JPH01501896A - 多色ウエスタンブロット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多色ウェスタンプロッド 　に　る　昭 本出願は１９８７年１月２０日出願の米国特許出願第００４，４６４号の一部継 続出願である。

見肌Δ１１ 本発明は、タンパク質、タンパク質断片、糖タンパク質、リポタンパク質、また はそれらの混合物（以下これらを一般的にタンパク質と称する）を検出する方法 に関する。さらに詳しくは、本発明はタンパク質検出のためのウェスタンプロッ トまたはドツトプロット技術に関する。

当業界において公知のように、ウェスタンプロットは、タンパク質を電気泳動ゲ ルからタンパク質吸着マトリックス（これは該ゲルにおける位置に相当する位置 でトランスファーされたタンパク質を固定する）にトランスファーする時に形成 される。　Ｇｅｒｓｈｏｎｉら“タンパク質のプロッティング：原理と応用”、 ｕ１ｎ亘１」力ｍｌ■畦旺墜、凪、　１−１５（１９８３）を参照されたい、そ れの関連部分は引用によりこの明細書に組み入れられる。

一部タンパク質吸着マトリックス上に固定された特定のタンパク質の位置をプロ ーブ、即ち該マトリックスにおける存否または位置を決定することになっている １つもしくは複数のタンパク質に特異的な結合相手、と共にインキュベートする ことにより決定する０例えば、該マトリックスを抗体、抗原、レクチン、または その種の他のものと共にインキュベートすることができる。

プローブはマトリックスとインキュベートする前にラベル化されるか、または第 一のプローブに特異的な第二のラベル化プローブと反応することにより該マトリ ックス上で一部ラベル化され得るか、どちらかである０例えば、第一の動物由来 の特定タンパク質に対する非ラベル化抗体は、第二の動物由来のラベル化抗体の 使用により、マトリックス上でラベル化され得る。第二の動物由来のラベル化抗 体は、普通第一の動物由来の抗体と結合する。利用されているラベルは、放射能 標識、酵素との結合、および蛍光標識との結合を包含する。

Ｇｅｒｓｈｏｎ　ｉら、上記、第９頁を参照されたい、放射能標識の場合には、 プロットと一枚の写真フィルムとを接触せしめそれによって放射性プローブが該 プロットに結合することになった場所で該フィルムを露光することにより、該プ ロットのオートラジオグラフが調製される。

本発明の前に多数のアプローチが提唱されそしてテストされているが、ウェスタ ンプロット技術により複数のタンパク質のゲル上の位置を決定するための簡便な 実験方法はなかった０例えば、ゲルから一連のマトリックスへの多重トランスフ ァーに続き異なる１０−ブを用いた個々のマトリックスの現像が使用されている 。Ｌｅｇｏｃｋｉら、“多重イムルプリカ技術＝１つのポリアクリルアミドゲル を使った一連の異なる抗体での特定タンパク質のスクリーニング、　Ａｎａｌ　 ｔｉｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　１１１．３８５−３９２（１９８１ ）　ＨＬｉｎら、“モノクローナル抗体を使ったウエスタンブロッティングーエ ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイによるエプスタイン−バーウィルス の初期抗原拡散成分の定性と定量”、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ■刈垣江、　５３ ．７９３−７９９（１９８５）を参照されたい、率直に言えば、多重トランスフ ァーを行う必要性がこの技術を煩雑にする。　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎら、“ＳＤＳポ リアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙へのポリペプチドの定量的な電気 泳動トランスファー：抗原の免疫オートラジオグラフ検出におけるそれらの再利 用法”　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ、　５１゜２４１−２４９（１９８２）の第２４８頁を参照されたい、さら に、当業界において理解されるように、全てのプロットがゲルの最初のタンパク 質パターンを正確に表すであろうと保証するのは困難である。　Ｇｅｒｓｈｏｎ ｉら、上記、第８頁を参照されたい。

多重トランスファーの問題を解決するために、放射能標識を使う技術が開発され た。この技術においては、１）プロットを第一のプローブで現像し、２）該プロ ットをオートラジオグラフし、そして３）第一のプローブを該プロットから溶出 せしめ、その後１つまたは複数の付加的プローブでこの操作を繰り返す、　Ｅｒ １ｃｋｓｏｎら、上記；　Ｃｅｒｓｈｏｎｉら、上記、第９−１０頁ＨＣｕ１ｌ ｉｃｋら、“魚頭の電気器官およびヒトの筋肉からのアセチルコリンレセプター の構造的−散性”、　Ｂｉｏｃｈｅ−１畦１．２１．４５６３−４５６９（１９ ８２）　ＨＬｅｇｏｃｋｉら、上記；　Ｏ１論５ｔｅｄ。

Ｊ、　Ｂ、、“均質なタンパク質試料のジアゾ化ペーパープロットからの抗体の アフィニティー精製”、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ−ｉｃａｌ 　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　２５６．１１９５５−１１９５７：Ｒｅ１ｓｅｒら、 　“ゲルにおける分画およびジアゾフェニルジチオエーテル紙へのトランスファ ーによる全細胞抽出物中の特定タンパク質の検出”。

らジアゾベンジルオキシメチル紙へのタンパク質のトランスファーおよび抗血清 での検出：抗体特異性および抗原構造の研究方法”、ヒ虻遺桂Ｌｋ坦４吐訓汰、 　７６、３１１６−３１２０（１９７９）；Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎら、“ゲルから ジアゾ紙への電気泳動トランスファー後のタンパク質の免疫オートラジオグラフ 検出”、　Ｐｒｏｃ二Ｎａｔ１．＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、　７８．１７７− １８１（１９８１）を参照されたい。

この多重免疫オートラジオグラフ法は多重プロットのアブロー芋より優れている けれども、それ自体の問題を看する。第一に、個々のバンドの正確な位置を決定 するために一連のオートラジオグラフを整頓するのが困難である。明らかに、こ の問題は、同じ分子量を有するタンパク質同士を識別しようとする際に最も深刻 である。さらに、多重プロットのアプローチと同様に、多重オートラジオグラフ 法は、単一のゲルに関する多数の記録を調製し、同定し、そして保存する必要性 のために根本的に煩雑である。

