JPH01501471A

JPH01501471A - 非細胞性赤血球代替品

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Publication number: JPH01501471A
Application number: JP62503558A
Authority: JP
Inventors: セーガル，ラクシマン　アール．; デ　ウオスキン，リチヤード　イー．; モス，ジエラルド　エス．; ガウルド，ステーブン　エイ．; ローズン，アーサー　エル．; セーガル，ハンザ
Original assignee: ノースフイールド　ラボラトリーズ　インコーポレイテツド
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1989-05-25
Anticipated expiration: 2014-11-29
Also published as: PT85133A; GB2200639B; IL82890A0; GB2200639A; NL194909B; JP2983544B2; FR2600255B1; DE3790322C2; NL8720283A; CA1298783C; DE3790322T1; PT85133B; EP0271542B1; US4826811A; NL194909C; EP0271542A1; GB8801735D0; WO1987007832A1; FR2600255A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】非細胞性赤血球代替品発明の背景発明の分野本発明は本質的にストローマ異物を含有してぃなぺ四量体不含で、架橋し、かつ重合したピリドキモル化ヘモグロビン溶液からなる非細胞性赤血球代替品に関する。更に、該非細胞性赤血球代替品の製法に関する。

関連文献の説明数年来、ストローマ不含へそグロビンが酸素運搬及び可逆酸素（又はりがンド）結合能力を有していることは、該分野において公知である。毒性問題が血液代替品としての使用を妨げているので、ストローマ不含ヘモグロピ／は非毒性で、有用な医薬品を提供するためにもつと改良を必要とした。米国特許第４００１２００号：同第４００１４０１号及び同第４０５３５９０号明細書中には重合し、架橋したストローマ不含ヘモグロビンが、組織及び器官に酸素を運搬する九めの血液代替品として、かつ血漿増量剤として記載されている。ストローマ不含ヘモグロビンのピリドキクル化は可逆酸素結合能力を有利に改め、生物学的生成物の安定性及び貯蔵寿命上増大すること七示し九。Ｊ、　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｇ　５　Ｑ巻、第１４〜２０頁（１９８１年）。グルタルアルデヒドと重合し九、キリドキシル化へモグロビ７　ハＬ−Ｒ−Ｓｅｈｇａｌ　等著、” 　工ｎ　Ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆＰｏｌｙｍｅｒｉｚＭ、Ｐｙｒｉｄｏｘｙｌａｔｅａ　ＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ　’、ｔｅａ、　Ｒｒｏｃ、第６９巻、第２３８６頁（１９８０年）　；　Ｌ、　Ｒ，Ｓａｈｇａ１等著、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｈａｒａｃｔａｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ＰＯｌｙｍｅｒｉｚｓｄ　。

Ｐｙｒｉ＋１ｏｘｙｌａｔａｄ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　、　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　ｇ　２３（２）巻、第１５８頁（１９Ｂ５年６月〜４月）中に記載され、かつ特徴すげられている。更に、重合したｔＶドキシル化ヘモグロビンの、酸素運搬者として働らく能力はり、　Ｒ，Ｓｅｈｇａ１等著、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅａ　＃Ｐｙｒ１ｄＯｘｙｌａｔｅａ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　：　Ａ　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅＷｉｔｈ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｏｃｙｇａｕ　Ｃａｐａｃｉｔｙ、　Ｓｕｒｇｅｒｙ第９５（４）巻：第４３３〜４３８頁（１９８４年４月）　；　Ｌ、　Ｒ。

Ｓ＠ｈｇａ１等著、Ａｎ　Ａｐｐｒａｉｓａｌ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍａｒｉｚｅｄ　。

Ｐｙｒｌｄｏｘｙｌａｔｅａ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｈａ　ａｎ　Ａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｏ：ｃｙｇｅｎＣａｒｒｉｅｒ　＃　Ａ４ｖａｎｃｓａ　ｉｎ　Ｂｌｏｏａ　５ｕｂａｔｉｔｕｔｅ　Ｒｅａｅａｒａｈａ！１９〜２８頁（Ａｌａｎ　Ｒｅ　Ｌｉ５ｓ　、　工ｒ１ｃ、　１９８３　）に開示された。

数年の研究において、種々の技術によって製造されるへそグロビン溶液は、一方では生命上支持する之めに十分量の酸素を運ぶ能力を有しているが、不所望な副作用も有しているということが報告されている。最も問題となる副作用は腎機能における低下である。この変化はバクテリア内毒素又は赤血球細胞膜の７２グメント（ストローマ）の工うな不所望な異物の存在によると思われる。このような異物は本当に腎の変性を引き起こすことができるが、一方＃Ｊ紀異物を本質的に含有しないヘモグロビン溶液もなお事実上の腎機能障害ｔひきおこす。この機能障害は一時的なものであり、もとに戻るものであるが、これは出血性ショックのような、又は腎がすでにこの工うに低い血流状態における危険にあるような病的な状態においては非常に大変なことである。腎障害の原因は生理学的に認容できない量の非重合ヘモグロビン四量体にある。四量体へモグロピンの注入の他の不所望な副作用は腎毒性、血管収縮、血球素尿症、心傳度数の抑制、平均動脈血圧の上昇及び特に腹腔中への注入物の浴出である。

公知のいずれのヘモグロビン由来血液代替品も毒性問題を完全に回避することに成功していない。公知技術に工り製造されたこれらの製品は変化する量でヘモグロビン四量体を含有していることが見い出され九。

例えば、米国特許第４００１２００号、同第４００１４０１号及び同第４０５３５９０号明細書による製法は、臨床的に有用な生成物を提供しない。

第１に、他の方法のように最終生成物に不所望な多量の非重合ヘモグロビン四量体が存在する。第２に、毒性残留トルエンのような異物を製造の間完全に除去す、ることかできないので、このような異物が溶液中にあまシにも多く残る。第５に、１００〜１２０ｚｍＨｇのｐｓｏ　’ｒ有していると述べられている生成物は、このへそグロビン溶液が肺の酸素を捕獲しないという点で生理学的は非愼能的である。最後に、高い分子量重合体の割合の増加は高いゲル化不安定な生成物？生産し、その後の濾過及び精製の工種が困難であるか、又は認容できない希釈溶液中で行なう他は不可能である。

本発明の概要非細胞性赤血球代替品として臨床的に有用な非毒性ヘモグロビン溶液全提供することは本発明の重要な課題である。

もう１つの課題は、受血者との適合性検討を必要としない、可逆性酸素結合能を有する非毒性ヘモグロビン溶液を提供することである。

更なる課題は、通常の酸素運搬能を有する、非変性ヘモグロビン四量体を本質的に不含の純粋な重合体ヘモグロビン溶液を提供することである。

もう１つの課題は微生物及びウィルス性抗体及び病原体を十分に不含にすることのできる一時的酸素キャリャーを提供することである。

前記の及びその他の課題を考慮して、ここで本発明は十分にストローマ及び他の異物を含有していない、本質的に四量体不含で、架橋し、かつ重合し九、ピリドキシル化ヘモグロビンを提供する。

図面の説明添付図面に関しては、分類文献から出発し、本発明？図示する１４枚の図面上提出し、これらにつき以降詳細に説明する：第１図はピリドキシル化のバッチ法？示す概略図である；第２図は本発明による膜促進ピリドキフル化及び重合の概略図でちる。

第５Ａ、５Ｂ及び６０図は５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル電気泳動に工り分離さｎた本質的に四量体不含で、架橋し、かつ重合した１”　ＩＪドキシル化へモグロピンの密度測定走査線？示すグラフ図である；第４図はｒル濾過カラムから得られた架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの溶離パターン？示す：第５図はｒル濾過カラムから得られた本質的に四量体不含で、架橋し、重合し九ピリドキシル化ヘモグロビンの溶離パターン？示す；第６Ａ図はオキシヘモグロビンに関するスペクトル曲線？示すグラフである；第６Ｂ図は酸化した、本質的に四量体不含で、架橋し、重合し九ビリドキクル化ヘモグロビンで得られ九スペクトル曲線【示すグラフである：第７図は本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンのヘモグロビン濃度とコロイド浸透圧（ｃｏｐ　）との間の関数？記載し九グラフである：第８図は本質的に四量体不含で、架橋し、重合し九ピリドΦシル化ヘモグロビンに関するオキシ−ヘモグロビン解離曲線を示すグラフである：第９図は高圧液体クロマトカラムからの本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの溶離パターン全記載したグラフでちる。

