JPH01501121A - リンホカイン活性化キラー細胞増殖用無血清培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 リンホカイン活性化キラー細胞増殖用無血清培地発明の分野 本発明はリンホカイン活性化キラー細胞のインビトロ培養に適する組成物に関す る。特に、本発明は該細胞の増殖可能な無血清培地に関するものである。

＾匪旦１見 癌治療において最も期待可能な研究の１つは受動免疫療法の概念によるものであ る。

この研究は癌患者に抗癌反応を生せしめる可能性のある既感作免疫学的試薬、例 えば、細胞まには抗体の移入に関するものである（ローゼンベルク・ニス・エイ 、キャンサー・トリートメント、リボ−）　（Ｃａｎｃ、Ｔｒｅａｔ、Ｒｅｐ、 ）、第６８巻第２３３−２５５頁（１９８４年））。投与しうる可能性ある多く の免疫学的試薬のうちには、インターロイキン　２（ＩＬ−２）またはインター フェロンのようなリンホカインがある。不幸なことに、癌患者は典型的には免疫 抑制されており、従って、免疫療法による成功は、従来期待されたものに比べて 制限されたものである（ローゼンベルク（１９８４年））、最近、グリムとその 共同研究者は、この欠点を克服するために有意義な可能性を有する研究結果を免 疫療法で確認した（グリム・イー・エイら、ジャーナル・オブ・イクスペリメン タル・メデイシン（Ｊ、Ｅｘｐｒ、Ｍｅｄ、）、第１５７巻第１８２３−１８４ １頁（１９８２年））、グリム・イー・エイら、ジャーナル・オブ・イクスペリ メンタル・メディシン（Ｊ　、　Ｅ　ｘｐｒ、Ｍ　ｅｄ、）、茅１５７巻第８８ ４−８９７頁（１９８３年））、グリム・イー・エイら、（ジャーナル・オブ・ イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐｒ、Ｍｅｄ、）、第１５８巻第１ ３５６−１３６１頁（１９８３年））。これらの研究書違はもし末梢血リンパ球 細胞が患者から分離され、インビトロで、インタロイキン−２の存在下、培養す れば、細胞は癌細胞を特異的に認識し破壊するであるあごとを発見した。この発 見は典型的な癌患者の免疫抑制状態を考慮すると特に有意義である。そのような 状態で、医師は少数のリンパ球を回収し、これらの細胞をインビトロで培養し、 多数の癌特異的免疫性細胞を培養することができるからである。これらの細胞は リンホカインの存在によって活性化され、癌細胞を攻撃するから、リンホカイン 活性化キラー細胞と呼ばれている。

当初の実験は、ナチュラルリンホカインを用いて行われたが、その後、ＤＮＡ組 換技術によって、生産されたリンホカインはこの活性を伝達できることが発見さ れた（レイナー・エイ・エイら、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、第５５巻第１３ ２７−１３３３頁（１９８５年））、イト−・ケイら、ジャーナル・オブ・イム ノロジー（Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、）第１３４巻第３１２４−３１２９頁（ １９８５年）、ミュール・ジェイ・ジェイら、ジャーナル・イムノロジー（Ｊ　 、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、）第１３５巻第６４６−６５２頁（１９８５年））。

ＰＢＬ細胞は、ヒトの血、リンパ管組織中に天然に存在するから、リンホカイン さえ癌患者に投与すれば、患者のＬＡＫ細胞を生成せしめる結果になると当初は 信じられた。癌患者の一般的なＬＡＫ細胞の誘導を抑制する特異的な要素の存在 が今までのところ、この存力な治療法を妨害して来た。従って、ＬＡＫ細胞を生 産するためには、リンホカインの存在下、インビトロでＰＢＬ細胞を培養し、イ ンビトロで得られたＬＡＫ細胞を癌患者に投与することが必要である。

インビトロでのＬＡＫ細胞の生産はヒト血清を含む培養培地中ですでに試みられ ている（グリム、イー・ニー、ら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メ デイシン（Ｊ　、　Ｅ　ｘｐｅｒ、Ｍ　ｅｄ、）　、第１５７巻第８８４−８８ ７頁（１９８３年））。血清が非常に高価であること、入手が制限されること、 微生物、特にウィルスに汚染される可能性があることから、ＰＢＬ細胞の増殖と ＬＡＫ細胞の生産が可能である他の培養媒体の確認を目的とする研究が進められ ることになった。

マスムダ−。ニー・ら、（ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン （Ｊ　、Ｅｐｅｒ、Ｍｅｄ、）、第１５９巻第４９５−５０７頁（１９８４年） ）およびローゼンテイン、エム・ら（ジャーナル・オブ・ナシロナル・インスチ チ３−　）（Ｊ　、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｅ、Ｉ　ｎｓｔ、　）、第７２巻第１ １６１−１１６５頁（１９８４年））はウシ胎児羊血清を含む培養培地がＬＡＫ 細胞の生産を刺激することを開示している。しかしウシ胎児羊血清はヒト血清よ りＬＡＫｉＢ］胞形成の誘発効果が少ないことが知られている（イミル、ピー、 ら、クリニカル・イムノロジー・アンド・イムツバトロジー（Ｃ１ｉｎ、１ｏａ ｕｎｏ１．Ｉｍ＋ａｕｎｏｐａ、）、第３６巻第２８９−２９６頁（１９８５年 ））。これらの研究者は、ヒト血清中に生産しうるＬＡＫ細胞の数は、ウシ血清 を含む培地中で培養した時に等量のＰＢＬ細胞接種物が生産しうるよりも８倍大 であると報告している。これらの結果から、イミルらはウシ胎児血清はＬＡＫ細 胞の生産を阻害するようであり、ヒト血清がより好ましい培養添加物であるとい う結論に達した。さらに、胎羊血清の使用はＬＡＫ細胞前駆物質又はＬＡＫ細胞 自体のいずれにも直接毒性を有すると思われる。

上記の制限に答えて、フローリツヒ、シー・ジエイ、ら（ジャーナル、才ブ・イ ムノロジカル・メソッヅ（Ｊ、Ｉ龍ｕｎｏｉ、Ｍｅｔｈ、）、第８６巻：第２０ ５−２１１頁（１９８６年））はＰＢＬの増殖およびｌ、Ａに細胞の生産の両方 を共に維持しうる無血清培地を確認している。

