JPH01501203A - 日本脳炎ウイルス及び類似ウイルスの診断及びワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の名称〕 日本脳炎ウィルス及び類似ウィルスの診断及びワクチン本発明は米国陸軍医学研 究および発展司令からの基金（契約番号ＤＡＭＤ　１７−８２−Ｃ−２２３７） を含む政府援助によりなされた。政府は本発明にいくらかの権利を持つ。

〔背景技術〕

本発明は日本脳炎ウィルス（ＪＥＶ）に関連する核酸、診断試験、およびワクチ ンに関する。

ＪＥＶはヒトおよび家畜の双方において脳炎の原因となる７ラビウイルスである 。本出願においてＪＥＶは、ヒトおよび他の動物に存在する本ウィルスのすべて の変異体および株（発病力があるものないもの両方）を包含する。その様な、株 の例はパネルジー〔イ／ディア／ジャーナルオプメディカルリサーチ８３：２４ ３、（１９８６））により示されている。本ウィルスは主として極東に分布し、 シベリアから東インド、スリラン力、インドネシア化および中央部、ポルネオお よびフィリッピンにかげての沿海地域で多（流行する。特に中国で広まっており 、歴史的には日本においての衛生問題であった。

ＪＥＶを防ぐ事を意図したワクチンは日本人および中国人により発展されてきた 。それらはヒトおよび豚のごとき家畜の両方への使用を意図し化学的に弱毒化し た全ウィルス調製試料で構成されている。

現在のＪＥＶ感染の診断は免疫学的方法の使用を伴う、例えば、全ウィルス調製 試料を用いる標準ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤検定）試験でウィルス抗体を 検出する〔ザイアロら、ウィルス　インフェクション　エックスチェンジユニＬ −づレターフォー　サウスイースト　アジア　アンド　ザ　ウェスト　パンフィ ック２ニア、（１９８４）） 〔発明の開示〕 本発明はＪＥＶの診断およびそれに対する免疫法に使用するためのポリペプチド および核酸生成物を特色とする。ウィルス感染の診断はヒトまたは家畜のごとき 動物からの生物試料中の特定のウィルス核酸、特定のウィルス抗原または特定の ウィルス抗体の検出に基づいている。合成ウィルスタンパク質免疫原またはその ような免疫原をコードしているベクターの動物への接種により防御的抗ウイルス 抗体が誘い出される。

本発明はＤＮＡまたはＲＮ　＃’ｌ−’Ｊ７くとも・１吋基対配列Ω配列を持つ 実質的に精製された核酸を特色とし、それは日本脳炎ウィルスの核酸配列に等し く対応するが、黄熱ウィルスの核酸配列に好適な実施態様においては、図１に示 した配列内のセグメントから１０塩基配列が選択され、それは西ナイル熱ウィル ス（キャッスルら、パイロロジー１４９：１０．１９８６　；ウエングラーら、 パイロロジー１４７：２６４．１９８５　；キャッスルらパイロロジー１４５： ２２７．１９８５）、またはミュレー渓谷ウィルス（グルガル）ら、ジャーナル オプモレキュラー　バイオロジー　１８７　：　３０９．１９８６）、デング熱 ウィルスまたはセントルイス脳炎（ＳＬＥ）ウィルス（ポーターフィールド、ト ガウィルス、シュレジンガー編、アカデミツクプレス、ニューヨーク、ｐ１３− ３６．１９８０）の核酸配列には観察されないものである。

本発明の第一点はまた以下のごとき特色を示す：緊縮条件下日本脳炎ウィルスの 核酸と雑種をつ（るが前に掲げた関連ウィルスのものとは雑種をつくらない実質 的に精製された核酸：少くとも一つの抗原決定基を持つポリペプチドをコードし ている実質的に精製された核酸で、日本脳炎ウィルスがコードするタンパク質と は免疫学的に活性であるが、関連したウィルスによりコードされたタンパク質に は不活性であり：および日本脳炎ウィルスによりコードされているポリペプチド 配列（しかし黄熱ウィルスにはコードされていない配列）をコードしている実質 的に精製された核酸配列。

好適な実施態様においては、西ナイル熱ウィルス、ミエレー渓谷つイルスデング 熱ウィルスまたはＳＬＥウィルスではコードされていないポリペプチド配列を核 酸配列がコードしており；コードされているポリペプチドは日本脳炎に対する免 疫防御を上昇させ；ポリペプチドは日本脳炎ウィルスのおもなエンベロープタン パク質（Ｅ）または非構造性タンパク質Ｎ５１（ＮＳ１）に反応性を持ち；ポリ ペプチドは日本脳炎ウィルスのおもなエンベロープタンパク質（Ｅ）またはタン パク質ＮＳＩと実質的に同じであり；および、核酸はファージ、プラスミド、コ スミドまたはバキュロウィルス、ワクシニア、ロタウィルスおよびアデノウィル スのごとき真核生物ウィルスから選択されるベクター内に存在する。

本発明の第二点は前記の、またはＪＥＶの核酸の一部に実質的に対応する実質的 に精製された核酸からの核酸の発現により合成される実質的に精製されたポリペ プチドを特色とする。好適なポリペプチドはヒトまたは家畜において防御的免疫 原となる。

本発明の第三点は、前記核酸をプローブとして提供し、試料中の核酸へグローブ がハイブリダイズするかどうかを決定する事を特徴とする生物試料の日本脳炎の 診断の方法を特色としている。好適な実施態様においては、試料は感染細胞また は感染生物から得られ；プローブは日本脳炎ウィルスの主なエンベロープタンパ ク質（Ｅ）または非構造タンパク質（ＮＳ１）の少（とも一部をコードしている 核酸から構成される。

本発明の第四点は前記ポリペプチドからなる組成物または前記核酸を動物に接種 する事により日本脳炎に対する防御能を上げるための動物の予防接種の方法を特 色とする。好適な実施態様においては、注射または混虫ベクターにより接種され ；予防接種は黄熱、西ナイル用脳炎、ミーレー渓谷脳炎、セントルイス脳炎また はデング熱に対する免疫を誘導し；動物とはヒト、家畜または鳥の事である。

本発明の第五の点は、前記抗原性ポリペプチドまたはこれらの抗原性ポリペプチ ドのために産生された抗体と免疫学的に反断の方法を特色とし；好適にはＥＬＩ ＳＡ試験またはウェスタン　プロットにより検出される。

ＪＥＶの核酸が単離およびクローニングされたため、ＪＥＶ、およびもし望むな ら前記関連ウィルスからの分化ＪＥＶ、に特異的な検定の考案が可能になった。

さらに、クローン化されたＪＥＶを持っていれば、ＪＥＶゲノム゛のセグメント を核酸グローブとして使用し、ベクター内でそれらを発現せしめてウィルス抗原 を産生する事が可能であり、それゆえ、ＪＥＶ検定に抗体を使用できる（これら の検定がＪＥＶに特異的であってもな（でも無関係に）。これらの合成抗原は、 化学的に弱毒化したウィルスに較ベワクチンからのウィルス感染の危険性を減じ ているのでワクチンとして適している。

本発明の他の目的や利点は以下に記載する好適な実施態様および請求の範囲から 明らかにされよう。

〔発明を実施する為の最良の形態〕 最初に簡単に図面について説明する。

図 第１図はＪＥＶゲノムの部分的な核酸配列であり；第２図はＪＥＶ　ｃＤＮＡの クローニングの図式的表現であり； 第３Ａ、Ｂ図はＪＥＶゲノムの図式的表現であり、タンパク質−コード領域、制 限酵素部位およびクローン上に存在するその領域を示している。

第４図はＪＥＶゲノムのタンパク質コード配列およびλｇｔ１１組換え体中のｃ ＤＮＡ挿入物部分の図式的表現であり：第５ＡおよびＢ図はｐＯＥＭ　−４中の ＪＥｖ挿入ＣＤＮＡの配向の図式的表現であり： 図６はモノクローナル抗体で実験したλｇｔ１期換え体−感染細胞溶菌物のクツ ２シーブルー染色ゲルおよびウェスタンプロット分析の写真であり；抗大島菌ベ ーターガラクトンダーゼ、抗−ＪＥＶ−Ｅタンパク質、および抗−ＪＥＶ−Ｍタ ンパク質；“ｓｔｄ″は分子量標準品を表わす。