上記に加えて、報告されたある研究においては、プロットを特定の第一のプロー ブで探索して結合性酵素で発色せしめ、そして一般の第二のプローブ（Ｃｏｎ＾ ）で探索して再び同じ結合性酵素で発色せしめる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、“ニト ロセルロース上に固定されたヒト血漿タンパク質の二次元電気泳動パターンの特 異的抗血清染色”、シμ」二連回二互ｉ−１亀、　１３５−１４２（１９８２） を参照されたい、この研究において、発明者らは、彼らが研究している異なるタ ンパク質の１０ツト上の位置を前もって知っていた。従って、両方のプローブが 同じ色に発色するという事実にもかかわらず、彼らはそれらのプロットを判別す ることができた。実際、第二のプローブを使用することにおける彼らの目的は、 第一のプローブの位置を同定するための基準系を提供することであった。そのよ うな前情報なしに、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの技術を使って２つのプローブの位置を 決定することはできなかっただろう。

多数のプローブを使った単一プロットの発色は、Ｃｅｙｓｅｎら、“免疫ペルオ キシダーゼ技術を使って１日以内に単一のニトロセルロースプロット上の２つの 異なる抗原の連続または′二重°免疫染色を行う方法”、旺虹旦因駕り臣■、艷 ：　１２９−１３１（１９８４）　；　ＬｉｎおよびＰａｇａｎｏ　、　”　２ つの抗体プローブを使用することによる同一ウニスタンプロットにおけるエプス タイン−バーウィルスおよび単純ヘルペスウィルスにより誘導される種々ノ抗原 の連続的検出”、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＶｉｒｏｌｏＨ、５９：５２２−５２ ４（１９８６）　、およびＴｈｅｉｓｅｎら、“異なる色の生成物を使ったウェ スタンプロットにおける抗体の連続的検出”。

＾ｎａｌｙｔｉｅａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１５２　：　２１１−２ １４（１９８６）においても論じられている。

これらの参考文献のそれぞれにおいて、Ａｎｄｅｒｓｏｎの参考文献におけるよ うに、プロットは連続的に発色される。特に、（：ｅｙｓｅｎ、　Ｌｉｎおよび Ｔｈｅｉｓｅｎの各技術については、プロットを１）検出するべき抗原の１つに 対して特異的である第一の抗体、２）　第一の抗体と結合する酵素ラベル化抗体 、３）該酵素ラベルのための基質、４）プロットから第一の抗体を溶出させるた めの溶出液、５）検出するべき抗体のもう１つに対して特異的である第二の抗体 、６）第二の抗体と結合する酵素ラベル化抗体、および７）　該酵素ラベルのた めの基質、と共に連続的にインキュベートする。連続的発色はそれら技術の全て を複雑にそして遅くする。特に、（：ｅｙｓｅｎらは彼らの技術が１７段階を含 みそして実施するのにフルワークの日（約６時間）を要すると述べ；　Ｌｉｎお よびＰａ８ａｎｏは実施するのに１０時間以上かかる１２段階について記載し； そしてＴｈｅｉｓｅｎらは、実施するのに約２４時間（ＢＳＡ中での一晩のイン キュベーションに加えて４つの抗体それぞれのインキュベーションについて２． ５時間）かかる１２より多い段階について記載している。

ウェスタンプロット技術に加えて、タンパク質吸着マトリックス上に固定された タンパク質の免疫染色もまた、ドツトプロット法の一部として行われている。こ の方法に関しては、１シリーズまたは１グループの試料中の１つのタンパク質は 、沢紙上に置かれる試料ウェルプレート中に該試料を入れそして該濾紙を通して 試料を吸わせるために該ウェルの底部に真空を適用することにより、一枚の濾紙 の特定の範囲に局在化される０例えば、“ミニホールド−微試料−過のマニホー ルド”と題する５ｅｂｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌの製品パンフレ ット。

５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｔｎｃ、、Ｋｅｅｎｅ、　 Ｎ、Ｈ，（１９８１）を参照のこと、従来、特定の試料が着目タンパク質を含む か否かを決定するための濾紙の免疫染色は、ウェスタンプロットで使われるもの と同様な技術を使って行われていた。特に、本発明に関する、多数のプローブお よび酵素基質を使ったドツトプロットの同時免疫染色は、まだ行われたことがな い。

光１しとＩ約− 前記の技術の現状を考慮して、本発明の目的は、多数のタンパク質の電気泳動ゲ ルにおける位置を同定するためにウェスタンプロット法を利用するための改良方 法を提供することである。より詳しくは、本発明の目的は、多数のプロットまた は多数のオートラジオグラフの必要なしに単一のウェスタンプロット上の多数の タンパク質を同定するための方法を提供することである０本発明のさらなる目的 は、該同定を行うのに要する時間および段階数を最小にすることである。

本発明の目的は、ドツトプロット上の多数のタンパク質を簡単に且つ迅速に同定 するための方法を提供することでもある。ウェスタンプロットについてと同様に 、該同定を行うの上記のまたは他の目的を達成するために、本発明は、それのあ る態様に従って、ウェスタンプロットまたはドツトプロットを発色せしめる方法 を提供しており、それは（ａ）異なるタンパク質と結合する第一および第二の非 ラベル化プローブ（以後“結合プローブと称する）の混合物と共に該プロットを インキュベートする段階；（ｂ）該プロットを第一および第二のラベル化１０− ブ（以後“標識プローブと称する）と共にインキュベートし、第一の標識プロー ブは第一の結合プローブと特異的に結合しそして第二の標識プローブは第二の結 合プローブと特異的に結合する段階（第一の標識プローブは第一の酵素でラベル 化されており、そして第二の標識プローブは第二の酵素でラベル化されている） ； （ｃ）第一の酵素の存在下で第一の色を呈する第一のマーカー物質を生成する第 一の基質と共に該プロットをインキュベートすることにより、該プロット上の第 一の標識１０−ブの位置号マークする段階： （ｄ）第二の酵素の存在下で第二の色を呈する第二のマーカー物質を生成する第 二の基質と共に該プロットをインキュベートすることにより、該プロット上の第 二の標識プローブの位置をマークする段階（第一の色と第二の色は異なる）、を 含んで成る。

明細書並びに添付された請求の範囲において年周する場合、“標識プローブとい う表現は、結合プローブと結合するそ酵素を担持している“ラベル化プローブと 結合プローブとを接続するために゛″媒介プローブが使われる２部分プローブを 包含することを意味する０例えば、結合プローブ／２部分標識プローブの組み合 わせは、着目タンパク質と結合する第一の動物由来のモノクローナル抗体（結合 プローブ）、第一の動物由来の抗体と一般に結合する第二の動物由来の非ラベル 化抗体（媒介プローブ）、およびプロット上の該タンパク質の位置をマークする ために使用される酵素と結合する第一の動物由来のモノクローナル抗体（ラベル 化プローブ）を含むことができる。このタイプのプローブの検討は、“（Ｐ　Ａ 　Ｐ　）ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体”と題する＾ｃｃｕｒａ ｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌの製品パンフレット（＾ｃｃｕｒｉｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌａｎｄＳｃｉｅｕｔｉｆｉｅ　ＣｏｒｐｏｒｉｔｉｏｎＪｅｓｔｂｕｒｙ、 Ｎｅｗ、Ｙｏｒｋ）中に見つかる。

