JPH01501148A

JPH01501148A - 悪性‐ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク

Info

Publication number: JPH01501148A
Application number: JP62503674A
Authority: JP
Inventors: マルティン，トマス　ジョン; モゼリー，ジェイン　マリーズ; アーネストケンプ，ブルース; ウェッテンホール，リチャード　エドワード　ヒュー
Original assignee: University of Melbourne
Current assignee: University of Melbourne
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1989-04-20
Anticipated expiration: 2012-04-09
Also published as: DE3751997D1; US5872221A; JP2807660B2; EP0273928A1; US5460978A; CA1341030C; JP2598801B2; US5703207A; JPH09216899A; JP2657053B2; EP0273928A4; WO1988000596A1; JPH08211053A; DE3751997T2; US5116952A; EP0273928B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 “悪性−ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク” 本発明は、以後ＰＴＨｒＰ　（副甲状腺ホルモンに関連したホルモン）　、ＡＣ５Ｆ　（アデニル酸シクラーゼ刺激因子）、又はＢＲＦ　（骨放出因子）と称される悪性の液性過カルシウム血症において活性なタンパクに関する。

さらに本発明は、ＡＣ３Ｆのベゾチド断片、並びにＰＴＨｒＰの精製及びＰＴＨｒＰの部分的配列決定に関する。

さらにまた本発明は、　ＰＴＨｒＰ又はそれらの断片について向けられる抗体及びＰＴＨｒＰの同定に有用な該抗体を含有するキットに関する。〔注：ここに記載される引用文献は、本明細書の最後に全部水される。〕悪性の液性過カルシウム血症（ＨＥＭ　）は、一定の癌、特徴的には肺の扁平細胞癌に非常に一般的な併発症があシ、それによシ罹病率及び死亡率に本質的に寄与する（１．２）。癌が誘導する液性因子は、腎による骨吸収を促進しそしてカルシウム排出を制限することによって血中のカルシウム　し々ルヲ高め得る（１−３）。これらの癌による１異所性（ｅｅｔｏｐｉｃ）　”産生の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）が上記）ＩＢＭ症候群を惹起すると多年にわたり考えられていた（４　、５　）にもかかわらず、形質転換戊長因子（ＴＧＦ′Ｓ）′（ｉ−含むＰＴＨ以外の因子が原因であることが明らかになってきた（１−３．６−８　）。そして該因子は骨吸収を促進する能力がある（２，３．９−１１）。

また、ＰＴＨから免疫学的に別個ないくつかの因子の特定の癌による産生についての証拠があるが、その因子は直接的にＰＴＨレセプター又は密接に関連する膜構成要素に作用することによって、ＰＴＨ標的細胞（腎及び骨）中でアデニル醒シクラーゼを刺激する点ではＰＴＨに似ている。かかる可能性は、臨床的知見に基づき予想され、そしてさらにＨＨＭを有する叡者由来の抽出物中に（１２，１３）、腎皮質性癌由来の条件化培地中Ｋ（１４）、そして諏モデル動物由来の腫瘍抽出物と条件化培地培養物中で（１５，１６）その活性が記録されている。

初めは、気管支の扁平細胞癌を有する過カルシウム血症患者から衝立されたＢＥＮ細胞系（１７）が、先に記載したＰＴＨｒＰのような、感知できる量の上記ＰＴＨ様活性を示すことを本発明者らは見い出した。

本発明者らは、ここにＰＴＨｒ　Ｐの精製及びＰＴＨｒＰの特徴付けに成功した。

従って、本発明の態様の１つは、後に特定されるような実質的に純粋なＰＴＨｒＰ　ｆ提供するにある。

従って、本発明の茨なる態様は、　ＰＴＨｒＰ活性を具備するＰＴＨｒ　Ｐの断片又はＰＴＨｒ　Ｐのサプーユニットヲ提供するにある。

ＦＴ）（ｒｐの単離及び精製は、悪性の液性過カルシウム血症におけるその役割を特徴付けるために行われる研究全可能にするであろう。

ＰＴＨｒ　Ｐ又はそれらのペプチド断片は、本技術分野におけるそれ自体公知の方法によって、モノクローナル及びポリクローナル双方の抗体試薬を産生ずるために使用し得る。例えば、ＰＴＨｒＰもしくはそれらのペプチド断片単独で又はアジュバント及び／もしくは担体タンパク質の存在下で適当な免疫感作をすることによシ、抗体試薬が調製され得る。適切な宿主の例としては、マウス、ラット、ラビット、羊、馬、山羊及び牛を包含する。モノクローナル抗体試薬が調製される場合、一般に用いられる技術はＫｏｈｌｅｒ等（１８）及びＫｅｎｎｅｔ等（１９）によシ提示された手法に従っている。

ＰＴＨｒ　Ｐに対して向けられる抗体試薬は、例えば全血液、血清、又は他の生物学的流体中のＰＴＨｒＰ活性を検出するためのアッセイにおいて利用され得る。

特に、かかる試薬は、　ＰＴＨ自体が原因となることが考えられる癌、慢性腎不全及び他の骨疾患を有する患者の調査及び診断において相当な有用性があるであろう。

ＰＴＨｒＰ及びそれらのペプチド断片に対して産生された抗体は、またさらに、免疫組織化学的な診断薬として有用でアシ、そして種々の組織中でＰＴＨｒＰ　４産生しうる細胞の免疫的位置決定（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　）のために有用である。

診断の目的のだめの抗体試薬は、検出しうるマーカー、例えば；ローダミン、フルオレセイン、コロイド状の金、ワサビ　パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリ　フォスファターゼ、フィコビリプロティン（ｐｈｙｅｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ　）、ルシフェラーゼ、フェリチン、Ｉ、Ｐ、Ｈ又は１４ｃで適当に標識付けされたＰＴＨｒＰに対して向られる抗体を含んでなることができる。

本発明者らは、ＰＴＨｒＰの合成ペプチドに対する抗体を調製した。これらの抗体は、例えば放射線イムノアッセイ（５０）又はウェスターン法（５１）によシ、ＰＴＨｒＰ又はそれらの断片を見い出すために使用し得る。試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）培養細胞又は生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）腫瘍によって産生されるＰＴＨｒＰは、ＰＴＨｒＰに対して向けられるこれらの抗体又は他の抗体試薬を用いて検出され得る。

本発明のさらなる態様によれば、ＰＴＨｒＰ及びそれらの断片に対して向けられる抗体試薬が提供される。

本発明のさらに次なる態様によれば、ＰＴＨｒＰのエピトープに結合することが出来る１以上の抗体試薬を含んでなるＰＴＨｒＰ又はそれらの断片を検出するためのキットが提供される。

本発明によって提供されるキットは、例えば上記に記載したようなフルオレセイン、放射性活性、又はタン・ぐり性標識でラベルされたＰＴＨｒＰに対して向けられる抗体を含有してもよい。また、キットは１以上のラベルした第二又は第三の抗体を含有してもよい。付言すれば、キットは試薬を希釈するための緩衝液、そしてアッセイを実施するだめの皿又はトレイのような種々の支持材を含有してもよい。

ＰＴＨｒＰ又はそれらの断片に対して向けられる抗体は、凍結乾燥し、そして、即ち適当な水溶液中での懸濁のために適した粉末状態であってもよい。他方、該抗体は、貯蔵のために適切な水溶液の中に存在してもよい。

さらに本発明の態様によれば、ＰＴＨｒＰのエピトープに結合し得る抗体試薬とサンプルを接触するか、又は該試薬と担体上に固定化されたサンプル中のタンパクと接触し、そしてその後抗体結合性の有無を検出することを含んでなる、所与のタンパク含有サンプル中のＰＴＨｒ　Ｐ又はそれらの断片を検出するための方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、　Ｐ、ＴＨｒＰのエピトープに結合し得る抗体を担体上に結合されたものとサンプルとを、抗体が結合することを許容するために十分な時間を通してインキュベージ、ンし、そしてその後ＰＴＨｒＰのエピトープと結合し得る抗体試薬と結合したＰＴＨｒＰの存否を検出することを含んでなる、所与のサンプル中のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片を検出するための方法が提供される。

ＰＴＨｒＰＯｆｆ製及びそれらのＮ−末端アミノ酸配列の決定は、ＰＴＨｒＰのアミノ酸配列に対応して合成オリゴヌクレオチドを製造することを可能にするだろう。次に、これらのオリゴヌクレオチドは、ハイプリダイゼーシ、ン　プローブとして使用でき、即ちＰＴＨｒＰ　ｆコードする遺伝子又は遺伝子類の単離を容易にする。また、かかるオリゴヌクレオチドは診断試薬としても使用でき、またさらにＰＴＨｒＰ　ｆコードするｍＲＮＡの発現の検出、及びＰＴＨｒＰをコードする遺伝子又は遺伝子類の発現の制御の研究において使用され得る。