第１０図は本質的に四量体不含で、架橋し、重合し九ピリドキクル化ヘモグロビンのへモグロピ／濃度と溶液粘度との関係を記載し几グラフである；そして第１１図はストローマ不含ヘモグロビ７（Ｓｇ　）及び本質的に四量体不含で、架橋し、重合しｘｆｌＪドキシル化ヘモグロビンの血漿消失曲線を記載したグラフである。

発明の詳細な説明本発明は本質的にストローマ及び他の異物を含有していない、本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピリドキシル化へ七グロビンからなる非細胞性赤血球代替品に関する。

本発明の目的に関して、「架橋し、」とは、分子の形状、大きさ、機能又は物理的特性を変化させる目的で分子上又は分子中、又は分子間に分子１ブリツジ”を化学的に設置することを意味する。「本質的に四量体不含」とは哺乳動物に通用し九四量体に一定の生理学的応答がもはや生じない四量体含量に関する純度の程度を示す。主な基塩は、薬学的に有効な量を注入する時腎機能に変化が起こらないことであシ、すなわち約９８％以上の純度のレベル（四量体約２係より少量が存在）である。１超精製”又は１精製”生成物とは本質的に四量体不含であると同じ意味を有する。「重合溶液」とは”架橋”又は重合剤、例えばグルタルアルデヒド、イミドエステル、ジアスピリン又は他のもの全生化学的に好適な担持剤中に含有する溶液である。

「半透過膜」とは一定の分子種類に透過性で６９、他のものに透過性でない膜を意味し、かつ約５００００ドルトン以上の分子量を排除する選択性フィルターとして働らく膜である。

本発明による方法の生成物でおる、四量体（天然の）ヘモグロビン及び種々の他の異物を本質的に含有していない重合し九ピリドキシル化ヘモグロビン溶液は生理学的に認容性であり、かつ治療上及び臨床的に有用である。該生成物は酸素運搬特性に必要である可逆的な酸素結合能を有している。最も著しいことは、該生成物が使用において全血に類似の酸素−ヘモグロビン解離曲線（Ｒｓｏ　）　ｋ有していることに関係する良好な取込み及び放出性を示す。該生成物は肺を通る毛細管中で結合酸素に対して高い親和性を示し、次いで体中で組織に酸素を十分に放出する。該生成物は受血者との適合性検討も必要としない。

本発明の方法は重合ヘモグロビンの分別及び精製において従来未公知の程度に四量体汚染のない生成物が得られるという点で特別である。本発明の方法は、微生物又はビールス性抗原及び病原体を十分に不含の最終生成物が生じるという利点を提供する。そのような抗原及び病原体は、例えばバクテリア、リケッチャ、真菌類、原生動物、ビールス及びその他の生物である。

最も重要であるのは、生物学的生成物は肝炎や後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ　）　ｉひきおこすビールスを十分に不含にすることができるということである。四量体ヘモグロビン及び種々の他の異物に関して純粋な生成物は広い臨床的利用性、使用の容易さ及び安全性を有し几。

生理学的特性に関するかぎり１１本発明の生物学的生成物は血管収縮、腎毒性、血球素尿症及びその他の四量体ヘモグロビン？不所望な量含有する公知ヘモグロビン溶液を静脈内投与することにニジ起ζる問題をひきおこさない。記載した生成物の静脈内投与に関して、結果は尿生産において認めうるほどの減少も、糸球体濾過率における認めうる減少も、腹腔中への認めうる浴出も、かつ生産尿の色の認めうる変化も示されなかつ友Ｏ従って、本発明の非細胞性赤血球代替品は傷害、心筋梗塞、卒中、急性貧血及び十分に血液を酸化する丸めの肺の損傷又は不全による血中酸素減少、低酸素症又は末期低酸素症の工うな酸素不足症の治療に有用性金兄い出し几。該製品は人工蘇生液（例えば傷害、特に出血ショック）、血管内容積拡張剤又は交換輸血を必要とするすべての症状又は医学的状況の治療における有用性も見い出され九。医学的治療に加えて、該製品は移植の九めの器官の保存にも使用することができる。

更に、本発明は、本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合し九ピリドキシル化ヘモグロビンの薬学的な有効量を、非毒性で、薬学的に認容性のキャリヤーと組合わせて、そのような治療ケ必要とする哺乳動物に静脈内投与することによシ、医薬治療の几めにこの生物学的製品を用いる方法をも含む。交換輸血は例えば敗血症、自己免疫症等のような一定の状態又は疾病の治療において常用の方法を用いて、本発明の非細胞性赤血球代替品と患者の血液との交換を伴なう。薬学的に効果的な量は特定の症状又は行なわれている医学的状況に必要とされる治療及び例えば患者の体重のような典型的な投与量パラメーターに１９変化する。一般に、薬学的に有効な量は、もちろん医師及び実地において医学的に有用な他のスタッフによシ考見られる投与範囲である。ある状況においていかに投与量を選択するかは医学の分野において熟練し九人には明らかである。薬学的に認容性の担体は有利に非毒性で、不活性で、かつヘモグロビンと適合するものである。そのような担体の例は水、平衡塩溶液、生理学的塩溶液（例えば乳酸加り／デル液、ハルトマン溶液（Ｈａｒｔｍａｎ’ａ　ａｏｘｕｔｉｏｎ　）等）、ブドウ糖溶液等を挙げることができるが、これに限定されない。

本発明方法において有利な出発材料は期日を過ぎた人血である。有利に、バッグに押され九有効期間消滅日を８週間以上すぎて貯蔵されてい友ならば、その血液をこの方法には使用しない。ここで記載されているすべての方法は、この分野での熟練者の範囲内で最少の改変で、他の補乳動物に通用可能である。

全工程は約２°Ｃ〜約８℃、有利に約５℃で実施するのがよい。期日を過ぎ九血液’ｋ　Ｏ，９％塩化ナトリウムのＬうな等張塩溶液約２〜約５倍容量で洗浄する。洗浄液は場合に！））抗生物質、例えばペニシリン、ストレフトマイシン、ゲンタマイシ７ｆ）ミキシンＢスルフェート等を含有していて工い。抗生物質の添加は該方法に必須ではないが、該方法を非薬学的環境で実施する場合最少にバクテリア汚染される。

パンクし赤血球を洗浄し、包ンで、集めて、アルカリ金属燐酸塩緩衝剤（例えば燐酸ナトＩＪウム）又は発熱物質不含水で溶解する。次の工程では、溶液から赤血球ストローマを分離する。赤血球ストローマの除去は微孔性濾過によシ行なわれる。有利な方法は中空ファイバーカートリッジでの交差流濾過（Ｏｒ０８ｇ　−ｆｌｏＷｆｉｌｔｒａｉｏｎ　）の使用である。交差流濾過システムの例はペリコン・システム（Ｐｓｌｌｉｃｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃ０ｒｐ、　、　Ｂｅｄｆｏｒｄ　、　ｙａ　）　；　ＨＦ−ラブ１５ウルトラフイルトレージヨンシステム（ＨＦ　−Ｌａｂｌ　５　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　；　Ｒｏｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　。

Ｗｏｂｕｒｎ、　ＭＡ　）　：　ＫＦ　２００−１００クロスフロウ（ＫＦ　２００−１００　ＫＲＯ３ＦＩＯＷ　；　ＭｉｃｒｏｇＯｎ、　ＬａｇｏｎａＨｌｌｌｓ、　ＣＡ　）又はＤＣ−３３システム（Ａｍ１ｃｏｎ。

Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓ　）である。システムは後の例に記載されている；シ小さいバッチにも、大きいバッチにも適用可能である。

