JPH01501358A - 化学、生化学および免疫学反応および混合を容易にする、特に微滴定量を改善する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学、生化学および免疫学反応および混合を容易にする、特に微滴定量を改善す る方法および装置本発明は反応および混合を容易にする方法および装置に関する 。

尤里久１景 すべての化学的、生化学的および免疫学的相互作用において、結合がファン　デ ル　ワールス力、イオン力、共有力または他の力のいずれにせよ、分子存在体（ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｔｉｔｉｅｓ）は結合を生じさせるために物理的に極め て接近させる必要がある。従来、興味ある分子存在体間の相互反応を容易にする 広範囲にわたる種々の方法が開発されている。これらの方法には（１）分子相互 反応の容易さを高めるために化合物の相を変えること（すなわち、固相を気相か ら液相を形成すること）　、（２）分子を他の分子と極めて接近させる機会を高 めるために、結合に必要とされる活性エネルギーを達成させ、かつ分子の運動を 高めるのに反応物を加熱すること、（３）分子間の反発するイオン場（ｒｅｐｅ ｌｌｉｎｇｉｏｎｉｅ　ｆｉｅｌｅｓ）を減少するように試みる低い−イオンー 強度溶液（ｌｏｗ−ｉｏｎｉｅ−ｓｔｒｅｇｔｈ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）のような 種々の薬剤を使用すること、および（４）反応の見込みおよび速度を高めるのに 無機触媒および酵素のような生物学的触媒を使用することを包含している。

さらに、試薬を混合する多くの技術が開発されており、この技術には不活性また は非反応性ガスを反応溶液を通して泡立てること、および反応混合物を繰り返し 渦を巻くようにまたは傾けるように作動する電気的に駆動するプラットホームを 使用することを包含している。これらの混合技術は触媒および酵素により高めら れた反応に特に有利である。なぜならば、最終生成物を触媒または酵素反応部位 の付近から離れて移動されるのに、および新しい基質をかかる付近に移動させる のに混合技術を用いないかぎり、触媒または酵素の付近における最終生成物の蓄 積が他の基質−触媒または酵素相互反応の見込みを低下させるためである。

生化学および免疫学における測微法の到来により、反応液体のマイクロリットル ＩＩＪ　（ａ＋１ｃｒｏｌｉｔｅｒ　ｖｏｌｕｗ＋ｅｓ）により課せられた制約 内に分子相互反応を高める必要がある。これに対して、実際上、現在利用しうる すべて混合技術の使用を否定することは生化学および免疫学測微法における近代 革新に課せられた付加的な制約である。すなわち、多数の小さい反応室（ｒｅａ ｃｔｉｏｎ　ｈｅｌｌｓ）のマトリックス（８Ｘ１２マトリツクスにおいて、そ れぞれ最大で３５０μ２の液体を保持できる、例えば９６個の反応室）を有する マニホールド装置を多くの複合反応手段を同時に実施するのに用いられている。

必要とする微滴定反応量（例えば２５〜１００μ２程度の）、同時に生ずる反応 の数（同時に９６までの反応）、酵素の頻繁な使用（酵素反応部位において生ず る最終生成物の関連する問題による）、および極めて速やかに、かつ極めて反復 可能な反応時間に対する要求を与えることによって、上記生化学および免疫学測 微法における試薬の効果的な混合を達成する新しい方法が要求されるようになっ た。

現在までのところ、生化学および免疫学における測微法は、試薬の受動的な拡散 によって簡単にするか、または遠心力の利用（米国特許第４５１５８８９号明細 書）、または渦巻き形板により誘導される機械的撹拌の利用（米国特許第４１３ ３６３９号および４２００６１３号明細書）が試みられている。

後者の装置の利用は多量の試薬を傾斜させる（ｔｉｌｔｉｎｇ）および／または 渦巻くように回動させる（ｓｉｍｉｒｌｉｎｇ）ことが反応の性能を高めるのに 効果的であった従来技術から受け継がれている（例えば、米国特許第３４８８１ ５６　、３８７６３７９および４４５７８９４号明細書参照）、上記装置は、反 応室の小さい寸法および反応液体の小さい容量のために、マニホールド装置と組 み合わせた場合にすべての効果において最小である。その代わりとして、最近の 方法学では方針を変え、かつ反応を起こすのに利用する表面積を高めるように試 みられている。これらの試みは、少な（とも１種の反応物を艶消ガラス（米国特 許第４２８０９９２号明細書）、ワツフル状フィルター表面（米国特許第４３１ ７８１０号明細書）、ビーズ（米国特許第４ｉ３３６３９号、　４．１６６１０ ２号、　４２００６１３号および４２１７３３８号明細書）、多孔性膜（米国特 許第４４０７９４３号明細書）または反応チャンバーの壁（米国特許第３６４６ ３４６号。