ヒト騰瘍系ＢＥＮによって産生されるＰＴＨｒＰは２つの形態で存在し、まったく同一の生物学的活性を有しているが、免疫交叉反応性、分子量及びＨＰＬＣによる溶出挙動に基づき識別し得る。ＰＴＨｒ　Ｐのこれらの形態のどちらのものも本発明の態様の範囲内にある。

さらに本発明の態様によれば、ＰＴＨｒＰはＢＥＮ細胞が培養された培養物から得られる。さらに具体的１ｃ、ＰＴＨｒＰの精製のための１の方法は次の工程：（、）　培地中でＢＥＮ細胞を培養する；（ｂ）　培養物を陽イオン交換樹脂にかける；（ｃ）　上記陽イオン交換樹脂から溶出分画する；（ｄ）　溶出された画分子　ＰＴＨｒＰ活性についてアッセイする：（ｅ）　それらのＰＴＨｒＰ活性を有する画分について逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　ｉ実施し、そしてその後実質的に純粋なＰＴＨｒＰ　ｆ単離する、を含んでなる。

単に例示のために添付する図面を引用して、ここに本発明をよシ詳細に記載する。そしてその内容は：第１図は、ＰＴＨｒＰの最終精製工程における、２１５１ｍにおける吸収及び生物学的活性の）ＩＰＬＣ挙動を示す；Ａ　Ｖｙｄａｃ　ＨＰＬＣ由来のピークＢ物質を集めた２２０μｇがＣ１８ベイカーポンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　）カラム（２５Ｘ　Ｏ，４６ｃｒｎ）にかけられた。溶離は１分画たシ０．６６％の比率における０−６０％アセトニトリル／　０．１％ＴＦＡのダラージェントヲ用いて実施された。画分は２１５ｎｍにおいて観察されるタンパクビークに従って集められた。アデニル酸シクラーゼ活性は、各々の両分から１０μを分取したものでアッセイされそして両分容量に対して数値が調整された。

Ｂ　実験Ａ（画分５１−５５　）から集められた６μｇｈＰＴＨ（１−３４）同等物が、上記実験Ａのカラムに再びかけられそして１分画た！＋０．３３％の比率における０−６８％アセトニトリル１０．９％ＴＦＡのダラージェントで溶離された。

第２図は、第１図の画分３１，３２及び３３のＳＤＳポリアクリルアミド　グルを示す：第３図は、インタクト（１ｎｔａｃｔ　）　ＵＭＲＩ　０６細胞においてウシｐｒＨ（ｔ−３４）に対してアッセイされたＯ第１図の画分３１の生化学的活性のプロン）　（（Ｊ）を示す：第４図は、ＳＰセファデックス　カラムクロマトグラフィー、及び２回のＢａｋｅｒｂｏｎｄクロマトグラフィ一工程の後に得られた逆相ＨＰＬＣカラム（Ｂａｋａｒｂｏｎｄ　Ｃ１８ｗ１ｄｅｐｏｒｅ　２５Ｘ０．４６（７＋１）でりｏｖト処理された精製ＰＴＨｒｐのＨＰＬＣ挙動を示す。挿入は画分４７の５ＰＳＰＡＧＥ銀染色法（５ｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎ　）グル挙動及び分子量標準を示す。

第５図は、トリプシンによる消化後のＰＴＨｒ　Ｐ（１００ｐＭ１００ｐ　）のＨＰＬＣ挙動を示す。トリプシン消化物は、Ｃ８Ｂｒｏｗｎｌｅｅカートリッジ、１０ｃＩｎＸ２．１瓢、流速２５０μｔ／分、及び０．１％ＴＦＡ中の０−５０チアセトニトリルのダラージエント（１％／分）引用いられクロマト処理された。

第６図は、ブラウンリー（Ｂｒ、ｏｗｎｌｅｅ　）　ＣＢ　（２，ＩＩＥＩＩ　）　ｆｆイクロデアー（ｍ１ｅｒｏｂｏｒｅ　）カラム上でクロマト処理された第４図の画分４６及び４８を集めた物質を示す。挿入は、主要ピークのダイオード　アレー（ｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ　）検出を示す。

第７図は、トレーサーとして種々のラベルしていないペプチド及び１１２５でラベルしたＣ　Ａｓｎ”　。

Ｔｙｒ”　）　ＰＴＨｒＰ　（１−１７）及び合成ＰＴ）ｔｒＰ　（１−１７）ペプチドに対するラビット抗血清を用いるラジオイムノアッセイを示す。結合したペプチド／遊離（プチドがペプチド／ｒｎｔの量に対してプロットされた。

Ａ　ラベルされていないペプチドは：（Ｇｌｕ８．Ａｓｎ”　、（ｙａｌｌ　）　ｐｒｕｒｐ（ｔ−１１）（０）ｙｈＰＴＨ（１−３４）＠）、ラット　カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃ０ＲＰ　）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン及びウシ　インシュリン（全て、１０μｇ／ｄ。

Δ）、サケ　カルシトニン（１０μｇ　／ｍｌ　’、ム）であった。

Ｂ　ラベルされていないペプチドは：（Ｇｌｕ。

Ａｓｎ”、Ｃｙｓ”　）　ＰＴＨｒＰ（１−１１）（○）、ラットＰＴＨ（１− ３４）（ロ）、ウシＰＴＨ（１−３４）（■）、ヒ）ＰＴＨ（１−３４）（・）　、　ラ　ッ　ト　ＣＧＲ（１０Ａｇ／ｍｌ　。

△）、サケ　カルシトニン（１０μｇ　／ＴｒＬｔ、　ム）。

第８図は、ＳＰ−セファデックス部分精製ＰＴＨｒＰのＨＰＬＣに由来する画分の生物学的なアッセイ及びラジオイムノアッセイの比較を示す。

第９図は：Ａ　ＵＭＲ１０６−０１細胞における増腑するサイクリックＡＭＰ産生についての合成ＰＴＨｒＰ　（１−３４）の生物学的活性（・）を、標準としてのウシＰＴＨ（１−３４）（○）と比較して示す。

Ｂ１２５Ｉ−フィブリン上で培養されたＵＭＲ１０６−Ｏ１細胞におけるプラスミノーゲン　アクチベーター活性に対する合成ＰＴＨｒＰ（１−３４，）の効果（・）及びウシＰＴＨ（１−３４）の効果（○）ｔ−示す。このアッセイは既にＡ１１ａｎらに記載された方法によシ実施された（５２）。

第１０図は、実施例３のビークＡの２つのサンプル（ＡＩ及びＡ２．レーン２及び３）、高度に精製したウシ副甲状腺ホルモン（レーンｌ）、及び高度に精製した実施例３のピークＢから誘導されたＰＴＨｒＰ　（レーン４）のウェスターン　プロト分析を示す。サンプルは５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ニトロセルロースに移され；　Ｐ’Ｉ’ＨｒＰ　（１−１６）に対して生じるラビット抗血清によシブロープし；洗浄しそして山羊の抗−ラピッ）　ＩｇＧ１の１２５ニーラベルしたＦａｂ断片とインキュベートシ、そしてオートラジオグラフ化した。分子量標準は水平線で示される。

定義： “ＰＴＨｒＰ”とは、ＳＤＳポリアクリルアミド　グル電気泳動によシｕｊ定される場合に、１５，０００〜２５．０００ダルトンの分子量を有し、そして副甲状腺ホルモンと同様の態様で、適当な標的細胞（例えば、ＵＭＲＩ　Ｏ６−０１細胞）中でアデニル酸シクラーゼ活性を刺激する活性を有する悪性の液性過カルシウム血症において活性なタンパクを称する。

既に記載したように、ＢＥＮ細胞から精製されるＰＴＨｒＰは多型性であシそして実質的に同一の生物学的活性を有する２つの識別されうる産生物として存在する。これらの産生物の１つは、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによシ測定される場合に１５ −１８に間の分子量を有し、そしてＮ−末端配列は第１表に示される。別の産生物は、１８に−２５に間の分子量を有する。この第２の産生物は第１に記載した産生物のＰＴＨｒ　Ｐに対して産生される抗血清と交叉反応する。ＰＴＨｒＰの両度生物とも本発明の態様に含まれそして’　ＰＴＨｒｐ　’の語によシ包含される。

