなど、及び５ｃｈｒｅｉ ｅｒなど、の一般的指摘は、誤っているように思える。転移ペプチド配列、プロ セッシング配列及び成熟小サブユニットペプチドの後プロセッシングアミノ末端 部分又は他の極性配列を含む、小サブユニットの遺伝子のセグメントへの訂ｏＡ 遺伝子の融合のための必要条件が存在するように思える。機能的な突然変異体が 使用され得、ここで１又はそれよりも多くの、好ましくは１〜３個のアミノ酸が 、好ましくは保存的に他のアミノ酸により置換され、転移ペプチド遺伝子がａｒ ｏＡ遺伝子に連結されている。

発現せしめるためには、転写及び翻訳調節シグナルを有する必要があろう。便利 には、それ自体の開始コドン及び終結コドンを有するキメラ遺伝子が調製され得 、その結果、発現が開始され、そして適切なコドンで終結されるであろう。さら に、ＲＮＡポリマラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む転写開始領域及びター ミネータ−領域が、それぞれキメラ遺伝子の５′及び３′に付与されるであろう 。

便利には、転写開始領域は、転移ペプチドに関連する生来のプロモーター領域で あることができる。しかしながら、多くの場合、その生来の転移ペプチド転写開 始領域は、それが、所望する程度の転写を提供せず又は構成的転写が所望され（ ここでリーダーペプチドの転写は誘発性である）るので、許容され得す、又は逆 も同様である。従って、その生来の転写開始領域は、異なった領域又はＲＮＡポ リマラーゼ結合部位から上流の領域により置換され得、そして転写開始は、誘発 性転写を付与するために置換され得る。

使用され得る転写、開始領域は、小サブユニット（ＳＳＵ）カルボキシラーゼ、 アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）及び延長因子１のような植物遺伝子を含 む種々の植物遺伝子プロモーター領域に由来し、又は植物において機能的である 細菌性プラスミド遺伝子プロモーター、たとえばアグロバクテリアム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）のＴｉ−又はＲｉ−プラスミドのオピンシンターゼプロ モーター又はウィルスプロモーターでもあり得る。これらのプロモーターは、オ ピン合成、たとえばオクトビンシンターゼ、ツバリンシンターゼ、マンノビンシ ンターゼ、アグロビンシンターゼ、等に関連するプロモーターを含む。ウィルス プロモーターは、カリフラワーモザイタウィルス３５Ｓプロモーター及び領域■ プロモーターをζ・む。

キメラ遺伝子の構築と同じ態様で、キメラ遺伝子が、所望の転写調節を提供する ために転写開始及び終結領域を端に有する発現カセットが開発され得る。多くの 場合、及び高い頻度で、発現構造物が開発され、ここで転写開始及び終結調節領 域が提供され、多くの制限部位を有するポリリンカーにより分離され、ここで該 リンカ−の小フラグメントの挿入又はキメラ遺伝子との置換により、キメラ遺伝 子が、発現カセットの調節制御下存在するように、連結され得る。その発現カセ ットは、特に原核宿主を含む１又はそれよりも多くの宿主において複製及び選択 することができるベクター上に通常、担持される。

発現カセットが植物細胞中に導入される態様に依存して、その発現カセットは、 他のＤＮＡ調節領域に初めに連結され得る。通常、その発現カセットは、単離、 配列決定、分析及び同様のことのために、その発現カセットのクローニング化を 可能にするために、原核生物、特にＥ、コ！Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で機能的な 複製系に連結されるであろう。複製系に関しては、宿主中において選択を可能に する１又はそれよりも多くのマーカー、すなわち耐殺生物性、たとえば耐抗生物 質性；耐重金属性：耐毒性；相補性；栄養要求性宿主への原栄養性の提供；免疫 性；等を通常含むマーカーを含むであろう。

ＤＮＡが宿主細胞中にマイクロインジェクションされる場合、注入されたＤＮＡ が組込まれ、そして機能的になるこれらの細胞の選択を可能にするマーカーが普 通所望されるであろう。従って、植物宿主中に検出され得るマーカーが選択され るであろう。

他方、武装され（胆汁形成を引き起こす）又は武装されていない（胆汁形成を引 き起こさない）、腫瘍誘発性プラスミド、たとえばＴｉ−又はＲｉ−プラスミド を使用することができる。　）ｌｏｅｋｅｍａ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３） 　３０３　：　１７９〜１８０　；　ＥＰＡ第１１６７１８号及びＷｏ　８６１ ０３７７６を参照のこと。Ｔ　−ＤＮＡを含む種々の構成法が存在し、ここで対 象の発現カセットは、単一のＴ　−ＤＮＡボーダー、すなわち右ボーダーを有し 、又はＴ−ＤＮＡボーダーにより右及び左の両側上で接することができる。