３７９０６６３号および４２２５７８４号明細書）のような大きい全表面を有す る部分に結合するようにしており、この大きい表面積は混合不足について一部補 償するものと思われる。

最近５年間に提起され、かつ試薬の混合を高めるのに関係のない目的のために導 入された新しい技術は本発明の範囲に取り入れることができる。この技術は、い わゆる、マニホールド真空装置の発明に起因する。簡単に云えば、生化学的およ び免疫学的測微法におけるこの進歩は一般に入手しうる９６−室マトリックス（ マニホールド）の改良にある。各室の液体−不浸透性ベースを種々の手段で変え ており、このために液体を標準大気圧下で室に保持している（これによって生化 学および免疫学反応を室内で生ずるようにする）、けれども、真空がマニホール ドのベースを横切って作用される場合に、液体が液体界面を介して室の改良され たベースを通じて流出した。種々の改良がこの目的達成のために導入されている けれども、マニホールド　ベースを横切って加えられる真空が室の液体を流出す るように、マニホールドの各反応室のベースに比較的に低い抵抗口（ｌｏｗ−ｒ ｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｏｒｔ）を用いている共通の欠点がある拳以下に詳細に 記載するように、本発明はマニホールドのベースを横切る振動真空（ｏｓｃｉｌ ｌａｔｉｎｇ　ｖａｃｕｕｍ）を与えるのに上述する低い抵抗口を利用している 。この振動真空はマニホールドの全９６個の室の液体含有物を同時に激しくかき まぜ、混合する作用をし、これによって反応の速度および効率を高める。

液体の振動噴射（米国特許第４２０１６’７２号明細書）、振動圧力波（米国特 許第４５１８４９９および４５２６６７７号明細書および英国特許第４８５５５ ３号明細書）または機械的振動（ｗ＋ｅｃｈａｎｉｅａｌｖｉｂｒａｔｉｏｎｓ ）　（フランス特許第１１４５２６３号明細書）を与えて液体・フィルター界面 を効果的に撹乱する古い方法学が存在するけれども、これらの技術は小容量の生 化学反応を高めるのに向けられておらず、むしろ障害を除く工業用フィルター（ 米国特許第４２０１６７２．４３７６０４６．４５１８４９９および４５２６６ ７７号明細書、英国特許第４８５５５３号明細書、およびフランス特許第１１４ ５２６３号明細書）についての、または熱交換液体の循環を高めるために前拡散 バイアスを作る（米国特許第４３７６０４６号明細書）ための大容量の工業的手 段に向けられている。

かように、本発明は従来技術からの新しい開発および生化学免疫学測微法の技術 の進歩を示すものである。

光皿皇貝煎 本発明の目的は１つの試料または多くの試料の液体含有物を同時に混合できる化 学、生化学および免疫学的試験に用いる混合装置を提供するものである。

本発明の他の目的は種々の真空圧力を用い、これにより機械的、磁気的などの手 段を導入することなく反応媒質に効果的にマイクロリットル量または多量の試料 を混合する装置を提供することである。

また、本発明の他の目的は液相成分単独、または微小球、ビーズおよび全細胞に 制限するものでないが、これらと液相成分とを組合わせて混合する効果的なシス テムを提供することがある。

本発明の他の目的は試験操作間で、反応室から成分を除去することなく混合すべ き二三の順次試験段階の実施を可能とすることである。

本発明の他の目的は機械的、磁気的などの撹拌手段の導入、または反応混合物を 混合すべき他の容器に移送することにより生ずる遅延を生じさせることなく多量 の試験試料を処理でき、これにより反応混合物の取扱いおよび汚染の機会を最小 にする混合方法を提供することである。

本発明の他の目的は上述する作業を実施するのに、要求される最近の高価で、非 効果的で、かつ扱いに（い研究室用装置の代わりに、簡単で、安価で、かつ効果 的な装置を提供することである。

光里坐互！ 本明細書に記載する装置および方法は、装置および方法が多量の試料を用いる処 理に適用するにもかかわらず、小反応容量の試料を用いる効果的な生化学および 免疫学反応の達成における固有の問題点を解消するために開発したものである。