これらの研究者により確認された培地は、ウシ血清アルブミンと３つの脂肪酸： リルイン酸、オレイン酸およびパルミチン酸、を添加したイーグル培地を修正し たダルベコ培地である。この培地はまた、インシュリン、トランスフェリンおよ びエタノールアミンを含んでいる。この培地はヒト血清含有培地の増殖より著し く低い効率ではあるがＬＡＫ細胞の増殖が認められ得る。フローリツヒ、シー・ ジェイ・らは（１９８６年）はこの無血清培地によるＬＡＫ細胞生産の効率は、 ピルビン酸ナトリウムおよびブロスタングランジン生合成阻害剤であるヨードメ タンを加えることにより、増大すると報告している。しかし、これらの添加剤を 加えてさえ、フローリツヒにより報告された無血清培地は、ＬＡＫ細胞の増殖の 可能性におＬ）てヒト血清含有培地より著しく効率が悪いことが判明している（ フローリッヒら、（１９８６年））、それに加えて、無血清培地へウシ血清アル ブミンの含有は魯疫感応がインビトロで外来性のウシアルブミンに対して、上昇 し、その結果、間接的にＬＡＫ細胞拡大お上び活性を促進するのではないかが問 題となる。さらに、外来性のウシアルブミンの存在によって、患者が免疫感応を インビボで高める可能性があることは、その後に患者に戻って行＜ＰＢＬ細胞の 培養にウシアルブミンを使用するのが適当か否かという問題が生じる。

本発明はキナーゼＣ１すなわち天然およびＰＢＬ細胞中に存在する内在性酵素の 活性化がＰＢＬ細胞をしてＬＡＫ細胞増殖へ発展させるという知見にもとづく。

キナーゼＣはホルボールエステルの生理学的受容体であり、ホルボールエステル は発癌プロモーターの１つである（ファーラー、ダブリュ・エル・ら、リンホカ イン・リサーチ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、）、第４巻：第８７−９３巻 （１９８５年））。インターロイキン−２はキナーゼ酵素Ｃを活性化しうろこと が知られている。活性化されたキナーゼＣ１は無傷のリンパ球のインターロイキ ン−２受容体分子をリン酸化することが知られている。これは、キナーゼＣが動 物の免疫感応に役割を果していることを示唆するものである（ファーラーら、（ １９８５年）、田口、エム・ら、バイオケミストリー・アンド・バイオフィジカ ル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍ＋ｍｕｎ、）第１３５巻：第２３９−２４７頁（１９８６年）） 。

リンホカインによって−たび活性化されると、ＬＡＫ細胞は増殖し、ガンマイン ターフェロンを生産しうる。このように生産されたガンマインターフェロンは、 外部から添加されたインターロイキン−２と協力してさらにガンマインターフェ ロンの生産を刺激すべく相互に作用する。さらに、ガンマインターフェロンの存 在は、インターロイキン−２の細胞レセプター部位の出現に関与すると考えられ ている（シバタ、ケイ１、キャンサー・イムノロジー・アンド・イムノテラビイ （Ｃａｎｃｅｒ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　Ｉ　ｍａｕｎｏｔｈｅｒ、　、第２１ 巻策１１９−１２８頁（１９８６年））。ＬＡＫ細胞により生産されたガンマイ ンターフェロンは細胞の細胞傷害性および治療学的性質に関係していると考えら れている（ローゼシスティン。エム、ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ 、Ｒｅｓ、第４４巻第１９４６−１９５３頁（１９８４年）ニレイナー、ニー、 ニー、ら、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスチチュート（Ｊ 　、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｅ、Ｉｎ５ｔ、）第７５巻第６７−７４頁（１９８５年 ））。

要約すれば、かくして、グリムらにより発見されたＬＡＫ細胞治療による癌患者 治療を可能とするには、当該細胞の生産を可能する経済的かつ効率的な細胞培養 培地の利用が必要である。ヒト血清０利用は、ＬＡＫ細胞の生産には効果的では あるが、けたはずれに高価であり、ウィルスの有力なキャリアーであり供給に制 限がある。

他の非−ヒト血清又は無血清培地の研究が総体的に満足すべきものでないとかが 判明している。このような、経済的かつ効果的なＬＡＫ細胞のための培地に対す る需要が続けて存在する。

発明の要約 本発明は明確に規定された無血清培養培地中で、ＬＡＫ細胞の生産を可能ならし める方法および組成物に関する。本培養培地はヒト血清含有培養培地の利用によ り得られる効率に十分相当しうる効率で、ＬＡＫ細胞の増殖が可能である。しか し、本発明の細胞培養培地は、規定された無血清培地が、ＰＢＬ細胞からＬＡＫ 細胞への活性化を制御する機構の解明を容易にする点で、前記の血清含有培養培 地より優れている。

詳細には、本発明は下記のものからなる。

末梢血リンパ球細胞又はリンホカイン活性化キラー細胞の増殖成長方法であって 、 ａ）細胞のインビトロ培養を可能にするに十分な量の培養培地に細胞を接触させ 、培地が実質的に無血清で、キナーゼＣ酵素を活性化しうる、非蛋白物質を含み 、その化合物は活性化をなすに足りる濃度で培地中ら存在し、および、ｂ）増殖 生長が可能な条件下で培養培地中に細胞を維持する、ことからなる方法である。

本発明は、さらに、下記のリンホカイン活性化キラー細胞を生産する方法をも目 的とするものである。すなわち、ａ）　細胞のインビトロ培養を可能にするに十 分な培養培地量に末梢血リンパ球細胞を接触させ、培地が本質的に無血清、かつ （ｉ）リンホカインおよび（ｉｉ）キナーゼＣ酵素を活性化しうる非蛋白化合物 を含有し、化合物は培地中に活性化に十分な濃度で存在する、および、 ｂ）　リンホカイン活性化キラー細胞の生産を可能ならしめるに十分な条件下、 培養培地中に、細胞を維持する、ことからなる方法である。

本発明はさらに癌細胞の成長・発育を抑制する方法にも適している。すなわち、 ａ）　細胞のインビトロ培養を可能ならしめるに十分な培養培地量に末梢血リン パ球細胞を接触させ、培地は本質的に無血清であり、かつ（ｉ）リンホカインお よび（ｉｉ）キナーゼＣ酵素を活性化しうる非蛋白化合物を含有し、化合物は活 性化に十分な濃度で培地中に存在し、および、 ｂ）　リンホカイン活性化キラー細胞の生産を可能ならしめるに十分な条件下、 細胞を培地中に維持し、およびＣ）　癌細胞の生長および増殖を抑制しうる方法 のもとで、癌細胞にリンホカイン活性化キラー細胞を投与することからなる。

本発明はさらに、 （＆）　インビトロ培養末梢血リンパ球細胞又はリンホカイン活性化キラー細胞 、および（ｂ）キナーゼＣ酵素を活性化しうる、外部かに添加された非蛋白物質 、 からなる、本質的に無血清である物質の組成物をも目的とする。