そのボーダーは、少なくとも約５０ｂｐ、普通少なくとも約１００ｂｐのＴ　− ＤＮＡを含むであろう。所望により、それらの発現システムを有する１又はそれ よりも多くのＴ　−ＤＮＡ構造遺伝子を含むことができ、その結果、植物宿主中 への組込みがＴ　−ＤＮＡの組込みの存在のためにマーカーとして使用され得る オビンの発現をもたらすであろう。発現カセットが宿主の核中に導入される特定 の態様は、その発現カセットが存在し、そして所望する生成物を供給するために 機能することができるかぎり、本発明に対して臨界的でない。

１又は両者のＴ　−ＤＮＡボーダーを有する原核性ベクター中に含まれる発現ベ クターは、それぞれＴｉ−又はＲｉ−ブラたとえばＺａｍｂｒｙｓｋｉ、など１ 、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｐｒ１ｎ−ｃｊｐｌｅｓ　ａｎ ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第６巻（Ｓｅｔｌｏｗ及びＨｏ　１１ａｅｎｄｅｒ版）２ ５３〜２７８　（Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８４）　；　Ｂｉｎａｒｙ 　Ｖｅｃｔｏｒ出願番号第８３４、１６１号；及びＡ、Ｈｏｅｋｅｍａ、　Ｔｈ ｅ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｐｌａｎｔ　ＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍｓ　（１９８５）、 （Ｏｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ、Ｂ、Ｖ、Ａｌｂｌｅｓ− ｓａｒｄｕｍ）によって記載された技法を参照のこと。その発現カセットは、Ｔ 　−ＤＮＡ中の腫瘍誘発性プラスミド中に組込まれ、そして次にそのカセットを 含む細菌を用いて、植物細胞又は組織を感染せしめることができる。

所望の生成物が、ゲノムに組込まれた植物細胞中に存在するかいずれかを決定す るための種々の技法が存在し、そして説明される。たとえば、ノザン法が、融合 されたペプチドをコードするｍＲＮＡを検出するために使用され得る。さらに、 発現の存在が、種々の方法で検出され得る。その発現生成物が、検出可能な表現 型、たとえば新規の表現型又は内在性表現型の増強を提供する場合、所望の生成 物の発現は、表現型を検出することによって決定され得る。検出可能な表現型が 利用できない場合、成熟生成物に対して特異的な抗体が使用され得る。クロロプ ラストは従来の方法に従って単離され、破壊され、そしてウェスターン又は他の 技法が、所望する生成物の存在を同定するために使用され得る。

形質転換の後、細胞組織（たとえばプロトプラスト、外植片又は子葉）は、カル スの形成のために再生培地に移される。

その再生培地は、通常、殺菌剤、たとえばカルベニシリン（５００■／ｌ）を含 み、そして形質転換された細胞を選択するために選択用試薬を含むことができる 。たとえば、耐カナマイシン遺伝子（ＡＰＨ３’　ＩＩ）に関しては、カナマイ シンは、少なくとも約３０■／ｌ及び普通約５００ｍｇ／　ｌよりも多くなく、 好ましくは約５０〜１００ｍｇ／Ａで選択培地に添加されるであろう。その再生 培地は、適切な塩源、たとえばＭｕｒａｓｈ　ｉｇｅ−３ｋｏｏｇ塩培地、炭素 源、たとえばスクロース及び適切な他の添加物、たとえばホルモン、たとえばゼ アチン、等（約０．７５〜２．２５ｍｇ／ｌで）、マイオイノシトール（約５０ 〜２００■／ｌ）、等を含む。またビタミン、たとえばＮ１ｔｓｃｈビタミンが 、再生培地において従来通り存在するように、１００ＯＸストツクの約０．５〜 １．５　ｍｆ／β　（通常１．０ｍｊ２．＃）で添加され得る。Ｎ１ｔｓｃｈビ タミンの１０００　Ｘストックは、次のものを最終体積１００ｍ７！中に含む： チアミンＨＣｌ５　Ｑ　ｍｇ、グリシン２００ｍｇ、ニコチン酸５０■、ピリド キシン５０■、葉酸５０ｍｇ、ビオチン５ｍｊ２及び水（最終体積１００ｒｎ１ への残りの量）。炭素源は１０〜３０ｇ／βで存在するであろう。便利には、再 生培地は、約０．５〜１．０％の寒天を含み、そしてその再生培地は約６±０． ５のｐ）Ｉで緩衝化される。

２〜３週で、新芽が通常、成長する。その新芽が約１〜２印に達した後、それら は基部で切断され、そして根用培地に移され、そして、この培地は苗木が成長す る培地と同じであり、そしてカルベニシリン及びカナマイシンスルフェートが添 加される。