さらに、ＰＴＨｒＰ活性を有するＰＴＨｒ　Ｐの対立遺伝子的変形体（Ｖａｒｉａｎｔ＠）も本発明の態様内のものでありそしてまたさらにＰＴＨｒＰ　’の語によシ包含される。このような変形体は、ＰＴＨｒ　Ｐの配列に対す名アミノ酸（類）の削除、置換又は付加によシ提供され、そしてこれらは第１表に示される（一部）。第１表によシ示されるようなもともと存在するアミノ酸が削除されそして／もしくは他のアミノ酸に置換されるか、又は本来的な配列のＰＴＨｒ　Ｐに対しさらにアミノ酸が加えられる場合の変形体は、通常のタンパク合成技術（４１）又は組換えＤＮＡ技術（５３）によって調製され得る。これらの変種でＰＴＨｒＰ活性を具備するものは本発明の態様内のものであシ、そしてまた′″ＰＴＨｒＰ　”の語によシ包含される。

ＰＴＨｒＰに関連して使用される場合の１実質的に純粋”とは、ＰＴＨｒＰと通常会合しているタンノ４り性の又は他の汚染物質が実質的に存在しない場合のＰＴＨｒｐを意味する；一般にＳＤＳ　−ＰＡＧＥ上で単一バンドを生じせしめ；そして全タンパクの一般に約９５重量％−１００重量％、通常約９７重量％がＰＴＨｒｐである場合をいう。本発明の実施に従う“ＰＴＨｒＰ”は、先行技術文献に記載されたようなＰＴＨ様の活性を有する物質の粗製の特徴付けられていない生産物から識別出来る。先行技術文献の生産物（５４及び５５）は、多数のタン・９りから成シ、活性因子はタンパク及び他の物質の合計量に比べて非常に少量である。これらの生産物は、タンパク配列分析又はＰＴＨｒＰに対して特異的な抗体の調製のためには適していなかった。

本明細書の“サプユニツ）　（５ｕｂ−ｕｎｉｔ　）”又は“断片２の語は、　ＰＴＨｒＰに特有であるところのＰＴＨｒＰタン・やりの一部を意味するために用いられる。予想されるように、これは単一のアミノ酸を特に除去する。一般に、長さとして５個以下のアミノ酸のペプチドは特異的なものにはならないだろう。

籠エピトープ”とは免疫応答を引き出すことができるＰＴＨｒＰ又はそれらの断片もしくはサラユニットの任意の抗原部位を意味する。

略語：ＨＰＬＣ高性能液体クロマトグラフィー５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ドデシル硫寂ナトリウム　ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＴＩ（副甲状腺ホルモンｈＰＴＨヒト副甲状腺ホルモンＰＴＨｒＰ（１−１１）　第１表のアミノ酸ｌから１１に対応するＰＴＨｒＰの合成ペプチドＰＴＨｒＰ（１−１６）　第１表のアミノ酸１から１６に対応するＰＴＨｒ　Ｐの合成ペプチドｐＴＨｒｐ（ｘ−ｘ７）　第１表のアミノ酸１から１７に対応するＰＴＨｒＰの合成ペプチドＰＴＨｒＰ（１−３４）　第２表のアミノ酸工から３４に対応するＰＴＨｒ　Ｐの合成ペプチドＣＧＲＰ　ラット　カルシトシン遺伝子関連ペゾチドＴＦＡ　）リフルオロ酢酸実施例ＩＰＴＨｒＰ活性に対する生物学的なアッセイ生物学的アッセイは、　ＰＴＨに応答して、骨芽細胞様の細胞、例えば広範囲な種々のＵＭＲＩ　Ｏ６−０１細胞系（２０−４０）におけるサイクリック甚の量依存性産生金利用する。上記アッセイが実施し得る種種の方法は骨芽細胞様の細胞の腹ホそジネート中のアデニル醒シクラーゼの直接的な測定、そして無処理（１ｎｔａｃｔ　）細胞によりて産生されるサイクリック蔚のアッセイを包含するものである。簡単に、都合よくそして非常に多量のサンプルの迅速なアッセイを可能にするために、本発明者らは、１２−ウェルプラスチック皿中でｔＪＭＲ１０６−０６ｍｍ全全レプリカ培養して増殖せしめ、３Ｈ−アｆニンと共に２時間にわたシ前−インキュベーシ、ンすることによシ細胞ＡＴＰプールｔ−３Ｈによシラペルし、細胞を短時間洗浄し、次にホスホジェステラーゼ　インヒビタートシて１ｍＭイソブチルメチルキサンチンを添茄することにより応答を測定した。１０分間後に反応を止めすしてＤｏｗｅｘ　（登録開環）及び中性アルミナ上での連続的なりロマトグラフィーによシ培養物から　Ｈ−サイクリックＡＭＰｉ精製した。上記細胞は、サイクリック蔚産生において投与量依存性増加を伴りて、　ＰＴＨそしてＥシリーズのプロスタグランジン（主にＰＧＥ２）に対して応答する。これはＰＴＨ又はＰＴＨ様活性についての簡単な再現性ある生物学的なアッセイに改良されている（３４．４０）。この系において、　ＰＴＨ（４０）の拮抗ペプチド又は合成ヒ）　ＰＴＨ（１−３４）（４０）に対して産生したＰＴ）Ｉに対する他の抗血清と共にサングルを事前にインキ−ベートすることによシＰＴＨに対する応答は抑制されたが、ＰＧＥ２に対してはそうでなかった。

実施例２ＢＥＮ細胞によって誘導されるＰＴＨｒＰ活性実施倒１に記載された生物学的アッセイによシＢＥＮ細胞培養液が直接アッセイされた場合に、それはサイクリック謂産生を刺激する能力を示す。活性は培地の連続的な希釈物、しばしばほぼｌ：１００の希釈物中で測定できる。粗培楚液の希釈物はＰＴＨによシ誘導されるそれと平行して活性を刺激し；山羊乱−ヒトＰＴＨ（１−３４）と培地との事前のインキ−ページ、ンは、ＰＴＨｒＰ活性に対していかなる効果ももたらさないが、同じ抗血清はｈｐｒｕ（ｌ−３４）それ自体（４０）の活性を完全に不活化する。合成ペプチド、（”Ｔｙｒ　］　ｈＰＴＨ（３−３４）アミド及び［”Ｔｙｒ　］　ｈＰＴＨ（５−３４）アミドは、上記ＵＭＲ１０６−Ｏ１細胞中のＰＴＨｒＰ及びｈＰＴＨ（１−３４）に対するサイクリック甚応答をそれぞれ抑制するが、これらの拮抗剤は同じ細胞中のＰＧＥ２に対する応答についてなんらの効果ももたない（４０）。

ＢΔ細胞培地とトリプシンとのインキュページ。

ンは、　ＰＴＨｒＰの生物学的な活性の欠失をもたらし、それがタンパクであることと一致する。それは２分間１００℃の温度に耐えうるから適度な熱安定性全有する。０．１Ｍ酢酸中Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ２Ｏ上での無血清ＢＥＮ細胞条件化培地のグルの濾過は、流出物チューブの生物学的なアッセイによシ、活性が約４０，０００の分子量の巨大分子に基づくことを示した。これはおそらく、未精製段階にある間、上記活性物質が他のタンパクを伴う結果として過大に算定されるためであることが後になりてわかった。

ＰＴＨラジオイムノアッセイは多数の相違する抗血清具体的にはカルメキシ末端について２つ１分子の中間につ込て１つ、そしてアミノ末端について１つ、について実施された。どの場合でも、　ＢＥＩＷ細胞培養物中で免疫反応性ＰＴＨは検出されなかった。ＢＥＮ細胞をコンフルエンスに増殖せしめ、洗浄して血清を除去し、そして無血清培地（５０％Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’　Ｍｅｄｉｕｍ　、　５０％メｆウム１９９）中で２４時間インキュベートすることによシ、実質的な量のＰＴＨｒＰ活性（１／Ｚｏｏ、までの希釈で検出可能）の生産を行うことが可能であることが見い出された。従って、これは活性物質を大量に含む培地を蓄積する標準方法として使用され、そして該培地は精製が始められるまで一２０℃で貯蔵された。

実施例３ＢＥＮ細胞培養物からのＰＴＨｒＰの精製ＢＥＮ細胞培養物（２４時間、無血清インキュベージ、ン）が蓄積され、セしてＵＭＲ１０６−０１サイクリックＡＭＰ応答アッセイにおいて、標準としてヒトＰＴ）ｔ　（１−３４＞に対する生物学的なアッセイによシＰＴＨｒＰ活性が測定された。培養物の蓄積したバッチ− １回に５ｔ−が、１Ｍの酢酸でｐＨ４，８に酸性にした後、ＳＰセファデックスカラム（３５−容ｆＲ）上に注がれた。そのカラムがｐＨ４，８の０．１　Ｍ酢酸ナトリウムで十分に洗浄された後、個々の試験管につめてＥ２８０の存在を測定しながら、０．１．０．２及び０．３　Ｍ　ＮａＣＡの各２５０ゴ、そしてさらに０．５　Ｍ　ＮａＣＬ　５００ａｔ　ｋ加えることによシタンノやりの回分的な溶出が実施された。