図７は各々ベーターガラクトシダーゼまたはＪＥＶ−Ｅ−タンパク質へのモノク ローナル抗体で実験したλｇｔ１１組換え体−感染細胞溶菌液のクマッシーブル 染色ゲルおよびウェスタンプロット分析の写真であり； 図８はＪＥＶ−Ｅタンパク質の疎水度をグラフで表現したもので一連の５７−１ クローンに存在するコード領域を示しており； 図９はＨＭＡＦ（ネズミ腹水液）からアフィニティー精製した抗体で実験したＪ ＥＶピリオンタンパク質のウェスタンプロット分析の写真であり；および 図１０はＨＭＡＦからアフィニティ精製した抗体で実験したＪＥＶ−感染蚊細胞 の溶菌物のウェスタンプロット分析の写真本発明の核酸の好適な起源はＪＥＶゲ ノムである。図１に一つのＪＥＶゲノムの核酸配列の実質的部分が示されている 。この配列によりコードされているタンパク質のアミノ酸配列はＲＮＡ配列の上 に標準１文字符号で与えである；遺伝子の位置はこのアミノ酸配列の上に示しで ある。他の適した核酸配列はＪＥＶの核酸を少くとも１０塩基対含み、関連する 黄熱ウィルスの核酸に１見０出されないものである。好適であるのは、西ナイル 熱ウィルス、ミュレー渓谷熱ウィルス、デング熱ウィルス、セントルイス脳炎ウ ィルスの配列にも対応しない配列である。

核酸はウィルスから以下に記載するごと（して得られ、所望のベクター中へ挿入 される。特異的プローブはこの核酸から誘導できる。特異的にとは、緊縮条件下 ＪＥＶのウィルス性核酸とのみ雑種をつくり、黄熱ウィルスのごときウィルスの ものとはつくらない領域をグローブが含む事を意味する。好適には、これらの条 件は西ナイル脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウイルスミュレー渓谷脳炎ウィル スおよびデング熱ウィルスの核酸とは雑種をつくらしめないであろ５゜緊縮条件 とは約１５塩基対のプローブ核酸配列が少（ともグローブ配列の８０％に対応す る配列を持つ他の核酸配列と雑種をつくらない条件を意味する。

ＪＥＶには特異的であるが関連するウィルスには特異的でないタンパク質コード および非コード配列の両方を含む他の核酸配列（例えば人工合成された）もまた 本発明に適している。このようなグローブはＪＥＶゲノムから直接クローン化ま たは化学的に合成でき、ベクター上に存在せしめるかまたは直線状核酸分子とし て維持できる。このように、ＪＥＶ内の天然の環境から単離され、通常それらを 囲む核酸から分離されたこれらのグローブはプローブとしてまたは発現ベクター 内で使用するために必要な程度まで実質的に精製される。

ＪＥＶゲノムのセグメントに対応する核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）として調 製される。ｃＤＮＡの収集またはライブラリー化はプラスミド、コスミドファー ジまたはウィルスのごとき所望のベクター内にできる。本発明に有益な核酸配列 の存在は、ＪＥＶの前記の領域への相同性の発見により、およびＪＥＶ未感染細 胞からのＤＮＡへの雑種形成能の欠除により検出できる。さらに、発現ベクター （λｇｔ１１のごとき）も使用できる。これらのベクターはこれらのベクターを 含む細胞からウィルス抗原タンパク質の発現を誘起しそれはウィルスまたは個々 のフィルス性タンパク質に反応性がある抗体で検出できる。

そのようなＪＥＶゲノムのライブラリーを２つ、およびスクリーニング方法の例 を以下に記載する。これらの例は本発明を制限するものではなく、この分野に精 通する者はＪＥＶ核酸な単離できる多くの他の技術があること認めるであろう。

更Ｋ、これらの方法はＪＥＶの全ての株からの核酸の単離に適している事を理解 されたい。

以下の実施例−へ・ては（特定的ではあるが限定的ではない）ｃＤＮＡ技術を用 いてＪＥＶゲノムがプラスミドベクター中にクローン化され、続いてλ−発現ベ クター中にサブクローン化される。λ−クローンは抗原性クイルメタ／バク質の 調製に利用され、それは続いて抗ウイルス抗体の調製に使用される。

１０．９ｋｂと推定されるＪＥＶゲノム（ナカヤマ株）の約１０ｋｂがｃＤＮＡ としてクローン化され、クローン化されていない部分は５′−末端の約４３０塩 基および３′−末端の４５０塩基に対応する。

実　施　例　１　：　ｃＤＮＡ　ライブラリー化された。ポリ−ｄＧの尾を持っ たベクターを用いｐ　Ｂ　Ｒ３２２０貝１遺伝子のＰｓｔ１部位へクローニング された。３′末端と相補的な一つのプライマーおよび５′末端から約２．５ｋｂ からの内部配列と相補的な他のプライマーから始まる２つの転写のサイクルを使 用した。第１の配列から約８．６ｋｂの独特なｃ　ＤＮＡが、第２のものからさ らに１．３５ｋｂのものが誘導された。図２を参照すると、レピックらにより記 載されたＲＮＡ抽出法により（レピックら：ジャーナル　オブ　バイロロジ−２ ０：１５７　；　１９７６およびラビングら、アメリカン　ジャーナルオプ　ト ロピカル　メディスン　アンド　ハイジーン　３２：５７７．１９Ｂ５）ベロ細 胞上で増殖したＪＥＶから正によれたウィルスＲＮＡが抽出されている。ＲＮＡ ゲノムの３′末端（３’−ＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＧＡ−５’）またはＲＮＡゲノ ムの５′末端から約２．５ｋｂ離れた配列（３’−ＧＡＣＣＴＣＧＴＧＧＴＴＴ ＡＣＡＣＣＣＴ−５’、以下に記載されるがＰＭ−６に存在する）Ｋ対応する合 成りＮＡプライマーを用いてｃＤＮＡのクローニングを開始する。

３′合成プライマー存在下、室温にて（２０−２５℃）１０μｇのＪＥＶ　ＲＮ Ａを５０ｍＭ水酸化メチル水銀（５μりで１０分間処理し、その後５倍モル過剰 のβ−メルカグトエタノールで反応を停止する。逆転写は５０ｍＭメリス／ＨＣ １（ｐＨ８３，４２℃）、６ｍＭ　Ｍ！ｊＣ１ｔ　、１００ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍ ＭｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ（”Ｐ）−ｄＡＴＰ（２キ：＞　 −リ／　ミ！Ｊ　モ／’　）、２００１’ｌ／ｍｌ　セラチア、５゜ユニットの ＲＮＡ　ｓ　ｉ　ｎおよび１００ユニツトの逆転写酵素を含有するｉ　ｏ　ｏ　 ｐｇの反応液で室温で１０分および４２℃にて１時間実施する。２０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、ｐＨ８０，０，２Ｍ　ＮａＣ１に調整する事により反応を停止する。混合 物をクロロボルムで抽出し、１０ｍＭ）リス／ＨＣｌ５　ｐＨ８Ｄ、１　ｍＭ　 ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　ＮａＣ１によるセファデックス−Ｇ１００カラムにて分離 し、エタノールで沈殿せしめる。

図２の方法に従い（Ａ）、第二の鎖合成のためのテンプレートは５ｍＭクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７，６，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ中ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッ ド（２５０μｇ）を１００℃にて２分間加熱し続いてすばやく氷水中で冷却する 事により調製される。第二鎖合成は１００ｍＭヘペスーＫＯＨｐＨ６，１０ｍＭ 　ＭｇＣ１ｚ　、２．５ｍＭ　ＤＴＴ、７０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭデオキシヌク レオチド三リン酸および２５ユニツトのクレノ÷ブラクメント（ＤＮＡポリメラ ーゼ）を含有する１ｏｏμｌの反応液中１６℃にて１６時間実施する。２０ｍＭ 　ＥＤＴＡ、ｐＨＢｆ：）および０．２Ｍ　ＮａＣＡ’に調整する事により反応 を停止せしめ、続いてクロロホルム抽出し、セファデックスＧ−１００カラムを 通過せしめた後エタノール沈殿する。