改質された植物が得られた場合、それらを、十分な成熟度へ成長せしめて、所望 の生成物が植物細胞のすべて又は一部からなお生成されるかどうかを決定するた めの十分な材料を提供することができる。所望する生成物の発現が植物に示され た後、その植物は、種子を得るために成長せしめられ、発現カセットの所望の発 現能力を有するハイブリッドを産生ずるために他の植物との異種交配のために使 用され、又は一層の繁殖のために種々の胎芽を生成することができる。

クロロプラストは、ひじょうに重要な細胞オルガネラである。従って、クロロプ ラストへのタンパク質の輸送は、耐除草剤性、アミノ酸代謝の改良、光合成の改 良、脂肪酸代謝の改良及び他の重要な代謝機能の改良を可能にすることができる 。

リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットリーダーペ プチド、より好ましくはダイズからの小サブユニツ）　ＩＪ−ダーペプチドを用 いる構成法が特に興味の対象であるＣ　Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅなど、　、ＪｌＭ ｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９８２）転子、特に上記のように、野生型 酵素のために、酵素インヒビターにより阻害に対して耐性の酵素を発現するａｒ ｏＡ遺伝子に連結され得る。

キメラプラスミドと共に、転写調節系、たとえばＴ−ＤＮＡに関連するもの、た とえばオクトビン、ツバリン、マンノビン又はアグロビンシンターゼ、又は小サ ブユニット転写調節系を使用することができる。普通、その構成は、リーダーペ プチド又は転写開始領域のターミネータ−領域を含むであろうし、そしてそれは 、従来の手段により構造遺伝子から下流に導入され得る。通常、そのターミネー タ−領域は、停止コドンから約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ下流に存在するであろ う。

本発明の方法は、新規タンパク質の産生をもたらす。成熟生成物のＮ−末端の１ 〜２０個のアミノ酸が、極性領域又は極性領域により拡張されたＮ−末端により 置換され得る。これらのタンパク質は、親水性領域によりコードされた天然に存 在しないＮ−末端を有することによって区別される。従って、典型的には、ａｒ ｏＡ遺伝子は、そのＮ−末端で８〜２０個の異種アミノ酸を含有する。ＳＳＵサ ブユニットに関しては、そのタンパク質は、成熟ＳＳＵタンパク質の１４〜１ｇ 、好ましくは１６個のアミノ酸を含有するであろう。同様に、他のクロロプラス ト内在性タンパク質は、生来のＮ−末端と極性領域との置換の結果としてそれら のＮ−末端を欠くことによって、又は野生型のＮ−末端を拡張するために極性領 域に融合されることによって特徴づけられ得る。次の例は例示的であって、限定 するものではない。

３種のＲｕＢＰ　５ＳＩＩクローンを用いた。ｐＳＲ３２，１は、ゲノムタバコ クローンである［Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅなど、　（１９８２）前記］。ＴＳＳＵ ３−８及び５ＳＵ３−２は、ゲノムタバコクローンである〔０°Ｎｅａ　Ｉなど 。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、（１９８７）　）　。ｐｓｓ１５は、エントウの ｃＤＮＡクローンである［　Ｃｏｒｕｚｚｉなど、　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、（１９８３）　２５８：１３９９］。ダイズ及びタバコＳＳＵの転移ペプチド 領域は、７５％相同である。前者はイン　ビトロでの摂取研究のために使用され 、後者はに７　玉−Ｈでの植物発現のために使用さＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、　ＮＹ　］に従って行なわれた。適用できる場合、製造業者の規格に 従って行なゎｐＨｃ１２（Ｃｍ”　）及びｐＵｃ１３（Ｃｍ”　）　（Ｋｅｎ　 ＢｕｃｋｌｅｙのＰｈ、Ｄ、論文、Ｕ、Ｃ，サンジェイゴ）を、ＥｃｏＲＩ及び ＨｉｎｄＩＩ［によりそれぞれ消化し、そしてｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９からの ポリリンカーを、線状化されたｐＵｃ１２及びｐＵｃ１３中にそれぞれ挿入し、 ｐＣＧＮ５６５及びｐＣＧＮ５６６をそれぞれ得た。それぞれのプラスミドは、 耐りロラムフェニコル性マーカーを担持する。　′ＲＩＩＢＰＣｓｓｕの５′− 非翻訳領域及び５′−コード領域を含てそのＥｃｏＲＩフラグメントをそれぞれ ｐＣＧＮ５６５及びｐＣＧＮ５６６のＥｃｏＲ１部位中に挿入し、それソｎＰｃ ＧＮ３３０　及ヒｐＣＧＮ３３１メント上に担持されるＲｕＢＰｃｓｓｕ遺伝子 のアミノ末端部分を得る。