次の工程において、ストローマ不含溶ｉｔヘモグロビンに対して約２＝１〜４：１のモル比で燐Ｒ５’ビリ−キサルを用いてぎリドキシル化する。有利に、ぎリドキシル化はトリス塩酸緩衝剤の工つな酸緩衝剤の存在が約０．１　Ｍ最終濃度及びグルタチオン約１ｇ／Ｌで行なう。該溶液をガス交換機ヲ用いてヘリウム、窒素又は他の不活性ガスで、有利には窒素ガスタンク又は液体窒素タンクを用いて完全に脱酸素する。溶液ｔボ／ゾで吸い上げるために使用する任意の管は有利に酸素不透過又は最少限に透過性である、例えばタイボン（Ｔｙｇｏｎ　）　Ｂ　−４４管（Ｃａ１ｍ　−Ｐａ１ｒａａｒ　ＣＯ＠　、シカ−１’、ＩＬ）、ナトリウムシアロボロハイドライド又は有利にナトリウムボロハイドライドのような還元剤を脱酸素溶液に加える。過剰の試薬’ｊｉｂ　Ｃ−ＤＡＫ　１．３（Ｃ０ｒｄｉｓ　Ｄｏｖ　Ｃｏｒｐ、　、　Ｍｉａｍｉ　、　ＦＬ　）又はＴＨ−１５（Ｔｅｒｕｍｏ　Ｃｏｒｐｓ　＃東京、日本）のような麿透゛析フィルター七用いて発熱物質不含水に対して透析することによって除去することができる。あるいは分子量５００００ドルトン以下のものを分離する限外′ｌ＠過カートリッジを使用することもできる（カートリッジはＡｍ１ｃｏｎ’Ｃｏｒｐ、　、　Ｒｏｍｉｃｏｎ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒａから市販のものである）。

次に、ストローマ不含、ピリドキシル化ヘモグロビン溶液に２５ｅＩＯグルタルアルデヒ）Ｆ　（Ｌ　Ｍｅ　Ｇｒａｄｅ。

Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｓｓ　、　Ｗａｒｉｎｇｔｏｎ　、ＰＡ　）　ｆ用いて重合すムストローマ不含、ピリドキシル化ヘモグロビン溶液を腎透析フィルター又は他の好適な膜フィルター全通してグルタルアルデヒドにさらした。重合の期間及び加、するグルタルアルデヒドの量はうモグロビン溶液の容量、所望のポリマー収量及び所望の分子量分布に依存する。一般に、重合時間がよシ長ければ、ポリマーの分子量分布はよシ高く、その収量はよシ犬であシ、かつ最終溶液のｃｏｐはより低い。典凰的に、ポリマーの収量７０チは３．５〜４時間でほぼ得られる。これが有利な重合の最終点である。収量８０〜９０％は７時間後に得られるが、ポリマーの著しく高い分子量分布が得られる（第６Ｃ図）。

本発明によシ実施する時、重合工程は高い収量でポリマー全生産する。確かな医学的有用性を有する生成物上生産する丸めに、反応のスピードを制御し、重合の間の相互作用の表面上制御し、平均が分子量約１２００００ドルトンである。せまい分子量範囲の生成物上製造することが重要である。重合反応はコロイド浸透圧計、例えばＩＬ　ｉ　３６（ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｓ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ　）又はウェスカー・コロイド・オスモメーター（Ｗｅｓｃｏｒ　ｃｏｌ：ｔｏｉａ　ＯｓｍＣｔｏｅｔｅｒ；Ｗｅｓｃｏｒ　、　Ｌｏｇａｎ　、　Ｕｔａｈ　）　ｆ用いてコロイド浸透圧における低下により、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によシ、又は任意の優れた公知技術に；り監視することができる。痕跡量の高分子量分子はドブクル硫酸ナトリクムポリアクリルアミドグル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＣ，Ｅ　）によシ測定されるので存在してよ為本発明の工程のピリドキシル化及び重合工程において半透過性膜界面で、生化学的担体（すなわち、水、塩、糖、他の小さい分子又はイオン）は静水圧力、流体力学的圧力、浸透圧力又はコロイド浸透圧力に応じて膜を横切って的後に自由に動く。活性剤（例えば重合剤、還元剤、キリドキクル化剤等）の分子又はイオンはその寸法及び重量に；シいくらか自由でなく膜を横切る。ヘモグロビン分子はそこなわれていない膜を全く横切ることはできない。この構成は結果としてヘモグロビン分子又は他の出発材料の活性剤への制御された暴露を生せしめる。変えることができる変数はヘモグロビン溶液の流速、溶液中のへモグロビ／濃度、活性剤の濃度及び活性剤の流速である。前記の変数に加えて、時間、温度及び表面積のような変数は反応成分、反応及び効率の広い範囲に関して、この構成を改良する丸めに変化させることができる。全体の反応は生理学的に認容性の媒体中で行なうことができる。更に、ヘモグロビン溶液は希釈環境又はイオン性環境において全く著しい変化を経験することなく反応の中を動くことができる。

第１図は概略的に、ｆｌＪドキシル化のバッチ法を示す。ストローマ不含ヘモグロビン及び燐酸５′ピリドキサルを含有する試薬の溶液６を混合容器５に加える。

ｐｉ（２−電極７にニジ調節し、監視する。容器５はベント又はガス抜きパルプ１１を有する。電気モーター９、モーターシャフトを混合クヤフトに結合する九めの自在継手９＆及び攪拌子１０からなる環状ミキサーの工うな攪拌装置が連続的な混合を提供する。溶液６をポンプ４τ用いて膜状ガス交換器１七介して容器５から取シ出し、次いで容器５に戻す。窒素源８は溶液６を脱酸素する丸めに膜状ガス交換器１七介して一定の窒素流で供給する。該膜状ガス交換器１はガス放出の九めのベント３に有する。還元剤上含有する溶液をシリノジ開口部２を介して加える。脱酸素ヘモグロビンの溶液の循環は所望の収量のピリドキシル化へモグロビ／が得られるまでポンプ４により提供される一定のポンプ活動により、この構成の中で継続する。

第２図は本発明による膜技術法金用いるピリドキシル化及び重合それぞれの概略図である。ピリドキシル化に関しては、ストローマ不含ヘモグロビン及び燐酸５ ′ピリドキサルの溶液を混合容器又は第２貯蔵器１８に加える。第２貯蔵器１８はベント又はガス抜きバルブ１７に有する。電気モーター１６、自在継手１６＆及び攪拌子２０からなる環状ミキサーのような攪拌装置置が連続的なへ拌を供給する。最初に、溶液１９は開口部３１及び３２が締められている間、ポンプにより２つの脱酸素通路上連続的に通る。同時に、溶液１９はポンプ１５により第２貯蔵器１８から出て膜状ガス交換器１３七通シ、かつポンプ２１によシ膜状ガス交換器２３及び腎透析膜フィルター２７を通過し、次いで第２貯蔵器１８に戻る。窒素源１２及び２４は膜状がス交換器１３及び２３を介してそれぞれ脱酸素溶液１９に一定の窒素流を供給する。膜状ガス交換器１３及び２３はガス放出のためのベント１４及び２２を備えている。−は電線２６七介して−メーターに接続している組電極２５によシ監視される。脱酸素後、開口部３１及び３２は開放さｎる。還元剤３０に含有する溶液を容器又は第１貯蔵器２９からポンプ２８により腎透析膜フィルター２７七通し、第１貯蔵器２９に戻す。

ピリドキシル化が完了し九後、還元剤３０七含有する溶液上発熱物質不含水に交換する。発熱物質不含水ｔポンプ２８を用いて腎透析膜フィルター２７を通μ過剰試薬を透析し、第１貯蔵器２９に戻す。開口部３１及び３２七クランプにより閉じ、溶液１９を脱酸素の関連成約に循環させる。

重合の間、開口部３１及び３２は開いている。ストローマ不含ピリドキシル化ヘモグロビンの溶液１９を装置全通して一定に循環させる。第１貯蔵容器２９中の発熱物質不含水？重合剤３０ゲ含有する重合溶液と憧きかえる。次いで、重合溶液をポンｆ２Ｂｋ用いて腎透析膜フィルター２７通し、第１貯蔵容器２９に戻す。なくなつ九場合、重合剤全第１貯蔵容器に段階的に加える。

基本的に、ピリドキシル化のための還元剤全含有する溶液又は重合剤を含有する重合溶液を第１貯蔵容器２９から腎蔵透析膜フィルター２７中の半透過膜の片側に供給し、一方脱酸素ヘモグロビン溶液又はピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビン溶液？、それぞれポンプによシ第２貯蔵容器１８から前記膜の反対側に供給する。還元剤又は重合剤を含有する溶液の１部は膜を横切って拡散し、膜の他の側のヘモグロビン全ピリドキシル化又は重合する。拡散しない還元剤又は重合剤を含有する溶液の１部は第１貯蔵器２９に戻る。同様にして、ピリドキシル化又は重合ヘモグロビン全含有する脱酸素ヘモグロビン溶液は第２貯蔵容器１８に戻る。この操作を所望の生成物収量が達せられるまで続ける。