装置および方法は比較的低い抵抗口を設けられている従来の単一反応室またはマ ニホールド真空装置の機能を改良するものである。上記低い抵抗口は反応液体を 標準大気条件下で反応室内に残留することができる。室内の液体は、真空を口を 横切って作用する場合に、口を通じて室から排出することができる。かかる従来 技術の装置は制限するものでないが米国特許第４４２７４１５号（１９８４年１ 月）　、４４９３８１５号（１９８５年１月）および４５２６６９０号明細書（ １９８５年７月）、および米国特許出願第８５６６４７号明細書（１９８６年４ 月２５日出願）に記載されている。

本発明は単一反応室またはマニホールドのベースを横切って加えられる真空の強 さを周期的に変える。これにより、液体は反応室から無くなることがなく、むし ろ加えられる真空によって繰り返しおよび徐々に排出および除去される。

結果として液体を激しく、かつ混合する作用を達成する。

この混合作用としては、制限するものではないが、（１）単−室またはマニホー ルド　プレートの下の真空チャンバーに真空ポンプを連結する管の有効内径を周 期的に減少させまたはさえぎるピストン駆動または類似装置、または（２）単− 室またはマニホールド　プレートの下の真空チャンバーに装置を連結する管に、 他の形式で真空および正圧を付与する能力を有するピストン駆動または類似装置 を包含している。

本発明においては、試薬を液相に、または液相に懸濁させて、または液相と接触 させるようにできる。本発明は酵素標識抵抗を用いる免疫検定；直接放射線免疫 検定；間接放射線免疫検定；拮抗阻害免疫検定；螢光的標識抗体、他の結合剤（ 黄色ブドウ球菌蛋白質へのような）または抗原、およびフィルター、生物親和性 膜（ｆｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｍｅｒ＋ｂｒａｎｅｓ）、ビーズ、微小球または 反応室の壁のような存在体（ｅｎｔｉｔｉｅＳ）に結合する試薬を用いる免疫検 定のような用途を包含する。

Ｅ［ｆｌ！Ｊす０１朋− 第１図は本発明の原理を具体化するシステムを示す線図であり、真空ラインを形 成する管を物理的に圧縮またはさえぎることによってマニホールド　プレートに おける真空ポンプの作用を中断するようにモーター駆動ピストンを周期的に用い ている。

第２図は真空ラインの圧縮およびストローク　サイクルにおけるピストンの対応 位置に関する第１図に示すピストンの各サイクル中に生ずる順次段階を示す線図 である。

第３図は第２図と垂直に並べた第１および２図に示すストローク　サイクルを横 切る真空における周期変化を示すグラフである。

第４図はモーター・駆動ピストンが真空路を中断する本発明の原理を具体化する システムの変形状態を示す線図である。

第５図は第２図と同様で、かつ第３図と垂直に並べたグラフであるが、しかし第 ４図に関係している。

第６図は第３図と垂直に並べた線図で、第２および５図における反応室に生ずる 循環液体移動を示Ｌ７７いる。

第７図はモーター駆動ピストンに他のポンプおよび真空作用を設けた本発明の原 理を具体化する他のシステムを示す線図である。一方向弁を閉鎖位置に七７）す る場合には、モーター駆動ピストンは反応室を空にするのに要する真空、および 室において液体を混合する他の真空およびポンプ作用を生ずる。これに対して、 一方向弁が作用する場合には、圧送空気の低い抵抗通路が得られ、これによりマ ニホールドに対する真空だけが効果的に得られる。

第８図は第７図のシステムにおける空気流のパターンを示す線図であり、この場 合通路はストーロク　サイクルの種々の段階で閉鎖していない。

第９図は第７図のストローク　サイクル中に生ずる圧力変化のパターンを示す第 ８図と同様の線図であり、この場合通路は閉鎖しいている。

第１０図はシリンダーおよびピストンの代わりにベローを用いる本発明の変形例 を示す線図である。

゛な亘　の量′ 第Ｉおよび４図はマニホールドの単−室または多数の室における液体をモーター の駆動ピストン装置で混合できる２つの関連するが、しかし異なるシステムを示 している。

第１図において、−一多数の個々の室−一を有するマニホールド　プレートおよ び真空チャンバー１０を真空ポンプ１２に真空ライン１１を介して連結する。弾 性管からなるライン１１はピストン案内シリンダーと称するシリンダー１３を貫 通する。この目的のために、シリンダー１３は円筒状壁を通す直径の反対側の開 口１４および１５を有する。ピストン１６はシリンダー１３内をモーター１７に よ、て往復運動する。