した。−その得られたフラグメントは、５′−非翻訳領域の８含むファージＭ１ ３−６５８４８を得た。

ミノ末端部分に相当する、Ｎａｒ　１部位の５’ＤＮＡ領域を欠失Ａｃｃ　Ｉ及 びＰｓｔ　Ｉにより切断されたｐＵｃｇ中にクローン化し、がａｒｏＡ遺伝子の Ｎ−末端の１４個のアミノ酸を置換している。ｐＰＭＧ３４は、これまで記載さ れている［　５ｔａｒｋｅｒなど１、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８５）　 ２６０：　４７２４〜４７２８］　、　ａｒｏＡ遺伝子を含むＢａｍＨＴ　−５ ａｌ　ＩフラグメントをｐＨｃ９中にクローン化し、ｐＰＭＧ３４．１を得た。

ＢａｍＨＩ部位から出発して、ａｒｏＡ遺伝子の５′−非翻訳領域を、単一のヌ クレオシドトリボスフエートの存在下で７４　ＤＮＡポリマラーゼによる処理に より劣化し、その後、マング（ｍｕｎｇ）豆のヌクレアーゼにより消化した。そ れぞれの７４　ＤＮＡポリマラーゼ及びマング豆のヌクレアーゼによる処理の後 、そのフラグメントを、５ａｌｌ挿入体のプラントとしてｐＵＣベクター中にサ ブクローンし、そして形質転換体を予定された生成物のためにスクリーンした。

これらの２により切断し、ｄＧＴＰの存在下でＴ４ポリマラーゼ、マング豆のヌ クレアーゼ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼにより処理した。そのＤＮＡを、Ｅ、王Ｉ ＪＬＣ３、すなわちａｒｏＡ突然変異体［Ｃｏｍａ　１ｆｅｅ、　、Ｎａｔｕｒ ｅ　（１９８３）　３１ユニ７４１〜７４４］中に形質転換し、補ういくつかの プラスミドを特徴化した。プラスミドｐＰＭＧ３４．３クレアーゼにより消化し 、オーバーハングを除去し、そして前記部位中に挿入し、耐クロラムフェニコー ル性遺伝子を含むｐＰＭＧ６４を得る。

部位は、ＲＵＢＰＣ，Ｓｕ遺伝子のエクソン１の３′−末端に近い。

−ペプチド及びプロセッシングシグナルを提供する。その配列は次のとおりであ る： 、、、ＡＣＡＡＴ　Ｉ　ＧＣＡＴＧＣＩ　ＣＩ　ＧＧＡＴＣＣＩ　ＣＧ　Ｉ　Ｔ ＧＡＣＴＴＴＣＩ　ＡＴＧＧＡＡ、、。

５ｐｈｌ　ＢａｍＨＩ　５’　−ＵＴ　ａｒｏＡ　ａｒｏＡ　：７−ド領域　領 域 Ｒ［ＩＢＰＣＳ、コード１リンカ−領域　１領域 その得られたプラスミドｐＰＭＧ７０を）ＩｉｎｄＩＩＩにより消化し、小サブ ユニットの上流の非翻訳（ＵＴ）領域を除去し、プラスミドｐＰＭＧ７２を得た 。プラスミドｐＰＭＧ７２をＨｉｎｄ　ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そ して５ＳＵ−ａｒｏＡプロモーター／遺伝子フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩｒ及 びＥｃｏＲＩによりすでに消化されたｐＳＰ６４　［Ｍｅｌｔｏｎなど、、ＮＩ Ｊｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８６）　１２ニア０３５］ 中にクローン化し、プラスミドｐｃＧＮ１０６８を得た。そのベクターｐＳＰ６ ４は、クローン化されたＤＮＡのイン　ビトロでの転写を可能にする。

５ＳＵ−ａｒｏＡ融合体３の構成 この融合は、成熟ＳＳＵペプチドの２４個のアミノ酸が小サブユニット転移ペプ チドとａｒｏ／に、配列との間に存在するよそして連結した。これは、μ＋ｏ） とＳｍｅ　１部位とめ間に存在するＢａｍＨＩ部位の欠損を引き起こした。その 得られたプラスミドｐｃＧＮＩＯ７５をＥｃａＲＩ及び）ｌｉｎｄｌＩ［により 切断し、ｓｓローａｒｏＡキメラ遺伝子（融合１）を分離した。この遺伝子を、 ＥｃｏＲ１（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉ ｅｇｏ）中にクローン化し、ｐｃＧＮ１０７６を得た。プラスミドｐｃＧＮ１． ０７６をｓｐｈ　Ｉ及びＢａｍＨＩにより切断し、そしてエントウ豆のＳＳＵ　 ｃＤＮＡクローンからのよって単離し、その得られたフラグメントを、アガロー スゲル電気泳動及びそのゲルからの電気溶離により分離した。