重合の最後に、溶液中の非重合四量体ヘモグロビン濃度全任意の好適な濾過及び文献公知の精製技術にょシ著しく減少させることができる。本質的に、すべての残留未変化四量体の除去はポンプにより重合した溶液？中空ファイバー限外濾過カートリッジ全通し、次いでデルクロマトグラフィーに；シ精製することにより又はゲルクロマトグラフィー単独にニジ行なうことができる。

未変化四量体ヘモグロブリンの残留痕跡量は、ノ１シトグロビン単独七添加することにより、中空ファイバー限外濾過カートリッジ及び／又はデルクロマトグラフィー七使用しｆｃ後ハプトグロビンで処理することにニジ、又はｒル結合ハプトグロビン？用いる親和性クロマトグラフィーに工り除去することに；シ、本発明に従って複合体を形成することができる。ノーブトグロビンは重合ヘモグロビンの存在においても四量体ヘモグロビンと非可逆的に結合する。／・シトグロビンはへそグロビンと１：１のモル比で結合している。複合が自由浴液中で行なわｎるならば、ヘモグロぎン１ｇを結合する九めにハプトグロビン１．５〜１．５ｇｔ−要求する。あるいは、ハプトグロビンは活性化アガロースデルに結合されることができる。

最終溶液のＰＨ七約９に調節し、濃縮電解質で平衡上保持し、正常血漿のｐ）ｌ ’ｌ−再現する。臨床的に使用する場合、添加することのできる電解質はナトリウム、カリウム、塩素、カルシウム、マグネ７ウム等であるが、これに限定されない。

グルタチオン、アスコルビン酸塩又はグルコースのような常用の酸化防止剤も有利に添加することができる。最終溶液を生物学的生成物に通用する九めに好適な任意の公知技術を用いて滅菌することができる。

近似の量又は範囲における本発明の溶液の重大な特性？比較の目的で全血の特性と並べて示す：Ｈｂ　７〜１８ｇ／ａ１１２〜１５Ｖａ’１０２運搬量　９．７〜２５．０容量チ　１６．６〜２０．９容量チ結合係数（３７℃）　１．３０Ｃｅ／ｇＨ’ｂ　１．３２Ｃｅ／、ｌｉ’ＨｂＰ５０　（１）ＣＯ２４０）ル。

ｐＨ７，４，３７８Ｃ）　１４〜２２トル　２６トルメテモグロピン　１５％を下まわる　２％に下まわるコロイド浸透圧　７〜３０　）ル　２０〜２５ドルオスモル濃度　２９０〜３１（ｋｎｏｓＭ　２９０〜３１０ｍ０８Ｍ全燐脂質含量　０．Ｃｔｍ／ｒｎｌ　ｗ下まわる粘　度（２５℃）　５．２　ｃｐ（８Ｖ６１）　５．！５　（Ｈｃｔ＝４５％）次の例は本発明の一定の態様ｒ示す。しかしながら、こｎらの例は例示上目的としており、本発明の条件及び範囲上限定する目的のものではない。すべての温度は他に記載のない限！＋ｒ℃Ｊで表わす。代表的な反応条件（例えば、温度、反応時間）が与えられている時、あまり有利ではないが、この特定され九範囲の上又は下の両方の条件ｋｊＥ用することができることを認めるべきである。

本発明の更なる理解は次の限定しない例から得ることができる。これらの例は約５℃と大気圧で実施されたＯ例　１ストローマ不含四量体ヘモグロビン溶液の製造期間の過ぎ九人血を、溶液１１あた夛次の抗生物質を含有する０、９憾塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し九二ペニシリン　５０．００００ストレゾトマイ７ノ　５０■ デンタマイクン　４０１ｎ９硫酸ポリミキシンＢ　２．５〜赤血球（ＲＢＣ）　上等容量の前記溶液で２回洗浄し、１５分間２５００ｇで遠心分離する。バフィーコート層の９５チ以上七血漿抽出器（Ｆｅｎｗａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｍｏｒｔｏｎ　Ｇｒｏｖｅ、　ＩＬ　）で除去した。洗浄し、集合し九赤血球會プールし、発熱物質不含水６〜４容量で溶解し九。洗浄した赤血球１００単位が２０〜２４％のへマドクリットで容量１５〜２Ｃｌになつ九。

洗浄赤血球１５〜２０４ｔ−冷発熱物質不含水４０〜８０Ｊに注ぐ。この工うに作られ良溶解物質ｔポンプ・通した。空気作動ポンプを使用した（　ＬＰ　５０　％Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃａｒｐ、、　Ｄａｎｖｅｒａ　、　ＭＡ　）　。Ｑ、１μ 分離カートリッジはロミコン社（Ｒｏｍｉｃｏｎ　Ｉｎｃ＋；　Ｒｏｈｍ　ａｎｄＨａａｓ　Ｃｏ、の子会社、Ｗｏｂｕｒｎ、　ＭＡ　０１８０１　）から市グロビンは赤血球の他の酵素含有物と共に限外濾液としてフィルター七通過する。

濾液の１部？この工程の間数回遠心分離した。沈殿物の不存在が良好な膜の完全性を反映する。本質的にストロアマ不含ヘモグロビンの９７係回収が得られ九。

この第１の分離工程の間、溶解体容量に１２〜１５Ａに減少させ、ヘモグロビンの必要な回収が遂げられるまで発熱物質不含水？添加することにより、その容量に保持した。該工程と同時に、ヘモグロビンを有する限外濾過液を３０に分離中空ファイバーカートリッジフィルター（Ｈ１０Ｐ３０、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　、Ｄａｎｖｅｒｓ。

ＭＡ　）　３〜４個及びＬＰ３Ｑエヤーポンプを用いて濃縮した。限外濾液を濃縮して、約２０〜２２．！９／ｄｌの最終ヘモグロビン濃度にした。

例　２ストローマ不含四量体ヘモグロビン溶液の製法（二者択一的方法）期限切れ血液の個々の単位ｔｏ、９％塩化ナトリウム溶液で満九し九。赤血球及びバフィーコート七沈殿させるために一夜放宜した。次いで、上澄液とバフィーコートを抽出した。

次いで、集合細胞？０．９％塩化ナトリウム溶液５〜５容量に注いだ。該細胞を洗浄し、０．２μ中空フアイバー交差流フイルター（Ｋ　２０５−　ＫＲＯＳＦＬＯＷ　。

Ｍｉｃｒｏｇｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｌａｇｕｎａ　Ｂｅａｃｈ、　ＣＡ　）及びエヤーポンプ（ＬＰ　３０、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、Ｄａｎｖｅｒ　、　ＷＪ、　）　ｆ用いて濃縮し九。次いで、集合細胞上発熱物質不含水５〜５倍容量？添加して溶解し九。次いで、交叉流濾過を再び開始し、四量体ヘモグロビンを赤血球の酵素含有物と共に限外濾液中に集め、一方ストローマはフィルターに保持さｎ７＋ｃ０濾液の一部を該工程の間数回遠心分離し丸。沈殿物がないことは良好な膜の完全さ七反映する。本質的にストローマ不含ヘモグロビンの９７チ回収が達せられ九。この工程と同時に、ヘモグロビン全含有する限外濾液に５０に分離中空ファイバーカートリッジフィルター（Ｈｌ　０Ｐ３０、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｄａｎｖｅｒｓ　、ＭＡ　）及びＬＰ　５０エヤーポンプを用いて濃縮した。限外濾過液は最終ヘモグロビン濃度約２ｏ〜２２Ｆ／ａ１に濃縮され九。

例　６ストローマ不含へそグロビンのピリドキシル化−混合バッチ法ストローマ不含ヘモグロビン溶液を例１又Ｆｉ２の方法にニジ製造し九。次の試薬ｒ−緒に混合し九二１　燐酸５′ピリドキサルーヘモグロビンに対してモル比４：１：２　トリス−Ｈ（Ｊ緩衝剤−ヘモグロピン溶液中最終濃度０．１モル：６　グルタチオ／−１ｇ／ｌ溶液：４　アスコル♂ン酸−０，２ｊ；／／ｌ：５　グルコース　０．５９／ｌ；及び６　抗生物質−例１に記載し九と同じ抗生物質。

前記の試薬を最少容量の発熱物質不含水中に溶かμｔＪ（ｋ７．２５〜７．４５に調節し友。約記混合物をヘモグロビン溶液に加えた。ヘモグロビン溶液の−ｔ５℃でＱ、ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを用いて７．６５〜７．４５に調節した。最後に、ヘモグロビン濃度に１７．５〜１８−５１７　ａｌに調節し九。