生物活性は個々のカラム試験管のサンプル１００μｔにつｈてアッセイされ、そして生物活性のバルク（ｂｕｌｋ　）は、０．５　Ｍ　ＮａＣｔ画分を集めることによシ得られた。この段階での生物活性の回収率は９０−１００％であシ、そして１０倍の精製全達成する。

それは本質的なｎＩ製手段というよシは、むしろ有用な濃縮方法として役立つ。

かかる５を段階から蓄積した活性物質は、ＳＰＩ　。

ＳＦ３　、等のように称される。上記活性プール（０，５Ｍ　ＮａＣＬ　）はＴＦＡによｌ）０．１％の濃度に酸性にされ、セして逆相）ｉＰＬｃ　（ＲＰ　３００）カラム上に注がれ、そのカラムから１分画５０．６６％のアセトニトリルグラ−ジエン）１用いて活性物質は溶出された。ＲＰ３００カラム溶出物からの偲々のカラム画分（１ｍｊ画分当たシ１０μＬ）は、バイオアッセイされそしてロータリー　エバポレーターによシ処理される。

この段階での回収率は６０％である。６つのかかるＳＰプールが次の段階の精製のために一緒にされた。

すなわち、これは培養物の３０を分に相当する。

タンパクの評価は、標準としてＢＳＡ　ｔ−用いてブラッドフード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ　）　（５６）によシ行われ、そしてその物質は２ｍｇづつ分けてＨＰＬＣＶｙｄａｃ　Ｃ１８カラム（１０μ、　２．５４　Ｘ　２２量Ｍ）にかけられ、セしてカラムから１分画だ、！７０．５％アセトニトリル　グチ−ジェットでそれは溶離される。該Ｖｙ　ｄ　ａ　ｃカラムから生物活性の２つのピーク、丁なわち３２％アセトニトリルにおいてピークＡそして３７％においてピークＢが首尾よく得られる。ヒ−りＢはピークＡよシ他のタンノ９りによる汚染がより少なく、そして次の精製のために機械的に選ばれる。

活性の合計回収率は３０％である。ピークＡ：ピークＢの割合はバッチ間で２：１から０．５：１まで変化する。

ピークＢ物質が集められ、そしてｗｉｄｅ　ｐａｒｅ　（３００Ｘ　）　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｃ１８逆相カラムにかけられ、そしてサラにアセトニトリル　グラージェットで溶離される（第１Ａ図）。２１５　ｎｍにおける吸収がモニターされる。個々のカラム画分がバイオアッセイされ、そして最高の活性を有する画分（画分５Ｏ−５５）が集められる。該活性物質は第１Ｂ図に示されるように改良した溶出条件を用いる逆相Ｉ（ＰＬＣによシさらにｎｇ製されるＣ１分分当シ０．３３％のシャロウワー（ｓｈａｌｌｏｗｅｒ　）アセトニトリル　グラージェット〕。

第１図の細かい平行線の領域は、生物学的アッセイデータをヒトＰＴＨ（１−３４）のμｇ相当量として示し、そして試験管番号２８−３８のカラム画分が示される。生物活性ピークは画分３１において観察され、それは４つの近似する位置のタンノ４クピークの１つに一致する。画分３１の内容物はアミノ酸配列決定のために用いられセして５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために用いられた。まず最初のこの物質の配列決定は、第１表の７ミノｒＲ１−２４を同定した。

上記ピーク画分は、銀染色法（ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）によるタンパク　バンドを検出するために使用されたグルの一部を用いて５Ｏ８−ＰＡＧＥによシ分析された。

上記グルの残シヲスライスしてはぎとシ、そして生物活性についてアッセイされたグル　スライスから活性物質を溶離した。

１７％ポリアクリルアミド　グルへの画分３１の２０％の使用（約６　ｐＭｏｌｅｓ　、又は１２０　ｎｇ　）は、分子量標準によシ決定した場合ｌ８−１９にの分子量に一致する銀染色する物質の主要バンドをもたらす（第２図）。２つの不明瞭なバンドが３５Ｋ及び６７Ｋに観察された。これらはＰＴＨｒ　Ｐの２量体及び３量体の可能性がある。再度試験したグルが３諺幅の切片にスライスされそして０．１％ＳＤＳで溶離された場合、溶離した活性は１８−１９Ｋにおける銀染色ピークに一致する単一バンドのみ観察された（第３図）。グルに適用された量は生物学的アッセイにょシｈＰＴＨ（１−３４）の１．４μｇと等価であった。直接的にタンパクの定量は行わなかったが、アミノ酸配列データから計算された。

配列決定のために用いられた純粋物質の比活性は、ｌｔｇ　ＰＴＨｒＰタンパク当たシウシＰＴＨ（１−３４）の６ｔｔｇと等価であることが推定された（第３図）。

別々の精製バッチにおいて、ＨＰＬＣ工程Ｂから回収された生物活性物質（第１図１画分３ｌ−３２）は−緒にされそして１分画た＃０．３３％の割合でアセトニトリル　ダラージェントによシｗｉｄｅ　ｐｏｒｅ　（３００Ａ　）　Ｂａｋ＠ｒｂｏｎｄ　Ｃ１８逆相カラム上で再りｅｌ−ｆ）処３１された。第４図に見られるような、単一の鮮明に限定されたピーク、すなわちピーク４７は、分子量１８に−１９にのタンパクを含む。この両分中には、５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定されるような他のいかなる夾雑タンパクも検出されなかった。この物質は実施例１に示すアッセイによれば生物活性があシ、そしてバイオシステム　がス　フェーズ　マイクロシークエンサー器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｇａｓ　ＰｈａｓｅＭｉｅｒｏｓｓｑｕｅｎｃｅｒ）を使用してアミノ酸配列決定のために使用された。この物質の配列決定は、次の実施例中に示すように４１個の７ミノｒＲｔ同定した。

実施例４ＰＴＨｒＰの部分的配列決定実施例３によシ調裏された精製ＰＴＨｒ　Ｐが一連のエドマン分解にかけられ、そしてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｇａｓ　ｐｈａｓｅ　５ｅｑｕｅｎｔａｔｏｒ　（５７）を用いて分析された。配列決定は３度行われ、得られる結果を第１表に示す。ｎ製ＰＴＨｒＰのＮ−末端配列分析により４１個のアミノ酸が同定される。ＰＴＨｒＰのアミノ酸配列はＰＴＨｒ　Ｐのトリプシン分解断片を用いて５０残基まで拡張された。第１表のアミノ酸は、レター　コード（１ｅｔｔｅｒ　ｃｏｄｓ　）　？：使用して指定される（５８）。

精製ＰＴＨｒＰのトリプシン分解は、７５μｇのＰＴＨ様生物活性＊（合成ＰＴＨ標準に対して、ＵＭＲ−１０６細胞生物学的アツセイによってＰＴＨｒＰの調整物をアッセイすることによ、ｉ５　ＰＴＨ様生物活性物は測定される）ｔ３７ ℃で２４時間トリグシｙ　（１：　１０Ｗ／Ｗ）とインキュベートすることによシ実施された。このトリ！シン分解物はＨＰＬＣによｆｉ１８個のピークに分離された（第５図）。これらのピークの数個のアミノ酸配列が決定され、そしてピーク７に含まれる配列は、残基３８において始まるＰＴＨｒＰのＮＨ２−末端配列と重なることがわかった。このペプチドがＰＴＨｒＰのアミノ酸配列を残基５０まで伸張した。

ＰＴＨｒＰの最初の２４個のアミノ酸が、コンピュータープログラムを使用してＮＢＲＦデーター　ベース（５９）中のタンパク配列と比較された。４５−８０％の重複配列の相同性を伴って、ヒト及びラッ）　ＰＴＩ（の最初の２４個のアミノ酸との実質的な同質性が明らかにされた。構造的同一性は、ヒ）　ＰＴＨの最初の１３個の７ミノ駿とで特に示され、そしてそれ以降ではずっとよシ少ない。ＰＴＨの最初の１０個のアミノ酸全含有する配列は、非常に弱い免疫原であシ、そして実際にこれは現実の配列、そしてコンピー−ター化した予測法から予測され得る。ＰＴＨｒＰ配列が同様な方法で分析される場合、ＰＴＨよシも感知できるほどよシ一層免疫原住であることがわかった。