加えて、本発明は、キナーゼＣを活性化しつる外部から添加された非蛋白化合物 を含む培養培地であって、本質的に無血清な培養培地である、に関する。

好ましい具体例の　Ｂ １、ＰＢＬ細胞のインビトロ培養の説明細胞生存能力を維持しまたは増殖生長を 促進するに足る条件下に、細胞が培養されているとき、組織培養培地において細 胞が「維持」されているという。ここで用いる、「細胞生存能力」という言葉は 、細胞が栄養源を代謝し、生合成過程に向う能力をいう。「増殖生長」という言 葉は、細胞が後代の細胞を生産する能力をいう。細胞生存能力の維持は細胞の増 殖生長を必要としない。

一般に、本発明の細胞のインビトロ培養は次の４つの基本的な要素を必要とする 。：（１）細胞が培養される基質又は相の性質：（２）細胞が培養される気体の 組成と濃度：（３）培養温度：および（４）培養培地の生理化学的および生理学 的組成である（フレッシュエイ。アル。

アイ１．：カルチュア・オブ・アニマル・セルズ（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎ ｉ＋ｍ１４１Ｃｅｌｌｓ）で、マニュアル・オブ・ペイシック・テクニーク（Ｍ ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、アラン・アール・リズ 、インコーポレイテッド・ニューヨーク、第５５−７８頁（１９８３年）中：ラ ムベール、ケイ、ジェイ、ら、アニマル・セル・バイオテクノロジー（Ａｎｉ＋ ｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻、スピエル、アール 、イー。

ら編、アカデミイ、プレス、ニューヨーク第８６−１２２頁（１９８５年）中で 引用するものをここに引用する。）。すなわち、重要な考慮点として、細胞を培 養培地の懸濁状態で培養するのか、固体表面で接触させて生長させるのかのいず れが望ましいかが含まれている。好適な固体表面にはガラス、ポリスチレン培養 血又は懸濁粒子の表面である。その他に、細胞は透過性膜表面又は中空繊維中で 生長させることができる。Ｐ、ＢＬ細胞の細胞生存能力又は増殖生長能力を維持 しうるいずれの培養技術も採用できるが、Ｔ−フラスコ又はローラーボトル中で 細胞を懸濁させて培養させるのが望ましい（マグムダ−。ニー、ら、キャンサー （Ｃａｎｃｅｒ）第５３巻第８９６−９０５頁（１９８４年））、シかし他の方 法、エアーリフト又は深底タンク発酵装置又は中空繊維、限外濾過装置も使用で きる。培養培地の容積は５０μＱの小さいものから１００１２の大きさまである 。

細胞は、細胞の生存が維持できるいずれの温度でも培養できるが、３０から４５ ℃間の温度で細胞を維持するのが望ましく、最も好ましいのは、３７℃の培養温 度で細胞を培養するのが望ましい。しかし、培養細胞は、温度がかなり低下して も耐えることができ、４℃で数日間生存でき、適当な、凍結保存剤のもとでは、 凍結し、−１９６℃まで冷却することができる。培養細胞の温度制御において、 温度繊維調節は重要であり、温度は最適温度の±２℃以内に以内に維持すべきで ある。

細胞が培養されている気体条件は酸素および炭酸ガスを含んでいなければならな い。種々の気体組成および濃度が可能であるが、最終濃度５％炭酸ガスを含むよ うに補正された空気を含む気体条件を採用するのが望ましい。

さらに気体は比較的高い湿度の８０％、好ましくは９０％以上であることが望ま しい。

一般的な組織培養培地の基本構造要素がウェイマウス、シー、により開示されて いる（メソッヅ・ファア・ブリベアレーション・オブ・メディア、サブルメント ・アンド・サブストラータ・フォア・ゼールムーフリー・アニマル・セル・カル チュア（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｍｅｄｉａ 、　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕ ｍイｒｅｅＡｎｉ＋ｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）、アラン　アール、レ グ。ニューヨーク、第２３−６８頁（１９８４年）中）のをここに引用する。培 養培地の基本的成分として無機塩のイオンが含まれる（例えば、Ｎａ＝、Ｋ’″ 、Ｃａ１′″、Ｍｇｔ　”、ＣＩ−、ＨＰＯ，’−およびＨＣＯ３−のようなも のがある。）。さらに、培養培地は金属イ１ンを含ませることができる（例えば 、Ｆ　ｅ”、Ｚｎ”、Ｃｕ”０、Ｍｎ″９、Ｃｏ”およびＳｅａ”−など）。

加えて、培養培地は微量のＳｎ、Ｖ％Ｃｒ、　Ａｌｓ　Ａ８％およびＭＯのよう な元素を含むことができる。

本発明の培養培地は、天然に動物蛋白中に存在するような、アミノ酸をも含むこ とができる。ビタミンは、（例えば）以下のような：Ｂ、ｔ、Ｃ，ＡＳＥおよび ビオチン、同じく、脂質および脂溶性成分も培養培地に含めることができる。培 養培地に用いることができる、脂質および脂溶性成分は特にリルイン酸、コレス テロール、レシチン、スフィンゴミエリン、リン脂質およびオレイン酸である。

本発明の培養培地はまた、エネルギー源の役を果たす炭化水素をも含む。本発明 の培地中に基本的なエネルギー源としてグルコースおよび／またはグルタミンの 使用が好ましいが、他の糖（フルクトース、ガラクトース、マンノース、マルト ースまたはラクトースのようなものである）も使用できる。かかる培地における 糖の濃度は、一般に１０００．ｖ９／Ｌ以上および５０００！＋９／Ｌ以上であ ってもよい。

本発明の細胞は、インビトロで新規にヌクレオチドの合成が可能であるが、プリ ンやピリミジン塩基又はヌクレオチドの添加は成長能を増大せしめうる。本発明 の無地血清培地に添加しうる塩基はアデニンおよびヒボキサンチンが含まれる。

ヌクレオチドはチミジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキ シグアノジンが含まれる。

ＰＢＬ細胞は培養培地のｐＨ変化に影響されやすく、従って、培養培地に緩衝液 を添加する必要がある。使用できる緩衝液には、ＨＦＰＥ５、炭酸緩衝液、リン 酸緩衝液、トリス緩衝液、他の類似の緩衝液がある。そのような緩衝液は約６． ５−８．０のｐＨ５好ましくはｐＨ６，８−７，４に維持できることが望ましい 。

培養培地には、成長因子、ミトゲンまたはホルモンを補足するのが望ましい。と りわけ、添加しうる成長因子およびホルモンには、インシュリン、コルチゾール またはデキサメタシン、インターロイキン１、インターフェロン、トランスフェ リン等が含まれる。さらに、培養培地にはヒトアルブミンを含むことが望ましい 。

ＰＢＬ細胞は存在する可能性のある、バクテリアのような汚染菌よりも緩慢に成 長するから、培養培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン 等の抗生物質を添加するのが望ましい。