２部分プローブを使用する時には、プロットな第一および第二の結合プローブと それぞれ結合する第一および第二の媒介プローブと共にインキュベートし、洗浄 し、そして、第一および第二の媒介プローブとそれぞれ結合し且つ第一および第 二の酵素を担持している第一および第二のラベル化プローブと共にインキュベー トする。使用する特定のプローブおよび検出するタンパク質に依存して、ある場 合においては、媒介プローブおよびラベル化プローブの適用の間の洗浄段階を省 略することが可能である。この場合においては、初めに媒介プローブをプロット に適用し、次いでラベル化プローブを適用する。また、媒介プローブおよびラベ ル化プローブを同時に適用することもできる。

所望であれば、２部分の標識プローブは１部分の標識プローブと組み合わせて使 用してもよい０例えば、１つのタンパク質を１部分標識プローブで検出でき、そ してもう１つのタンパク質を２部分標識プローブで検出できる。この場合、全プ ローブを一緒にプロットに適用することが可能であり、または１部分プローブお よび２部分プローブのうちの媒介プローブを一緒に適用し、そしてプロットの中 間洗浄なしに後で２部分プローブのうちのラベル化１０−ブを適用することが可 能である。

ある実施君様においては、上記の方法の段１１（ａ）および（ｂ）を−緒にして プローブとのインキュベーションをただ１回だけ含むようにする。同様に第一お よび第二の酵素並びに第一および第二の基質の適切な選択により、マーキング段 階（ｅ）および（ｄ）を同時に行うことができる。加えて、所望であれば、プロ ーブのインキュベアジョンおよびマーキング段階と同時に行うことができる。従 って、本発明はプローブおよび基質とのインキュベーションを１〜４回含む種々 の形式で実施され得る。

上記の方法に加えて、当業界において公知の種々の酵素連結技術を使って、結合 プローブを直接ラベル化することが可能である。この場合、本発明は、下記の段 階：（ａ）プロットを別々のタンパク質と結合する第一および第二のラベル化プ ローブ（以後“結合−標識プローブと称する）の混合物と共にインキュベートす る段階（第一の結合−標識プローブは第一の酵素でラベル化されており、そして 第二の結合−標識プローブは第二の酵素でラベル化されている）：（ｂ）前記第 一の酵素の存在下で第一の色を呈する第一のマーカー物質を生成する第一の基質 と共にプロットをインキュベートすることにより、該プロット上の第一の結合− 標識プローブの位置をマークする段階；および（ｃ）前記第二の酵素の存在下で 第二の色を呈する第二のマーカー物質を生成する第二の基質と共にプロットをイ ンキュベートすることにより、該プロット上の第二の結合−標識プローブの位置 をマークする段階（第一の色と第二の色は異なる）、 を含んで成る。

また、第一および第二の酵素、並びに第一および第二の基質の適当な選択により 、マーキング段ｔＷ（ｂ）および（ｃ）を同時に行って二段階プロセスを生むこ とができる。同様に、所望であれば、プローブのインキュベーションおよびマー キング段階を一緒にして一段階プロセスを生むことができる。

明らかなように、付加的タンパク質の位置は、前にプロットを発色させるのに使 ったもの以外の色を有する生成物を生ずるような付加的プローブ／酵素／基質の 組み合わせを使って該プロットを発色させることにより、決定され得る。付加的 タンパク軍の位置は、タンパク質の最初のセットのためのプローブをプロットか ら溶出させることなく決定され得るし、あるいは、最初のプローブを溶出させそ して本発明の技術および／または先行技術を使って該プロットを付加的タンパク 質について再度発色させることもできる。１つより多いプローブが同一のタンパ ク質と結合するならば、ハイブリッドカラーが生成され得るということに留意す べきである。

ウェスタンプロットまたはドツトプロット上の種々のタンパク質を位置決定する ことにおけるそれの利用に加えて、本発明の方法は、ウェスタンプロットまたは ドツトプロットを使った種々のタンパク質結合研究において利用され得る。

例えば、該技術は、特定抗原上のどのエピトープを抗体が認識するかに間して、 ２つまたはそれより多くの抗体を比較するのに利用され得る。この研究は、例え ば、抗原をフラグメントに消化し、該フラグメントを電気泳動ゲルにおいて分離 し、該フラグメントをプロットにトランスファーし、該プロットを第一および第 二の抗体と共にインキュベートし、そして異なる色を有する第一および第二のマ ーカー物質を生成する第一および第二の酵素／基質系を使って第一および第二の 抗体の位置をマークする、ことにより行われる。二つの抗体が同一のまたは異な るエピトープを認識するかどうかを決定することは、第一および第二のマーカー 物質が同一のまたは異なる位置に現れるかを見るために該プロットを簡単に調べ ることになる。

同様に、該技術は、抗原、ホルモン、神経伝達物質、およびその種の他のものへ の膜レセプタータンパク質の結合を研究するために利用され得る。この研究は、 例えば、膜をフラグメントに消化し、該フラグメントを電気泳動ゲルにおいて分 離し、該フラグメントをプロットにトランスファーし、該プロットを例えば、第 一および第二の抗原と共にインキュベートし、第一および第二の抗原それぞれに 対する第一および第二の抗体と共にインキュベートし、そして異なる色を有する 第一および第二のマーカー物質を生成するような第一および第二の酵素／基質系 を使って第一および第二の抗体をマーりする、ことにより行われる。そうして、 ２つの抗体への膜フラグメントの結合における相違は、該プロット上の２つのマ ーカー物質の色の分布から容易に明らかになるであろう。

タンパク質結合研究に対する本発明の方法の他の適用は、本開示により当業者に 明らかとなるであろう。

タンパク質吸着マトリックス上の多数のタンパク質を検出することにおけるそれ らの利用に加えて、本発明の技術はまた、そのようなマトリックス上の単一のタ ンパク質を検出するのに利用され得る。特に、下記の例４および５に例示される ように、先行技術において使用された種々の洗浄段階の省略および種々のインキ ュベーション段階の合併が、タンパク質吸着マトリックス上の特定の着目タンパ ク質を検出するための非常に迅速かつ容易に実施できる方法を生む、従来、当業 者は、中間の洗浄およびインキュベーション段階の全てがタンパク質吸着マトリ ックスの好結果の発色に必要であると思っていた。これら中間段階の省略は、本 明細書において証明されるように、本発明の全範囲の一部分を形成している。