実施例５精製ＰＴＨｒＰのアミノ酸分析高度に精製したＰＴＨｒＰのサンプル（第４図のカラム溶出由来の４６−４８試験管：合計ＰＴＨ様生物活性物７μｇ）が、第６図に示されるようにＢｒｏｗｎｉｅｓｃ８カラム（２，ｌ■）によシクロマド処理された。

主要ピークのダイオード・アレイ（Ｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ　）検出（第６図の挿入部）は、ピークの肩に芳香族アミノ駿内容齋の夾雑を示した。主要ピークの中心部は１１０℃で２５時間加水分解され、そしてベックマン６３００アミノ散分析器（Ｂｅｅｋｍａｎ　６３００Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ａｎａｌｙｓｅｒ　）で分析された。その結果は第２表に示される。分析された量は２０　ｐｍｏｌｅｓで、そして８．８μｇのウシＰＴＨ（１−３４）と生物活性において等価であることがわかった。この精製調製物の比活性はＰＴＨのそれよりも約２０倍大きいことを示した。上記アミノ酸分析は、　ＰＴＨｒＰが１５４個のアミノ酸を含有することを示す。

実施例６ＰＴＨｒＰペプチドのペプチド合成及びこれらのペプチドに対する抗血清の調製ＰＴＨｒｐの７ミノ末端配列に対応して合成ペプチドが、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４３　ＯＡ自動ペグチド合成装置を用いてメリフィールド法（４１）によシ合成された。合成ペプチドは無水ＨＦを用いて担体樹脂から開裂され（４２）、６０％アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢醸で抽出され、ロータリー　エバポレートされ、さらに凍結乾燥された後、０− ６０ｑｂアセトニトリルのダラージェント（合計容量１０１００Ｏによシ低圧逆相カラム（２，５Ｘ３０ｃｍ　＃　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃ，８逆■、１５−１７μ２５０Ａ　ｐｏｒｔ　５ｉｚｅ）でクロマト処理された。精製されたペプチドは凍結乾燥された。ペプチドの組成を確認するためにアミノ酸分析が用いられた。カルブキシ末端システィンを介して大豆トリプシン　インヒビターに接合された合成ペプチドによシ、ラビットが免疫感作された。

第１表における配列情報に基づき次のペプチド類似化合物が合成された：Ａｌ　ａ−Ｖａ　ｌ　−８ｅ　ｒ−Ｇｌｕ　−Ｈｉ　＠−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ− Ｇｌ　ｕ−Ｈｉ　ｓ−Ａ＠ｎ−Ｃｙｓ（（Ｇｌｎ８．　Ａｓｎ”　、　Ｃｙｓ” 　：ｌ　ＰＴＨｒＰ（１−１１）　ｅ　Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ　−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　５−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ− ８ｅｒ−１１ｅ−Ｇｌｎ　（（Ａｓｎ１０）　ＰＴＨｒＰ　（１−１６）　）　、　（Ａｓｎ”　ｅＴｙｒ”）ＰＴＨｒＰ（１−１７）、及びＰＴＨｒＰ　（１ −３４）　、該類似化合物［Ｇｌｕ８．　Ａｓｎ”　、　Ｃｙｓ”　］　ＰＴＨｒＰ　（１−１１）及び［：　Ａｓｎ”　）　ＰＴＨｒＰ（１−１６）はアデニル酸シクラーゼ　アッセイ中で不活性であシ、そしてＰＴ）（それ自体の又はＢＥＮ細胞由来の条件化培地の活性に拮抗しなかった。大豆トリプシンインヒビターに接合された［　Ｇｌｕ８．Ａｓｎ”、Ｃｙｓ”］　ＰＴＨｒＰ（１−１１）が、ラビッ）１免疫感作するために使用され、そして抗血清が調製され、これがラジオイムノアッセイで使用された。また、（Ａａｎ”　）　ＰＴＨｒＰ（１− １６）に対する抗血清は同様な態様でラビットに生じた。

実施例７ＰＴＨｒ　Ｐに対して向けられた抗血清を用いるアッセイラジオイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイのためのトレーサーとしてエ　−ラペル化［Ａｓｎ　。

Ｔｙｒ”　）　ＰＴＨｒＰ（１−１７）　’ｃ用いて実施され、そしてラビット抗血清が、１／１０００の最終希釈物として実施例５によシ調製された。最初のインキュベージ、ンは、０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍリンリントリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中で４℃で夜通し行われた。遊離ペプチドからの結合ペプチドの分離は、固相第二抗体（Ｓａｃ　Ｃｅｌｌ−Ｗｅｌｌｃｏｍｓ。

Ａｕａｔｒａｌｉａ　）　ｆ用いて達成された。合成ペプチドのヨウ素化は、既にカルシトニンについて開示されているように（４４）、約１５０μＣ１／μｇの比活性になるように実施された。

第７Ａ図に示したように、上記アッセイはＰＴＨｒＰ（１−１０）及び（１−１６）を同等に認識した。ｈＰ’ｒＨ（１−１０）及びｈＰＴＨ（１−３４）の交叉反応性は、それぞれ０．５及び０．３％であった。ラフ）ＰＴＨ（１−３４）、ウシＰＴＨ（１−３４）及びヒトＰＴＨ（ｔ−３４）の交叉反応性は、それぞれ７％、５％及び０．４％であった（第７Ｂ図）。ＰＴＨｒＰは、ＰＴＨｒ　Ｐのエピトープに結合することができる抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。この技術において、　ＰＴＨｒＰに結合することができる抗体が担体マトリックスに付着される。ＰＴＨｒＰ含有材料は、担体マトリックスがクロマトグラフィー　カラム中にある場合にはそれを通して濾過され、また別法としてバッチ的法を用いるならば該マトリックスと混合される。上記材料中に存在するすべてのＰＴＨｒＰが該マトリックスに結合し、そしてそれはすべての夾雑物質を除去するため洗浄することができる。その後、精製ＰＴＨｒＰは、抗体結合を開裂する条件、例えば高いか又は低い一条件を用いてマトリックスから溶出され得る。同様な技術がＰＴＨｒＰに結合することができる抗体を精製するために使用し得る。これに関しては、実施される工程はＰＴＨｒＰが担体マトリックスに付着されることを除いては、上記の概要のものと同じである。

第８図は、部分的に精製されたＰＴＨｒＰＯＨＰＬＣ画分（即ち、ＳＰ−セファデックス　クロマトグラフィー溶出物）へのラジオイムノアッセイの結果を示す。

部分的に精製されたＰＴＨｒＰ　（３５Ａｇ　ｈＰＴＨに等価）は、Ｃ１８逆相監視（ｇｕａｒｄ　）カラム（ＲＰ３００，７μ０．３　Ｘ　４．Ｏｃｍ　）によシクロマド処理された。溶離は９０分以上１　ｍｌ　／　ｍｉｎの流速で０− ６０％アセトニトリル／　０．１　％　ＴＥＡのダラージェントにおいて実施された。生物学的アッセイはおいている円（○）を表わし、閉じた円（・）としてラジオイムノアッセイが表わされる。第８図は、生物学的活性及び免疫学的活性の同時的溶出を示す。

ＰＴＨｒＰ（１−３４）’グチドは、ＵＭＲ１０６−０１細胞中のサイクリック蔚応答についてウシＰＴＨ（１−３４）に対してアッセイされ、そして等価な能力が存在することがわかった（第９Ａ図）。同様に、ＵＭＲ１０６−０１細胞中のプラスミノーゲン　アクチベーター活性を増加する能力においてもウシＰＴＨ（１−３４）に対して等価であった（第９Ｂ図）。これは、本発明者らが報告してきたＰＴＨ応答系であシ、そして十分に特徴付けられている（５２）。

ニスターン　プロット　’Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　）分析実施例３のピークＡの２つのサンプル由来のタンノｆり、実施例３のピークＢから誘導される高度に精製したＰＴＨｒＰ　、及び純粋なウシ副甲状腺ホルモンが５ＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｋかケラれ、ニトロセルロースに移され、１時間低界面活性剤“プロン）　（Ｂｌｏｔｔｏ　）″でブロックされ、１：２００希釈における［：　ＡＳＮｌｏ）ＰＴＨｒＰ　（１−１６）に対するラビット抗血清とインキユベートされ（実施例５参照）、山羊抗−ラビット血清の１２５ＩでラベルしたＦａｂ断片と１時間インキュベージし、そしてその後オートラジオグラフ処理された（第１０図）。