手順の定まった実験の際には、上記成分の適量を含む細胞培養培地を開発するこ とが可能だが、そうでなければ、特定の組合わせおよび成分濃度がすでに決定さ れている多くの市販の既製培地のいずれかを使用することが可能である。そのよ うな培養培地の組成はフレッシュニイ、アール、アイ、により：カルチュア・オ ブ・アニマル・セル・ア・マニユアル・ペイシック・テクニーク（Ｃｕｌｔｕｒ ｅ　ｏｒＡｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅ）、アラン　アール、リズ、ニューヨーク、第６７−７８頁（ １９８３年））中で開示されている。

ここで用いらてれる「基本培地」は培養培地の基本的な成分を含んでいる（前記 のような）培地である。そのような基本培地（およびここには開示したＬＡＫ細 胞生産培地）は血清の濃度が０．１％以下であれば「実質的無血清培地」である という。本発明の基本培地として役立ちうる多くの可能性ある培地が処方されう るが、特にダルベコのイーグル変法培地：ハムＦ１２培地の容積比がｌ：ｌから なる基本培地を採用するのが望ましい。この培地は以後ダルフラーの基本培地と 称することにする。この培地の組成を第−表に示す。

■、リンホカイン活性化キラー細胞の生産細胞免疫反応はＴ細胞、Ｂ細胞および マクロファージ間の複雑な相互作用による。Ｔ細胞は胸腺で形成される「白血球 」である。それらは生産し、多種の異なる刺激に応答しくリンホカインおよび抗 原など）、動物の免疫反応を制御し、調節する。Ｂ細胞は、骨髄で形成され、感 染に応答する抗体を生産する「白血球」である。マクロファージは動物の組織か ら異種細胞（すなわち、バクテリアなど）を除去する一次応答の白血球である。

これらの細胞の複合相互作用は直接細胞の接触によっておよび「リンホカイン類 として知られているような可溶性化合物によって伝達される。「リンホカインは 、一般に、分子量１Ｏ−１００ｋｄ、の間の蛋白質又は糖蛋白質である。リンホ カイン類の例はスチーフエンソンによって開示されている（アマル・セル・バイ オテクノロジー（Ａｎｉ＋ａａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第 ２巻スピイアー、アール、イー、ら編、アカデミ−・プレス、第４１−４５頁（ １９８５年））。ＰＢＬ細胞を活性化し、ＬＡＫ細胞に方向づけうる化合物はい ずれも、本発明によって採用され得るが、リンホカインを使用するのが好ましく 、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、リンホカインを使用するのが特に好まし い。インターロー１’キン−２は１５ｋｄの糖蛋白質である（キリス、ニス、ら ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ　、Ｅｘｐｒ、Ｍｅｄ 、）、第１５２巻第１７０９頁（１９８０年））。それは、活性化されたＴリン ホカトにより分泌される（ボナールら、ジャーナル・才ブ・イムノロジー（Ｊ　 、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）第１３２巻第２７０４頁（１９７９年））。

この分子は活性化リンパ球上に存在する膜受容体と相互作用し、それにより活性 化細胞の増殖を誘導するカスケード現象をそこで誘発すると考えられている（ロ ブ、ジェイ、アール１、イムノロジー・ツデイ（Ｉ　ｍｍｎｎｏｌ　、　Ｔ　ｏ ｄａｙ）第７巻第２０３頁（１９８４年））。

リンホカインは自然の組織源から精製される（スヒイズ、ピー、ジェイ、ら、ジ ャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Ｊ　、　Ｉ　ｍ＋ｎｕｎｏ１．Ｍ ｅｔｈ、　）第４２巻第２１３−２２２頁（１９８１’ｔｉｅ）、またはＤＮＡ 組換技術によっても得られる（ローゼンバーグ、ニス、エイ、ら、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２２３巻第１４１２−１４１４頁（１９８４年））、ニジム ラ、ティー、ら、キャンサー・イムノロジカル・イムノテラビイ（Ｃａｎｅ、　 Ｉ　ｍｎｕｎｏｌ、　Ｉ　ｍ＋ｏｕｎｏｔｈｅｒ、）第２１巻第１２頁（１９８ ６年））。

上記に開示したように、リンホカインは末梢血リンノく球のサブセットをＬＡＫ 細胞に変換しうる。リンパ球は特色としてよく凝縮したクロマチンをもった球形 の核を有している。リンノ（球の生産および精製の方法はフレッシニニイにより 開示されている（カルチャー・オブ・アニマル・セル、ア・マニアル・オブ・ペ イシック・テクニーク（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌｓ　Ｃｅ１ｌｓ、 Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、 アラン　アール、リズ、インコーポレイテッド、ニューヨーク、第２３８頁（１ ９８３年）およびマズムダー、ニー、ら、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、第５３ 巻第８９６−９０５頁（１９８４年））。

指摘したように、リンホカイン活性化キラー細胞はリンホカインとの接触によっ て活性化された抹消血リンパ球細胞である。ＬＡＫ細胞が生産させる正確な機構 は十分に解明されていないが、そのような解明は本発明の実施上は必要ではない 。リンホカインの存在する適当なインビトロ組織培養条件のもとでＰＢＬ細胞を 培養すれば自然にＬＡＫ細胞を生産できるからである。培養培地に外部添加する 量は、リンホカインの貯蔵溶液を希釈し、ＬＡＫ細胞形成を誘発しうるリンホカ インの最少量を決することによって定めることができる（スズキ、アール、ら、 ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）第１３０巻第９８１頁（１９８３年）、／％ンダ、ケイ 。

ら、ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ　、Ｉ　＋Ｉ１ｍｕｎｏ１．　）第１ ３０巻第９８８頁（１９８３年））。僅か３単位／ＭＱ小から１，０００単位Ｚ ｘＱ大まで及ぶインターロイキン２をＰＢＬ細胞からのＬＡＫ細胞の生産のため に使用できる。インターロイキンの１単位はＮＫ−７細胞への最高［［’ＨＪＴ ｄＲの取り込みの５０％が起こる希釈度の逆数とした（イト−、ケイ、ら、ジャ ーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ。

Ｉ　ａ＋ｍｕｎｏ１．　）第１３４巻第１３４５−１３４９頁（１９８５年）） 。

細胞又は培地中の化合物の濃度が、本発明の実験の際に、化合物の添加によって 増加したとき、化合物は「外部添加ヨされたものとする。この添加は化合物自体 を添加することにより直接なされ、または化合物の前駆物質を添加することによ り間接的になされる。もし上記に定義した方法に従って濃度が増加したのでない 限り、通常又は天然に細胞または培養培地に存在する化合物は、培地に外部添加 されたとは言わない。