ｐｃＧＮＩ０７７中のキメラ遺伝子は、ダイズのＳＳＵの転移ペプチド、成熟エ ントウ豆のＳＳＵの一部（２４個のアミノ酸）及びａｒｏＡ遺伝子から成る。そ れは融合３と呼ばれた。ＥｃｏＲ１及び旧ｎｄＩＩＩによるｐｃＧＮ１０７７の 消化及び）ＩｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより切断されたｐＳＰ６４　［０， Ａ、Ｍｅｌｔｏｎなど、　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　（１ ９８４）　１２　：　７０３５］へのキメラ遺伝子の続く連結により、プラスミ ドｐｃＧＮ１０８６を構成した。ｐｃＧＮ１０８６中のキメ中にクローニングす ることによって構成し、ｐｃＧ８１００８を得た。

失する５ＳＵ−ａｒｏＡ融合体を構成するために、ｐＰＭＧ３４．３のａｒｏＡ 遺伝子をＢａｍＨｌ　−５ａｌ　Ｉフラグメントとして切り出し、そしてゲル精 製した。プラスミドｐＰＭＧ７２をＢａｍＨＩ　−３ａｌ　Ｉにより消化した。

ベクター及びＳＳＵコード領域を含むフラグＭｅｔコドンを欠失する５ＳＵ−ａ ｒｏＡ融合体を含んだ。

野生型ａｒｏＡ、融合体１及び融合体３のインビトロでの合成した。次に、それ らを、製造業者の規定（Ｐｒｏｍｅｇｏ−Ｂ　１ｏｔｅｃ。

Ｍｅｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）に従って、５Ｐ６−　ＲＮＡポリマラ ーゼ及びヌクレオチド前駆体の添加により転写せしめた。次に、ＲＮＡを小麦の 胚からのイン　ビトロ翻訳抽出物に添加しくＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍ Ｄ）　、そして５３５−メチオニンの存在下で翻訳せしめた。その得られたペプ チドを、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ｐｃＧＮｌ ｏｏＢからのｍＲＮＡの翻訳は、移動度において野生型ａｒｏＡ生成物に相当す る４３ｋｄのペプチドの合成をもたらした。ｐｃＧＮ１０６８及びｐＣＧＮ１０ ８６からのｍＲＮＡの翻訳は、それぞれ５０及び５３ｋｄのペプチドをもたらし た。さらに、４３ｋｄのペプチドを、たぶん、元のａｒｏＡ出発コドンで翻訳の 見せかけのリポソーム開始に起因する、ｐｃＧＮ１０６８からの０ＩＲＮＡの翻 訳から生成した。それぞれにより記載されているように、単離されたホウレンソ ウのり四ロブラストと共にインキュベートした。次に、そのクロロプラストをト リプシンにより処理し、そのクロロプラスト以外のすべてのペプチドを消化せし めた。ストロマ及び膜画分を、前記参照に記載されているようにして分離し、そ して５ＤＳ−ゲル電気泳動により分析した。

５ＳＵ−ａｒｏＡ融合体産生ベクターｐｃＧＮ１０９６の構成ヌクレアーゼシュ ３１による切断により多くの融合体を生成するために、ｐｃＧＮ１０９６と呼ば れる特殊化されたベクターを構成した。次のものは構成スケムである：　ｐｃＧ Ｎ１０７７のａｒｏＡ成分をｓｐｈ　Ｉ及び５ａｌＩによる消化により除去した 。その場所に、た。その得られたプラスミドｐｃＧＮ１０９４は、ダイズクロー ンの転移ペプチド及びエントウ豆クローンの成熟部分を有するハＧｅｎｅｔ、（ １９７９）　１７７　：　６５）のＨｉｎｄ　ｍ−ＢａｍＨＩ領域を、ｐＤｓ７ を生成するｐＢＲ３２２［Ｂｏｌｉｖａｒなど、　、Ｇｅｎｅ　（１９７７）　 ２　：　９５］の同じ部位中にクローン化した。耐カナマイシン性遺伝子のｐｃ ＧＮ１０９３を生成するフラント部位中に連結した。プラスミドＰＰＭ６３４． ３を５ａｌｌにより消化し、上記のようにフィルインさから切り出された耐カナ マイシン性遺伝子を連結し、ｐｃＧＮ１０９５を得た。カナマイシン及びａｒｏ Ａ遺伝子を、Ｓｓｔ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ硼−―■暉−−−−−−畷ツーー―■− 騨−畷一畷■酔−開明■■■曙−■―■―による消化によりｐｃＧＮ１０９５か ら断片として切り出し、ｐｃＧＮ１０９４のＳｓｔ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ部位中に 挿入し、ｐｃＧＮ１０９６を得た。要約゛すれば、ｐｃＧＮ１０９６は、５′か ら３′に次の適切な特徴を含む：ＳＳＵコード領域の種々の量を削除せしめた。