二重鎖ＤＮＡ（ｄ　５ＤＮＡ）を１００μノの５０ｍＭクエン酸ナトリウムＩ） Ｈ４５，０，３Ｍ　ＮａＣＡ’、１ｍＭ　ＺｎＣＡ！ｔおよび０．５％グリセロ ール中３７℃にて６０分間５００ユニツト／ｍ１ｓ−１ヌクレアーゼ処置する。

反応液を２０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８に調整した後反応液をクロロホルムで抽出し 、七フアクリルＳ−１０００カラムによるクロマトグラフィーによりｄｓＤＮＡ を大きさ別に分画し、５００　ｂｐｓの長さ以下のフラグメントを除去し、担体 として１０μＩのカキグリコーゲン存在下エタノール沈殿せしめる。

分画したｄｓ　ｃＤＮＡ（８−１０ｎ、！ｉ’）は末端トランスフェラーゼを用 い３′末端にオリゴｄａの尾を付ける。反応は１４０ｍＭカコジル酸、ＫＯＨで ｐＨ７に調整した３０ｍＭ）リス塩基、ｌｍＭＣｏ　Ｃｌ！　、　０．１　ｍＭ ＤＴＴ、　１００μｌ／１ｍｌゼラチンおよび２５ｍＭ　ｄＣＴＰを含有する５ ０μｌの反応液中で実施する。

反応液を２５℃にて１０分間インキュベートした後５０ユニツトの末端トランス フェラーゼを添加して反応を開始する。２，４゜６．８および１０分後に反応液 の一部（１０μｌ）を取り、氷冷した１０ｍＭに添加し反応を終結せしめる。反 応液を７０℃にて５分間加熱し、クロロホルム抽出、エーテル抽出し、エタノー ル沈殿を行う。

Ｐｓｔ−Ｉ部位にｄＧの尾を持つプラスミド・ベクターｐＢＲ３２２にューイン グランド　ヌクレア）を当量のｄＣの尾を持つｃＤＮＡにアニール化し、常法に 従い大腸菌ＨＱ１５７４（ＭＣ１０６１のｒｅｃ　Ａ誘導体）を形質転換するの に使用する。

ｐＢＲ３２２中のｃＤＮＡ挿入片はＡｍｐ５ＴｅｔＲ＝＋ｏニーを産生ずる為Ｋ ｂｌａ遺伝子を不活性化するであろう。

図２の方法（Ｂ）を参照すると、ＰＭ−７挿入物は２〇−ｍａｒ合成りＮＡプラ イマー（前記）からプライマー拡張により生成される。第二の鎖合成に先立って 第一の鎖合成過程からのＲＮＡ：　ｃＤＮＡハイブリッドが溶融されない点を除 いて本質的に前記の方法であり、それは０．５ユニツトの大腸菌ＲＮａｓｅＨの 添加により実施される。得られるｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡはセファデックスＧ−１０ ０カラムにより遊離ヌクレオチドから分離され、前記のごとく、形質転換のため のオリゴｄｃの尾を付ける。

＋’　Ｔｅ　ｔ　ＲＡｍｐ　Ｓ形質転換クローンはドツトプロット上のクロス− ハイプリダイゼータ３ンにより特徴付けられ、大きさおよび相関したクローン間 の重複領塚は制限分析により地図作りする。

ｃＤＮＡクローンはクロス−ハイブリダイゼーションにより最初に分類し、制限 酵素スクリーニング検定を行う。いくつかのより大きいｃＤＮＡクローンの分析 を実施し、ゲノムの部分的な物理的地図を得た。ハイブリダイゼーション　スク リーニングの結果は最初に集めたもののうち３０％以上の挿入片−含有クローン がＪＥＶゲノムと相関していなかった。４つのｃＤＮＡが本当にフィルス起源で あるとい５証拠はウィルスＲＮＡとのノーザン　ハイブリダイゼータ３ン検定に より確められた。第一段階のスクリーニングは電気泳動的に強化した完全長のウ ィルスＲＮＡによるドツト−プロット法による。第二段階はその後ウィルス感染 および非感染ペロ細胞両方からの全ＲＮＡを用いて実施された。ＪＥＶ配列に対 応するゲノムバンクの最終的証明は、ＤＮＡ配列決定およびいくつかのコードさ れたタンパク質の同定によりなされた。

５ｃＤＮＡクローンの構造は図３に示しである。ｃＤＮＡは２．２から５．３ｋ ｂの大きさの範囲にあり、−緒にすると独特の情報の１０キロ塩基を明らかにす る。プライマー拡張分析の結果は、集められたクローン化ＪＥＶ　ｃＤＮＡから ゲノムの５′および３′末端に存在する約４３０および４５０の塩基の短いセグ メントが失われてい゛る事を明らかにしている。

実、−；施　例　２　λｇｔ１１　ライブラリーλｇｔ１１はＪＥＶクローンを 発現せしめるのに使用される発現ベクターである。ＤＮＡは独特なＥｃｏＲＩ部 位内へ挿入でき、それにより大腸菌１ａｃオペロン　プロモーターの制御下に置 かれる。発現は化学薬品ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトサイド）を使用し て誘導される。ここで、我々はこの特定の発現ベクターをＪＥＶゲノムにコード されているタンパク質の発現に使用した。何故なら、それは多くの異った型のタ ンパク質の免疫学的同定に有益である事が証明されているからであり（ヤングら 、サイエンス２２２ニア７８．１９８３；プロシーディン　オプ　ザ　ナショナ ル　アカデミ−オブ　サイエンスＵ、Ｓ、戊乱旦：１１９４．１９８３）、他の 発現ベクターも同様に適したであろう。

ウィルスタンパク質コード配列の同定のため、ＪＥＶｃＤＮＡの無作意なフラグ メントを調製し、λｇｔ１１のｌａｃ　Ｚ遺伝子の独特なＥｃｏＲＩ部位にクロ ーン化し、組換え体のバンクを抗ウイルス抗体でスクリーニングした。適当な向 きで読み取りわ（内に挿入されたｃＤＮＡフラグメントを含むバクテリオファー ジ組換え体は挿入された配列をＪＥＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タ／バク質の 形で発現するはずである。

ントを含むパイテリオファージ　２イブラリ−は、ナ／ペルグらの方法（プロシ ーディ／　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オプ　サイエンス　Ｕ、Ｓ、Ａ、 ８１　：　３６７５．１９８４）をわずかに改良してλｇｔ１１内に調製された 。ＪＥＶ　ｃＤＮＡ含有プラスミドをＭｎ十十存在下ＤＮＡａｓｅＩで消化し、 ・１００塩基対（ｂｐ）から７．５Ｋｂの大きさの範囲の無作意なフラグメント を得る。これらの７ラグメントは続いての消化から天然に存在するＥｃｏＲＩ部 位を保ｉｉ！するためＥｃ立ＲＩメチラーゼにューイングランド　バイオラボ） で処理し、末端修復のためＴ４ポリメラーゼ（Ｐ、Ｌ、バイオケミカルズ）処理 し、ＥｃｏＲＩ部位含有オリゴヌクレオチドリ／カー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を連 結し、Ｅｃ旦ＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切断する。１００　ｂｐから５Ｋｂ の長さの７２グメ／トをセファクリル５−ｉｏｏ。

上分割して過剰のリンカ−を除去し、」≧ｏＲＩ切断、子ウシ腸アルカリホスフ ァターゼ処理λｇｔ１１ＤＮＡ（両方ともペーリンガーマンハイムＣＩＡＰまた は直接プロメガ　バイオテクノロジー、マジソ／、ＷＩから購入）内へ連結する 。

選択されたＪＥＶ−λｇｔ１１組換え体のサブクローンはＪＥＶ−２ｇｔ１１Ｄ ＮＡを特定の内部制限部位で切断し、ＪＥＶｃＤＮＡを再クロー化することで生 成せしめる。制限エンドヌクレアーゼ切断に続いてＪＥＶ−λｇｔ１１ＤＮＡ７ ラグメントの混合物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理し、前記ＥｃｏＲＩリンカ− と連結し、」旦立ＲＩで切断する（本来のクローンのＪ旦立ＲＩ部位Ｑ再生）。