ＰＢＬ細胞培養は少なくとも１日間は行うべき（イト−、ケイ。

ら（１９８５年））であるが、活性化されて、ＬＡＫ細胞になるＰＢＬ細胞のパ ーセントは時間とともに増加する。初濃度が１０”−８×１０６細胞／１ｉＱの 間でＰＢＬ細胞培養を行うのが好ましい。一般に細胞を副次培養する（すなわち 、別の無菌培地を加えて、細胞の培養濃度分割する）のは好ましくないＬＡＫ− 誘導条件を３−１０日間維持するのが望ましい。ひとたびＬＡＫ細胞か産生ずれ ば、細胞は２ケ月以上の期間インビトロで培養することができる（レイチー。エ イ、エイ、ら、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）第５５巻第１３２７−１３３３頁（ １９８５年））。これらの条件のもとで、１０’−１０＠細胞／スｇの細胞濃度 を維持しつつ、ＬＡＫ細胞を副次培養するのが好ましい。かくして増殖したＬＡ Ｋ細胞は、１０″０倍以上にも増加することがあるので、ＬＡＫ細胞治療を、Ｐ ＢＬ細胞を少量採取した個体（例えば癌疾患者）に行うことができる。インター ロイキン２は他のリンホカインを添加しなくてもＬＡＫ細胞を生産できるが、別 のリンホカイン（例えば、ガンマインターフェロン）の添加はＩＬ−２−誘導Ｌ ＡＫ細胞産生を増大させることが知られている（シイバ、ケイ、ら、キャンサー ・イムノロシイ・アンド・イムノテラビイ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍ＋ｍｕｎｏ１． 　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　）第２１巻第１１９−１２８頁（１９８６年））。

ＬＡＫ細胞は癌の種々の群を攻撃することもできる（グリム、イー・エイ、ら、 ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メリッヅ（Ｊ　、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｍ ｅｄ、　）第１５５巻第１８２３−１８４１頁（１９８２年））。ＬＡＫ細胞治 療で治療しうると思われる癌細胞の類型は軟い組織の肉腫、黒色腫、骨肉腫、腺 癌（結腸、卵巣および膵臓腫瘍）、リンパ腫、食道肉腫および副腎肉腫である。

（レイチー。ニー、ニー、ら、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）第５５巻第１３２７ −１３３３頁（１９８５年））。

本発明の最も重要な知見は、キナーゼＣ酵素を活性化しうる非蛋白性化合物が、 リンホカインの存在下、無血清培地で培養される、ＰＢＬ細胞からのＬＡＫ細胞 の産生を促進しうるということである。

「非蛋白」物質はペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸からなるもので ない。キナーゼＣを活性化しうる非蛋白物質はいずれもこの目的を違しうる。そ のような活性化化合物にはアセチルアシルグリセリンおよびジアシルグリセリン がある。（エベリング、ジェイ、ジー０、プロシーディング・オブ・ナショナル ・アカデミイ・才ブ・サイエンス・ニーニスエイ（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ）、第８２巻第８１５−８１９頁（１９８５年）： マフロン、アール、エイ１．カルシノジェネシス（Ｃａｒｅｉｎｏｇｅｎｅｓｉ ｓ）、第６巻第１６９３−１６９８頁（１９８５年））。キナーゼＣを活性化す るジアシルグリセリンの合成はエベリング、ジェイ・ジーら（１９８５年）によ り開示されている。

特にジアシルグリセリンが好ましい。本発明に従って、ジアシルグリセリンのラ セミ混合物またはジアシルグリセリンの立体異性体を等しくない量で含んでいる もののいずれをも使用できるが、６レー１．２−ジアシルグリセリンを使用する のが好ましい。特に好ましい５ｎ−１，２−ジアシルグリセリンは、短い飽和ア シル側鎖（２から１２の間、および好ましくは、４からｌＯの間の炭素数を有す るもの）を有するものである。本発明によれば、アシルグリセリン、５ｎ−１， ２−ジオクタノイルグリセリン（ｄｉｃ、）は、炭素数８のアシル側鎖を有して いるが、ＬＡＫ細胞産生および増殖促進のための最もすぐれた試薬である。この 化合物は、１１９／Ｌ以上の濃度で存在するときは、その効果を表わし得るが、 ｏ、５−２０ｍｇ／Ｌの濃度で二の試薬を用いることがさらに好ましく、最も好 ましくは、５５−２０ｚ／Ｌ、である。一般的にこの化合物は、はんのわずか水 に溶解する（３−５ｚ９／Ｌ）。しかし、この化合物の溶解性はツイーン（１− ２０１９／Ｌの濃度で）またはアルブミン（１０００−１００００ｚ９／Ｌの濃 度で）のような溶解補助剤を用いることにより、１０−２０ｍｇ／Ｌに高めるこ とができる。

特定の化合物がキナーゼＣ活性化剤であるかどうかを決定するために種々の方法 を用いることができる。例えば、血小板を３２Ｆであらかじめラベルし、それか らこの化合物を３０分間培養する。血小板細胞を溶解し、遊離して来た蛋白質を ドデシル硫酸ナイリウムーポリアクリルアドゲル　電気泳動（例えば、１１％ポ リアクリルアミドゲルを用いて）およびオートラジオグラフィーにより分析する 。ラジオラベルした４０，０００ダルトンの蛋白質の存在は、可能性ある活性化 化合物が、実際には、キナーゼＣを活性化しうるということを示している。この 方法はラペチナらによって報告されている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミ、ストリー（Ｊ、Ｂｏｉｌ、　Ｃｈｅｗ、　）第２６０＠第１３５−１３ ６頁（１９８５年））。その他に、キナーゼＣを活性化する化合物の可能性は、 無細胞含有キナーゼＣ−細胞抽出物または精製キナーゼＣを含む（緩衝液、Ｍ　 ｇ　Ｃ１ｔ、ＣａＣ］＊、Ｈ１ヒストン（基質）の存在下）、［ガンマ−”ｐｌ Ａｒｐおよびフォスファチジルゼリンを用いて検定することができる。キナーゼ Ｃを活性化しうる化合物（例えば、上記方法のいずれで決定しても）は本発明の キナーゼＣ活性化化合物として使用できる。この方法はクラフト、ニー、ニー、 らにより記載されている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、　）第７５７巻第１３１９３頁（１９８２年） ）。

本発明によれば、どんな手段でキナーゼＣを活性化しても、ＰＢＬ細胞のＬＡＫ 細胞への発展を可能にする。すなわち、キナーゼＣの直接活性化の代替方法とし て、本発明の目的を達成するために、キナーゼＣ酵素を間接的に活性化する化合 物を配合することができる。そのような物質には、例えば、ホスファチジルイノ シトールを加水分解する（すなわち、ジアシルグリセリンを生成する）試薬や、 キナーゼ（活性を生じさせうる活性化化合物と構造的に類似の化合物が含まれる 。さらに、活性化剤としてジアシルグリセリンの前駆物質である前駆化合物（例 えば、トリグリセリド）を使用することができる（ファンダメンタル・オブ・ク リニカル・ケミストリー（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ｏｒ　Ｃ１１ｎｉｅａｌ 　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）エヌ・ダブリ３”テイーツ編、ダブリエ・ビー・サンダ ース・コーポレイション、第４１６−４１７頁（１９７０年））。トリグリセリ ドの例としてはトリカプリリン化合物がある。