次いで、溶液（１８〜２０Ａ）”ｔがス密ステンレススチール貯蔵容器に移し九。該溶液の脱酸素は膜ガス交換器（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｈａｒｖｅｙ　、　Ｂｏｎｔｌｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｊ、５ｓＳｈｉｌｅｙ　５ａｌｅｓ　Ｃｏｒｐ、　ｓ　Ｉｒｖｉｎｅ　、　ＣＡ　）　ｉ使用して行なった。窒素ガスを約１７０Ａ ’／分の流速で交換器を通して溶液中に通気し九。ヘモグロビン溶液をポンプにニジ流速４〜６１７分でガス交換器を通した。酸素の通切な除去は５％ニジ低いｏ２飽和度と定義され、これは１容量チェシ低い酸素含量である（　ＸＬ　２８２、Ｃｏ　−Ｏｘｉｍｅｔｅｒ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｓｘｉｎｇｔｏｎ　、　ＭＡによる）。これは４〜８時間で完了した（第１図参照）。

脱酸素し九ヘモグロビン溶液に、溶液１１あたジナトリウムボロハイドライド０．０２　Ｍ　（最終濃度）を加えた。ナトリウムボロハイドライドｋ　Ｏ，００１ＮＮａＯＨ５００〜５００ＴＩＩＩＬ　Ｆ）少量中Ｋ　溶カＬ　九ｏ　コレをヘモグロビン溶液中にガス交換器の７リンゾロから流速約１ｏｏｍｔ／時間で注入した。ステンレススチール貯蔵容器中のガス抜きパルプを圧力形成音道けるために開口しておい友。ＮａＢＨ４の添加に続けて、該溶液脱酸素に保持し九。ピリドキシル化ヘモグロビン約７０〜８０％の最大収率が６〜１０時間で得らｆｔ九。

該収率（ｌ−ｉ酸素−ヘモグロビン解離曲線（Ｐ５ｏ　）における移動を測定することにより決定され声。

過剰の試薬を腎透析フィルター（Ｃ−ＤＡＫ　１．３、Ｃｏｒｄｉｓ　Ｄｏｗ　Ｃｏｒｐ、　、　Ｍｉａｍｉ、Ｆ工又はＴＨ−１５、’ｒｅｒｕｍｏ　、東京、日本）を用いて発熱物質不含水に対して透析することにニジ除去した。該溶液？１膜酸素交換器（Ｏｘｙｇａｎａｔｏｒ　）　ｋ系中に保持することにより、透析の間脱酸素ｒ保持し九。酸素交換器？通過するＮ２流速は約１０１Ｍ／分であった。

例　４ストローマ不含ヘモグロビンのピリドキモル化−膜促進法ストローマ不含ヘモグロビン溶液を例１又は２の方法にニジ製造し九。次の試薬七−緒に混合した：１　燐１！　５’ピリドキサルーヘモグロビンに対してモル比２：１；２　トリス−ＨＣ１緩衝剤−ヘモグロビン溶液中最終濃度０．１　Ｍ　；３　グルタチオン−１９／ｌ溶液：４　アスコルビン酸−０，２ｇ／ｌ：５　グルコース　０．５ｇ／ｌ：及び６　抗生物質−例１に記載したと同じ抗生物質。

前記試薬を発熱物質不含水最少容量中に溶かし、−ｋ　７．５５〜７．４５に調節した。前記混合物をヘモグロビン溶液に加えた。ヘモグロビン溶液のｐＨ’！に５°Ｃで０．１Ｎ　ＮａＯＨｆ用いて７．３５〜７．４５に調節しり。ヘモグロビン濃度？ｒ１７．５〜１８．５９　／　ａｌに調節した。

次いで、溶液（１８〜２ｐＡ）’にガス密ステンレススチール貯蔵容器に移し友。溶液の脱酸葉音１個又は複数個の膜ガス交換器（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｈａｒｖｅｙ　、　ＢｅｎｔｌｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、５ｈｉｌｅｙ　５ａｌｅｙｓ　Ｃｏｒｐ、　＃　Ｉｒｖｉｎｅ　。

ＣＡ　）　ｉ用いることによシ完了し九。窒素ガス？交換器を通して流速約１７０Ｊ／分で溶液中に通気し九。

ヘモグロビン溶液？ポンプにニジ流速４〜６１／分でガス交換器？通し一〇酸素の好適な除去は５チよシ低い０２飽和度と定義さｎｌこれは１容量％工す低い酸素含量である（　ＩＬ　２８２、Ｃｏ　−ＯＸｉｍｅ’ｌｒ　。

Ｉ　ｎ１ｉｔ　ｔ！”ｕｍｅｎ’ｔ’　Ｉ！Ｌｔｉ　Ｏｎ　Ｌａ　ｂＯｒ　ａ　ｔＯｒ　ｉ　ｅ　ａ　１Ｌ’ＢＸｉ　ｎｇｔ　Ｏｎ　Ｎ　Ｍlによる）。これは４〜８時間で完了した。

この工程において、膜酸素交換器又はガス交換器２３？腎透析フイｐｙター’ｌ　７　（Ｔｓｒｕｍｏ、　ＴＨ−１５）と直列にし九（第２図参照）。透析フィルターの外側部分勿締め、脱酸素の量水の損失？防いだ。

脱酸素の最終点が達せられ九時、５ｇチナトリウムボロハイドライド溶液６１？透析フィルターの外側にポンプに工９送った。この工うにして、ピリドキモル化は迅速に終了した。ｆ　ＩＪドキシル化ヘモグロビンの収率７５〜８０チが１時間６０分で得られ、かつ、８５〜９０チの最高収率が２〜６時間で得られた。この収率は酸素−ヘモグロビン解離曲線（Ｐ２Ｏ）における移動？測定することにエリ決められた。

過剰の試薬は系中の腎透析フィルター（Ｃ−ＤＡＫｌ、６、Ｃ０ｒｃｌｉｓ　ＤＯＷ　Ｃｏｒｐ、、Ｍｉ　ａｍｉ、ＦＬ又はＴＲ−１５、Ｔｓｒｕｍｏ、東京、日本）を用いて、発熱物質不含水に対して透析することにより除去した。該溶液？透析の間脱酸素に保持した。酸素交換器を通過するＮ２流速は約１００７／分であった。

例　５ストローマ不含ビリドキフル化ヘモグロビンの重合ストローマ不含ピリドキシル化ヘモグロビン溶液を例６又は４の方法に工９製造した。該透析溶液に次のもの會加えた：１　０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝剤（最終濃度）２　例１に記載し九と同じ抗生物質：及び６　グルタチオン−１ｆｉ／ｌ。

上記の化学物質をビロデン不含水５００ｍｔ中に溶かし、ヘモグロビン溶液に加え几。５°Ｃで、０．５ＮＮａＯＨｋ用いて、溶液の一會８．０に調節した。ヘモグロ♂ン濃度ｋＯ，ＩＭ燐酸塩緩衝液を添加することにより１４〜１５ｇ／ａ１に調節し一０該溶液を、膜酸素交換器を系に保持することに工す、脱酸素状態に保持した。約１７０Ａ／分のＮ２流速が保持され九。

ヘモグロビン溶液上ポンプを用いて混合容器又は第２貯蔵容器１８から膜酸素交換器又はガス交換器２３を介して腎透析フィルター２７（第２図参照）中に流速５〜７１／分で送つ定。サンプリング？酸素交換器のシリンシロ全通して行なった。オキシヘモグロビンのパーセンテージが、コオキ７メトリ−（Ｃｏ−ｏｘｉｍｅｔｒｙ　）にニジ測定した時１０チエシ大であるならば、重合は開始しなかった。該溶液を腎透析膜に工す重合し九。重合溶液に１０１容量にし、これは次のもの七含有した：１　０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ヘモグロビン溶液におけると同じ最終濃度）；２　抗生物質−ヘモグロビン溶液におけると同じ濃度；６　グルタチオン−１ｇ／ｌ　；及び４２５係グルタルアルデヒド溶液１２５〜２２５ｍ１（ヘモグロビン１モル６ｍり約１４．８〜１８．１モ／ｌ／グルタルアルデヒド）。