混合物はその後ＣＩＡＰ−処理λｇ処理２内ｔ１１内−ン化する。

ウィルスタンパク質を発現する事ができ、即ちウィルス核酸を含むλｇｔ１１ラ イブラリー中のクローンを同定するため、組換え体ファージのライブラリーを大 腸菌株Ｙ−１０９０のローン上で増殖せしめ、ヤングらの方法で（前記文献）免 疫学的にスクリーニングする、ただ保護（室温で３０分間）および抗体インキュ ベージ：ｔ／（室温で４時間または４℃で１２から１６時間）は３％ＢＳＡ含有 ２０ｍＭ）リス、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ８，１（ＴＢＳ）中で実施し、洗 浄は室温で１５分間３回行う（１回目はＴＢＳ、２回目はＴ　Ｂ　Ｓ　＋０．１ ％ＮＰ−４０およびｉ終洗浄はＴＢＳ）。ファージプラークのニトロセルロース フィルターレプリカを保護し、ネズミ腹水液（ＨＭＡＦ、ＪＥＶタンパク質に対 する抗体を持つ、プラントら、７ミリカン　ジャーナル　オプ　トロピカル　メ ディスン　アンドノ−イジーン１６：３３９．１９６７）からのモノクローナル （ｍｃＡｂ　ｓ　）またはポリクローナル抗体とインキユベートし、洗浄後、ア ルカリホスファターゼと結合した１２５　Ｉ−標識ウサギ抗−マウスＩｇＧまた シキャギ抗−７？δＩｇＧσへ・ラブ功）と（力や株式会社とフキ−５，＝トす る；・フィルターを洗浄し、′使用したプローブに依存してオートラジオグラフ ィーにかけるか、または５−ブロモ−４−クロロインドキシルリン酸塩およびニ トロブルーテトラゾリウム含有ホスファター°ゼ基質混合物中でインキユベート する。０．５から５Ｋｂの長さの範囲の挿入片を持つ７．５００の組換え体の免 疫学的スクリーニングによりボリクＰ−ナルＨＭＡＦと反応する４７のクローン を得た。０．１から１．ＯＫｂフラグメントから生成する４、０００組換え体の スクリーニングにより更に４４のＨＭＡＦ−反応性組換え体を得た。２．ＯＫｂ までの挿入片を含有するより大きなｃＤＮＡフラグメントから構成されているラ イブラリーからいくつかのクローンが得られるが、はとんどのクローンは５００ 　ｂｐｓ長以下の挿入片を含んで（ζた。予備的分析はこれらの組換え体の２つ がＥタンパク質抗原性決定基を発現するが９０クローンの大多数はＮＳ３タンパ ク質への抗原性決定基を発現する事を示した。

構造タンパク質をコードすると考えられる配列の発現を最大にする為、ゲノムの ５′末端を目標にしたλｇｔ１１ライブラリーを構築した。プラスミドＰＭ７（ ｐＰＭ７、図６）の０．５から２Ｋｂフラグメントで生成したこれらのライブラ リーの一つはＪＥＶのＥまたはＭタンパク質のいずれかに対するモノクローナル 抗体と反応する１２０組換え体を得た。さらに２４のＨＭＡＦ−反応性組換え体 がゲノムの５′末端から生成したｃ　ＤＮＡの小さなフラグメントのクローニン グによる第２のライブラリーから得られ、そのうちい（つかはＥおよびＭ　ｍｃ Ａｂｓと反応性があった。これらのクローン化配列のい（つかを図４に示し、接 頭記号Ｊ７−またはＪ−で標識した。

〔産業上の利用可能性〕

核酸プローブ ＪＥＶ核酸は動物、鳥および昆虫全体およびそれらを起源とする細胞培養液中の ウィルス核酸の検出に有益である。すなわち、日本脳炎ウィルスの検出のための 診断プロ、−ブとして使用できる。一般にそれは核酸ハイブリゼータ３ン技術を 含む標準的な方法である。ＪＥＶの場合、ある診断法はヒト脳を髄液中のウィル ス核酸の検出を含む。例えば、一つの方法は試験材料からの核酸をメンブランフ ィルタ−のごとき固体マトリックスへ固定し、ウィルス核酸およびグローブがハ イブリダイゼーションできる条件下放射性標識ＤＮＡプローブとフィルターをイ ンキユベートし、その後メンブランフィルタ−上に存在する標識によりそのよう なハイブリダイゼーションを検出する。他の標識としては螢光分子および酵素的 −または免疫学的−検出のごとき他の生化学的化学的および物理的試薬が挙げら れる。

以下は一つの診断プローブの使用例である。使用するｃ　ＤＮＡはＰＭ−１と称 されるものであり、図３に示したＰＭ−（５ｃＤＮＡにほとんど対応する。本検 定は臨床試料中のＪＥＶ核酸をはっきり検出でき、ＪＥＶ関連核酸を含まない試 料から区別できる。デング熱ウィルスは検出されないが、ミュレー渓谷ウィルス および西ナイル熱ウィルスの核酸は検出される。

精製されたｃＤＮＡフラグメントまたは全プラスミドは）−イブリダイゼーシッ ン実験に使用する為、ニューイングランドヌクレア（ボストン、ＭＡ）のニック 　トランスレーションキラトラ用い、！！ｐ−デオキクシチジン５′−三リン酸 （ミリモル当り３００ｃｉ　）にて放射性標識される。

転写ベクターｐＧＥＭ−４はＳＦ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの結合のため のブロモ−タ一部位を持つグラスミドで、プロメガ　バイオチック（マジンン、 ｗＩ）から得られる。クローニングベクターとしての使用に先立ち、グラスミド ＤＮＡをＰｓｔＩで制限し、続いて１ユニツトのアルカリホスファターゼで１時 間３７℃にて処理し、フェノール：クロロホルム抽出続いて酢酸アンモニウム− エタノール沈殿を使用して再精製する。精製した未標ＲＪＥＶ　ｃＤＮＡフラグ メントはアニール化、連結し、犬鰻菌ＨＢ　１０１中へ形質転換する。挿入され たものを持つ細菌のクローンは放射性標識挿入ＤＮＡを用いるコロニーハイブリ ダイゼーションにより検出し、アムビシリンを含む（５０μｍ／／ｍｌ）　Ｌ　 Ｂ肉汁に接種する。１６時間インキュベート後プラスミドＤＮＡを分離し、挿入 ＤＮＡの配位を制限酵素分析により決定する。代表的な細菌培養は純粋培養法に より２度選択されている。

ミリグラム量の挿入物含有転写プラスミドＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）は急速抽出法に より得られる。鋳型ＤＮＡは５ａｌＩ制限酵素で直線状となし、フェノール：ク ロロホルム抽出、続いてノ酢酸アンモニウムーエタノール沈殿により再精製する 。転写反応はプロメガ　バイオチック法に従い３０ユニツトのＲＮ　Ａ　ｓ　ｅ を含む１０ｍＭジチオスレイトール、５０μＣｉ”Ｐ−ウリジン５′三リン酸（ ミリモル当り８００　Ｃｉ）、５００μＭ非標識リボヌクレオチ十゛［三リン酸 ：（ＡＴＰ、Ｉ（１：叩おｌびｃｘｒ）Ｓおよび１２μＭウリジン５′三リン酸 から成る製造元より供給される転写緩衝液の反応混合物中１μＩの鋳型ＤＮＡお よび１５ユニツトのＴ７ボリメラーゼを用いて実施する。３７℃にて１時間イン キュベーション後１ユニットのＲＱ　Ｉ　ＤＮＡ５ｅを添加し、更に反応混合物 を１５分間インキエペートしてＤＮＡＭ型を分解する。放射性標識ＲＮＡはフェ ノール：クロロホルム抽出および酢酸アンモニウム−エタノール沈殿により精製 する。

一般に、ＲＮＡはそれが転写されろ対応するＤＮＡよりプローブとしてはより感 度が高い。しかしながら、フラとウィルスは単一配向の非セグメント化ＲＮＡ（ および鎖状メツセンジャーＲＮＡ様ＲＮＡも）を有しているので、どの転写され たＲＮＡプローブが検出ウィルスに対し的確な配向を持つかを制限分析を用い決 定する事が重要である。例えば、新規組換え体中の挿入ＰＭ−１の配向＆礼５ｓ ｔＩを使用して決定される。プラスミドｐＥＨ１００２およびｐＥＨ１００５は 各々正および負の配向を持つ代表的なＪＥＶ　ｃＤＮＡｍ換え体である。（図５ ）。