ましい　１．　のミ 上記に論じたように、本発明はウェスタンプロットおよびドツトプロットを発色 せしめるための改良方法に関する。

ウェスタンプロットおよびドツトプロットは当業界において公知の典型的な技術 により生成される０例えば、ウェスタンプロットは、５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲルのような電気泳動ゲルにおいてタンパク質混合物を電気泳動的に分離し、 そして分離されたタンパク質をニトロセルロースフィルター膜のようなタンパク 質吸着マトリックスにトランスファーすることにより調製される。トランスファ ーは、電気泳動的に、拡散により、または溶媒の物質流により行われ得るが、電 気泳動的トランスファーが好ましい。

同様に、ドツトプロットは、商業的に入手可能な装置を使って、タンパク質含有 試料を試料プレートのウェル中に置きそしてタンパク質吸着マトリックス、例え ばニトロセルロースフィルターを通して該試料を減圧？過して該試料中のタンパ ク質を該マトリックスにトランスファーすることにより調製される。

そのようにして生成されたドツトプロットおよびウェスタンプロットを本発明の 方法を使って発色せしめる。ド・ントプロットの場合、ドツトプロット装置を使 って発色を行うこともできるし、またはフィルターを装置から取りはずしてそし て別々に処理することもできる。

本発明の方法は、種々の方式において実行できる０例えば、独立した結合プロー ブおよび標識プローブな使用する時、２つのタンパク質の検出は１〜４回のイン キュベーションを含むことができる。４回のインキュベーションの態様において は、プロットを１）２つの着目タンパク質のための２つの結合プローブと共に例 えば１−２時間インキュベートしそして洗浄し；２）２つの標識プローブと共に 例えば１／２−１時間インキュベートしそして洗浄し；３）第一の基質と共に例 えば５分間インキュベートしそして洗浄し；４）　第二の基質と共に同時間イン キュベートしそして再び洗浄する。付加的タンパク質は、最初の２つのインキュ ベーションにおいて付加的な結合および標識プローブを単に加え、そして検出し たい付加的タンパク質それぞれのための付加的基質のインキュベーションを加え ることにより検出可能である。一般に、プロットの洗浄は約５分間かかり、そし て例えばＴＢＳを使って行われる。従って、２つのタンパク質／４つのインキュ ベーションの８様については、全発色過程を行うには約２〜約３．５時間かかる 。

所要時間および含まれる段階の数は、種々のインキュベーションを一緒にするこ とにより減少できる０例えば、結合プローブおよび標識プローブのインキュベー ションを１−２時間の１回のインキュベーションとそれに続く１回の洗浄に合減 少することができる（結合プローブはインキュベーション中に常に存在している 必要はないが、所望であればインキュベーションの終了間近に添加することが可 能であるということに注意）、同様に、段階の数および発色過程に含まれるある 程度の時間をさらに減らすために基質のインキュベーションを合併することが可 能である。この合併を行う場合に、基質はもう１つのものと適合できるように選 択されなければならない、特に、該基質は単一緩衝液中に例えば普通のｐ）ｌで 溶解されなければならない、適合性の酵素／基質系の例は、ペルオキシダーゼお よびアルカリホスファターゼ酵素とそれら各々の基質とを包含する。

さらなる単純化および時間の縮小は、全く中間洗浄なしにプローブおよび基質の 両方と共にプロットをインキュベートすることにより達成され得る。プローブお よび基質をプロットと一緒に適用してもよく、また最初にプローブを適用しく例 えば標識プローブの前に結合プローブを適用して）そしてその後に基質を適用し てもよい、インキュベーション溶液中に非結合の標識プローブが存在するために 、基質は溶液中およびプロット上の両方でマーカー物質に転換されるだろう。

従って、この実施Ｂ様は、一般に、プロット上で容易に可視できるレベルのマー カー物質を生成させるために多量の基質を必要とする。インキュベーション溶液 中での転換は、該プロットを基質の添加の前に大量の溶液がら分筬することによ り最少にできる。この一段階法により、最小の数のプロット操作で１時間のオー ダーまたはそれより少ない時間内にプロットを発色させることが可能である。

結合プローブを直接ラベル化するならば、２つのタンパク質の検出は１〜３回の インキュベーションを含むことができる。３回のインキュベーションの実施態様 においては、プロットを１）２つの結合−標識プローブと共に例えば１−２時間 インキュベートしそして洗浄し：２）　第一の基質と共に例えば５分間インキュ ベートしそして洗浄し；そして３）第二の基質と共に同時間インキュベートしそ して再び洗浄する。

従って、この態様については、全発色過程を実施するのに約１．５〜約２．５時 間かかる。付加的タンパク質は、最初のインキュベーション中に付加的な結合− 標識プローブを含みそして検出したい付加的タンパク質それぞれについての付加 的基質つインキュベーションを加えることにより、検出され得る。

検出プローブ／標識プローブの態様についてと同様に、基質のインキュベーショ ンを互いに合併せしめることにより、そしてプローブのインキュベーションと基 質のインキュベーションとを合併せしめることにより、段階の数および所要時間 を減らすことが可能である。これらのインキュベーション段階の合併に関して前 述した考察は、結合−標識プローブのＢ様へも適用できる。

上記の実施態様に関連して、発色過程の開始前にマトリックスをタンパク質含有 ブロッキング緩衝液、例えばＢＳＡを含むｗＬ衝液と共にインキュベートするこ とが好ましい。そのようなＭ８液は、タンパク質のトランスファー操作の間に該 タンパク質と結合されなかったマトリックス上の部位をブロックする。同じ理由 で、ＢＳＡのようなタンパク質がプローブ用の緩衝液中に含まれていてもよい。

ブロッキング緩衝液との約３０分間のインキュベーションで一般に十分であるが 、所望であれば、より長いインキュベーション時間を使用することができる。

結合プローブまたは結合−標識プローブは、マトリックス上の存否および／また は位置を決定することになっているタンパク質もしくはタンパク質群にマトリッ クス上の他のタンパク質よりもより強く結合するように選択される。実施する特 定の研究に依存して、これらのプローブは抗体、抗原、レクチン、またはタンパ ク質を結合する能力のある類似物質を含む、また、ある場合においては物質の混 合物、例えば抗体または抗原の混合物を使用してもよい。当業界において公知の 方法に従って、着目タンパク質またはタンパク質群以外の物質へのプローブの結 合を最少にするようにインキュベーション条件が調整される。