それはまた、遺伝子の５′末端から出発して耐カナマイシン性遺伝子の種違転子 をＳＳＵコード領域内の点に連結せしめた。３種の融合のうち１つの融合は、Ｓ ＳＵコード領域とａ　ｒ　ｏ’Ａとの間に翻訳的に活性な融合体を生成すべきで ある。これらの出来事は、Ｅ、コリＬＣ３、すなわちａｒｏＡ突然変異体［（ｏ ｍａｉなど０、（１９８３）前記〕中でその得られたプラスミドを形質転換する ことによって、そして耐アンピシリン性によりそのプラスミド及び最少培地上で の増殖により翻訳的に正しい融合体についサンガーのジデオキシ配列分析により 決定した。

るために構成した。ｐｃＧＮｌｓＯＬは、ホウレンソウのＡＣＰ−１のより切断 されたｐＵｃ１８中にクローン化し、ｐｃＧＮ１９１９を得た。

−ド領域をクローン化し、ｐｃＧ８１６０８を得た。このプラスミドの関連する 領域を５′から３′に向かって次のとおりに列挙切り出されたプラスミドをＳｍ ａ　Ｉにより消化し、そして再運てａｃｐコード領域の種々の量を削除した。そ れはまた、遺伝子の５′末端から出発して耐カナマイシン性遺伝子の種々子をａ ｃｐコード領域内の点に連結せしめた。３種の融合のうち１つの融合は、ａｃｐ コード領域とａｒｏＡとの間に翻訳的に活性な融合体を生成すべきである。これ らの出来事は、Ｅ、ｒｌＪＬＣ３、すなわちａｒｏＡ突然変異体中でその得られ たプラスミドを形質転換することによって、そして耐アンピシリン性によりその プラスミド及び最少培地上での増殖により翻訳的に正しい融合体について選択す ることによって、選択された。相補的なプラスミドを単離し、そして制限消化に より特徴づけた。融合体の配列を、ａｒｏＡのアミノ末端領域に相同のプライマ ーを用いて、サンガーのジデオキシ配列分析により決定した。

融合構造物の試験 特徴づけのために選択される融合体を、次のようにして発現ベクター中にクロー ン化した。ｐｃＧＮ１６０８に由来する融合体を、Ｓａｌ　Ｉ　−ＢｃｏＲＩフ ラグメントとして、その同じ酵素により切断されたｐｃＧＮ１９０６中にクロー ン化した。ｐｃＧＮ１９０６は、ｐＵＣ主鎮中にリンカ−を通してクローン化さ れる、ＣｏＭＶ３５Ｓプロモーター（ヌクレオチド７１４６〜７５４６）及びＯ Ｃ３３’領域２　：　３３５　：ｌを有する発現ベクターである。５ａｉｌ及び ＥｃｏＲ，Ｉ部位は、発現されるべき遺伝子の正しい位置決定を可能にする５′ プロモーター及び３′終結領域の間に位置する。その得られたプラスミドは、Ｃ ａＬ４ν３５Ｓプロモーターの制御下で融合体を含み、そしてｔ　ｍ　ｌポリア デニル化シグナルにスブラフラグメントとしてクローン化した。後者は、ＣａＭ Ｖ３５Ｓプロモーター及びシルＩＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ及びＥｃｏＲ１部位により 分離されたＯＣ３３’ポリアデニル化領域を担持する。その得られたプラスミド は、制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけらｐｏｒａｔｅ）された。４８ 時間のインキュベーションの後、そのエレクトロボレートされたプロトプラスト をウエスターンブ融合体１及び３は、成熟５ＳＬ７の初めの１個及び２４個のア ミノ酸をそれぞれ組み込む。融合体４は、リンカ−コードｐｃＧＮ１００８から のｍＲＮＡの翻訳は、移動度において、野生型のａｒｏＡ生成物に相当する４３ ＫＤａのペプチドの合成をもたらした。ｐｃＧＮ１０６８及びｐｃＧＮＩ０８６ からのｍＲＮＡの翻訳は、それぞれ５０及び５３ＫＤａのペプチドをもたらした 。次に、放射性ラベルされた前駆体を、単離されたホウレンソウのクロロプラス トと共にインキュベートした。そのインキュベーションの後、クロロプラストを 洗浄し、必要ならトリプシンにより処理し、そして膜及びストロマ画分を分離し 、そしてＳＤＳ　ＲＡＧＥにより分析した。融合体１タンパク質は、無視できる 量がその膜又はストロマ画分のいずれが中に見出される場合、クロロプラスト中 に効果的に転位されていない。融合体３は転位される：２個のポリペプチドがス トロマ画分中に見出され、そして処理された生成物のために分子景４７及び４６ ＫＤａの予相サイズを有する。転位されるタンパク質の移動度の変化は、トリプ シン処理の後、明らかである。これは、輸送が完全でなく、そしてタンパク質の 一部がまだ、プロテアーゼに近ずくことができることを指摘する。これを支持す れば、ＥＰＳＰシンターゼの４７ＫＤａ種の少量が膜画分中に存在する。