上述するシステムによって、ピストン　モーター１７はそのサイクルを通してピ ストン１６を駆動し、ピストン１６を周期的に圧縮し、これにより真空ライン１ １をさえぎる。この周期圧縮は真空ポンプ１２により生じ、および真空チャンバ ー１０を介してマニホールド　プレートのベースを横切って作用する真空の強さ を連続的に変える作用する。

第２図は真空ライン１１の直径上におけるピストン１６の作用およびこの結果と しての上記ラインを介して引抜（真空の強さにおけるピストンの作用を示してい る。

第３図は第２図に示す真空ラインにおける圧力バターンが真空ライン内の圧力を どのように変えるかを示している。

第４図は、モーター１７により駆動するピストン１６が真空チャンバーＩＯを通 るマニホールド　プレートのベースに適用されるように、真空ポンプ１２により 発生する真空を周期的に中断するように構成された変形例を示している。この場 合、真空ライン２０は開口２１を通るシール端によりピストン案内シリンダー２ ２に導く。他の開口２３は真空ポンプ１２に向かう導管２４をシールする。

この手段において、ピストン案内シリンダー２２内の空気は実際的に真空路の機 能的役割をする。ピストン１６が２つの真空ライン２０および２１の端部間を周 期的に移動する場合には、空気流は効果的に中断され、次いで空気流をもとどお りにする。

第５図はストローク　サイクルにおける種々の点で真空ライン２４を通る真空に おける第４図のピストン１Ｇの作用を示している。

第６図はマニホールド内の室２５の液体容量の一一第１〜３図のおよび第４図の ｍ−２つの装置の作用を示している。

単−室２５だけの断面を示しているけれども、すべての室における作用は同じで ある。第６図から明らかなように、液体２６は周期的に引抜かれ、次いでピスト ン１６がそのストローク　サイクルを通過するにつれて解放される。

第７図は単−室においてまたはマニホールド　トレーにおいて液体を混合する他 の例を示している。この場合、ピストン案内シリンダー３０はシリンダー　ヘッ ド３１を通るように示している２つの口：すなわちマニホールド１０に管３３を 介して導く第１の口３２（弁を有していない）および一方向弁３５を有する第２ の口３４を有しており、第２の口３４は第１０口３２の抵抗に関係する圧送空気 の低い抵抗出口の通気孔３６に連結する。弁システムの細部を設計する多くの手 段があるけれども、すべての設計は基本的に同じ手段である。

ピストン１６およびモーター１７はポンプとして作用する。

ポンプ１６．１７が真空ポンプとして作用するかどうかは（すなわち、正圧をマ ニホールド１０に伝えない）またはポンプがマニホールド１０に送られた圧力を 振動するように作用するかどうかは（すなわち、正および負圧を交互に送る）一 方向弁を通る空気流の解放性（ｐａ　ｔｅｎｅｙ）に影響される。

この通路が閉鎖される場合には（空気流を制限する、弁で調節する、または可逆 的に止めることによって）、振動圧力は第９図におけるよう乙ごマニホールド１ ０に送られる。この通路が閉鎖されない場合には、真空だけが第８図におけるよ うにマニホールド１０を横切って供給される。

振動ポンプ（ｐｕｌｓｅ　ｐｕｍｐ）の効果はバラニｌ−ロフーノ〜ル基質にお けるアルカリ　」ζスファターゼ活性の割合につい°Ｃの研究により試験されて いる。次の試験結果は振動ポンプによる光学密度の有意な増加、およびかかるポ ゛／ブによらない実質的に平坦な応答を示している。

３０分における　１．５分における 犬ヱ孟度−７−人５字−窩腋−９−４−−振動ボンブに　。０６Ｇ　。０６５ よらない場合 第１０図はシリンダー□ｂよびピストンの代わりにベロ・〜４０を用いる本発明 の変形例を示している。ベロー４０は固定上端プＩ／−）４１に一方向弁４２で シールし、可動下端プレート４３にシールする。下端プレート４３はポンプ４５ により往復運動するピストン　ロッド４４に連結する。ベロー４０の気密内部は 廃液トラップ　ボ［・ル４７に導管４６を介して接続し、更にボトルは微滴定プ レート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）５０の下の真空チャンバー４９に導 管４８を介して接続する。

ロッド４４のストローブ長さばコントロール５１により調節し、ストローブ速度 はコントロール５２により調節し、このためのオン−オフ　スイッチ５３を設け る。ストローブ速度および容量は導管４６および４８に含まれる死空間の量、廃 液トラップ　ボトル４７の容量および真空チャンバー４９の容量に、並びにベロ ー４０およびその含有チャンバーの大きさに影響される。