ある場合においては、着目タンパク質の位置を明らかにするために一連のプロー ブを使用することが好都合であるかもしれない、各プローブは前のプローブに結 合し、そして最後のプローブは酵素に結合する０例えば、前述の膜レセプター研 究の場合においては、第一のプローブは、ホルモンに対し非結合性の第一の抗体 を結合し、次に第一の抗体に対し結合性の第二抗体を結合しているホルモンを含 んで成ることがで本発明の実施態様の各々については、基質とのインキュベーシ ョンがマトリックスと結合または反応するマーカー物質の形成を生み、そのよう にして着目タンパク質またはタンパク質群の位置を永久同定する。基質はプロッ ト上に存在する双方の標識プローブと共にまたは双方の結合−標識プローブと共 に該プロットに適用されるので、各プローブについて異。

なる酵素が使用されなければならない。

種々の酵素／基質系が本発明の実施において使用され得る。

酵素はそれの緩衝液に不溶である生成物を生成し、それは明確で独特の色を有し 、そして生成される部位で直接沈澱するべきである。酵素自体は該プローブとの カップリングの後に活性でなければならず、好ましくは室温で安定であるべきで あり、そして好ましくは妥当なコストで容易に得られるべきである。西洋ワサビ のペルオキシダーゼおよび大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）からのアルカリホスファター ゼはこれらの要求を満足することがわかっている。アスペルギルス・ニガー（＾ ５ｅｒｉＩＩｕＳｎｉ！ＬＬ）からのグルコースオキシダーゼ、ブタの筋肉およ び心臓からのラクテートデヒドロゲナーゼ、並びに酸性ホスファターゼもまた使 用することができるがあまり好ましくない。

Ｂｌａｋｅ　ら（１９８４）＾ｎａ）、Ｂｉｏｃｈｅｓ、、１３旦、　１７５− １７９　ＨＮａｋａｎｅら（１９６６）　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｔｏｃｈ ｅｍ、、１４．７８９−７９０　；　Ｐｅａｒｓｅ（１９６１）ＨｉｓＬｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒ　＝４）＋ｅｏｒｉｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａ　ｌ１ｅｄ、　Ｂｒｏ ｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、。

Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｈ＾、を参照されタイ。

後の第１表は結合酵素およびそれの基質の適切な選択により生成されうる遺別色 の一覧表を示したものである。

最初のインキュベーションに付加的プローブを追加す仝ことにより付加的タンパ ク質を同定することに加えて、例えば酸性緩衝液または変性剤、例えば尿素、Ｓ ＤＳもしくはチオシアン酸カリウムを含む緩衝液を使ってマトリックスから最初 のプローブを溶出させ、そしてプロットをその付加的タンパク質について発色せ しめることにより、付加的タンパク質を同定することができる。このアプローチ により、異なる色を有する異なるマーカー物質を生成するために、プロットの第 一の発色に使った１つまたは複数の酵素を異なる基質での第二の発色において再 利用することができる。同様に、結合抗体／標識抗体の組み合わせを第一および 第二の発色の両方において使用することができる。目下抗体を得ることが可能で ある動物の数が限られているので、同一動物のベアを使用できることは、モノク ローナル抗体を使用すべき場合に特に有効である。

本発明は、いかなる場合においても限定する意図のものではなく、下記の例によ りより詳しく記載されるであろう０例に共通する材料および方法は以下のようで ある。

扛且ａ支り左置 およびプラスミド 大腸菌（Ｌ弦■）Ｋ１２株Ｊ＾２２１　（ｈｓｄＭ”　ｈｓ邸−■且＾む且１ａ ｃＹ」）を形質転換宿主株として使った。形質転換は、ヒトα−１インターフエ ロンをコードするＤＮＡ配列の挿入部を含む発現プラスミドが潜在するプラスミ ドｐＮＬＯＯ８を使って実施された。

、　および；ｉ 組換えα−１インターフエロンは、後述の操作手順に従って大腸菌株Ｊ＾２２１ ／ｐＮＬＯＯ８の細胞培養物から抽出しな０組換えα−２インターフエロン、天 然のγ−インターフェロン、およびγ−インターフェロンに対するウサギのポリ クローナル抗体は、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏ ｒａｔｅｄ、　Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓ−ｗｉｅｋ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ（以下 “ＩＳＩ”と略す）から入手した。α−１インターフエロンに対するラットのモ ノクローナル抗体ＹＯＫおよびα−２インターフエロンに対するマウスのモノク ローナル抗体ＮＫ２は、Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ　Ｌｉ論１ｔｅｄ、　Ｂｅｒｋｓｈｉ ｒｅ。

ＵＫ、から入手した。マーキング（発色）抗体：ペルオキシダーゼが結合したヤ ギの抗マウス　ＩｇＧ、ペルオキシダーゼが結合したヤギの抗ラット　ＩｇＧ、 およびアルカリホスファターゼが結合したヤギの抗ウサギＩｇＧは、Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｆｏｒｎｉａから入手した。基質：４−クロロ−１ −ナフトール、３．３′−ジアミノベンジジンおよび５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドキシルホスフェートは、Ｓ　ｉ　ｇｕａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ、　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手した。

α−１イン　−フエロンの　４お　び　評大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）　Ｊ＾２２１ ／　ｐＮＬ００８のＯＤ、、、＝１．０の１０１００Ｏの培養物からの細胞抽出 物を、Ｌｅｅら、“高レベルの遺伝子発現のための縦列遺伝子系を使ったクロー ニング、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄＲｅｓ、、１２　：　６７９７　（１９８４）に 従って調製した。その細胞抽出物を１ｘＰＢＳ！衝液に対して一晩透析し、モし てａ−インターフェロンアフィニティクロマトグラフィー力うム上に載せ、続い てＩＸＰＢＳ、ＰＢＳ／エチレングリコール（３０％ＰＢＳ。

１．５Ｍ　ＮａＣｌ　、　５０％エチレングリコール）およびＩＸＰＢＳで順次 洗浄した。グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐ）ｌ　２．２＞を使ってα−１インター フエロンをカラムから溶出させた。その溶出液を固体のトリス塩基で中和し、０ ．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに対して透析し、凍結乾燥し、そして−２０℃で保 存した。

−゛・　およびプロツーイン Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９７３）、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１２．２４１−２５２ の方法により、１５％スラブゲルを使って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動を実施した。ウェスタンプロットは、プロッティング緩衝液（１５，６ｍＭ ）リス、１２０１ＩＩＭグリシン、ｐＨ８，３，２０％メタノール）中４℃で３ 時間７０Ｖでタンパク質を該ゲルからニトロセルロースフィルターｌ−電気泳動 的にトランスファーすることにより形成させた。　Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９） 、　Ｐｒｏｃ、Ｎ１ｔ１．＾ｃｕｄ。

