JPH01502131A - エバネッセント波背景螢光／吸光度の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エバネンセント波背景螢光／吸光度の検出発明の背景 発明の分野 本発明はバイオリアクタ（生物反応器）等における生物学的な培養及び醗酵媒質 の成る光学的特性の検出と測定のための方法と装置、特に、非連続相が存在して いるところで連続相の螢光及び／或いは吸光度の測定に関するものである。

関連技術の詳述 細胞内にあるＮＡＤＨ或いはＮＡＤＰＨの螢光は培養媒質中の細胞濃度のインデ ィケータ（指示体）として働くのと同様に培養中の細胞の代謝状態の良好なイン ディケータであることが示されてきた。いくつかの論文は微生物及び酵母の両方 の培養を応用したこの種のインサイチュ−（現場）測定の価値を証明している。

例えばダブリス・ビー・アーミガー（Ｗ、Ｂ、Ａｒｍｉｇｅｒ）等による「培養 螢光を用いて太くエシエリヒア・コーリＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を 産するフェフドーバッチ（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）　醗酵の分析と制御」バイオテ クノロジー会報８４．ワシントン・ディーシー　１９８４を参照せよ。これらの 測定を実行するための装置はペンシルバニア州のマルベルン（Ｍａｌｖｅｒｎ） にあるバイオケミ・テクノロジー・インコーポレーションからのｒ　Ｆｌｕｃｏ ｒｏＭｅａｓｕｒｅｊ（商標）システムとして入力可能である。

経済的見地から、産業上重要な培養におけるアルコールづけされた糖みつ或いは 穀物のような複雑な栄養物をより低価格で使用することは有益であろう。しかし ながら、これらは付加的な背景螢光をもたらす。もし媒質が培養中に変化しない 螢光成分を含んでいるなら、背景（バンクグランド）補正はゼロ点での示度数を すべてのあとの示度数から引くことにより簡単になされる。媒質の螢光が細胞に よる使用によって変位する場合あるいは細胞が競合螢光を産する場合、背景での 変化をオンラインで補正することはより難しくなる。これは１続きのサンプルを 用い、細胞を除去し、媒質の螢光を測定することによって、バッチ培養に対して なされることができる。連続的な培養の場合あるいは培養中に栄養物を段階的に 加える場合には背景補正はより難しいものである。

螢光媒質に対し、どのくらい媒質の螢光が醗酵中に変化しているかの測定を可能 にし、その結果細胞の代謝状態及び成長率に関して測定をなすことができるとい うことは有益であろう。必要とされることは細胞螢光を可溶物質から有効に分離 する手段である。

醸酵あるいは組織培養のための光学センサは細胞内物質及び条件に関する情報を 与えることが可能である。係る情報は現存するオンラインセンサ、温度、ペーハ ー、溶存酵素、オフガス分析よりもむしろ現実の細胞内情報に基づいたより精密 な制御を可能にするだろう。それは組換えＤＮＡ及び細胞融合技術から得られた 生産物のより良い規模拡大及び商品化をもたらすであろう。現在光学的な背景で の変化を補正するための容易な方法がないので光学センサは干渉しない媒質に対 して最良に作用する。

以下に述べる細胞内代謝に対する光学センサを用いた初期の研究は１９５７年か ら始まり、それは、パン屋のイースト（酵母）の螢光がＮＡＤＨのそれと同じで ありそして醗酵が不完全な酵母の螢光は懸濁液にエタノール或いはグルコースを 加えることにより高められるということをデュイセン（Ｄｕｙｓｅｎ）とアメッ ツ（Ａｍｅｓｚ）が観測した年である。後に培養螢光をインサイチュ−（その現 場）に測定することを可能にしそして連続培養における好気性／嫌気性の転換を 監視することができる器具をハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）とチャンス（Ｃｈａ ｎｃｅ）が造った。同様な装置を用いることによって、醗酵槽上に設けられた螢 光測定器が細胞内ＮＡＤＨの変化を測定できそしてプロセス制御に有益となるで あろうということをハンフレイ（Ｂｕｍｐｈｒｅｙ）と協力者及びその他の人々 は開示した。ザブリスキー（Ｚａｂｒｉｓｋｉｅ）とハンフレイ（Ｈｕａ＋ｐｂ ｒｅｙ）は培養螢光の対数と細胞濃度の対数との間の直線的（リニヤな）関係を 開示した。リストロフィ（Ｒｉｓｔｒｏｐｈ）７Ｘ；ｆ−ｘ−−≦４　’Ｊ　Ｚ 　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）の成長間の関係を研究した。