ｐＥＨＩＤＯ２プラスミドから誘導されるＲＮＡはＪＥウィルスを検出できる（ ｐＥＨ１００５プラスミドからのものはできない６　） 適Ｌ　ｆ、：　ＲＮ　Ａ　７’　ｏ　−７’　ヲ得る為、ｐ　ＥＨ１００２ヲ” Ｐ−ウＩＪジン５′三すン酸存在下Ｔ７ボリメラーゼを用いて転写し、グローブ の相対的比活性を、起源の二重鎖プラスミドから産生されるニックトランスレー ジ１ン化プローブと比較する。一般に、転写反応はより比活性の高い核酸グロー ブを産生ずる。＋１２ｐ−デオキシシ尤ジン５′、三リン酸を用いて放射標識し た二ツクトランスレーシヲンされたＤＮＡはμｇ当り４．７　Ｘ　１０”　ｄｐ ｍの一部ＲＮＡグローブの平均比活性を持つＤＮＡを産生じた。

感度試験の為のウィルスの調製は、フラビウイルスー感染細胞培養液上澄を１０ ０μｌ当り約１００−２００プラ一ク形成単位となるようにリン酸緩衝塩溶液（ ＰＢＳ）で希釈し、続いて連続的に２倍に希釈して行う。特異性試験のための標 本は使用前に１：２に希釈する。試料の一部（５０または１００＃）を１ｏｘｓ ｓｃ中３容量の６．１５Ｍホルムアミドで処理し、１５分間６０℃にてインキュ ベートし、シュライシャー＆ジェニル社製（キーン、Ｎ、Ｈ，）のＢＡ４５ニト ロセルロースＰ紙を備えた真空マニホールド器具のスロットに応用する。、Ｐ紙 は熱ランプ下乾燥せしめ、真空オーブン内で８０℃で焼く。

オープン乾燥ニトロセルロー７１紙は、前ハイブリダイゼーション緩衝液（９０ ｍＭクエン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４，０，９ＭＮａＣ１，０，１％フィコール、 ０．１％ポリビニルピリドリドン、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ドデ シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００μ９７ｍ１の変性サケ精子Ｄ　Ｎ　 Ａ　’）で処理した後硫酸デキストラン（１０ｍＪ当りＩＮ）およびｍｌ当り１ ＱＳｃｐｍの標識ｃＤＮＡグローブを加えた新しい前ハイブリダイゼータ１ン緩 衝液（使用前に５分間煮沸する）に溶液を交換する。袋を再び閉じ、さらに適当 な温度で１６時間インキスペードする。インキュページテン終了後Ｐ紙を２ＸＳ ＳＰＥ（ＩＸＳＳＰＥは０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４，０，１５ＭＮ ａＣ１および１ｍＭ　ＥＤＴＡである）中、熱シール袋内で７０℃にて２時間、 １．０％ＳＤＳ室温で２度、および２ＸＳＳＰＥＯ９１％ＳＤＳ　６５℃または ２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ室温で４度洗浄する。結合放射活性は螢光スクリ ーンとコダックＸ−ＯＭＡＴ　ＸＭフィルムで検出し、製造業者の指示による現 像までは一７０１１″にてインキユベートする。

２４時間フィルム露光後、各々の場合において、ＪＥＶの８から１６のプラーク −形成単位の低い量に対し、本試験は鋭敏であった。非感染細胞培養液上澄では 反応が起きてない事が確められた。

ＪＥＶに対し、ｐＥＨ１００５プラスミドから転写されたＲＮＡは対応するニッ クトランスレーション化ＤＮＡよりも鋭敏であった。ＪＥＶ核酸との強い反応が ６時間のＸ線フィルム露光後観察され、有意な弱い反応が密接に関連する西ナイ ル熱ウィルスで観察された。

図３および４には診断プローブとして有益なＪＥＶ核酸を含有する多数の他のク ローンを示した、例えばＰＭ、Ｊ７およびＪ系列のクローン。他のグローブもＪ ＥＶ核酸から同様誘導されるであろう（特に、ＰＭ系列のクローンから）。もち ろん、ＥおよびＮＳ１領域からのプローブは同様にＪＥＶに特異的なプローブが 得られるが前に掲げた関連ウィルスには特異的ではない。プローブの特異性は、 その種々の核酸とのハイブリダイゼーション反応を比較する事により、またはＪ ＥＶ配列に対応するか、黄熱ウィルス、ミエレー渓谷熱ウィルス、西ナイル熱ウ ィルス、デング熱ウィルスまたはセントルイス脳炎ウィルスのうちの一つのごと き他の関連するウィルスの核酸配列とは対応しない少くとも１０塩基対の配列を 選択する事により実験的に決定できる。

このように放射性標識核酸グローブは一般的に日本脳炎ウィルスの敏速な決定に 適している。一般に、現在はＪＥＶゲノムの種々の領域から高比活性のプローブ を産生する事が可能であり、それによりＪＥＶの１０ブラ一クー形成単位という 少量でも検出できる。転写ベクターは、ニック−トランスレーションされたＤＮ Ａグローブより高い比活性を持つ一重鎖ＲＮＡグローブの産生な可能にする。Ｒ ＮＡプローブはニックートランスレージ１７法を用いて産生されるプローブより より高濃度で使用でき、より容易に検出できる信号を与える。密接に相関したウ ィルスに対して試験する場合は一般的にＤＮＡグローブの方がＲＮＡプローブよ りより特異的である。

免　性ポリペプチドの生産 本発明に適したポリペプチドは、クローニングされたＪＥＶの核酸、又はＪＥＶ の核酸と実質的に同一の核酸から生産される抗原性タンパク、及びそれらのタン パクに対する抗体を含んでいる。実質的に同一とは、生産されたポリペプチドが ＪＥＶ又は類似ウィルスの少なくとも一つの抗体決定基に対応するアミノ酸配列 を有していることを意味している。これらのタンパクは、所望の宿主、例えば形 質転換又はトランスフエフシランされた原核もしくは真核細胞又は生物等の組み 換え体から単離することかできる。好ましくは、バクテリオファージ、グラスミ ド、コスミド（（ｏｓｍｉｄｓ）を含む発現性ベクター、及びワクシニア、レト ロ−、アデノ−、ロタ−ウィルスを含むホ乳類、植物、昆虫及び鳥類のウィルス で形質転換された細胞である。

その細胞は大腸菌、バシラス、カビ、植物又は動物宿主細胞でも良い。そのタン パクはＪＥＶ由来の純粋なタンパク又は他の非ウィルス性タンパクと結合してい るような融合タンパクでも良い。一般に、これらの抗原性タンパクはウィルス核 酸を発現性ベクター（例えば、２ｇＮ１）に挿入すること及び挿入された核酸を 発現させることによって生産される。抗体は、これらの抗原タンパクを精製する こと及びそれらを適当な動物に注射抗体を精製して、抗原タンパクに対するプロ ーブとして用いることができる。

組み換え抗原ポリペプチドが大腸菌内で生成される犬渦菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　 −Ｊ　Ｅ　Ｖ混成タンパクであるようなりローン構築の例は前述されている。他 の例として、ＪＥＶタンパクとｔｒｐ　Ｅ融合タンパクの構築の例がある。ウィ ルスｃＤＮＡの断片はｐＡＴＨプラスミド内でｔｒｐ　Ｅに融合され（Ｄｉｅｃ ｋｍａｎｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　；　１５１３．１９８５） そして精製されたベクターは大腸菌ＨＢ１０１に形質転換された。融合タンパク は生成され、そしてＫｌｅｉｄらの方法（５ｃｉｅｎｃｅ　２１４　ｙ１１２５ ．１９８０）により培養液１リツター当たり２０〜６０ｒｎ９の収率で容易に精 製された。Ｍ及びＥ構造タンパクの部分並びに三つの主な非構造タンパク（ＮＳ Ｉ、ＮＳ３、Ｎ５５）がこのような方法で発現された。

上記の融合タンパクは感染動物の体液内のＪＥＶウィルスに対する抗体の検出に 役立つ。これらのタンパクは、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンプロット法又は同 様の試験のような種々の標準的な形式におけるプローブとして使用することがで きる。