五動Ｘ空−ポＺブｑ通里桝 ミクロチューブ免疫検定に振動真空ポンプを用いる研究には次の手段においてガ ラス超微ｍｔｉ（ｇｌａ！（ｓ　ｍ１ｃｒｏｆｉｂｅｒｓ）に細胞抗原を結合さ せることを含ませるのが好ましいや１う］皿桔−金 ガラス超＠繊維に結合する抗原の製造には４つの段階：（ａ）ガラス超微繊維の 調整、（ｂ）分離細胞膜の調整、（ｃ）分離細胞膜をガラス超微繊維に結合し、 次いで任意の残留結合位置を閉鎖すること、および（ｄ）結合ガラスの処理およ び貯蔵を含んでいる。

（ａ）ガラス超微繊維は、先ずこれを５０％（Ｖ／Ｖ）　Ｉ（Ｃｊｌ！に室温で １時間さらし、次いで蒸留水でゆすいでガラス表面をきれいにして調製する。洗 浄は表面ヒドロキシル（すなわち、シラノール）およびガラスにおけるほう素の 存在による負帯電基（ルュイス酸部位）を露出し、シラノールおよびルュイス酸 部位はカップリング　プロセスを生ずる存在体（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）である、酸 洗浄後、ガラス超微繊維は電気ブレンダーを用いて短い長さに砕くことが好まし い。

（ｂ）分離細胞膜の調製において、主な考察は一体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の メンテナンスおよび抗原部位の反応性、並びに細胞膜の結合によって調製ガラス 超微繊維を干渉する細胞成分（ヘモグロビンおよび細胞質蛋白質のような）に集 中している。赤血球の場合、処理は１％ＬＡＳ−１０ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７，２ ）溶液により、次いで１０ｍＭ　ＰＢＳ　（ｐ）１７．２）中室温での一連の温 間により溶解することからなる。順次温間の間、溶液を１２．０００　ｇで３０ 分間遠心処理し、上澄液を傾瀉し、捨てる。

（ｃ）カップリングおよび阻止、負−正一負「サンドイッチ」を形成するのが望 ましく、この場合正帯電多価アミノ酸は負帯電ガラス超微繊維を負帯電細胞膜フ ラグメントに結合する作用をする。これを達成するために、酸洗浄ガラスを０． １■／１１１のポリリシン（３０，０００〜７０．０００Ｍ啼に室温で１５分間 さらすことができる。蒸留水でゆすいだ後、分離細胞膜を加え、遠心処理により 結合する。ガラス上の任意の残留未結合部位を結合して免疫試験中、試薬の非特 異的結合（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を防止する。阻止は１０ ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７，２）に溶解した５％脱脂粉乳（ｒ＋ｏｎｂａｔ　ｄｒｉ ｅｄ　ｍ１ｌｋ）の添加、次の遠心処理によって容易に達成できる。ミルクはそ のコスト的効果性、安定性、および抗体のような試薬による非特異的結合の良好 な阻止物として知られている小さい蛋白質（主としてカゼインおよび２０〜３０ ．０００ダルトンの肚を有するラクトグロブリン）の高含有物のために優れた阻 止物である。

（ｄ）３つの上記段階の完了の際に、結合ガラスそれ自体はピペットにより容易 に処理することができる。所望量のガラス超微繊維を上述するように特に変えた 微滴定トレーに単に添加し、風乾して各反応室のベースにフィルターを形成する 。現在までのところ、これらの抗原−結合フィルターは室温および湿度で６ケ月 貯蔵しても抗原性の著しい損失は示されていない。

一度、抗原−結合フィルターを形成すると、フィルターは患者の血清と反応して 免疫結合の存在を検出することができる。この事は、次のように酵素免疫検定と して実施することができる： ｎ１逸淡韮文。

乾燥抗原−結合ガラス超微繊維フィルターは、先ず１滴の洗浄緩衝液（１０ｍＭ 　ジェタノールアミン、　ＤＥＡ；　ｐＨ７，３’１０ｕｌ！のアンチフオーム （Ａｎｔｉｆｏａｍ　Ａ）　（シグマ）及び１ｇの脱脂粉乳／１００　ｄ　ＤＥ Ａを含有する；長期間貯蔵する必要のある場合には、０．０１％メチロールを洗 浄溶液に添加することができる）を加えることによって再水和する（ｒｅｈｙｄ ｒａｔｅｄ）のが好ましい８次いで、再水和フィルター（ｒｅｈｙｄｒａ　ｔｄ ｅｆｉｌｔｅｒｓ）を５ｕｌの血清に４５ｕ１２の１％脱脂粉乳−１０ｍＭＰＢ Ｓ（ｐＨ７，３）中で３〜５分間さらす。洗浄サイクルに次いで、１％脱脂粉乳 −１０ｍＭ　ＤＥＡ　（ｐＨ７，３；　酵素を安定化するのに加えたＭｇＣ１に より）における適当な酵素−結合第二抗体（アルカリ　ホスファターゼに抱合し た抗ヒトＩｇＧおよび／またはＩｇＭ）の１：１００希釈液５０μｌを添加し、 および３〜５分間温置する。