クロロプラストのトリプシン処理に基づく部分的な消化はまた、トリプシンによ るストロマへの制限された接近により説明され得る。他方、４７ＫＤａ種は、不 完全な輸送過程の結果であり、そして従ってタンパク質の加水分解に一部暴露さ れる。

葉のプロトプラストにおける過渡発現によるキメラ融合タンパク質のクロロプラ ストへの輸送 成熟小サブユニットの１２．１６．１９．３４．６４及び９２個のアミノ酸を組 み込む融合体を単離し、そして特徴づけた。輸送の分析を促進するために、これ らの融合体を発現ベクター中にクローン化し、そして葉のプロトプラスト中にエ レクトロポレートした。４８時間後、そのプロトプラストを、抗ａｒｏＡ抗血清 を用いて、ウェスターンプロットにより分析した。クロロプラストは単離されな いけれども、ウェスターンプロットは、前駆体と成熟タンパク質との間のサイズ の相違が約７ＫＤａであるので、そのタンパク質が正しく供給され、そして処理 されたことを明確に、立証した。実験においては、前駆体は決して検出されなか った。

効果的な輸送の場合又は輸送が行なわれない場合における検出可能な前駆体の不 在は、過渡的アッセイ条件下で、この種の半減期がひじょうに短いこきを指摘す る。それは好結果を伴って輸送されるか又は急速にターンオーバーされるかであ る。融合体に存在する成熟小サブユニットの量は、その輸送効率に対して十分な 効果を有する：すなわち最っとも効果的な構造物は、成熟小サブユニットの１６ 個のアミノ酸を組み込む構造物であった。その効率が１の任意の単位を与えられ る場合、次のものは標準化された効率である：１２ａａ＝０．３　、１９ａａ＝ ０．０９，２４ａａ＝０．０７，１ａａ＝０．０’０５　、６４及び９２　ａａ ＜　０．００３゜さらに、融合体３　（１９）及び４　（３４）により観察され るプロセッシング異種性は、１２又は１６ａａの融合体によりは見られなかった 。

成熟ＡＣＰの３５個のアミノ酸を組み込む構造物は、比較的低い効率ではあるが 、り四ロブラスト中に都合良く輸送された。４２個のアミノ酸を組み込む第２融 合体は、まったく輸送されなかった。転移ペプチドと１２のＡＣＰの使用パター ンは、たった２種の融合体に基づかれているが、それは小サブユニットの１つに 似ている。輸送された成熟タンパク質のアミノ末端でのペブチード領域は、最適 な効率のためには必要とされる。このペプチドは、目だった特徴を有する；それ は、ＳＳＵ及びａＣｐの両者において、タンパク質の表面上に位置することが、 Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　［Ｊ、！、４ｏ１．Ｂｉｏ１．（１９８２） １５７　：　１０５　）の分析により予測される。さらに、それは、一連の陽性 に荷電されたアミノ酸を担持し；小サブユニットの場合、それらは位置９．１０ 及び１１で存在しくすべてＬｙｓ）　、ＡＣＰの場合、位置８，９．１４，２０ ．２２でＬｙｓ残基、及び位置１でＡｒｇ残基が存在する。さらに陽性に荷電さ れたアミノ酸の重要な証拠は、陽性のアミノ酸残基が位置し、１１及び１８で見 出される、植物のＥＰＳＰシンターゼのアミノ末端領域（前駆体としてクロロプ ラストに輸送される）に基づいて、Ｄｅｌｌａ　Ｃ１ｏｐｐａなど０、Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８７）　５　：５７９〜５８４のデータにより与え られる。Ｌｕｂｂｅｎ及びＫｅｅｇｓｔｒａ。

前記は、イン　ビトロでの輸送を示すために、ＳＳＵ転移ペプチド及びダイズの 熱シヨツクタンパク質に融合された成熟ＳＳＵの１３個のアミノ酸を使用した。

しかしながら、輸送に対するＳＳＵの成熟部分の効果に対する情報は供給されな かった。

タンパク質、特に疎水性Ｎ−末端を有するタンパク質の転位の改良された効率が 、プロセッシングシグナルと対象のタンパク質との間に極性結合基を用いること によって達成し得ることは、上記結果から明らかである。この態様において、タ ンパク質のＮ−末端は、実質的に完全な転位を提供しながら、そのタンパク質の 野生型特性を保持するために選択され得る。さらに、リンカ−は、タンパク質の 増強された又は変性された特性を付与することができる。Ｎ−末端での変化を制 限しながら、遺伝子及びそれらの発現生成物の構成に、実質的に柔軟性が提供さ れる。