重合溶液の浸透圧はヘモグロビン溶液の浸透圧とほぼ同じであつ九。

脱酸素ヘモグロビン溶液の流れはまず、透析フィルター七介して確立され、一方発熱物質不含水は外側を循環し九。所望の流速になつ几ら、重合溶液全外側に循環させた。該溶液？ポンプ？用いて流速０．４〜０．６１１１分にし２　（Ｃｏ１ｅ　−Ｆａｒｍｅｒ　ｐｕｍｐｓ、７０１８ポンプヘツド）。貯蔵容器中のヘモグロビン溶液を工程の間中十分に混合した。

その後、重合剤（２５係グルタルアルデヒド）？Ｉ−次のスケジュールに工り重合溶液に加え九二時間　１時間　７５ｍ／；時間　２時間　５０ゴ時間　６時間　５３　ｍｌ時間　４時間　５０Ｉ＋ｌｔ時間　５時間　５Ｑ　ｍｊ！時間　６時間　２５ｍＡ時間　７時間　１０Ｉ＋ｌｔ重合ｔコロイタ浸透圧（ＣＯＰ　）の低下に工り監視した。ｃｏｐが約４０トルに近づい九時反応全中止し九。

重合溶液の透析フィルターの外側を放水し、発熱物質不含水をポンプとよりへｎ九。発熱物質不含水に対する透析は約２時間行なわれ−。ポリマーの約８０〜９０％収量が得られ九。

例　６ストローマ不含、重合、ピリドキシル化ヘモグロビンの超精製ストローマ不含、重合、ぎリドキシル化ヘモグロビン溶液七例５に工す製造し九。未変性四量体の除去は三工程で行なわれ几。

工程１：限外濾過重合溶液をポンプにニジ分子量１ｏｏｏｏｏドルトン分離（Ａｍ１ｃｏｎ　）の中空ファイバー限外濾過カートリッジ６〜４個を通し九。限外濾液のヘモグロビン濃度が十分に０．１％に下まわり、少なくとも２時間の間そのレベルに留まる時、この工程を止めた。この段階で、重合ヘモグロビン溶液は約９０呪純粋であった。

工程２：デル濾過約９５〜ｂ精製工程は次のようなゲルクロマトグラフィーによシ完了し九。

２本のクロマトグラフィー・バイオプロセス・カラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｏｌｕｍｎｓ　；Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、　ＰｉｓｃａｔａｗａｙＸＮＪ　）６０ｃｍＸ　２５ｃＩＩＬｋＡＣＡ　−５４ウルトロゲル（ＡＣＡ　−５４Ｕｌｔｒｏｇｅｌ；　ＬＫＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）約５５ノで満尺した。このゲルは分子量、９００００ドルトンの排除限界上官した。該カラムをこれらの間のデッドスペースが最少になるように直列に接続すると、約１０５ｃｍの有効ｒル長さが得られるヘモグロビン濃度６〜１０９／６１”＜有する工程１からの重合ヘモグロビン溶液１１の半分を約６１／時間の流速でカラムに負荷した。負荷の後、緩衝液（５℃でＱ、ｉＭ燐酸ナトリウム −７，４０）？使用し、流速５．Ｏ１／時間でヘモグロビン？溶離するために使用した（第４図）。カラムから溶離し一重合ヘモグロビン溶液の最初の２．０７　ｋ保有した。残りの溶液を捨て九〇カラムの２１フラククヨンｋＨＩＰ１００カートリツジ１〜６１固を有するアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　ＣＨ−２限外濾過システムを用いて濃縮し几（第５図）。超精製し九溶液を濃縮し九。重合し九溶液の四量体濃度γ減少させることが必要な場合、工程２を繰り返した。

第６エ程：親和性クロマトグラフィーハプトグロビン（Ｈｐ　）　ｋ次のような活性化アガロースデルに結合した：ハプトグロビン（８０％ニジ純粋）　ｆ　ＣｎＢｒ活性化セファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｓｔａｉｃａｌｓ　。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　、　ＮＪ　）に沈殿し一デル１ａｔあたｂ　Ｈｐ６ダの割合で加えた。セファロース１容量あたりカップリング緩衝剤（０，１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．３ＭＮａ（Ｊ、ｐ）１７．９）４容量七加えた。混合物ｔ４ ℃で１夜おだやかに攪拌し九。この反応の収量は沈殿したｒルｌ　ｍｌｂ九シＨｐ２ｍ９であった。Ｈｐ親和性ゲルの過剰（遊離四量体ヘモグロビンに対し）上型台したピリドキシル化ヘモグロビン溶液に加え、おだやかに４℃で１〜４時間攪拌した。次いで該溶液をおだやかに遠心分離しく２分間、４０００１）、上澄液を回収し九〇付加的な洗浄及び遠心分離上実施し、重合したヘモグロビン七最大限回収した。このようにして得られ九、重合し九、ピリドキシル化ヘモグロビンの９９．５１よシ多くが未変性四量体ヘモグロビン不含であつ九。

変法６：ハプトグロビンとの複合重合し、ピリドキシル化し九ヘモグロビン溶液から、ハプトグロビン（Ｈｐ　）と複合することに工り未変性四量体ヘモグロビンの最終痕跡量を除去し九。ノ・シトグロビンを遊離四量体ヘモグロビンに１＝１のモル比で加え九。該溶液七約２時間皇温で混合した。

例　７超精製し、ストローマ不含の、重合し、ピリドキシル化Ｌｍヘモグロビンの医薬組成物超精製し、ストローマ不含の、重合し、ピリドキシル化したヘモグロビン溶液を例６の方法によシ製造し九。５°Ｃでの溶液のｐＨｋ　Ｏ，５Ｎ　ＮａＯＨ２用いて約９．０２に調節し、電解質濃縮物で平衡にして最終溶液中で次の濃度が得られた：Ｎａ　１４０　ｍＥｑ／Ａ＋Ｋ　４．ＯｍＥｑ／７ｃｊ１００　ｍＷｑ／ＩＣａ”　５．ＯｍＥｑ／　ｌＭｇ１．５　扉Ｅｑ／Ｊ！グルタチオン　１　ｆｉ／１酵素混合物を該溶液に加え、これｔ酸化に対して安定にした。これは最終溶液１１あ九シ定まつ上置よシはぼ少なくない量を含有する：１　グルコース−６−燐酸　０．６ｇ２　グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ　０．２０ｍｐ６　フエロドキク／　６　■ ４　フエロドキ７ンＮＡｒ）Ｐレダクターゼ　６ｍｇ５　ＮＡＤＰ　４０　■ ６　カメラーゼ　０．２ｇ最終ヘモグロビン濃度？７〜１８，９／ａ１に調節し友。

例　８滅菌法例６にニジ製造し文、精製し、重合し、ピリドキモル化し九ヘモグロビンｔパル・プロフィル・フィルター　（Ｆａｌｌ　Ｐｒｏｆｉｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　；　Ｐａ１ＩＣｏｒｐ、　、　ＧｍｅｎＣｏｖｅ　、　ＮＹ　）で次の；うな濾過工程を用いて滅菌し九。

０１０・・）００７・・シ００５・・）　ＮＲ７Ｐ、　（０，２μ絶対）１μ　０．７μ　０．５μ　０．２μ フイルタ一媒体はポリプロピレンであつ九。最終０．２２μ滅菌フイルターはナイロンであった。すべてのフィルターは医薬用品質であった。

このように滅菌され九溶液は血液寒天プレート上（６７°Ｃ／４日間又は２５℃ ／１０日間）又はチオグリコレートＮ汁中で全く成長上＊さなかった。該溶液は非薬学的環境で製造する時、リムルス・アメーバサイテ・リゼイトーテスト（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ＡｍｏｅｂａｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ　）　Ｋ　Ｌ　、り、痕跡量の菌体内毒素（０，２５１ｎｐ／ｍｉ　）　ｋ有してい九。

例　９生化学的特性四量体不含の重合し、ピリドキシル化したヘモグロビンはベックマンＤＵ記録分光光度計（Ｂｓｃｋｍａｎｘｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　、Ｌｉｎｃｏｘｎｗｏｏａ　、　ＩＬ　）から得られる正常吸収スペクトル金示し九（第６Ｂ図）。該溶液を正常ヘモグロビン濃度（１２〜１４ｇ／ａ１）に再構成すると認容性コロイド浸透圧（ｃｏｐ　）　（１４，５〜２２．５　）ル）を有する溶液が生じた（第７図）。第７図の九めに、ヘモグロビン濃度’ｉ　ＩＬ　２８２コオキシメーター（ｃｏ　−ｏｘｉｍｅｔｅｒ　；　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｄａｎｖｅｒｓ　ＳＭＡ　）で測定し７ｔ−０ＣＯＰｆウエスカー（Ｗｅｓｃｏｒ　）コロイド浸透圧計モデル４４　Ｑ　Ｑ　（Ｂｏｙｃｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ、、Ｈａｎ、ｏｖｅｒ　Ｐａｒｋ。