特に、ＪＥＶ−Ｅ−及びＮ　Ｓ　１−　ｔｒｐ　、Ｅ融合タンパクの両方は、ヒ ト血清中の抗ＪＥＶ抗体の検出に有効な抗原である。

一つの好適なＥＬＩＳＡ法は、プラスチックのマイクロタイタープレートの壁に 組み換え抗原を塗布すること、検定血清中の抗体を結合させること、及び第二抗 体と結合している酵素及び色原体酵素基質を用いて付着抗原−抗体結合体を検出 することからなっている。用いられる酵素はセエイヨウワサビのパーオキシダー ゼで、基質はオルト−フェニレンジアミンである。

以下の実施例はそのようなプローブの効果を示すためであり、例示としての意味 であり決して本発明を限定するものではない。

上記のｔｒｐ−ＪＥＶ融合タンパクはＥＬＩＳＡ検定（ＥｎｇｖａＪｌ。

Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ）’＋　７０　；　４１９．１９８０ ）において有益である。それらは、ＪＥＶで免疫されたマウスの血清中に存在す るＩｇＧクラスの抗体を検出できる；及びＥ−タンパクは異すった抗Ｅ−タンパ クモノクロナール抗体と結合できる。

ンビボで他のフラビウイルスのＥ−タンパク、及び無毒化ＪＥＶのそれらの幾つ かと交差反応する。Ｅ−タンパクはパンコックで得られたＪＥＶに感染したヒト の血清中のＩｇＧクラスの抗体検出に使用することができる。更に、これらの融 合タンパクは、マウスに注射したとき（完全７ｃｒイドアジエバントで乳状化さ れた５〜２０μｇ）ＥＬＩＳＡアッセイにおけるウィルス感染細胞からのタンパ ク；及びウェスタンプロット法における適当なウィルスタンパクに結合する抗体 の生産を誘導する。

第６図に示されるように、前に述べたように特定のベクターで形質転換された大 腸菌から得られたＪＥＶタンパク及びＪＥＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパ クはＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された（　Ｌａｅｍｍｌ ｉ、　Ｎａｔｕｒｅ２２７　：６８０．１９７０）。タンパクはＴｏｗｂｉｎら （Ｐｒｏｃ。

ＮａｔＬ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ−８−Ａ−７６：　４３５０．１９７９）の方 法に従ってニトロセルロース膜に移された。ニトロセルロースへの移動（ウェス タンプロット法）はインキユベータＭ／緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐ　Ｈ７，４ ，０，９％ＮａＣ１，ｉ％ＢＳＡ。

０．０１％ＮａＮ３　）内で止め、イ／キーベージＮ／緩衝液で希釈された適当 な抗体（β−ガラクトシターゼ、ＪＥＶ−Ｅ又はＪＥＶ−Ｍタンパクに対するモ ノクローナル）とインキユベータ、７し、洗浄用緩衝液（２０ｍＭｌ−リス、ｐ 　Ｈ７，４，０，９％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＮＰ４０．０，０ １％ＮａＮ、）で３回洗浄した。インキュベージ１ン緩衝液で希釈された＋ｔｓ 　１ウサギ抗マウスＩｇＧと反応させた後、フィルターを洗浄用緩衝液で３回洗 浄し、乾燥し、そでオートラジオグラフィーを行った。全ての抗体のインキュベ ーションは室温で４時間又は４℃で１２〜１６時間であった。

多（の異なった組み換え体により生産されたＪＥＶ−β−ガラクトシダーゼ融合 タンパクの発現量の検定は、ＪＥＶの短いｃＤＮＡの挿入を有する組み換え体が 融合タンパクをより多く生産し、プラークアッセイにおいてより強い信号を与え ることを示している。これらのデータは、挿入されたＪＥＶのｃ　ＤＮＡの大き さ又はゲノムに広がった特定のウィルスの配列のどちらかがこれらの組み換え体 による融合タンパクの生産量を変化させていることを示している。

ＪＥＶ−Ｅタンパクをコードする配列部分の予備分析は、特定のウィルスの配列 は大腸菌内でのβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクの発現にとって好ましくない ことを示している。組み換え体Ｊ７−１及びそのサブクローンＪ７−１８及びＪ ７−１人によって生産される融合タンパク量の比較は、特定の制限酵素作用部位 での開裂によりＣ−末端配列の除去がβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクの蓄積 を１０〜２０倍増加させることを示している（第７図）。組み換え体Ｊ　７−Ｉ 　Ｓ−２（Ｊ　７−ＩＳからの挿入のフレーム内（ｉｎ　−ｆｒａｍｅ　）縦列 （ｔａｎｄｅｍ　）複製を有している）による融合タンパクの効率的発現はウィ ルスｃＤＮＡ挿大の大きさ単独では融合タンパクの蓄積量の決定に大きな変化を 与えないことを示している。第８図に示されるように、組み換え体Ｊ７−Ｉｓ及 びＪ７−ＩＡによってコードされている融合タンパクの増加した発現は完全なＥ −タンパクの膜固着部分（疎水性部分）の除去と関連している。更に、この疎水 性配列を持っている全てのクローン（Ｊ７−１、Ｊ７−２、Ｊ７−５、Ｊ７−６ 、Ｊ−１０１）はβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクを低いレベルでのみ発現し ている。これらの結果は外来の疎水性配列の発現は大腸菌にとって毒性があると いう報告（Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ２１９　：　６１４．１９８ ３）と一致している。

融合タンパクは免疫血清からの特定の抗体の分離にも使用することができる。そ のような方法には標準的な技術を使うことができる。これらの分離された抗体は ウィルス抗原の検出に用いることができる。実施例として、ウィルスの構造及び 非構造タンパクに対する抗体が単離された。

特定のＪＥＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパクを認識する抗体は、次に示さ れるように、ニトロセルロースフィルターに固定された大腸菌のタンパクに結合 させることによってＨＭＡＦからアフィニティークロマトグラフィーによって精 製された。ニトロセルロースフィルターを１０ｍＭ−ＩＰＴＧに浸し、乾燥した 後、大腸菌株Ｙ−１０９０上に密に撒かれた精製組み換えファージ（１５００〜 ５０００　ｐｆｕ／　９０ｍｍプレート）上に置いた。４〜１６時間のインキュ ベージシンに続いて、フィルターをＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳ及び３％ＢＳＡ中で ブロックして室温で４時間６％ＢＳＡ及びＴＢＳ中で１　：　５０ＨＭＡＦ希釈 液とインキュベージシンした。そのフィルターを各１５分間４回洗浄シ、１回は ＴＢＳ−（−１２回はＴＢＳ及びｏ、ｉ％ＮＰ−４０でそして再びＴＢＳで洗浄 した。特異的に結合した抗体は５０ｍＭグリシンＨＣＩ、ｐＨ２，３，５００ｍ Ｍ−Ｎａ　ＣＩ。

０．５％ツィー７２０．０，０１％ＢＳＡを含む緩衝液２ｍｌ中での６０秒のイ ンキュベージシンの間にフィルターから溶出し、そして溶出物を直ぐに同じ体積 の１００ｍＭ−Ｎａｔ　ＨＰＯ。

で中和した（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋−９９：　２０．１９８４ ）。溶出と中和を繰り返し、溶出物を一緒にして、２分の１の体積のＴＢＳ及び ３％ＢＳＡを含む溶液で希釈し４℃で保存した。これらの抗体はＥＬＩＳＡ検定 又は精製されたウィルスもしくはウィルス感染細胞から調製されたウェスタンプ ロット法における免疫反応性ウィルスポリペプチドの同定に使用することができ る。精製されたタンパクの他にも、λ７アージにより溶菌された大腸菌株Ｙ−１ ０９０の層から吸着される粗製の非精製大腸菌タンパクも免疫吸着物として使用 することができる。