さらに、キナーゼＣを活性化しうる、ジアシルグリセリンの類似体（例えば、１ ．２−シカプリン、１．２−シカプロインおよび１．２−シカプリリン）または アセチルアシルグリセリン（ｌ−オレオイル−２−アセチルグリセリンなど）を 本発明の活性化剤として使用できる。

本発明につき一般的な記載をしたが、本発明を若干の実施例を示すことによって 、よりくわしく説明するが、これは詳述するのみであって、明示がなければ本発 明を限定するものでない。

実施例１ 上記および第１表に示したダルフラー基本培地は下記のようなものにより製造さ れ、追加されている：５０Ｕ／ｊｌｆｆ　ペニシリン、５０μ９／ＩＩＱ　スト レプトマイシン、１０Ｆｇ／ｘＱ　ゲンタマイシン、３１９／Ｌ　ｘタノールア ミン、２　ｚ９／　Ｌ　ヒトインシュリン、５ｉｙ／Ｌ　ヒトトランスフェリン 、２５００１９／Ｌ　ヒトアルブミン（フラクションＶまたは無脂肪酸フラクシ ョンｖ）、１１１１／Ｌ　インドメタシン（無脂肪酸）、０．００３ｘ９／Ｌ　 ゼレンナトリウム、２６００ｉ９／Ｌ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、（ｐＨ７、０）、２ ５００友９／Ｌ　炭酸ナトリウム、３５０　ｔ）＋９／Ｌ　Ｌ−グルタミン、５ ５１９／Ｌ　ピルビン酸塩（ナトリウム塩）、１．５ｓ９／Ｌ　コレステロール 、３凝９／Ｌ　シリルオイルホスファチジルコリン、１ｊ１９／Ｌ　リルイン酸 、ｂｙ／Ｌ　パルミチン酸、５１９／Ｌ　ツイーン８０（ポリオキシエチレンソ ルビタンモノオレイン酸エステル）。水を培地に重量オスモル濃度２８０−３０ ０ｍＯｓＭになるまで加える。。。。使用直前に、６００ＩＪ／ＩＩρの組換イ ンターロイキン２を培地に添加する。以下の使用においては、ダルフラー基本培 地に非蛋白物質キナーゼＣ活性化化合物を除いた上記化合物をすべて添加した時 に、それを「ダルフラー補充培地」と称する。ダルフラー補充培地に活性化化合 物を加えた時、以後その培地を「ダルフラー完全培地」または活性化化合物の開 示量を伴うダルフラー補充培地と称する。

実施例■ 無血清培地における抹消血リンパ球の培養ヒト抹消血リンパ球をマグムダ−。エ イ、ら、（キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）第５３巻第８９６−９０５頁）の方法に より精製する。細胞を２Ｘ１０＠細胞／１４Ｑの濃度で、２５ｃｍ”Ｔフラスコ 中２ｚＱダルフラー完全培地中、温度１００％、気温３７℃において５％ＣＯを 大気中で培養する。７日後、細胞を血球計で計算し、マズムダーら（１９８４年 ）の方法に従ってクロム遊離アッセイを用いて、ダウディ（Ｄａｕｃｉ）細胞に 対する細胞傷害性を検定する。この工程によってＤＰＬ細胞の培養を確立したも のとする。

実施例■ ジアシルグリセリン−含有無血清培地は無血清培地中７日間培養でＬＡＫ細胞の 鉱産せしめる。

実施例■記載と同様にして得たＰＢＬ細胞はマグムダ−。エイ。

ら（キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）第５３巻第８９６−９０５頁（１９８４年）の 方法により、２％ヒト血清添加ＲＰＭ−１６４０培地で生長させるか、ダルフラ ー補充培地（実施例■記載）または２０ｍｇ／ＬｄｉＣ。

を含むダルフラー補充培地のいずれかで培養し、７日間、３７℃、９５％空気お よび５％ＣＯｔの大気中で培養した。この培養終了後、培養細胞の細胞傷害性を 測定した。この実験から、ジアシルグリセリンを含む無血清培地でのＰＢＬ細胞 培養は、細胞の血清含有培地での培養後のＬＡＫ細胞生産の効率の９７％でＬＡ Ｋ細胞を生産することが解明された。反対に、ジアシルグリセリンを欠く無血清 培地は、血清含有培地の効率のただの１／３しかＬＡＫ細胞を生産しなかった。

それ故、これらの結果は、ジアシルグリセリンを含む無血清培地はＬＡＫ細胞の ための血清含有培地に代替しうろことを示しており、そのような無血清培地は血 清含有培地の効率とほぼ同様の効率でＬＡＫ細胞を生産しうるということを示し ている。

実施例■ ＬＡＫ細胞生産に必要なインターロイキン−２の量ＰＢＬ細胞は実施例■記載と 同様に製造し、４部に分割し、続いて、２％血清を添加した９８％ＲＰＭＩ−１ ６４０培地（マグムダ−。エイ、ら（１９８４年））またはジアシルグリセリン 、ｓｎ　−１、２−ジオクタノイルグリセリンを２０　ｘ９／　Ｌで含むダルフ ラー完全培地のいずれかで培養した。ダルフラー完全培地はいずれも１００．３ ００または１０００　Ｕ／ｘＱのインターロイキン−２を含む。３７℃、９５％ 空気、５％二酸化炭素の大気中、７日間培養後、ＬＡＫ細胞増殖の相対効率を測 定した。１０００単位／ｊｌＱインターロイキン−２含有無血清培地は、インタ ーロイキン−２を１０００　Ｕ／ｚＱを含む血清含有培地培養によるＬＡＫ細胞 生産の効率の５２％で標的細胞を溶解しているＬＡＫ細胞を生産していることが 判明した。

しかし、３００または１００Ｕ／Ｊｌρのインターロイキン−２含有無血清培地 は、対照の血清含有培地中で観察される効率の各々、１０６％および８５％の効 率でＬＡＫ細胞を生産することが判明した。

この実験は、ジアシルグリセリン含有無血清培地の使用が、血清含有培地中でＬ ＡＫ細胞形成に必要とされるより少量のインターロイキン−２の存在で、ＬＡＫ 細胞を形成させ得るということを示している。この結果はインターロイキン−２ の入手可能性および価格がＬＡＫ細胞治療法の活用に重大な障害となっていたこ とを考えると、意義あるものである。