旺辷則４Ｊユ、硯、　４３５０−４３５４を参照されたい、使用したフィルター は、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　Ｎｅｗ 　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅにより製造されたＢ＾８５ニトロセルロースフィルター（ ０，４５ミ１００ｍｆの各基質溶液を次のようにして新し、く調製した：ａ）ジ アミノベンジジン（Ｄ　Ｂ　）１２．５＋＋＋ｇをＴ　Ｂ　Ｓ　１００ｍ１に溶 解し、そして３０％Ｈ２Ｏ２１００μｌを使用直前に加える；ｂ）クロロナフト ール（ＣＰ）５０１１１ｇを無水エタノールまたはメタノール１０社およびＴＢ Ｓ９０ｍＮに溶解し、そして３０％Ｈ２０□０．２５ｍ１を使用直前に加える； およびＣ）　ブロモクロロインドキシルホスフェート（ＢＣＩＰ）　９．２ｍｇ を３５Ｍ１の０．２５Ｍグリシン−Ｎａ０１（Ｍ新液、ｐＨ１０，４に溶解し、 そして０．１Ｍ　ＺｎＣｌ２１．２５＋ｎｆ、０．１ＭＮｇＣ１２１，２５ｍ１ および蒸留水６２．５ＩＱｉと混合する＜Ｚｎｃ１２／Ｈｅ、ＣＬ温溶液混合し たグリシン−ＮａＯＨ緩衝液は以後“緩衝液Ａ”とこの例は、異なる色を有する マーカー物質を使ってウェスタンプロットをマークするための模範的な一連の条 件を説明するものである。前述の４つのインキュベーションプロトコール、即ち 、結合プローブのインキュベーション、標識プローブのインキュベーション、第 一の基質のインキュベーション、および第二の基質のインキュベーションを使用 する。

組換えα−１インターフエロンおよび天然のγ−インターフェロンそれぞれ１． ＯｕｇをＳＤＳ　−ＰＡＧＥにおいて電気泳動し、続いてニトロセルロース膜上 ヘブロッティングする。プロットされたニトロセルロース膜をＴＢＳ　（２０１ １８）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５；　５００ｍＭ　ＮａＣｆ）で洗浄し、そして ３％ＢＳＡを含むＴ−ＴＢＳ（ＴＢＳ＋　０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で室温で ３０分間ブロックする。

その膜をα−１インターフエロンに対するラットのＹＯＫモノクローナル抗体（ １：　１０，０００）およびヒトγ−インターフェロンに対するウサギのポリク ローナル抗体（１：　１００）の混合物で１−２時間免疫染魯する。その膜をＴ −ＴＢＳ中で５分間洗浄し、そしてペルオキシダーゼが結合したヤギの抗ラット Ｉ　ｇＧ（１：　１０００）およびアルカリホスファターゼが結合したヤギの抗 ウサギＩ　ｇＧ　（１：　１０００）の混合物中で１７２−１時間インキュベー トする。その膜を再びＴ　−ＴＢＳ中で５分間洗浄しそして続いて前述のＤＢ溶 液およびＢＣＩＰ溶液で処理しく中間洗浄を伴う）、次いでＴＢＳまたは蒸留水 で最後に洗浄する。

生成する発色プロットは、１つの茶色がかった緑色および３つの青緑色のバンド を含み、それぞれα−１インターフエロンおよびγ−インターフェロンを示す。

匠−１ この例は、ドツトプロットを発色せしめるための３つのインキュベーションプロ トコール（結合プローブのインキュベーション、標識プローブのインキュベーシ ョン、そして第一および第二の基質を一緒にしたインキュベーション）の使用を 説明するものである。

γ−インターフェロンおよびα−１インターフエロンの６×１０４ユニツトをそ れぞれ５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　ＭＩＮＩＦＯＬＤミク ロ試料濾過マニホールドのウェル１および２に添加し、ニトロセルロースｒ紙へ 真空トランスファーする０例１において記載した操作に続き、プロットされた一 紙を１）　α−１インターフエロンに対するラットのＹＯＫモノクローナル抗体 （１：　１０，０００）およびヒトγ−インターフェロンに対するウサギのポリ クローナル抗体（１：　１００）の混合物、２）ペルオキシダーゼが結合したヤ ギの抗ラット　Ｉ　ｇＧ　（１：　１０００）およびアルカリホスファターゼが 結合したヤギの抗ラット　ＩｇＧ（１：　１０００）の混合物、そして３）　１ ００％エタノール５ＩＩＮに溶解したＣＰ２５ｍｇおよび緩衝液Ａ４５ｍ１に溶 解したＢＣＩＰ　５　ｔａｇの混合物、と共に順次インキュベートした。インキ ュベーションとインキュベーションの間に該プロットをＴ　−ＴＢＳ中で５分間 洗浄した。

発色したプロットは、青色と紫色を呈し、それぞれウェル１およびウェル２の位 置で発色した。

匠−１ この例は、ウェスタンプロットの３色の発色を説明するものであり、最初の２色 は結合プローブおよび標識プローブの溶出が介在しないで発色し、そして３色め は最初の２色において普通使用する結合プローブおよび標識プローブの溶出の後 に発色する。

γ−インターフェロン、組換えα−１インターフエロンおよび組換えα−２イン ターフエロンの各々１．Ｏｕ６を電気泳動し、そしてニトロセルロース膜上にト ランスファーせしめる。

例１の操作手順に従ってその膜を１）　γ−インターフェロンに対するウサギの ポリクローナル抗体（１：　１００）およびα−２インターフエロンに対するマ ウスのモノクローナル抗体Ｎ　Ｋ　２　（１：　１０，０００）の混合物、２） ペルオキシダーゼが結合したヤギの抗マウス　Ｉ　ｇＧ（１：　１０００）およ びアルカリホスファターゼが結合したヤギの抗ウサギＩ　ｇＧ　（１：　１００ ０）の混合物、３）　前述のジアミノベンジジン溶液、そして４）前述のブロモ クロロインドキシルホスフェート溶液、と共に順次インキュベートした。各イン キュベーションの後に該プロットをＴ　−ＴＢＳ中で５分間洗浄した。それらの インキュベーションの後、該プロットは、それぞれα−２インターフエロンおよ びγ−インターフェロンを示す、１つの茶色のバンドおよび青緑色のバンドを有 した。