洗浄サイクルに次いで、基質試薬の独特の組合せを加えるのが好ましい：他の最 近入手しうる試薬とは違って、この独特の組合せはアルカリ　ホスファターゼ抱 合体と接触する隙に高可視性の紫色沈澱物を速やかに形成する。基質はＭｇＣ１ を含有する５０μ！のニトロ　ブルー　テトラゾリウム（ＮＢＴ）塩溶液（キル ケガルド　アンド　ベリー　ラプス（Ｋｉｒｋｅｇａｒｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　 Ｌａｂｓ）　、５０ｕ　ｌの環部のジェタノールアミン（ＩＭ、　ｐＨ１２）お よびＰｎＰＰ溶液からなる。この基質を振動真空／ポンプ圧で用いる場合には、 反応生成物は液体中において１５〜３０秒内に肉眼で見ることができ、１〜３分 内にガラス超微繊維フィルターにより容易にトラップするのに十分な大きさの粒 子大きさの沈澱を生ずる０反応は、未反応基質を洗い流し、かつｐＨを反応最適 条件から推移させるｐＨ７，３０ＥＡの添加により停止する０反応の終了の際、 フィルターは反応室から容易に除去でき、かつ反応結果の永久記録として貯蔵す ることができる。

反応の速度および敏感性を高めるために極めて小容量を用い、ここに記載する振 動真空／ポンプ装置を使用する。

これは反応室を空にし酵素−結合免疫検定処理の各段階を終わらせる真空源とし ての作用する。また、これは中間反応生成物の洗浄を効果的にする。さらに、基 本型装置は反応チャンバーの透過性ベースを横切る振動引抜き（真空）および押 圧（ポンプ）力を生ずる。これらの振動力はチャンバー内に含有する反応液体を 繰返し引出しおよび放出する作用をし、これによって内容物を効果的に激しくか きまわし、かつ混合する。このシステムによって、単一の電子的に駆動するピス トン装置は従来の真空ポンプのすべての利点を得ると共に、他の最近利用されて いる技術に比べて反応の速度および敏感性を高めることができる０反応物は抗原 −結合ガラス超微繊維フィルターを介して繰返し引出すことができ、これにより 反応物間の緊密な接触が得られ、かつ酵素反応部位において生ずる最終生成物の 従来の問題を回避することができる。

ベローまたはピストンおよびシリンダー　システムは０．５〜２秒間の範囲のス トローク頻度で操作でき、およびストローク容積を１５〜２０立方インチにでき る。しかしながら、ストローク頻度および容積はシステムにおける全空気容積に 著しく影響する。

上述する方法は細胞膜抗原の供給源としての供与細胞、および酵素−結合免疫検 定における主抗体としての決定抗体を有する供与体／患者血清を用いる赤血球（ ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）抗体の検出に通用することができる。

振動ポンプ／真空を用いる完全システムは多くの事物に用いることができる。

１゜次の物に用いることができる： （ａ）アンチ＝Ａ対Ｂまたは０を結合しない結合アンチ−Ａ対ＡおよびＡＢ紺胞 膜 （ロ）ＡまたはＯに結合しない結合アンチ−Ｂ対ＢおよびＡＢ細胞膜 （Ｃ）０に結合しない結合アンチ−ＡＢ対Ａ、ＢおよびＡＢ細胞膜。

２、　システムを用いる場合 （ａ）抗ヒトＩｇＭ（ＩｇＧでない）はＡＢＯシステムに向ける抗体を含む供与 体／患者血清を確認する。

（ｂ）抗ヒトＩｇＧ（ＩｇＭでない）はＤ抗原に向ける抗体を含む血清を確認す る（他のＲｈ抗原／抗体は試験するために残す）。

３、　アンチ−Ａ、アンチ−Ｂ、アンチ−ＡＢおよび抗ヒト１ｇＭは制御フヘル ター（乳蛋白質と結合するが、しかし細胞膜に結合しない）、微滴定プレート壁 またはスパン−結合ポリエステル　ベース　フィルターに結合しない。