予期されたように、高度に精製したＰＴＨｒＰ　ｔ−含有したレーン４は、ＰＴＨｒＰの分子量と一致する１　８　Ｋｄのバンドを示す。これに対して、実施例３のピークＡ由来のタンノｆりを含有するレーン２及び３は約２２　Ｋｄのバンドを示す。このことは、　ＰＴＨｒＰが少なくとも２つの形態で存在し、両方とも同じ生物学的な能力を有するが、分子量及び逆相ＨＰＬＣ上の溶離挙動において相違することを強く示唆する。純粋なウシ副甲状腺ホルモン（レーンｌ）は、これらの東件下ではいかなるバンドも示さなかった。

ＰＴＨｒＰに対して向けられる抗体は、生物学的サンプル中に上記タンノｆりが存在するか否かを検出するために使用され得る。

該生物学的サンプルは固相担体、例えばニトロセルロース又はＰｖＣに結合され、そして抗−ＰＴＨｒＰ抗体と反応され得る。抗体の結合性は、その後抗体に付着する検出可能なラベルを用いることによシ検出され得るか、又はむしろ結合した抗体に対して特異的な第２のラベルした試薬を用りることによシ検出されるであろう。試薬としては、例えばプロティンＡ、又は抗−Ｆａｂもしくは抗−Ｆｅ抗体が使用され得る。

他方、抗−ＰＴＨｒＰ抗体が固相担体、例えばＰｖＣプレート、ポリスチレン　ビーズ等に結合され得るだろう。その後、アッセイされるための物質が上記担体に添加され、そしてそれが抗体と結合することを可能にするため十分な時間インキュベートされ、次いで結合していない物質が洗浄除去される。その後、第２のラベルしたＰＴＨｒＰ抗体が抗体結合性を検出するために上記担体に茄えられるであろう。第２の抗体がラベルされていないなら、抗体結合性を検出するために改めてラベルした試薬が該担体に加えられるだろう。容易に予期され得るように、これらの手段は、　ＰＴＨｒＰが少なくとも２つのエピトープ、その１つは固相担体に結合した抗体に結合するものであシ、そして他は第２の抗体に結合するもの、を含有すること想定している。

好適な検出可能ナラヘルは、１２５１．　Ｓ２ｐ、　３Ｈ１１４ｃ、ピオチン、アビジン、プロティンＡ、コロイド状の金もしくは銀、ウレアーゼ、アルカリ　ホスファターゼ、ワサビ　ノセーオキシダーゼ又はフイコヒリプロテインを包含する。

実施例７遺伝分析ＰＴＨｒＰタンノＪ？りはＰＴ）Ｉに対し実質的に相同性を持つため、それが特有の非対立遺伝子によりてコードされたものか、又はＰＴＩ（遺伝子それ自体の変異形であるかを決定することが必要だと思われた。

実験は、　Ｐでラベルされた単一コピーＰＴＨ遺伝子及びその３′フラツキング領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｓ＋ｇｉｏｎ）に特異的なプローブ（４５）ｔ−用いて実施された。

ノデン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　）グル分析は、ＨＥＮ細胞に由来するか又は外科的に切除されたヒト上皮小体腺腫から調製されるトラック（ｔｒａｃｋ　）　”Ｍｒたり５　ｍｇのＰｏ１ｙＡ　ｍＲＮＡ　ｆ用い、既に開示されているように（４６）実施された。サデーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）グル分析は、ＢＥＮ細胞に由来するか又はヒト白血球から調製されるトラック当たｌ）　１０　ｍｇの制限酵素消化されたｒツムＤＮＡ　’ｉｉ−用い標準法（４７）を改良したものである。ヒトＰＴＩ（プローブは、３２Ｆ−５１，／Ｖオテドによシ１０　ｄｐｍ／ｍｇ以上の比活性にまでランダムにプライムされた（２６）。ハイツリダイゼーシ璽ン及び洗浄条件は開示されたところのものであった（４６）。

ｐｏｌｙＡ　メツセンジャーＲＮＡのノザン　グル分析は、　ＢＥＮ細胞が上皮小体腺腫組織に比し検知可能なレベルにおいてＰＴＨ遺伝子を発現しなかったことを示した（例示しなかった）。ＢＥＮ細胞に由来するか又はヒト白血球に由来する制限酵素消化したゲノムＤＮＡのサザーン　グル分析は、同一のＰＴＨ−含有制限断片、例えば４．２及び３．８　ＫｂのＥｃｏＲＩ断片を示した。従って、Ｂ四は、非発現性ＰＴＨ遺伝子、及び指示したタンノ量り配列を備えているＰＴＨｒＰの発現から推論すると、ＰＴＨ−関連遺伝子をコードする相同の遺伝子の両方を含有する。

実施例８様々な組織によるＰＴＨｒＰの産生ＰＴＨｒＰ産生は腫瘍細胞に限られるとは思われない。

この点を明らかにするために羊の胎児、雌羊の組織及び胎盤の抽出物に関連する実験が遂行された。抗−ＰＴＨ抗血清又はＰＴＩ（拮抗物質と前もってインキーペーションした後にアッセイを行うことによって、本発明者らは生物活性が単独のＰＴＨもしくはＰＴＩ（ｒ　Ｐに帰すべきか、又はそれらの２つの混合物に帰すべきかを決定することが出来た。

羊の胎児上皮小体は５０％だけがＰＴＩ（によシ説明でき、残シはＰＴＨｒＰに帰する可能性があるところの生物活性を含有することがわかった。いくらがのＰＴＨｒＰ　（約２０チ）は母性上皮小体中に見い出された。

しかしながら、最も著しいことは胎盤（’１感知しうる程度の活性を含むことが見い出され、そしてそれはＰＴＨｒＰとして完全に説明することができ、そしてまたそれはＢＥＮ細胞培養物由来のＰＴＨｒＰと同じ態様においてＨＰＬＣ上で挙動した。さらにまた、胎盤中で検出できるＰＴＨｒＰＯ量は、上記上皮小体が胎児から切除された雌羊由来の胎盤の中では減少されなかった。このことは、胎盤がＰＴＨｒＰの重要な源泉であシうることを示唆する。

本発明者らは、悪性の液性過カルシウム血症を有する患者の尿からＰＴＨｒＰ　ｆ精製した（７′−夕は示さない）。これらの結果に基づけば、本発明の抗体試薬を用いて血清、尿又は他の生物学的な流体中のＰＴＨｒ　Ｐの存在が検出され得る。従って、本発明の抗体試薬は悪性腫瘍の識別における診断薬として有用性を有する。

本発明の他の態様、それらに対する改良そしてそれらに対する変形は、本ＢＡｗｉ書を読むことによ！：Ｉ轟業者にとって明らかになるであろうし、そしてががる全ての他の態様、改良及び変形は本発明の態様の中に包含されように考えられる。

引用文献１、Ｍａｒｔｉｎ　、　Ｔ、Ｊ、及びＡｔｋｉｎｓ　、　Ｄ、　（１９７９）　Ｅｓ５ａｙｓｉｎ　Ｍｅｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４．４９−８２゜２、Ｍｕｎｄｙ　、　Ｇ、Ｒ，及びＭａｒｔｉｎ　、　Ｔ、Ｊ、　（１９８２）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ３１，１２７４−１２７７゜３、Ｍｕｎｄｙ　、　ＧｅＲ，、Ｉｂｂｏｔｓｏｎ　、　Ｋ、Ｊ、　、　Ｄ　５ｕｏｚａ、　ＳｅＭ＊。

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Ｒ，Ａ＠　Ｍｅｌｉｃｋ、　Ｖ＠Ｐ、　Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ及びＮ−Ｈ＊　Ｈｕｎｔ　−Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｉｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ　ｉｎ　ａｎ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ、Ｎａｔｕｒｅ　２６Ｌ４３６−４３８　（１９７６）。

２１、Ｄ、Ａｔｋｉｎｓ、Ｎ、Ｈ，Ｈｕｎｔ、Ｐ、Ｍ＊　Ｉｎｇｌｅｔｏｎ　ａｎｄＴ、Ｊ＠　Ｍａｒｔｉｎ、Ｒａｔ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　５ａｒｃｏｒｎａ　ｃｅｌｌｓ：１ｓｏｌａｔｉｏｎ及びｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ及びｃｙｃｌｉｃ　ＧＭＰ＠Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０１．５５５−５６１　、（１９７７）。

２２、ＩＬ　Ａｔｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｔ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｒａｔ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　：Ｅｆｆｅｃｔａ　ｇｆ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ。

ｔｈｅｉｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ及びａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｏｎ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ、１３．８６１−８７１　（１９７７）。

２３、Ａ、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｎ、Ｈ，Ｈｕｎｔ、Ｊ、に、Ｄａｗｂｏｒｎ、Ｖ、Ｐ。

Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ａｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔ。

ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ及びｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ及びａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ及びｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒ、、７７ｔ　２１３，２２４ｔ　（１９７８）。