最初の結合および標識プローブを取り除くために、膜を溶出Ｍ缶液（０、１Ｍグ リシン−ＨＣｊ’、　ｐＨ２，２；　２０＋ｎＭ　ＭｇＡｃｚ　；　５０Ｉｌ１ ＭＫＣ１）で３回処理した。各洗浄は５分間であった。溶出後、膜をα−１イン ターフエロンに対するＹＯＫモノクローナル抗体（１：　１０，０００）、ペル オキシダーゼが結合したヤギの抗うッ）　ＩｇＧ（１：　１０００）、および前 述のクロロナフトール溶液、と共に続いてインキュベートした（中間洗浄を伴う ）、α−１インターフエロンを含むプロット領域に紫色が現れた。

最終的な３つの色は、茶色、青緑色および紫色のバンドを包含し、それぞれα− ２、γおよびα−１インターフエロンを示した。

この例は、プローブのインキュベーションと基質のインキュベーションとの間に プロットの洗浄が介在しないドツトプロットの発色を説明するものである。

例２の５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｃｌ　５ｃｈｕｅｌｌドツトプロツト装置を 使って６Ｘ１０’ユニツトのα−２インターフエロンを３枚のニトロセルロース Ｐ紙にトランスファーすることにより、３つのドツトプロットを調製した。各プ ロットを３％ＢＳＡブロッキング緩衝液で１５分間ブロックし、そしてＴ　−Ｔ ＢＳで５分間洗浄した。そのプロットをα−２インターフエロンに対するマウス のモノクローナル抗体Ｎ　Ｋ　２　（１：　２５００）およびペルオキシダーゼ が結合したヤギの抗マウス　Ｉ　ｇＧ（１：　１０００）の混合物と共に１−２ 時間インキュベートした。

第１のプロットについては、前述のジアミノベンジジン（Ｄ　Ａ　Ｂ　）溶液を プローブインキュベーション溶液へ直接添加し、該プロットをこの混合物中で５ 分間インキュベートし次いでＴ　−ＴＢＳで洗浄し：第２のプロットについては 、該プロットをプローブインキュベーション溶液から取り出し、前もって洗浄す ることなくＤＡＢ溶液に浸し、ＤＡＢ溶液中で５分間インキュベートし、モして Ｔ−Ｔ）３Ｓで洗い；第３のプロットについては、該プロットをＴ　−ＴＢＳで ５分間洗い、ＤＡＢ溶液に５分間浸し、そして丁−ＴＢＳで洗浄した。

３つのプロットの各々について、α−２インターフエロンの位置に茶色が現れた 。第２と第３のプロットの色のレベルは同等であり；第１のプロットの色のレベ ルは他のプロットのそれより劣り、そして第１のプロットはいくらかバックグラ ウンド染色を示しな。

この例は、フィルター膜上のタンパク質の位置が最小限の数のインキュベーショ ンおよび洗浄で容易に決定され得るということを証明する０発色に要する全時間 は、ブロッキングＭｆｆｌ液とのインキュベーションを含み、１，５〜２．５時 間程度である。比較のため、フィルター膜を発色するための現存の技術、例えば 上記のにｅｙｓｅｎらの技術を使ってこの例のプロットを発色した場合、全発色 時間は２．５時間よりも多いだろう（ブロッキング緩樹液との０．５時間のイン キュベーション、結合プローブとの１時間のインキュベーション、標識プローブ との０．５時間のインキュベニジョン、およびインキュベーション間の５分間の 洗浄と仮定する）、そして全プロセスは明らかにプロットの有意な多くの操作を 含むだろう。

医−１ この例は、ドツトプロットまたは他のタンパク質吸着マトリックスを発色させる ための迅速な最少限の段階の技術を説明するものである。

例２の５ｃｂｌｅｉｅｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌドツトプロット装置を使っ て、６Ｘ１０’ユニツトのα−２インターフエロンを１枚のニトロセルロースＰ 紙にトランスファーすることによりドツトプロットを調製した。該プロットを３ ％ＢＳＡブロッキング緩衝液で５分間ブロックし、そしてＴ　−ＴＢＳで５分間 洗浄した０次いで該プロットをα−２インターフエロンに対するマウスのモノク ローナル抗体ＮＫ　２０　：　１０００）およびペルオキシダーゼが結合したヤ ギの抗マウスＩ　ｇＧ（１：　１００）の混合物と共に９分間インキュベートし た。より高い抗体濃度は、発色強度の有意な減少なしにインキュベーション時間 を短縮させた。所望であれば、インキュベーション時間を短縮するために、より 高いインキュベーション温度そして／またはより高い抗体濃度およびより高いイ ンキュベーション温度の組み合わせを使用することができる。

抗体とのインキュベーションの後、プロットをインキュベーション溶液から取り 出しそして前述のＤＡＢ溶液に１分間浸した。プロット上のα−２インターフエ ロンの位置に茶色が現れた。

この例により例証されるように、洗浄段階を省きそしてインキュベーション段階 を合併することにより、ドツトプロットおよび他のタンパク質吸着マトリックス を２０分程度またはそれより少ない時間内に発色させることができる。このよう に迅速な免疫染色は、迅速な検出および測定を必要とする診断および他の適用に おいて特に価値あるものである０例えば、前記の技術およびディツプスティック の形のタンパク質吸着マトリックスを使って、溶液試料を該ディツプスティック へ付けそして前述のようにして該ディツプスティックを発色せしめることにより 、溶液中の特定のタンパク質の存否を迅速に且つ簡単に決定することができる。

溶液中の特定のタンパク質の定量は、例えば比色計を使って、発色したディツプ スティックの色の強度を測定することにより実施され得る。

第−」−」」 １１　夏二五１　色 ペルオキシダーゼ　ジアミノベンジジン　基ペルオキシダーゼ　アミノエチルカ ルバゾール　赤ペルオキシダーゼ　りロロナフトール　紫ペルオキシダーゼ　ジ アミノベンジジン／ＣｏＣ１□　黒ニトロブルーテトラゾリウム） β−ガラクトシダーゼ　Ｘ−ｇａｌ　青緑ダーゼ 国際調査報告