４、細胞膜ＡまたはＢ抗原と結合するガラス超微繊維は風乾し、室温および湿度 で貯蔵し、少なくとも６ケ月にわたり敏感性の著しい損失なくその反応性を維持 する。平行研究はＲｈシステムに関係する。

５、ＡＢＯシステム（および同時に行うＲｈシステムの予備研究）の場合、１２ ００〜１５００の範囲の抗原−結合ガラス超微繊維フィルターは免疫検定敏感性 を失うことなりｌｌｌ１１の細胞膜フラグメントから生成することができる。

６、ＡＢＯシステムの場合、免疫検定の敏感性は標準試験管凝集処理より少な（ とも８倍大きいことを確かめた。

７、ＡＢＯおよびＲｈシステムの場合、超？ｌＩ繊維−結合抗原は第一抗体に３ 分さらして、第二抗体にさらして３分およびアルカリ　ホスファターゼ基質にさ らして１５〜３０秒して正確に検出／確認する。速度は、抗体を結合抗原部位と 緊密に接触させる新規な振動真空／ポンプ装置の使用により直接に達成する。

８、　試験されたすべてのＲｈ抗体は正確に確認できた。アンチ−Ｂ１アンチ− Ｃおよびアンチ−Ｅ通常の抗血清は、ホモ接合ネガティブおよび乳−結合制御フ ィルターに比べてホモ接合および不均一対応抗原を正確に検出する。また、アン チ−Ｄおよびアンチ−Ｅ供与血清はホモ接合ネガティブおよび乳−結合制御フィ ルターに関するこれらの対応する抗原に結合する。

９、ガラス超微繊維対抗ＨＬＡ　Ａｔ抗体に結合する白血球におけるヒト白血球 抗原を用いる初期研究では適当な正の結果が得られ、またこれらの抗体の含まな い対照血清では予想された負の結果が生じた。現在の従来技術の処理では２日を 要することから、ＨＬＡ抗体を速やかに検出するシステムの適用は特に有意であ る。