醗酵における培養螢光により測定された細胞内ＮＡＤＨでの濃度は細胞の数、各 細胞内のエネルギー準位、及び代謝作用のレベルの関数であるということをこれ らの研究は開示した。これらの研究から得られた数学式は次のとおりである。

Ｆ（ｔ）　＝　（Ｙ　ｔ／ｘ　（１＋ｍ（ｔ）））　×（ｔ）　＋Ｅ（ｔ）Ｘ（ ｔ）は細胞濃度である。角力フコ中の項は螢光生産物であり、それはその種の有 機体の特質である不変成分Ｙｆ７Ｘと、代謝作用のレベルにおける変化に応じて 変化する可変成分ｍ（ｔ）とからなっている。最後の項Ｅ（ｔ）は、これは本発 明が主にかかわっているのであるが、環境あるいは背景の螢光である。明らかな ように、もしＥ（ｔ）が醗酵中に変動するなら、その時測定された総体的な螢光 から細胞についての情報を得ることは難しく、もしそうでないなら不可能である 。連続的なあるいはバンチフェフドされた醗酵あるいは細胞培養は、その問題を 悪化させるだけである。それらの技術において、付加的な変数は濃度に関する情 報に対応することな（取り入れられる。

Ｅ（ｔ）が低いところの、或いはＥ（ｔ）のための補正が経験的になされなけれ ばならなかったところの合成媒質をすべの公開された研究のほとんどが使用して いた。商品化のために醗酵および細胞培養を増大するとき、経済的要因によって 糖みつ或いは胎児牛の漿液のような自然の栄養物、−そしてそれらは自然の螢光 を有し従って背景値の一因となるのだか−、それらの使用するであろう。背景の 補正に用いたいくつかの仮定をチェックするとき、例えば糖みつの背景螢光及び 酵母細胞の螢光は直線的に付加しないという徴候を見出した。オンラインでリア ルタイムに媒質螢光の背景を測定するための方法の必要性、すなわち醗酵或いは 培養が行われているときに検出された変数を連続的に監視する１つのセンサ或い はセンサ類を用いる方法の必要性をこのことは指摘している。

媒質からの細胞を物理的に分離することなしに、媒質を螢光させ、同時に細胞を 螢光させているような方法が必要とされているということをこのことは意味して いる。本発明に従えば、エバネッセント波現象がこの必要性に応じるために用い られている。

光尻凶要赦 光ビームが異なった屈折率を有する２つの光学的な透明媒質間の非反射境界面か ら全部反射されるとき、第１図に示すようなエバネッセント波現象が存在する。

光ビーム１１は反射鏡表面と異なるこの種の表面から全部反射され、それが例え ば水成媒質のような密度の小さい媒質１２の中へ波長の約半分を通すかのように 作用する。参照番号１５は光ビーム１１の一部であり密度の小さい媒質１５内の エバネ７セント波である。参照番号１６は距離を示す測定矢印であり光ビーム１ １の１つの波長である。

もし反射鏡表面から反射されるのならそうなるであろうところかられずかに離れ たところに反射ビームが配置されているということを第１図及び第２図は図式的 に示している。この配置は実験的に示され、それはエバネフセント波が存在する ことの証拠の１つである。光ビームのこの部分は表面と平行な定常波の多くの特 質を有している。第３図は表面からの距離とともに強度がどのように減少するか を示している。

第３図において、Ｎは入射波、Ｒは反射波、θは臨界角θ。より大きい入射角で ある。Ｚはより密度の大きい媒質との界面から測定されたより密度の小さい媒質 における距離軸である。Ｅｏはより密度の小さい媒質における０の深度での光の 電界成分の初期の大きさである。ｄｐは透過の深度であり、表面でのその値ｅ　 −ｒを下げるような電界が必要とした距離として規定されている。ｄｐＯ値はよ り密度がある媒質における波長に直接に関係し、入射角に反比例し２つの媒質の 屈折率の割合に達している。エバネ７セント波の最大の強度は表面で生じ、表面 からの距離とともに指数的に減少する。