２４、Ａ、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｄ、Ａｔｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｔ、Ｊ、Ｍａｒｔｉ、ｎ、ＲａｔＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ：　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｅｌ、　Ｅ２．　ｌ２（ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）、　６　ｋｅｔｏ　Ｆ　、及びｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ１α Ｂ２ｏｎ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ及びａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、。

２８．１１９５−１２０１．（１９７８）。

２５、　Ｍａｒｔｉｎｔ　Ｐ、Ｍ、、　Ｉｎｇｌｅｔｏｎ、　Ｌ、Ａ、、　Ｃｏｕｌｔｏｎ及びＲ，Ａ。

Ｍｅｌｉｃｋ、　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ、　Ｃｌ１ｎ。

０ｒｔｈｏｐ、　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、、ｉ４ｏ、２４７−２５４．（１９７９）。

２６、　Ｄ、　Ａｔｋｉｎｓ、　Ｐ、Ｃ，Ｗａｌｌｅｒ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｒａｔｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ：　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　’ｂｙｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ及びｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｐｈａｒｍ、及びＰｈｙｓ、、　７゜２７．　Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、Ｄ、Ａｌｃｏｒｎ、Ｖ、Ｐ、Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ。

Ｂ、Ｅ、　Ｋｅｍｐ、　Ｇ、Ｂ、　Ｒｙａｎ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ。

Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｎｏｒｍａｌ及びｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｒａｔ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃｃｅｌｌｓ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１０８．　２１３−２１９　（１９８１）。

２８、　Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｂ、Ｅ、　Ｋｅｍｐ、　Ｍ、Ｃ，Ｖｅｒｏｎｉ及びＴ、Ｊ。

Ｍａｒｔｉｎ、　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｂｏｎｅｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ、　ｐｒｏａｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２及びｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１０８．２２Ｃ）−２２６（１９８１）。

２９、Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｒ，Ｊ、　Ｆｒａｍｐｔｏｎ、Ｊ、Ａ、　Ｅｉｓｍａｎ、　ｖ、ｐ。

Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ、　Ｅ、　Ｅｌｍｓ、、　Ｔ、Ｒ，Ｂｒａｄｌｅｙ及びＴ、Ｊ。

Ｍａｒｔｉｎ、　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　１，２５（ＯＨ）２ｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ３ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｉｎ　ｃｌｏｎｅｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ　ｒａｔｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１５゜１３９−１４２　（１９８０）。

３０、　Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｂ、Ｅ、　Ｋｅｍｐ、　Ｓ、Ａ、　Ｌｉｖｅｓｅｙ及びＴ、Ｊ。

Ｍａｒｔｉｎ、Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒａｔｉｏ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙｔｌｌｌ、１７８−１８３　（１９８２）。

３１、Ｓ、Ａ、　Ｌｉｖｅｓｅｙ、　Ｂ、Ｅ、　Ｋｅｍｐ、　Ｃ，Ａ、’　Ｒｅ、　Ｎ＠Ｃ。

Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｈｏｒｍｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　Ａ？ｖｉＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ　１ｓｏｅｎｚｙｙｎｅｓ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ及びｍａｌｉｇｎａｎｔｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５７＊　１４９８３−１４９８８（１９８２）。

３２、Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｄ、　Ａｌｃｏｒｎ、　Ｖ、Ｐ、　Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ、　Ｇ、□Ｒｙａｎ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ及びｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｃｌｏｎａｌｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｏｒｉｇｉｎ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３．４３０８−４３１４．　（１９８３）。

３３、Ｊ、Ａ、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｓ、Ｒ，Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、　Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｒｎ、　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ　ｃｅｉｌｓ　ｂｙｂｏｎｅ−ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、　１２２．２３０−２３６　（１９８４）−３４、Ｓ、Ｍ、　Ｆｏｒｒｅｓｔ、　Ｋ、Ｗ、　Ｎｇ、　Ｄ、Ｍ、　Ｆｉｎｄｌａｙ、　Ｖ、Ｐ。

Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ、　Ｓ、Ａ、　Ｌｉｖｅｓｅｙ、　Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｊ、Ｄ。

Ｚａ　ｊ　ａｃ及びＴｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ　ｃｌｏｎａｌ　１ｉｎｅ　ｗｈｉｃｈ　ｒｅｓｐｏｎｄｓ　ｔ。

ｂｏｔｈ　ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ及びｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、　Ｃａ１ｃ。

Ｔｉ５ｓ、　Ｉｎｔ、　３７．　５１−５６　（１９８５）。

３５、Ｍ、Ｋｕｂｏｔａ、　Ｋ、Ｗ、　Ｎｇ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｌ、２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ３ｏｎ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰｒｅ８ｐｏｎ８ｅ８　ｔｏ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｉｎ　ｃｌｏｎａｌ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、ｓ　２３１．　１１−１７　（１９８５）。

３６．Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、　Ａ、Ｌ、　０ｐｉｅ、　Ｒ，Ｔ、　０ｐｉｅ及びＴ、Ｊ　。

Ｍａｒｔｉｎ、　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ。

Ｃａ１ｃ、　Ｔｉ５ｓ、　Ｉｎｔ、、　３７．　５１９−５２５　（１９８５）。

３７、Ｋ、Ｗ、　Ｎｇ、　Ｓ、Ａ、　Ｌｉｖｅｓｅｙ、　Ｆ、　Ｃｏ１１ｉｅｒ、　Ｐ、　Ｇｕｒｒｒｎｅｒ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ。

ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５゜５１０６−５１１３　（１９８５）。

３８、Ｓ、Ａ、　Ｌｉｖｅｓｅｙ、　Ｋ、Ｗ、　Ｎｇ、　Ｇ、　Ｃｏ１１ｉｅｒ、　Ｍ、　Ｋｕｂｏｔａ。

Ａ、Ｌ、　５ｔｅｉｎｅｒ及びＴ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｒｅｔｏｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ及びＰＴＨａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ　ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　ｃｌｏｎａｌ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　８ａｒＣＯｍ＆ｃｅｌｌｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５ｍ　５７３４−５７４１　（１９８５）。

３９、Ｊ、Ａ、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｓ、Ｒ，Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、　Ｎ、Ｃ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ。

及びＴ＠Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙｂｏｎｅ−ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ及びｍａｌ　ｉｇｎａｎｔｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙｓ　１１６ｓ　２１８６−２１９１（１９８５）。

４０、Ｍ、Ｋｕｂｏｔａ、　Ｋ、Ｗ、　Ｎｇ、　Ｊ、　Ｍｕｒａｓｅ、　Ｔ、　Ｎｏｄａ、　ＪｏＭ。

Ｍｏ５ｅｌｅｙ　ａｎｄ　Ｔ、Ｊ、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｅｆｆｉｃａｃｙ及び５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅａｎａｌｏｇｕｅｓ　ａｓ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｉｎ　１ｎｔａｃｔ　ｃｌｏｎａｌｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１０８゜２６１−２６５　（１９８６）。

４１、Ｈｏｄｇｅｓ、　Ｒ，Ｓ、及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　（１９７５）　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６５．　２４１−２７２゜４２、Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｊ、Ｍ、及びＹｏｕｎｇ、　Ｊ、Ｐ、　（１９６６）　５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　１）ｐ−４４，”　６６、　Ｆｒｅｅｍａｎ、　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ。

４３、Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　ｊ、、　Ｄｒｅｖｉｎ、　Ｈｅ及びＡ−ｘｅｎ、　Ｒ，（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１７３．　７２３−７３７゜４４、Ｆｉｎｄｌａｙ、　Ｄ、Ｍ、、　ＤｅＬｕｉｓｅ、　Ｊ＠　Ｍｉｃｈｅｌａｎｇｅｌｉ、　Ｖ、Ｐ、。

Ｅｌｌｉｓｏｎ、　Ｍ、及びＭａｒｔｉｎ、　Ｔ、Ｊ、　（１９８０）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４０．１３１１−１３１７４５、Ｖａｓｉｃｅｋ、　Ｔ、Ｊ、、　ＭｃＤｅｖｉｔｔ、　Ｂ、Ｅ、、　Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｍ、Ｗ、。

Ｆｅｎｎ１ｃｋ、　Ｂ、Ｊ、、　Ｈｅｎｄｙ、　Ｇ、Ｎ、、　Ｐｏｔｔｓ、　Ｊ、Ｔ、　Ｊｒ、。

Ｒｉｃｈ、　Ａ、及びＫｒｏｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｍ、　（１９８３）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０，２１２７−２１３１゜４５、Ｚａｊａｃ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｐ、、　Ｎ１ａｌｌ。