本明細書に引用されたすべての出版物は、本発明に関する当業者の熟練のレベル のしるしである６それぞれの出版物は、引用された位置で参照により個々に組み 込まれている。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的にいくらか詳細に記載され ているけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

国際調査報告 １２＾”５１“−ｐＣ〒／１ｉｓＱフ１０２４０１”＝ｊ１１１Ｍ−ｈａｍｕ− ＝−ｍ、　ＰＣＴ　／　ＵＳ　８７　／　０２４０１−ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２ ４０１ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／工ＳＡ／２１０．Ｐａｒｔ　 １工。

ＰＣ？／υ５８７１０２４０１ Ａセｔａｃｈｍｅｎヒｔｏ　ＦｏｒＴｎＰＣＩＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ　Ｖ ＬＰσ／υ５８７１０２４０１ ｘｔｔａｃ）ｌＩＩＩｅｎｔｔｏ　Ｆｏｒ＋＋＋　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　 ｐａｒｔ　Ｖｌ、１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ構造物であって； １）植物において機能的な転写及び翻訳開始領域；２）転移ペプチド及びプロセ ッシングシグナルをコードする第１ＤＮＡ配列； ３）少なくとも２種の陽性に荷電されたアミノ酸を含んで成る極性領域をコード する約６〜２０個のコドン又は成熟．ａｃｐ遺伝子のＮ−末端領域をコードする １２〜３０個のコドンの第２ＤＮＡ配列； ４）植物源以外からの対象の遺伝子をコードする第３ＤＮＡ配列；及び 植物において機能的な転写及び翻訳終結領域を転写の方向に含んで成るＤＮＡ構 造物。
2. ２．前記第１配列が、リプロース−１・５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サ ブユニットの転移ペプチドである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造物。
3. ３．前記第２配列が、前記第１配列に結合された天然の配列であり、そして約１ ４〜１８個のコドンのものである請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造物。
4. ４．武装された又は武装されていないＴｉ−又はＲｉ−プラスミドにその末端で 結合されている請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造物。
5. ５．前記第１配列がリブロース−１．５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブ ユニットの転移ペプチドであり；そして前記第３配列が前記第２配列により置換 された２０個までの第１コドンを有するａｒｏＡ遺伝子である請求の範囲第１項 記載のＤＮＡ構造物。
6. ６．（１）植物細胞において機能的な転移ペプチド及びプロセッシングシグナル から成る第１ペプチド領域；（２）約６〜２０個のアミノ酸の極性領域；及び（ ３）クロロブラストタンパク質の機能を有するペプチドから成る第２ペプチド領 域を含んで成るタンパク質。
7. ７．前記極性領域が前記第１ペプチド領域に結合された天然の配列である請求の 範囲第６項記載のタンパク質。
8. ８．前記転移ペプチドがリブロース−１．５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小 サブユニットの転移ペプチドであり、そして前記第２ペプチド領域が前記極性領 域により置換された２０個までのＮ−末端のアミノ酸を有するａｒｏＡ遺伝子で ある請求の範囲第６項記載のタンパク賃。
9. ９．（１）植物のａｃｐ遺伝子の転移ペプチド及びプロセッシングシグナルから 成る第１ペプチド領域；（２）成熟ａｃｐのＮ−末端をコードする１２〜３０個 のコドン；及び（３）ａｃｐ以外のクロロブラストタンパク質の機能を有するペ プチドから成る第２ペプチド領域を含んで成るタンパク質。
10. １０．植物中のクロロプラストオルガネラ中に対象の遺伝子を導入するための方 法であって： １）植物において機能的な転写及び翻訳開始領域；２）転移ペプチド及びプロセ ッシングシグナルをコードする第１ＤＮＡ配列； ３）少なくとも２種の陽性に荷電されたアミノ酸を含んで成る極性領域をコード する約８〜２０個のコドンのＤＮＡ配列； ４）植物の遺伝子以外の対象の遺伝子をコードする第３ＤＮＡ配列；及び 植物において機能的な転写及び翻訳終結領域を転写の方向に含んで成るＤＮＡ構 造物を含んで成るＤＮＡ配列をそれらのゲノムに有する植物を成長せしめ、それ によって前記ＤＮＡ配列が翻訳され、前記転移ペプチド、プロセッシングシグナ ル、極性領域及び対象の前記遺伝子の翻訳生成物を含んで成るタンパク質が生成 され、そして前記タンパク質が前記クロロブラストに転位され、そして前記転移 ペプチドが除去されることを含んで成る方法。
11. １１．請求の範囲第１項記載の構造物を含んで成る植物細胞。