それは特定の色を有する物質により吸収され、そしてもしその物質が螢光性であ るなら螢光を発するようにその物質を励起する。関係する３４０　ｎｍ波長では 、このエバネッセント波により１平方センチメートルの範囲を超えてスイープさ れるリットルで表した体積は１．７　Ｘｌ０−”リットルであろう。２．５ω長 で２００　μｍ径の光ファイバの場合は、スイープされる体積は１．３　Ｘｌ０ −”　リンドルであろう。

本発明は光が異なった屈折率を有する２つの光学上の透明媒質間の界面から全体 的に反射されるとき、より密度の小さい媒質において形成されるエバネフセント 波の特性を用いることによって、この分離を成すことができる。波が水成層の中 へ波長の約１／３〜１／２だけ侵入するので、完全細胞は光導波管に隣接してエ バネッセント波によりスイープされた流動体の体積の中にあるということはあり そうもない、という私の観察を利用するものである。従って、本発明は細胞内螢 光あるいは溶液中の分子の螢光から干渉なしに媒質の螢光の測定を行うものであ る。

同じ概念が細胞及び特殊な物質から独立した媒質の光学的な吸光度を測定するた めに通用される。このことはデータを解析するために必要があるコンピュータプ ログラムの複雑さを大いに減少させ、従って醗酵及び組織培養の制御をより容易 になす。

バイオリアクタにおける細胞の通常の濃度では、前述したように、細胞がいかな る所定の時間でも流動体のこの小さい体積の中に存在するであろうということは ありえない。

また、例えば２８０　ｎｍの励起波長でエバネソセント波だけが液相の中に約１ １０〜１７０ｎｍ侵入するので、たとえ細胞がちょうど光導波管の表面上で静止 していても、細胞の体積（はとんどが細胞壁と細胞膜である）のわずかな部分も エバネ７セント波と相互に作用しないであろう。このように、光波と相互に作用 できる体積をエバネフセント波内のものに限定することによって、本発明は、媒 質の螢光或いは吸光度から細胞内の螢光或いは吸光度の分離を事実上証明してい る。

本発明の目的は、より広い多くの培養条件下での細胞内の光学的な測定のために は酵及び細胞培養の開発を容易にすることである。なぜならばオンラインでリア ルタイムで環境或いは背景の変化連続的に補正する方法が存在する。

さらに、本発明の目的は培養媒質の光学的効果からの細胞内容物の光学的効果の 分離を提供することである。

さらにまた本発明の目的は、細胞内容物における変化から干渉なしに培養媒質に おける変化を導くことである。

さらにまた本発明の目的は、培養媒質における変化から干渉なしに細胞内容物に おける変化を導くことである。

本発明のなお一層のさらなる目的は、細胞培養の螢光を監視する経費を減少する ことである。

本発明のなお一層のさらなる目的は、背景或いは環境螢光の分離、オフラインで 経験的な測定がなされる必要がないので、醗酵における媒質の拡大成いは変化の ための時間を短縮することである。単一の試験を行うことによって、培養条件は 媒質成分の特定の付加によって予備的な最適化がなされるであろう。

本発明のなお一層のさらなる目的は、せん断力あるいは他の機械的または化学的 原因によるものであるかには関係なく細胞破裂の程度に関する情報を提供するこ とである。

本発明に従えば、一体化された細胞に対するスターリング力（攪拌力）の効果は オンラインでリアルタイムで測定され、データがその後に分析されたときの操作 後よりもむしろ醗酵操作中に補正をなすことができる。

本発明のなお一層のさらなる目的は、他の非螢光性細胞内物質を導くための光学 吸光度法の利用を可能にし、その結果背景を補正する能力は連続的な二重ビーム の分光光度針と同等のものとなる。

本発明のなお一層のさらなる目的は、媒質における光学的に区別できる物質の特 殊な変化を導くために改良された能力を通して培養媒質における個々の栄養物の 濃度をより良く制御することである。

本発明のなお一層のさらなる目的は、醗酵及びＭｉ織培養の生産物を大いに改良 し、規模拡大の時間と経費を滅じ、細胞内の代謝状態に基づいたより正確な制御 を提供し、より能率的な醗酵及び組織培養技術を通して新しい組換えＤＮＡ及び 細胞融合技術の商品化を促進することである。