ＩＬ　）にニジ測定した。比較のために、非変性ストローマ不含ヘモグロビン（ＳＦＨ）にニジ得られ九曲線も示し九。重合の工程はヘモグロビンの酸素結合能力奮変工なたった（　１．３０　ｃｃ　７ｇ　）。正常ヘモグロビン濃度に再構成する時、該生成物は正常な酸紫運搬能力を有する。

ｐ”、ＰＣＯ２及び温度の生理学的条件下に測定する時、生成物のｐ５ｏは１４〜２２トルの範囲であった。生成物に関する典型的なオキ７−ヘモグロビン解離曲線を第８図に示す。サンプルｋｐ’７−４Ｌ温度３．７℃及びｐ０ｏ２４０トルの標準条件下に行なった。連続的な曲線上ヘムー０−スキャン（Ｈｅｍ　−０ −５ｃａｎ　）　ｆｌｉ素解離分析装置１　（Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、Ｄｅｅｒｆｉｅｌ＋ｉ　。

１１１１ｎｏｉｓ　）によりつくった。

ＨＰＬＣにより、生成物の分子量分布は１２０Ｃ１０１］〜６０００００ドルトンの範囲に現われ九（第９図）。

このデータから概算した平均分子量は約１２００００であった。第９図はＨＰＬＣカラム（ＴＳＫｒ”＃、ｔｙｐｅＧ　４　Ｑ　Ｑ　Ｑ　Ｓ、　Ｗ、、　Ｖａｒｉａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　（）ｒｏｕｐ　。

Ｐａ１ＯＡ１℃ｏ、、ＣＡ）からの溶離パターン全記載している。使用された溶離緩衝液は０．１　Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７，ｏ（２５°Ｃ）（オスモル濃度＝　５５５　ｍｏｓｍ　）。サンプルのヘモグロビン濃度七約５．０９７　、ｉｌに調節した。注入されたサンプル容量はＱ、１ｍｌであった。流速はｉ　ｍｌ　７分であり７Ｈ０（ＨＰＬＣ＄　ンプ（モデル２１５０）、ＵＶ％：ター（モデル２２５３　ＵｖｉｅＯｒｄ　ｓｌ［）及び記録積分器（モデル２２２０）はＬＫＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　。

Ｇａ１ｔｈｅｒｓ’ｂｕｒｇ　、　ＭＤ　Ｋよ！ｌｌ製造さｆした〕。

ＳＤＳ　−ＰＡＧＥにニジ特徴付けられた生成物は４本の重合バンドを示し７ｔ（第６Ａ図）。これは分子量１２００００で約５８％、分子量１９２０００で２６俤、分子量２５６０００で１１係、分子量５２００００で４％を示した。よシ高い分子量のポリマーの痕跡量はゲル上に可視であつ九。第５　Ａ　％　３　Ｅ及び６０図はＬＫＢメモ３０６　（ＬＫＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　。

（）ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　）中に記載され九方法を用いる５ＤＳ− ポリアクリルアミドデルにエリ分割された本発明の生成物の密度計走査線を表わす。この走査線は重合の異なる段階でのヘレナ・クイック・スキャン（Ｈｅ１ｅｎａ　Ｑｕｉｃｋ　５ｃａｎ　）　Ｒ及びＤ　（Ｈｅ１ｅｎａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅａｕｍｏｎｔ、　Ｔｅｘａｓ　）から得られた。

生成物の粘度は重合で変化した。最終生成物は約３．９’／ａ１のヘモグロビン濃度で６゜１センチポアズの粘度を有した。この値は全血の粘度と比較可能であった。第１０図は生成物のヘモグロビン濃度と溶液の粘度との関係を示した。測定は温度２５℃及び剪断速度４５０　秒”でプルてクツイールド・モデルＬＶＴ帖度肝（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌａ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａ’ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　。

９ｔｏｕｇｈｏｎ　、飄〕？用いて行なった。

赤血球膜中に存在する燐詣質は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により最終生成物中に発見されなかった。

遊離脂肪酸の痕跡量が時折のバッチに関するＴＬＣプレート上に可視であつｔｏ生成物中のメテモグロげ／レダクターゼ活性は工種発溶解物は１．０〜２．Ｏｕの範囲の酵素活性？有した。

酵素活性の１単位（ｕ）はヘモグロビン１ｇあ九９１分間還元さｆｉ７（フェロシアニド・メテモグロビン複合体１μＭとして定義し九。

例１０生理学的及び生物学的アッセイＡ　腎変性麻酔？力）けていないヒヒで行なった比較研究は四量体ヘモグロビン七２〜５％ニジ多量に含有する溶液の注入が注入前のレベルに比較して約５０係の尿生産の低下及び約１５壬の糸球体濾過率（クレアチニン・フレアランス）の低下を惹起した。本質的に四量体不含のピリドキシル化、重合ヘモグロビン溶液の注入はほとんど影響を与えなかった。

Ｂ　血圧効果ヒヒにおいて、心搏度数の約２５壬の低下、及び平均動脈圧の約１４％の上昇は５〜７％より多量の四量体ヘモグロビンを含有するヘモグロビン溶液の注入と関係した。これは四量体の本来の血管収縮神経活性であり、本質的に四量体不含のピＩＪ　）ｅキシル化、重合ヘモグロビン溶液を注入する時は全く示されなかった。

Ｃ浴出ヘマトリック０チに対して、四量体ヘモグロビンで交換輸血し九ヒヒの腹腔中には四量体へモグロ♂ン溶液２１までが観察され九。ヘマトクリット０チに対して、本質的に四量体不含のピリドキモル化重合ヘモグロビン溶液で交換輸血した動物の腹腔中にはヘモグロビン含有液体がほとんど観察されなかった。

Ｄ　ビールス抗原の破壊ここで開示し一方法に関する有利な出発物質である、九。この抗原の破壊は例５に記載されたＬうな重合１〜２時間後に起きた。

Ｅ　尿中のヘモグロビン存在の減少ヒヒへの四量体ヘモグロビン含有ヘモグロビン溶液の注入は尿中への四量体ヘモグロビンの排泄ｒひきおこし一〇注入した四量体ヘモグロビンの量が循環ハプトグロビンによりヘモグロビン四量体に結合するヒヒの能力を越えた時、四量体ヘモグロビンの排泄が生じた。生じた尿はヘモグロビンに特徴的な深い赤色を示し、尿１００−あたりヘモグロビン１〜２９に含有し九。四量体ヘモグロビン溶液は生体内（マウス、ヒヒが試験動物であった）半減期２〜４時間を示した。本質的に四量体ヘモグロビン不含ピリドキシル化重合ヘモグロビン溶液（四量体２チエ少少量存在）の注入は尿の色を僅かに又は感知できない程の変化をも九らす（尿１００１ｎｔあ九シロ０ダよシ少量のヘモグロビン）。

ハプトグロビン処理し穴型合し、ピリドキシル化し九ヘモグロビン溶液（９９，５１！　Ｄ多く四量体不合）は非常に多量の治療投与量で霊長動物に注入しても、尿の色に変化は生じない。

本発明方法で製造され几生成物の半減期は約２４時間であつ九（第１１図）。第１１図は非変性ストローマ不含ヘモグロビン（ＳＦＨ）及び本発明の生成物に関する血漿消失曲線（半減期）七記載している。乳酸加リンデル液中の５ＦＩ（又は本質的に四量体不含で、架橋し、重合し九ピリドキシ元化ヘモグロビン溶液を体重１　ｋｆ？あたシｉｇｉ、ヘモグロビン濃度約７〜約１４１１７ｄ１で６匹の成体雄ヒヒに静脈内投与した。血漿ヘモグロビン濃度２　ＸＬ　２８２、コオキシメーター（Ｃｏ　−ｏｘｉｍｅｔｅｒ　）によりＳＦＨの場合には２時間間隔で、本発明の生成物の場合６時間間隔で測定した。測定は被験血漿〃・らすべてのヘモグロビンが消失するまで就けられた。