Ｈ，Ｄ、及びＪａｃｏｂｓ、　Ｊ、Ｗ、　（１９８５）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１６ｙ７４９−７５５゜４７、Ｒｅｅｄ、　Ｋ、Ｃ，及びＭａｎｎ、　Ｄ、Ａ、　（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１３．　７２０７−７２２１゜４８、　Ｗｅｅｋｓ、　Ｄ、Ｒ，、Ｂｅｅｒｍａｎ、　Ｎ、及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、　０．Ｍ。

（１９８６）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５２．３７６−３８５゜４９．　Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｐ、　、　Ｈａｌｅｙ、　Ｊ、　＊　Ｊｏｈｎ＋　Ｍ、　Ｃｒｏｎｋ　）　Ｍ−ｐＣｒａｗｆｏｒｄ、　Ｒ，＊　Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ　ｔ　Ｊ−ｔ　Ｔｒｅｇｅａｒ　＊　Ｇ、Ｗ、　＊５ｈｉｎｅ　、　Ｊ、及びＮ１ａｌｌ　、Ｈ，Ｄ、　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０１　。

６２８−６３１　。

５０、　Ｙａｌｏｗ　、　Ｒ，及びＢｅｒｓｏｎｎ　Ｓ、Ａ、　（１９５９）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ、）、１８４．１６４８−１６５０−５１、　Ｔｏｗｂｉｎ　、　Ｈ，、５ｔａｃｋｅｌｉｎ　、　Ｔ、及びＧｏｒｄｏｎ　、　Ｊ　、　（１９７９’）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡｓ　７６．４３５０−４３５４゜５２、Ａ１１ａｎ、Ｅ、Ｈ，、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｊ、Ａ、、Ｍｅｄｃａｌｆｓ　Ｒ，Ｌ、。

Ｋｕｂ　Ｏｔａ　ｓ　Ｍ−及びＭａｒｔｉｎ、Ｔ、Ｊ、　（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ−ｓ　ｓｓｓ、１９９−２０７゜５３．５ｃｈｏｌｄ、　Ｍ、　ｓ　Ｃｏｌｏｍｂｅｒｏ、　Ｄ、　ｅ　Ｒｅｙｅｓｔ　Ａ、及びＷａｌｌａｃｅ、　Ｂ、　（１９８４）　ＤＮＡ、　Ｖｏｌ、　３．６．４６９−４７７゜５４、Ｒａｂｂａｎｉ　ｓ　Ｓ、Ａ、　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　、　Ｒｏｙ、　Ｄ、Ａ、、　Ｋｒａｍｅｒ。

Ｒ，、Ｂｅｎｎｅｔｔ　、　Ｈ，Ｐ、Ｊ、及びＳｏｌｔｒｙｍａｎ、　Ｄ、　（１９８５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１８ｓ１２００−１２０９゜５５、Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ａ、Ｆ、　＋　Ｉｎｓｏｇｎａ、　Ｋ、Ｌ、、　Ｓｏｌｔｒｙｍａｎ、　Ｄ、及びＢｒｏａｄｕｓ、Ａ、Ｅ、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ、８０．１４５４−１４５８゜５６、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、　（１９７６）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２ｍ２４８−２５４゜５７、　Ｗｅｔｔｅｎｈａｌｌ、　Ｒ，Ｅ、Ｈ，、Ｋｕｄｌｉｃｋｉｔ　Ｗ、、　Ｋｒａｍｅｒｓ　Ｇ、及びＨａｒｄｅｓｈｙ、　Ｂ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ−２６Ｌ

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋なＰＴＨｒＰ。２．第１表に一致するＮ末端アミノ酸配列、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に１４から２０キロダルトンの範囲の分子量を有する請求項１記載の実質的に純粋なＰＴＨｒＰ。３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に２０から２７キロダルトンの範囲の分子量を有する請求項１記載の実質的に純粋なＰＴＨｒＰ。４．請求項１から３項のいずれかの一つに記載されたＰＴＨｒＰ４のサプーユニット又は断片。５．ＰＴＨｒＰ活性を有することを特徴とする請求項４記載のＰＴＨｒＰのサプーユニット又は断片。６．サプーユニブト又は断片がＰＴＨｒＰ（１−３４）てあることを特徴とする請求項５記載のＰＴＨｒＰのサプーユニット又は断片。７．〔Ｇｌｕ８，Ａｓｎｌ０，Ｃｙｓ１１〕ＰＴＨｒＰ（１−１１），〔Ａｓｎ１０〕ＰＴＨｒＰ（１−１６），又は〔Ａｓｎ１０，Ｔｙｒ１７〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）。からｕる群から選択されるＰＴＨｒＰの変性サプーユニット。８．９．ＰＴＨｒＰのエピトープと結合し得る抗体試薬。〔Ｇｌｕ８，Ａｓｎ１０，Ｃｙｓ１１〕ＰＴＨｒＰ（１−１１），〔Ａｓｎ１０〕ＰＴＨｒＰ（１−１６），〔Ａｓｎ１０，Ｔｙｒ１７〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）ＰＴＨｒＰ（１−３４）．，又はからなる群から選択されるＰＴＨｒＰのペプチド断片に対して向けられることを特徴とする、請求項８記載の抗体試薬。１０．１以上の検出しうるマーカーでラペルされた請求項８又は９記載の抗体試薬。１１．ＰＴＨｒＰのエピトープに結合し得る１以上の抗体試薬を含んでなるＰＴＨｒＰ又はそれらの断片の検出のためのキット。１２．請求項１１記載のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片の検出のためのキットであって、そして上記抗体試薬がＰＴＨｒＰのペプチド断片そして〔Ｇｌｕ８，Ａｓｎ１０，Ｃｙｓ１１Ｈ〕ＰＴＨｒＰ（１−１１），〔Ａｓｎ１０〕ＰＴＨｒＰ（１−１６），〔Ａｓｎ１０，Ｔｙ１７〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）又はＰＴＨｒＰ（１−３４）．からなる群から選択されるペプチド断片に対して向けられることを特徴とするキット。１３．抗体試薬が検出し得るマーカーでラペルされていることを特徴とする請求項１１又は１２記載のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片の検出のためのキット。１４．付加的に、ＡＳＣＦ又はそれらのペプチド断片に対して結合する検出抗体のための１以上試薬を含んでなる請求項１１から１３項のいずれかの一に記載のキット。１５．請求項１２から１４項のいずれかの一に記載のキットであって、（ｉ）ＰＴＨｒＰ結合性を検出するためのアッセイをその上で逐行するための固相マトリックス；及び／又は（ｉｉ）試薬の希釈のための緩衝法もしくは適当な溶液を１以上、をさらに含んでなるキット。１６．所与のタンパク含有サンプル中のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片の検出のための方法であって、該サンプル、又は該サンプル中のタンパクがその上に固定されている固相マトリックスと、ＰＴＨｒＰのエピトープに結合し得る抗体試薬とを接触せしめ、そして引き続き抗体結合性の存在又は不存在を検出することを含んで成る方法。１７．ＰＴＨｒＰのエピトープに結合し得る抗体が検出可能なマーカーでラペルされていることを特徴とする請求項１６記載の方法。１８．ＰＴＨｒＰに結合する抗体の存在又は不存在が、抗体に結合可能な出検し得るマーカーでラペルされた試薬にすって測定されることを特徴とする請求項１６記載の方法。１９．所与のサンプル中のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片の検出のための方法であって、該サンプルと固相マトリックス（その上にＰＴＨｒＰのエピトープを結合し得る抗体が結合されている）とを、抗体が結合することを可能にするために十分な時間の間インキュベートし、そしてその後ＰＴＨｒＰのエピトープと結合し得る抗体試薬とＰＴＨτＰとの結合の存在又は不存在を測定することを含んでなる方法。２０．所与のサンプル中のＰＴＨｒＰの存在又は不存在を検出するために使用される上記抗体試薬が、検出可能なマーカーでラペルされていることを特徴とする請求項１９記載の方法。２１．ＰＴＨｒＰに対する抗体試薬の結合又は結合の不存在が検出可能なマーカーでラペルされた試薬にすり検出されることを特徴とする請求項１９記載の方法。２２．ＢＥＮ細胞が培養されたその培地からＰＴＨｒＰを回収することを含んででなるＰＴＨｒＰの精製のための方法。２３．ＰＴＨｒＰの精製のための方法であって、次の工程：（８）培地中てＢＥＮ細胞を培養し；（ｂ）上記培養物を陽イオン交換樹脂にかけ；（ｃ）上記陽イオン交換樹脂からの溶離物を分画し、そしてＰＴＨｒＰ活性について上記分画をアッセィし、そして（ｄ）ＰＴＨｒＰ活性を有するこれらの面分について逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施し、そして引き続き実質的に純粋なＰＴＨｒＰを単離すること、を含んでなる方法。