抗体のアフィニティーによる精製の可能性はＨＭＡＦかもの抗体を精製するため にｍｃＡｂ　ｓと反応するＪＥＶ−λｇ、ｔ１１組み換え体を用いることによっ て示された。ＪＥＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパクは感染多重度２：１で 組み換えファージで感染した大腸菌Ｙ−１０８９から調製された。溶原化大腸菌 を１０ｍＭ−ＩＰＴＯの存在下で６０℃０Ｄａｏｏが０．５になるまで培養（１ ，５〜２．０時間）した。培養液を４２℃にして１５分間培養し、そして更に２ 時間６７℃で培養した。細胞を遠心分離で集め１％ＳＤＳ、β−メルカプトエタ ノール及び１ｍＭ−ＰＭＳＦを含むＳＤＳサンプル緩衝液（前記のＬａｅｍｍｌ 　ｉ　）に再懸濁した。タンパク抽出物が前述の方法に従って加熱、超音波破砕 、及び清澄化によって電気泳動用に調製された。これらのタンパクはウェスタン プロット法のために用いられ、ＨＭＡＦからアフィニティーで精製された抗体で 検出される：レーンＡはλｇｔｌｌ；ＢはＪ７−８；ＣはＪ７−！；；ＤはＪ７ −２；ＥはＪ７−１５；ＦはＪ７−１、又は精製されテイナいＨＭＡＦ（レーン Ｇ）、抗Ｅモノクロナール抗体（レーンＨ）若しくは抗Ｍモノクロナール抗体（ レーアＩ）で検出され；レー／Ｊはコマクーブルー染色ウィルス粒子タンパク調 製物である。ウィルス粒子タンパク及びフィルス感染細胞溶解物の両方から調製 されるウェスタンプロット法とアフィニティーで精製されたこれらの抗体の反応 性は、ｍ　ｃ　Ａ　ｂ　ｓと交差反応する組み換えタンパクの全てがＨＭＡＦと 同様の特異性を有する抗体を精製することができることを示した（第９図及び第 １０図）。

第９図に示されるように、ウィルスタンパクとこれらのアフィニティーで精製さ れた抗体の反応性はクローンＪ７−１（レーンＦ）及びＪ７−２（レーンジはＥ タンパクの部分を発現し。

及びＪ７−３（レーン０月１Ｍタンパクなコードし℃いる配列の部分を発現する ことな確証している。ｍｅ　Ａ　ｂｓと異ってアフィニティーで精製された抗体 はＪＥＶ−λｇｔ１１組み換え体によって発現されろ複数のウィルス決定基と反 応し、ゆえに付加的な特定の免疫学的試薬を供給している。クローンＪ７−３（ Ｍｍｃａｂｓ　と反応性しかしＥ　ｍＣＡｂＳには反応性のない］と同じｍｃＡ ｂ　反応スペクトルな示すクローンＪ７−８（レーンＢ）の場合、アフィニティ ーで精製された抗体のデータはこのクローンがＭ及びＥの両方の部分な含む融合 タンパクな生産することを示している。この結果は９つの抗Ｅ　ｍＣＡｂＳによ って認識される抗原決定基とは別に抗原決定が有ることを示している。

ＪＥＶゲノムに対するクローンＪ７−８の物理的マツピングは、それがＪ７−３ と共通のＭの部分、及び９つの抗Ｅ　ｍｃＡｂｓと、反応するそれらから分離さ れているＥの配列な含んでいることを示している。従ってこれらのアフィニティ ーで精製された抗体はＪＥＶ−λｇｔｌｌクローン中で発現するウィルス配列の 同定のための特異的で有益な試薬を提供し及びウィルスタンパクに対する特異的 ポリクロナール試薬な提供する。

第１０図に示されるように、構造及び非構造ウィルスタンパクの両方のための前 述の方法の使用が示されている。ＪＥＶ構造タンパクの調製物はＪＥＶ感染ベロ （ｖｅｒｏ）細胞（前述のＣｏ５ｔｌｅら）から採取される勾配精製されたウィ ルス粒子（ＶｉｒｉＯｎＪから得られた。ＪＫＶに感染後（感染多蓋度０．０１ ：１Ｊ８０時間培養されたＣ６／３６アエデス・アルボピクツス（Ａｃｄｅｓ　 ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ〕蚊の細胞の全タンパク抽出物は非構造タンパクの供給源 として細いられた。感染細胞は２％ＳＤＳ　、５０ｍＭ　）リス、ｐＨ６，８中 にすりつけられホモゲナイズされ凍結された。電気泳動の直紡に、サンプルは１ ％β−メルカプトエタノール及び１ｍＭＰＭＳＦな含むＳＤＳサンプル緩衝液（ 前記のＬａｅｍｍｌｉ　）で希駅され、７０℃まで加熱して１５分間保持し、簡 単に超音波破砕を行い微量遠心分離機で５分間遠心分離を行って清澄化した。そ のタンパクはウェスタンプロット法にかけられそして各レーンからのタンパク（ レーンＡはλｇｔｘｘ；ＢはＪ−２；ＣはＪ−１５；ＤはＪ−５６；ＥはＪ−４ ９；ＦはＪ−９；ＧはＪ−１０１；ＨはＪ７−１；ＩはＪ７−６；ＪはＪ７−ｓ ；にはＪ７−３；レーンＬ−Ｑは検出されたＪＥＶの非構造タンパクの免疫学的 反応な表わしており：ＬはＨＭＡＦ（１：３０００希釈〕、ＯはＨＭＡＦ（１： 　１０００希釈）；Ｐは非免疫腹水液（１：３０００希釈ハＱは非免疫腹水液（ １：１０００希釈）；レーンＲは蚊細胞溶解物からのコマシーブルー染色タンパ クである。ンをＨＭＡＦからアフィニティーで精製された抗体で検出した。

上記と同様の分析の組み合せ、アフィニティーで精製された抗体とウィルスタン パクとの反応の特異性、及び既知の反応性な有するアフィニティーで精製された 抗体との同定されていない免疫陽性クローンからのプラークの迅速な検査な用い ると。

多くの免疫反応性組み換え体によって認識されるウィルスタンパク配列を同定す ることが可能である。９１の組み換え体（殆んどがウィルスのゲノム＜　ｐＰＭ ｉ　、　ｐＰＭ２　、　ｐＰＭ４及びｐＰＭ　５）からなるＣＤＮＡプラスミド から生じたライブラリーからＨＭＡＦで選択されたノのうち５４個にコードされ ている免疫学的同一性はこれらの方法な用いることにより℃同定された。

これらの組み換え体の２つはＥタンパクの部分を発現し；４つの組み換え体はＮ Ｓｉの部分を発現し；５つの組み換え体はＮＳ１’の部分（ＭＳＩの分子量の大 きい形）を発現し；及び４３の組み換え体はＮＳ３の部分を発現する。

上記のように、ウィルス抗原に対する特異的抗体は容易に単離することができろ 。また５組み換えタンパクを１例えば、マウス、ウサギ及びヤギのような動物に 注射することによっても抗体を生成することができる。これらの抗体は標準的方 法によって単離され、ＥＬＩＳＡ試験、ウェスタンプロット法及び類似の検定な 用いることによってウィルス抗原を検出することに使用できる。

防御免疫原 本発明の免疫原は１例えばヒト、鳥類又は家畜化された動物のような動物に注射 されたとき免疫反応な引き起丁ことのできる組み換え抗原タンパクな含んでいろ 。タンパクは前述のようにして生産される。例示的な実施例は以下に示されてい る。好ましい組み換えタンパクはＪＥＶのＮＳＩ及びＥタンパクな含んでいる。

以下の実施例はこれらの組み換えタンパクの防御免疫原として機能する能力な示 している。

前記のｔｒｐＥ＝−融合タンパクな７０イトの完全アジュバントで乳化し、５− ２０μ？をマウスに注射した。抗体が生産され単離された。そして感染細胞のウ ェスタンプロット法において適当なウィルスタンパクと結合することが分った。

その抗体はヒトに感染するＪＥＶＱ無毒化することのできるモノクロナール抗体 と同等に機能することが示された。この試験におけるウィルスの無毒化は試験抗 体とのインキュページ町ンの後ウィルス調製物の感染性が消失することによって 示された。即ち、この抗体はウィルスに対する防御な提供している。

組み換えｔｒｐＥ−ＪＥＶタンパクはＪＥＶ及びＮＳＩタンパク断片に対する抗 体な誘導する。これらの抗血清は、マウスに腹腔内注射したときＪＥＶ感染に対 する受動防御を提供するモノクロナール抗体と特異性が共通する抗体な含んでお り、ゆえに免疫学的に防御的である。これら二つの抗体の機能的同等性はＥＬＩ ＳＡ法及びウェスタンプロット法により℃示された。

他の冥施態様 他の冥施態様も次の請求の範囲内のものである。

防御免疫原の生産のための他の発現系はワクシニアのようなウィルスベクターな 含んでいる。ＤＮＡは、ウィルスがそのホムに容易に挿入することができる。従 って、特定のＪＥＶ配列を有する生きているワクシニアウィルスな動物に接種し 、ＪＥＶタンパクを発現させ、そしてそれによってＪＥまたは類似ウィルスに対 する免疫な誘導することができる。接種法は注射によるかまたは経口若しくは鼻 からの投与でもよい。