前記のように、ここでは例示の目的で本発明の有利な実施態様？詳説したが、本発明はこれに限定はされない。該分野における専門家に明らかな他の変法、分岐し一方法及び同等の方法は本発明範囲のものである。

コロイド浸透圧（トル）飽和度（％）時間（時間）国際調査報告一誇岬１−１１＾””””−ロご〒／＋マｅＱＭＭＡＩ”＋２八ＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴｂＺ　ｒＮＴＥＲＮＡＴ工０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣ３ｉ　ＲＺＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡｆ、ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＵＳ、８７１０１３７２　（ＳＡ　１７５９０）υ５−Ａ−４００１４０１　０４１０１／７７　ＵＳ−Ａ−４０６１７３６０６／１２／７７ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＺＣＡＴｒＯＮ　ＮＯ，ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０１３７２　（ＳＡ　１７５９０）

Claims

【特許請求の範囲】

１．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンと、非毒性の薬学的に認容性のキヤリヤーとからなる非細胞性赤血球代替品。
２．該ヘモグロビンが約９．７容量％〜約２５容量％の正常酸素運搬能を有する請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
３．該ヘモグロビンが実質的に血管収縮活性を有さない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
４．該ヘモグロビンは実質的に病原体、ビールス性抗原及び微生物性抗原を含有しない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
５．該ヘモグロビンは尿生産において感知可能な減少を引き起こさない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
６．該ヘモグロビンは糸球体濾過率において感知可能な減少を引き起こさない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
７．該ヘモグロビンは腹腔中に感知可能な溢出を引き起こさない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
８．該ヘモグロビンは生産された尿の色において感知可能な変化を引き起こさない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
９．該ヘモグロビンは平均分子量約１２００００ドルトンを有することを特徴とする請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
１０．該ヘモグロビンは約１４トル〜約２２トルのＰ５０を有することを特徴とする請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
１１．該ヘモグロビンは約７トル〜約３０トルのコロイド浸透圧を有することを特徴とする請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
１２．該ヘモグロビンは約２９０ｍＯｓＭ〜約３１０ｍＯｓＭのオスモル濃度を有することを特徴とする請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。
１３．該ヘモグロビンは約７ｇ／ｄ１〜約１８ｇ／ｄ１のヘモグロビン濃度を有することを特徴とする請求項１による非細胞性赤血球代替品。
１４．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架構し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの薬学的に有効量を非毒性の薬学的に認容性のキャリヤーと共に、損傷をこうむつた哺乳動物に静脈内投与することからんる損傷の治療法。
１５．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの薬学的に有効量を非毒性の薬学的に認容性のキヤリヤーと共に、急性貧血である哺乳動物に静脈内投与を行なうことからなる急性貧血の治療法。
１６．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの薬学的に有効量を非毒性の薬学的に認容性のキヤリヤーと共に、人工蘇生液又は血管容積拡張剤を必要とする症状又は医学的状況の哺乳動物に静脈内投与することからなる人工蘇生液又は血管容積拡張剤を必要とする症状又は医学的状況の治療法。
１７．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの薬学的に有効量を非毒性の薬学的に認容性のキヤリヤーと共に、交換輸血を必要とする症状文は医学的状況の哺乳動物に静脈内投与することからなる交換輸血を必要とする症状又は医学的状況の治療法。
１８．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキツル化ヘモグロビンを、非毒性の薬学的に認容性のキヤリヤーと共に酸素欠乏症の哺乳動物に静脈内投与することからなる酸素欠乏症の治療法。
１９．該酸素欠乏症は低酸素症又は血中酸素減少症である請求項１８記載の方法。
２０．血液から赤血球ストローマを分離し、ピリドキツル化し、重合し、かつ残留未変性四量体の本質的にすべてを除去することからなる本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンの製法。
２１．ピリドキツル化が燐酸５′ピリドキサルを含有する溶液を抽出したへモグロビンに加え、脱酸素し、還元剤を含有する溶液を加え、ピリドキシル化し、脱酸素したヘモグロビン約７０〜約９０％の収率が得られるまで混合し、過剰の試薬を除去することからなる請求項２０記載の方法。
２２．ピリドキシル化が、抽出したヘモグロビンに燐酸５′ピリドキサルを含有する溶液を加え、脱酸素し、還元剤を含有する溶液を加え、かつ約３０分〜約１０時間混合することからなる請求項２０記載の方法。
２３．ピリドキシル化燐酸５′ピリドキサルを含有する溶液を抽出したヘモグロビンに加え、脱酸素し、還元剤を含有する溶液をポンプにより連続的に第１の貯蔵容器から半透過性膜の第１の側に送り、燐酸５′ピリドキサルを含有する脱酸素ヘモグロビン溶液を連続的にポンプにより第２の貯蔵容器から前記膜の第２の側に送り、該還元剤の１部が前記膜を横切り拡散し、第２の側のヘモグロビンをピリドキシル化し、還元剤を含有する該溶液の未拡散部分を第１の貯蔵容器に戻し、ピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビンを含有する脱酸素ヘモグロビンを第２の貯蔵容器に戻すことからなる請求項２０記載の方法。
２４．重合が、ピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビンを重合溶液に、コロイド浸透圧が約４０トルに達するまで暴露し、かつ過剰の試薬を除去することよりなる請求項２０記載の方法。
２５．重合がピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビンを重合溶液に約２時間〜約７時間暴露することよりなる請求項２０記載の方法。
２６．更に、重合剤を最初の時間に約７０ｍｌ〜約８０ｍｌ、２時間目に約４５ｍｌ〜約５５ｍｌ、３時間目に約４５〜約５５ｍｌ、４時間目に約４５ｍｌ〜約５５ｍｌ、５時間日に約４５ｍｌ〜約５５ｍｌ、６時間目に約２０ｍｌ〜約３０ｍｌかつ７時間目に約５ｍｌ〜約１５ｍｌの各量で毎時間重合溶液に加え、８時間日に過剰の試薬を除去することからなる請求項２４記載の方法。
２７．過剰の試薬の除去が透析により行なわれる請求項２１、２４又は２６記載の方法。
２８．重合が、重合溶液をポンプにより連続的に第１の貯蔵容器から半透過性膜の第１の側に送り、ピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビン溶液をポンプにより連続的に第２の貯蔵容器から該膜の第２の側に送り、該重合溶液の１部が該腰を横切つて拡散し、ピリドキシル化ヘモグロビンは第２の側で重合し、重合溶液の未拡散部分は第１の貯蔵容器にもどり、かつ重合し、ピリドキシル化したヘモグロビンを含有するヘモグロビン溶液は第２の貯蔵容器にもどることよりなる請求項２０記載の方法。
２９．半透過膜が腎透析膜からなる請求項２３又は２８記載の方法。
３０．重合溶液がヘモグロビン１モルあたりグルタルアルデヒド約１４．８モル〜約１８．１モルを含有する請求項２４、２５又は２８記載の方法。
３１．残留未変性四量体の本質的にすべての除去は濾過及び精製からなる請求項２０記載の方法。
３２．残留未変性四量体の本質的にすべての除去が重合した溶液をポンプにより中空フアイバー限外濾過カートリツジを通すこと、ゲルクロマトグラフイーにより精製すること及びハプトグロビンで処理することよりなる請求項２０記載の方法。
３３．残留未変性四量体の本質的にすべての除去がポンプにより重合した溶液を中空フアイバー限外濾過カートリツジを通すこと及びゲルクロマトグラフイーにより精製することよりなる請求項２０記載の方法。
３４．残留未変性四量体の本質的にすべての除去がポンプにより重合した溶液を中空フアイバー限外濾過カートリッジを通すこと及びハプトグロビンで処理することよりなる請求項２０記載の方法。
３５．残留未変性四量体の本質的にすべての除去がゲルクロマトグラフイーによる精製及びハプトグロビンでの処理からなる請求項２０記載の方法。
３６．残留未変性四量体の本質的にすべての除去がゲルクロマトグラフイーによる精製からなる請求項２０記載の方法。
３７．残留未変性四量体の本質的にすべての除去がハプトグロビンでの処理からなる請求項２０記載の方法。
３８．ハプトグロビンでの処理がハプトグロビンの添加又はゲル結合ハプトグロビンでの処理からなる請求項３２、３４、３５又は記載の方法。
３９．病原体、微生物性抗原及びビールス性抗原を実質的に含有したい請求項１記載の非細胞性赤血球代替品を製造する請求項２０記載の方法。