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．複数のタンパク質、タンパク質断片、糖タンパク質、リポタンパク質または それらの混合物がトランスファーされたタンパク質吸着マトリックスを発色せし める方法であって、（８）該マトリックスを第一の結合プローブ（これはラベル 化されておらず、そして１つまたは複数のタンパク質、タンパク質断片、糖タン パク質、またはリボタンパク質と結合する）および第二の結合プローブ（これは ラベル化されておらず、そして別の１つまたは複数のタンパク質、タンパク質断 片、糖タンパク質、またはリボタンパク質と結合する）と共にインキュベートす る段階； （ｂ）該マトリックスを洗浄する段階；（ｃ）該マトリックスを第一および第二 の標識プローブと共にインキュベートし、第一の標識プローブは特異的に第一の 結合プローブと結合しそして第二の標識プローブは特異的に第二の結合プローブ と結合する段階（第一の標識プローブは第一の酵素でラベル化されておりそして 第二の標識プローブは第二の酵素でラベル化されている）；（ｄ）該マトリック スを洗浄する段階；（ｅ）第一の酵素の存在下で第一の色を呈する第一のマーカ ー物質を生成する第一の基質とともに該マトリックスをインキュベートすること により、該マトリックス上の第一の標識プローブの位置をマークする段階； （ｆ）該マトリックスを洗浄する段階；および（ｇ）第二の酵素の存在下で第二 の色を呈する第二のマーカー物質を生成する第二の基質とともに該マトリックス をインキュベートすることにより、該マトリックス上め第二の標識プローブの位 置をマークする段階（第一の色と第二の色は異なる）、 を含んで成る方法。
2. ２．洗浄段階（ｂ）が省略される、請求項１に記載の方法。
3. ３．段階（ａ）および（ｃ）が同時に行われる、請求項２に記載の方法。
4. ４．洗浄段階（ｆ）が省略される、請求項１に記載の方法。
5. ５．段階（ｅ）および（ｇ）が同時に行われる、請求項４に記載の方法。
6. ６．洗浄段階（ｈ）および（ｆ）が省略される、請求項１に記載の方法。
7. ７．段階（ａ）および（ｃ）が同時に行われる、請求項６に記載の方法。
8. ８．段階（ｅ）および（ｇ）が同時に行われる、請求項６に記載の方法。
9. ９．段階（ａ）および（ｃ）が同時に行われそして段階（ｅ）および（ｇ）が同 時に行われる、請求項６に記載の方法。
10. １０．洗浄段階（ｂ），（ｄ）および（ｆ）が省略される、請求項１に記載の方 法。
11. １１．段階（ａ）および（ｃ）が同時に行われる、請求項１０に記載の方法。
12. １２．段階（ｅ）および（ｇ）が同時に行われる、請求項１０に記載の方法。
13. １３．段階（ａ）および（ｃ）が同時に行われそして段階（ｅ）および（ｇ）が 同時に行われる、請求項１０に記載の方法。
14. １４．段階（ａ），（ｃ），（ｅ）および（ｇ）が同時に行われる、請求項１０ に記載の方法。
15. １５．段階（ｇ）の後に、該マトリックスから結合プローブおよび標識プローブ を溶出させそして該マトリックスを少なくとも１つの付加的な結合プローブ、標 識プローブおよび基質と共にインキュベートする付加的段階を含む、請求項１に 記載の方法。
16. １６．複数のタンパク質、タンパク質断片、糖タンパク質、リボタンパク質また はそれらの混合物がトランスファーされたタンパク質吸着マトリックスを発色せ しめる方法であって、（ａ）該マトリックスを第一のプローブ（これは、第一の 酵素でラベル化されており、そして１つまたは複数のタンパク質、タンパク質断 片、糖タンパク質、またはリボタンパク質と結合する）および第二のプローブ（ これは、第二の酵素でラベル化されており、そして別の１つまたは複数のタンパ ク質、タンパク質断片、糖タンパク質、またはリボタンパク質と結合する）と共 にインキュベートする段階；（ｂ）該マトリックスを洗浄する段階；（ｃ）第一 の酵素の存在下で第一の色を呈する第一のマーカー物質を生成する第一の基質と ともに該マトリックスをインキュベートすることにより、該マトリックス上の第 一のプローブの位置をマークする段階； （ｄ）該マトリックスを洗浄する段階；および（ｅ）第二の酵素の存在下で第二 の色を呈する第二のマーカー物質を生成する第二の基質とともに該マトリックス をインキュベートすることにより、該マトリックス上の第二のプローブの位置を マークする段階（第一の色と第二の色は異なる）、を含んで成る方法。
17. １７．洗浄段階（ｄ）が省略される、請求項１６に記載の方法。
18. １８．段階（ｃ）および（ｅ）が同時に行われる、請求項１７に記載の方法。
19. １９．洗浄段階（ｂ）および（ｄ）が省略される、請求項１６に記載の方法。
20. ２０．段階（ｃ）および（ｅ）が同時に行われる、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．段階（ａ），（ｃ）および（ｅ）が同時に行われる、請求項１９に記載の 方法。
22. ２２．段階（ｅ）の後に、該マトリックスから第一および第二のプローブを溶出 させそして該マトリックスを少なくとも１つの付加的な結合プローブ、標識プロ ーブおよび基質と共にインキュベートする付加的段階を含む、請求項１６に記載 の方法。
23. ２３．タンパク質含有溶液がトランスファーされたタンパク質吸着マトリックス を発色せしめる方法であって、（ａ）該マトリックスを、結合プローブ（これは 、ラベル化されておらず、そして該タンパク質含有溶液の１つまたは複数の成分 と結合する）を含む溶液と共にインキュベートする段階； （ｂ）該マトリックスを洗浄する段階；（ｃ）該結合プローブと特異的に結合し そして酵素でラベル化されている標識プローブを含む溶液と共に該マトリックス をインキュベートする段階；および （ｄ）非結合の標識プローブを除去するために該マトリックスを洗浄することな く、該酵素の存在下で色のついたマーカー物質を生成する基質と共に該マトリッ クスをインキュベートすることにより、該マトリックス上の標識プローブの位置 をマークする段階、 を含んで成る方法。
24. ２４．洗浄段階（ｂ）が省略される、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．段階（ａ）および（ｃ）が同時に行われる、請求項２４に記載の方法。
26. ２６．段階（ｄ）の前に該標識プローブを含む溶液から該マトリックスを取り出 す、請求項２４に記載の方法。
27. ２７．段階（ｄ）の前に該標識プローブを含む溶液から該マトリックスを取り出 す、請求項２５に記載の方法。
28. ２８．タンパク質含有溶液がトランスファーされたタンパク質吸着マトリックス を発色せしめる方法であって、（ａ）酵素でラベル化されておりそして該タンパ ク質含有溶液の１つまたは複数の成分と結合するプローブを含む溶液と共に該マ トリックスをインキュベートする段階；および（ｂ）非結合のプローブを除去す るために該マトリックスを洗浄することなく、該酵素の存在下で色のついたマー カー物質を生成する基質と共に該マトリックスをインキュベートすることにより 、該マトリックス上のプローブの位置をマークする段階、 を含んで成る方法。
29. ２９．段階（ｂ）の前に該プローブを含む溶液から前記マトリックスを取り出す 、請求項２８に記載の方法。