実施例■ ジアシルグリセリン分解阻害剤のＬＡＫ細胞生産向上実施例■記載と同様にＰＢ Ｌ細胞を生産し、２部に分割し、続いて、ダルフラー完全培地（ｓｎ　−１、２ −ジオクタノイルグリセリンを５ｍ９／Ｌの濃度で、１０００　Ｕ／ＩＬインタ ーロイキン−２、さらに１０１９／Ｌツイーン８０および１．５１９／Ｌのコレ ステロールを含む）中で、！−モノオレイルグリセリンを１Ｏｚｙ／Ｌの存在ま たは不存在下で培養する。３７℃、９５％空気、５％二酸化炭素の大気中で、７ 日間培養後、標的細胞を溶解しているＬＡＫ細胞の相対効率を測定した。モノオ レイル−ｒａｅ−グリセリンが存在しない場合は、溶解パーセントは、エフェク ター：標的が８：ｌのとき３５．４：ｌのとき２１．２：ｌのとき１３であった 。反対に、ｌ−モノオレイル−ｒａｃ−グリセリンの存在下では、溶解パーセン トは各々５０．３３および２５であった。同様の結果は、ｌ−モノオレイル−ｒ ｌｌｅ−グリセリンが５−１０π９／Ｌの最適濃度で、得られた。５１９／Ｌ力 月−モノオレイルーｒａｃ−グリセリンの最も好ましい濃度であることが判明し た。ジアシルグリセリンおよびその誘導体はジアシルグリセリン・キナーゼおよ びジアシルグリセリン・リパーゼなどの酵素の作用により分解する。この分解を 阻害する試薬（すなわち化学的化合物）がジアシルグリセリンおよびその誘導体 の細胞間濃度を高める。ｌ−モノオレオイル−ｒａｅ−グルリセリンがジアシル グルセリンキナーゼおよびジアシルグリセリンリパーゼを阻害するから（ダブリ ュ・アール、ビシβツブら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー （Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）第２６１巻、第１２５１３−１２５１９頁 （１９８６年）およびダブリュ・アール。

ビシジップら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ ｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　）、第２６１巻第６９９３−７０００頁（１９８６ 年））、これらのデータは上記細胞内酵素の阻害が細胞内ジアシルグルセリン濃 度を高める作用をすることを示唆する。その結果、より多くのＬＡＫ細胞、より 多くのキラー活性あるいはその両方が１−モノオレイル−ｒａｅ−グリセリン含 有により生産される。同様の活性を有するジアシルグリセリン他の分解阻害剤に は、ジオクタノイルエチレングリセリン、ジオクタノイルグリセルアミド、ジオ クタノイルブタントリオールおよびその他のジアシルグリセリン、モノアシルグ リセリンの類似体が含まれるがこれに限定されるものではない。

本発明を特定の実施例に言及しつつ記載したが、さらに改良を加えることが可能 であることはいうまでもない。出願は本発明の原理に従って生じる発明のあらゆ る変法、利用あるいは改良にわたるものであり、この発明に関連する技術分野の 既知または通常の実施がもたらすとともに前記基本的特徴に該当し、請求の範囲 に含まれる本開示の発展を含むものである。

国際調査報告 ｐ（’−Ｔ／Ｔ１＜Ｒ）／ｎフ７フ１ ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２７２１ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　−ｏ　Ｆｏｒｉ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．Ｐａｒｔ　 Ｉ工。

Ｘ工、　ＦｒＥＬＤＳ　ＳＥＡ只ＣＨ５ＥＡＲＣＨＴＥＲ，’ｌＳ：Ｌ　ｙＤ　 ｐｈ　ＯＣＹｔ　ｅ　ｒ　：＜　１１１　ｅ　ｒ　Ｃｅ　１１　ｚ　ｌ　ａ　Ｃ Ｃｅ　１１　＊　１　ｙ！Ｉｔ　ｐｈ　Ｏｋ　ｌ@！’１　ｅ　ａ　Ｃセ１ｖａ ｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ、ｃｕｌ？＊ｒｅ、ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ａ ｃｅｔｙｌａｃｙｌｇｌｙ−ｃｅｒｏｌ、　ｄｉｈｅｘ＋ｈｙ１ｇｌｙｃｅｒｏ ｌ、　Ｃ＋ｉｏｃｔａｎｏｙｉｇｌｙｃｅｒｏｌ、　６ｉｄｅｃａ−ｈｏｙｌｇ ｌｙｃｅｒｏｌ、ａｃ−ｉｖａｔｅｄ　ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ、１ｒｘｈｉｂ ｉ＝ｉｏｎ。

５ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｒ１．　’−ｕｍｏｒ、ｃａｒｃｉｎｏｒｎａ、ｒ＋ｅｏ ｐｌａｓｔｉｃ、ｐｒｏｌｉｆｅｒａ−ｔｉｏｎ、ｉｗｖｅｈ：ｏｒ’ｓ　ｎａ ｍｅ。

ふ・中１＋’１ｌｌＡＮＡｌム帥委・ζ婁喀・”’ａ？ｍ／ｒｕａ７１ｎフ７フ １ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２７２１ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　セｏ　Ｆｏｒ＋　ＰＣＴ＃ＳＡ／２１０．Ｐａｒｔ　Ｖ 工。