本発明は本明細書に記載する発明の要旨および範囲を逸脱しないかぎり当業者に より種々変更を加えることができる。

い

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．液体に混合すべき薬品を、液体を透過する下端を有する室に挿入し、 前記室をその下端により真空チャンバーにおいて一般に垂直に維持し、および 前記チャンバーにおいて圧力を真空条件と非真空条件の間で交互に変える ことを特徴とする薬品の混合および反応を容易にする方法。
2. ２．前記交互変化工程は前記真空チャンバーを真空ポンプに周期的に接続および 取外すことからなる請求の範囲１記載の方法。
3. ３．前記接続および取外す工程は前記チャンバーを前記ポンプに導管で接続し、 および前記導管を遮断することにより前記取外しを行う請求の範囲２記載の方法 。
4. ４．前記導管を可撓性にし、前記遮断は前記閉鎖した導管を締付けることにより 行う請求の範囲３記載の方法。
5. ５．前記締付けはピストンを前記導管の外面に対しておよび外面から離して周期 的に移動させて行う請求の範囲４記載の方法。
6. ６．前記遮断は前記導管にチャンバーを挿入して前記チャンバーにより接続され た２つの導管部分を設け、ピストンを前記導管部分から分離しおよびこれらを再 接続するように移動させる請求の範囲３記載の方法。
7. ７．前記接続および取外しはピストン型真空ポンプをポンプチャンバーを介して 駆動することにより行い、導管を前記真空チャンバーから前記ポンプチャンバー に導き前記ポンプチャンバーを周期的に通気しおよび再閉鎖する請求の範囲２記 載の方法。
8. ８．前記交互停止は導管により前記真空シャンバーに接続するベロータイプのポ ンプを圧縮および膨張することからなる請求の範囲１記載の方法。
9. ９．真空密チャンバー、 前記チャンバーに維持する液体透過性下端を有する薬品および液体のための室、 および 正圧および真空を前記チャンバーに交互にかつ速やかに供給して薬品を互いに混 合するポンプ手段の組合せからなることを特徴とする薬品を液体に混合する装置 。
10. １０．前記ポンプ手段は 真空ポンプ、 前記真空ポンプを前記チャンバーに接続する導管、前記管を通すピストン案内シ リンダー、前記導管を閉鎖および再開放する前記シリンダーにおいて可動するピ ストン、および 前記ピストンを周期的に移動するモーター手段からなる請求の範囲９記載の装置 。
11. １１．前記導管を可撓性にし、および前記ピストンを前記導管を閉鎖するように 締付けおよびこれを解放して前記導管を閉鎖および再開放するように作用させる 請求の範囲１０記載の装置。
12. １２．前記導管は２つの部分を有し、および前記チャンバーはこれらの部分の間 に挿入し、前記ピストンは前記導管部分を分離しおよびこれらを再接続するよう に周期的に移動させる請求の範囲１０記載の装置。
13. １３．前記導管を前記シリンダーヘッドに位置させおよび前記真空チャンバーか ら前記シリンダーに導き、前記ポンプは前記ピストン、モーターおよびシリンダ ーからなり、および前記シリンダーヘッドは前記シリンダーヘッドを大気に周期 的に通気する弁手段を有する請求の範囲１０記載の装置。
14. １４．装置は前記チャンバーに維持する一連の前記室を有する請求の範囲１０記 載の装置。
15. １５．前記ポンプ手段は 密封ベロー、 前記密封ベローにおよび前記チャンバーに接続する導管手段、 前記ベローを圧縮しおよび膨張するベロー作動手段、および 前記ベローを周期的に移動するモーター手段からなる請求の範囲９記載の装置。
16. １６．前記導管手段は廃液トラッブボトルを含む請求の範囲１５記載の装置。
17. １７．装置は前記ベロー圧縮空気膨張のストローク長さを調節する手段およびス トローク速度を調節する手段を有する請求の範囲１５記載の装置。
18. １８．装置は共通の前記真空チャンバーを共有する一連の前記室を有する請求の 範囲１５記載の装置。
19. １９．ガラス超微繊維を酸を水に溶解した水溶液で約１時間処理しおよびＨ２Ｏ でゆすいで負帯電ガラス超微繊維を生成し、 調製ガラス超微繊維を短い長さに砕き、抗原部位を有する細胞膜から細胞膜のカ ッブリングが前記調製ガラス超微繊維に干渉する傾向のある細胞成分を除去する と共に前記細胞膜の抗原部位の一体性および反応性を維持することにより負帯電 分離細胞膜フラグメントを調製し、 負帯電ガラス超微繊維を負帯電細胞膜フラグメントに正帯電多価アミノ酸を介し て結合し、 ガラス超微繊維上の非結合部位を阻止して後添加試薬の非特異結合を防止し、 前記ガラス超微繊維を微滴定トレーの室においてその場所で乾燥して各前記液体 透過性室の下端でフィルターに形成し、および 形成した乾燥微滴定トレーを貯蔵する ことからなる液体透過性下端を具えた室を有する微滴定トレーから特定の微滴定 フィルター装置を製造する方法。
20. ２０．分離細胞膜の調製は赤血球の調製に関係し、血球を溶解しおよび次いで室 温温置により行う請求の範囲１９記載の方法。
21. ２１．方法は順次温置間の溶液を遠心処理しおよび上澄み液を捨てることからな る一連の室温温置を含む請求の範囲２０記載の方法。
22. ２２．前記結合は、調製ガラス繊維をポリリシンは３０，０００〜７０，０００ の範囲の分子量を有するポリリシンの希薄溶液にさらし、材料を蒸留水でゆすぎ 、次いで分離細胞膜を添加し、次いで材料を遠心処理して結合することにより行 う請求の範囲１９記載の方法。
23. ２３．阻止は１０ＰＢＳに溶解した５％脱脂粉乳を加え、次いで混合物を遠心処 理する請求の範囲２２記載の方法。
24. ２４．請求の範囲１９の方法から形成した微滴定トレーを用いる酵素免疫検定方 法において、 前記トレーの乾燥抗原−結合ガラス繊維ミクロフィルターを再水和し、 前記再水和フィルターを患者の血清希釈液に約３〜５分間さらし、 フィルターをゆすぎ、 適当な酵素結合第二抗体を加えおよびこれにフィルターを約３〜５分間さらし、 フィルターをゆすぎ、 基質試薬を材料と前記フィルターにおいて反応させ、室中の圧力を真空条件と非 真空条件の間で変えてよい混合を達成し、および 生成フィルターを乾燥する ことを特徴とする酵素免疫検定方法。
25. ２５．前記基質試薬は（１）同部の塩化マグネシウムを含有するニトロブルート リアゾリウム塩溶液および（２）同部のジエタノールアミンおよびｐｎｐｐ基質 溶液からなる請求の範囲２４記載の方法。