ヒトまたは家畜動物集団内でのＪＥＶのレベルを減少させるのに使用できる一つ の方法は、保有宿主、例えば鳥類の免疫化からなっている。これは鳥類に本発明 の免疫原をコードしている特定の鳥類のウィルスを感染させること、それによっ て鳥類集団内に免疫な誘導すること、及びこの感染源から他の動物の感染を減少 させることによって行うことができるであろう。

ＪＥＶの特定の核酸配列な生産すること、又は抗原性タンパクを生産することは 、化学的方法な納いて行うことができる。

そのような合成化学物も不発明において有益である。

組み換えプラスミドベクターｐＰ　Ｍ−７’ｐｔ有する大腸菌株ＨＢＩＯＩ　は アメリカンタイプカルチャーコレクション　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）に寄託されており、その寄託番号は６ ７１９２である。

出願人は、ここで発効される特許の終了時期、最後の菌株要求後５年、又は３０ 年のいずれか長い期間の前に菌が死滅したときはその菌株を交換しなければなら ない義務、及び寄託菌が公に利用できるようになる特許付与のとき寄託な公示す る義務について認識している。その時まで寄託菌は３７０ＦＲ第１−１４条及び ３ｓＵＳＣ第１１２条の規定の下に特許長官の許可により利用できるであろう。

浄書（内容に変更なし） ウイノνスｃ　ＤＮＡ　ｒｒ　ｔ！司製及ｕ）　７０−ニンデΔＰ冷ｔす→　芋 Ｅ全なハ４フ゛す、ト、浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ａ８ＣＯＥＦＧＨＩ　Ｊ ＡＢＣＯＥＦＧＨＩＪＫＬＭＮＯＰＱ　ＲＦＩＧ、１０ 手続補正書

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．黄熱病ウイルスの核酸配列とは一致せす、日本脳炎クイルスの核酸配列と一 致している少なくとも１０個のＤＮＡ塩基対配列からなる実質的に精製された核 酸。
2. ２．１０個の塩基対配列が西ナイル川ウイルス若しくはマーレイ（Ｍｕｒｒａｙ ）バレーウイルスの核酸配列と一致しない、請求項１記載の核酸。
3. ３．１０個の塩基対配列がセントルイス脳炎ウイルス若しくはテンタ熱ウイルス の核酸配列と一致しない、請求項１記載の核酸。
4. ４．１０個の塩基対配列が第１図に示される配列に含まれている、請求項１記載 の核酸。
5. ５．ストリンジェントな条件下で黄熱病ウイルスではなく、日本脳炎ウイルスの 核酸とハイブリッドを形成する実質的に精製された核酸。
6. ６．核酸がストリンジェントな条件下で西ナイル川ウイルス若しくはマーレイバ レーウイルスの核酸とハイブリッドを形成しない、請求項５記載の核酸。
7. ７．核酸がストリンジェントな条件下でセントルイス脳炎ウイルス若しくはテン グ熟ウイルスの核酸とハイブリッドを形成しない、請求項５記載の核酸。
8. ８．黄熱病ウイルスがコードしているタンパクではなく、日本脳炎ウイルスがコ ードしているタンパクと免疫学的交差反応する少なくとも１個の抗原決定基を有 するポリベブチドをコードしている実質的に精製された核酸。
9. ９．西ナイル川ウイルス若しくはマーレイバレーウィルスがコードしているタン パクではなく、日本脳炎ウイルスがコードしているタンパクと免疫学的交差反応 する少なくとも１個の抗原決定基を有するポリベブチドをコードしている実質的 に精製された核酸。
10. １０．セントルイス脳炎ウイルス若しくはデング熱ウイルスがコードしているタ ンパクではなく、日本脳炎ウイルスがコードしているタンパクと免疫学的交差反 応する少なくとも１個の抗原決定基を有するポリベブチドをコードしている実質 的に精製された核酸。
11. １１．黄熱病ウイルスではなく、日本脳炎ウイルスがコードしているポリペプチ ド配列をコート、ている実質的に精製された核酸配列。
12. １２．西ナイル川ウイルス若しくはマーレイバレーウイルスではなく、日本脳炎 ウイルスがコードしているポリベブチド配列をコードしている実質的に精製され た核酸配列。
13. １３．セントルイス脳炎クイルス若しくはテング熱ウイルスではなく、日本脳炎 ウイルスがコードしているポリベブチド配列をコードしている実質的に精製され た核酸配列。
14. １４．ポポリペプチドが日本脳炎に対する免疫学的防御を引き起こす、請求項８ 記載の核酸。
15. １５．日本脳炎ウイルスがコードしているタンパクが該日本脳炎クイルスの主エ ンペローブタンパクＥ又は非構造タンパクＮＳ−１である、請求項８又は１１記 載の核酸。
16. １６．ポリペプチドが日本脳炎ウイルスの主エンベローブタンパクＥ又は非構造 タンパクＮＳ−１に実質的に同一である、請求項８又は１１記載の核酸。
17. １７．アージ、プラスミド、コスミド又は真核細胞のウイルスから選択されるベ クター内に存在する、請求項１，４，５，８，１１又は１４記載の核酸。
18. １８．ペククーカバキュロウイルス、ワクシニア、ロタウイルス又はアデノウイ ルスである、請求項１７記載のベクター。
19. １９．ＪＥＶの核酸に実質的に一致する実質的に精製された核酸から生成された 実質的に純粋なポリペプチド。
20. ２０．請求項１，５，８又は１１記載の核酸から生成される実質的に純粋なポリ ペプチド。
21. ２１．ポリペプチドがヒト又は動物体内で防御性免疫原性である、請求項１９又 は２０記載のポリベブチド。
22. ２２．請求項１，４又は５記載の核酸からなる核酸プローブを提供すること及び 該プローブがサンブル中の核酸とハイブリッドを形成するかどうかを検定するこ とからなる、生物学的サンブル中の日本脳炎診断方法。
23. ２３．サンブルが感染細胞又は感染生物から得られる、請求項２２記載の方法。
24. ２４．プローブが日本脳炎ウイルスの主エンペローブタンパクＥ又は非構造タン パクＮＳ−１の少なくとも一部をコードしている核酸からなる、請求項２３記載 の方法。
25. ２５．請求項１９又は２０記載のポリペプチドを動物に接触することからなる、 日本脳炎に対する防御を引き起こすための動物の予防接種の方法。
26. ２６．請求項１４記載の核酸を動物に接種することからなる、日本脳炎に対する 防御を引き起こすための動物の予防接種の方法。
27. ２７．接種法が注射である、請求項２５記載の方法。
28. ２８．接種法が経口又は鼻からの投与である、請求項２５記載の方法。
29. ２９．接種法が昆虫ベクターによる、請求項２６記載の方法。
30. ３０．予防接種が他のフラビウイルスにより引き起こされる病気に対する免疫を 誘導する、請求項２５記載の方法。
31. ３１．動物がヒト又は家畜化された動物である、請求項２５記載の方法。
32. ３２．動物が鳥類である、請求項２５記載の方法。
33. ３３．予防接種が他のフラビウイルスにより引き起こされる病気に対する免疫を 誘導する、請求項２６記載の方法。
34. ３４．フラビウイルスが黄熱病ウイルス、西ナイル川脳炎ウイルス、マーレイバ レイ脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス又はテング熱ウイルスから選択さ れる、請求項３０又は３３記載の方法。
35. ３５．動物がヒト又は家畜化された動物である、請求項２６記載の方法。
36. ３６．動物が鳥類である、請求項２６記載の方法。
37. ３７．請求項１９又は２０記載の抗原性ポリペプチド又は該抗原性ポリペプチド に対して生産された抗体で免疫学的反応性ポリベブチドを検出することからなる 日本脳炎の診断方法。
38. ３８．検出法がＥＬＩＳ試験又はウェスタンプロット法である、請求項３７記載 の方法。
39. ３９．請求項１９記載のポリペプチドと実質的に類似である化学的に合成された ポリペプチド。
40. ４０．請求項１８又は１９記載のポリベブチドに対して生産される抗体。
41. ４１．請求項３９記載のポリペプチドに対して生産される抗体。