Ｖ工、０ＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　Ｗ’ＨＥＲＥ　ＬＥＮＩＴＹ　ＯＦ　ＩＮＶ ＥＮＴＩＯＮ　工Ｓ　ＬＡＣＫＸＮＧ２４０．３１゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．末梢リンパ球細胞またはリンホカイン活性化キラー細胞の増殖成長方法であ って、 （ａ）上記細胞のインビトロ培養を可能にするに十分な量の培養培地に細胞を接 続させ、上記培地が実質的に無血清、かつキナーゼＣ酵素を活性化しうる非蛋白 質を含み、上記化合物は上記活性化をなすに十分な濃度で上記培地中に存在し、 および、 （ｂ）上記増殖生長をなしうるに十分な条件下、上記培養培地中に、上記細胞を 維持する、 ことを特徴とする方法 ２．リンホカイン活性化キラー細胞の生産方法であって、（ａ）末梢血リンパ球 細胞のインビトロ培養を可能にするに十分な量の培養培地に上記末梢血リンパ球 細胞を接触させ、上記培地が実質的に無血清、かつ（ｉ）リンホカインおよび（ ｉｉ）キナーゼＣ酵素を活性化しうる非蛋白物質を含有し、上記化合物が、上記 培地中に、上記活性化をなすに十分な濃度で存在し、および、 （ｂ）リンホカイン活性化キラー細胞の生産を可能ならしめるに十分な条件下、 上記培養培地中に、上記細胞を維持する。 ことを特徴とする方式。 ３．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物が、ジアシルグリセリン、ジアシ ルグリセリンの官能類似体およびジアシルグリセリンの前駆物質からなる群から 選ばれることを特徴とする、請求項１および請求項２のいずれか１記載の方法。 ４．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物が、アセチルアシルグリセリン、 アセチルアシルグリセリンの官能類似体およびアセチルアシルグリセリンの前駆 物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１および請求項２のいず れか１記載の方法。 ５．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物がジアシルグリセリンであること を特徴とする請求項３記載の方法。 ６．上記ジアシルグリセリンが長鎖炭素数６−１０の側鎖を有することを特徴と する請求項５記載の方法。 ７．上記ジアシルグリセリンがｓｎ−１．２−ジオクタノイルグリセリンおよび ｓｎ−１，２−ジヘキサノイルグリセリンおよびｓｎ−ジデカノイルグリセリン からなる群より選ばれることを特徴とする請求項６記載の方法。 ８．上記ジアシルグリセリンが、ｓｎ−１，２−ジオクタノイルグリセリンであ ることを特徴とする請求項７記載の方法。 ９．上記培養培地が、ダルフラー完全培地であることを特徴とする請求項１およ び２のいずれか１記載の方法。 １０．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物が１−２０ｍｇ／Ｌの濃度で存 在することを特徴とする請求項１および２のいずれか１記載の方法。 １１．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物５−２０ｍｇ／Ｌの濃度で存在 することを特徴とする請求項１０記載の方法。 １２．ガン細胞の成長・発育の抑制方法であって、ａ）末梢血リンパ球細胞をイ ンビトロ培養を可能にするに十分な量の培養培地に接触させ、上記培地が実質的 に無血清、かつ（ｉ）リンホカインおよび（ｉｉ）キナーゼＣ酵素を活性化しう る非蛋白を含み、上記化合物が、上記活性化をなすに十分な濃度で存在し、 （ｂ）リンホカイン活性化キラー細胞の増殖をなしうるに十分な条件下、上記培 養培地中に、上記細胞を維持し、（ｃ）上記癌細胞の生長・発育の抑制が可能な 方法で、上記癌細胞にリンホカイン活性化キラー細胞を供給する、ことを特徴と する方法。 １３．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物が、ジアシルグリセリン、ジア シルグリセリンの官能類似体またはジアシルグリセリンＩＶが前駆物質からなる 群から選ばれることを特徴とする請求項１２記載の方法。 １４．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物が、アセチルアシルグリセリン 、アセチルアシルグリセリンの官能類似体、またはアセチルアシルグリセリンの 前駆物質のいずれか１であることを特徴とする請求項１２記載の方法。 １５．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物がジアシルグリセリンであるこ とを特徴とする請求項１３記載の方法。 １６．上記ジアシルグリセリンが、長鎖６−１０炭素数の側鎖を有することを特 徴とする請求項１５記載の方法。 １７．ジアシルグリセリンがｓｎ−１，２−ジオクタノイルグリセリン、ｓｎ− １．２−ジヘキサノイルグリセリンおよびｓｎ−ジデカノイルグリセリンからな る群から選ばれることを特徴とする請求項１６記載の方法。 １８．上記ジアシルグリセリンがｓｎ−１．２−ジオクタノイルグリセリンであ ることを特徴とする請求項１６記載の方法。 １９．（ａ）インビトロ培養の末梢血リンパ球細胞またはリンホカイン活性化キ ラー細胞（ｂ）キナーゼＣ酵素を活性化しうる、外来添加非蛋白物質、および（ ｃ）リンホカイン、からなり、その組成が実質的に無血清である組成物。 ２０．上記外来添加物質（ｂ）がジアシルグリセリン、ジアシルグリセリン官能 類似体、ジアシルグリセリンの前駆物質からなる群から選ばれる請求項１９記載 の物質組成。 ２１．外来添加物質（ｂ）がアセチルアシルグリセリン、アセチルグリセリンの 誘導体およびアセチルアシルグリセリンの前駆物質からなる群から選ばれること を特徴とする請求項１９記載の物質組成。 ２２．上記外来添加物質がジアシルグリセリンであることを特徴とする請求項２ ０記載の物質組成。 ２３．上記ジアシルグリセリンが長鎖６−１０間の炭素数の側鎖を有することを 特徴とする請求項２２記載の物質組成。 ２４．上記ジアシルグリセリンが、ｓｎ−１．２−ジオクタノイルグリセリン、 ｓｎ−１，２−ジヘキサノイルグリセリンおよびｓｎ−ジデカノイルグリセリン であることを特徴とする請求項２３記載の物質組成。 ２５．上記ジアシルグリセリンがｓｎ−１．２−ジオクタノイルグリセリンであ る請求項２４記載の物質組成。 ２６．キナーゼＣ酵素を活性化しうる外来添加非蛋白物質を含有し、その培養培 地が実質的に無血清である培養培地。 ２７．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物がジアシルグリセリン、ジアシ ルグリセリン官能類似体およびジアシルグリセリンの前駆物質からなる群より選 ばれることを特徴とする請求項２６記載の培養培地。 ２８．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物がアセチルアシルグリセリン、 アセチルアシルグリセリンの官能類似体、アセチルアシルグリセリンの前駆物質 からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２６記載の培養培地。 ２９．キナーゼＣ酵素を活性化しうる上記化合物がジアシルグリセリンであるこ とを特徴とする請求項２７記載の培養培地。 ３０．上記ジアシルグリセリンが長鎖６−１０炭素数の側鎖を含有することを特 徴とする請求項２９記載の培養培地。 ３１．上記化合物がｓｎ−１，２−ジオクタノイルグリセリン、ｓｎ−１．２− ジヘキサノイルグリセリンおよびｓｎ−１．２−ジデカノイルグリセリンからな る群から選ばれることを特徴とする請求項３０記載の培養培地。 ３２．上記ジアシルグリセリンがｓｎ−１，２−ジオクタノイルグリセリンであ ることを特徴とする請求項３１記載の培養培地。 ３３．上記培養培地がさらに、上記非蛋白物質の分解を阻害しうる試薬を含むこ とを特徴とする請求項１、２および１２のいずれか１記載の方法。 ３４．上記非蛋白物質がジアシルグリセリン、ジアシルグリセリン官能類似体お よびジアシルグリセリンの前駆物質からなる群から選ばれることを特徴とする請 求項３３記載の方法。 ３５．上記非蛋白物質がアセチルアシルグリセリン、アセチルアシルグリセリン 官能類似体またはアセチルアシルグリセリンの前駆物質からなる群から選ばれる 請求項３３記載の方法。 ３６．上記試薬がジアシルグリセリンキナーゼおよびジアシルグリセリンリパー ゼからなる群から選ばれる酵素の阻害剤であることを特徴とする請求項３３の方 法。 ３７．上記試薬が１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセリン、ジオクタノイルエチ レングリコール、ジオクタノイルグリセルアミドおよびジオクタノイルプタント リオールからなる群から選ばれることを特徴とする請求項３３記載の方法。 ３８．上記試薬が１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセリンであることを特徴とす る請求項３７記載の方法。