型皿■皿傘屋説所 第１図はエバネッセント波現象を示す略図であり、光ビーム１１は光ファイバの ような導波管１３を通り経路を左から右へ横切っている。

第２図は第１図の円形部分２の拡大図である。

第３図は２つの媒質間の界面からの距離に従うエバネッセント波の強度の変化を 示す略図である。

第４図は本発明の１つの変化の横断正面図の部分略図である。

第５図は第４図に示された実施例の横断側面図であり、第４図の横断線５−５に 沿って切断した部分を右から見ている。

第６図は本発明の他の実施例を示す部分略図である。

第７図は第６図に示された実施例の横断側面図であり、第６図の線７−７に沿っ て切断した部分を右から見ている。

第８図は本発明のの好適実施例を示す横断正面図の部分略図であり、光導波管は 平面板１３１６であり、バリア１３１２は液体を導波管の一端に閉じ込めている 。

第９図は第８図の線９に沿って取り出されたディスク１３２８の正面図である。

第１０図は第８図に示された実施例の横断側面図であり、第８図の横断線１０− １０に沿って切断した部分を右から見ている。

第１１図は第８図の領域１１の拡大図である。

第１２図は第８図に示された実施例の略図であり、光線の経路及びデータ処理の 段階を示している。

第１３図は第８図のエレメント１３３１の中に含まれている設計の代わりの実施 例の光源と検出器ハウジングの中味の略図である。

第１４図は第１３図に示された実施例の部分図であり、第１３図の′ａ１４に沿 って取り出された部分を右から見ている。

詳１じ口先吸 第４．５図に示された本発明の実施例は、光のエバネソセント波が溶液の螢光を 励起するためにその中で使用される光ファイバ４４を取り囲む金属ハウジング４ １からなる軽量棒４０を液体中に浸漬することにより、特定の物質を含んだ溶液 の背景螢光を測定する比較的簡単な手段を提供するものである。ハウジング４１ は、チャンバ４７の輪郭を定め、そのチャンバ４７の中をテストされるための溶 液がハウジング４１内の開口４６を通って流れ込む。

光ファイバ４４のチャンバ４７内にある部分では、不透明外装４２と透明クラフ ト４３は除去されており、ファイバ４４をチャンバ４７内の溶液中に直接さらし ている。

ファイバ４４を照射するため、可視光又は不可視光の光源例えば、白熱ランプ、 レーザ等の光源１３０１、励起ビームレンズ１３０２、励起ビームフィルタ１３ ０３等が第４図に示す如く配設されている。

光源１３０１からの発光は、レンズ１３０２を通り、ここで平行とされ、次にフ ィルタ１３０３を通り、ここで望ましい波長の（矢印の破線で図式的に描かれた ）単色の励起ビーム１３２６に濾過され、プレート１３４０内の開口を通過する 。

励起ビーム１３２６は、励起ビーム１３２６で表示される波長光を、励起発光ビ ームレンズ１３５８へ反射するために設けられたグイクロインクミラー１３４９ に達する。

ここで、ビーム１３２６は、集束され、光ファイバ４４の基端から直接入射し、 その光ファイバ４４の基端は必要ならば金属ハウジング４１から延設してもよい 。上述した如く、励起ビーム１３２６は光フアイバ４４内を末端まで伝播し、例 えば、黒シリコンラバーからなる光トラップ４５に達する。

励起ビーム１３２６のエバネセント波部は、光ファイバ４４を下方へ伝播し、フ ァイバ４４に極めて接近した（すなわち上述した如り１７２〜１／３の波長内で ）チャンバ４７内の溶液分子と出合い、できる限り溶液が螢光を発するように励 起する。

係る螢光は、光フアイバ４４内に入り基端まで発光ビーム１３２７として伝播し 、そこで、光ファイバ４４を出て、励起発光ビームレンズ１３５８に達示集束す る。次に、ビーム１３２７は、グイクロインクミラー１３４９を通過し、そして それは測定される溶液の螢光によって発光された波長光を通過するよう形成され ている。

発光ビームは、そのとき例えばカウンティングモードの倍増型光電管の如き電子 検出システム１３２３に衝突する。

検出システム１３２３は、フィルタ又は、モノクロメータがそこに設けられてい るため、発光光の波長に選択的に応答する。電子検出システム１３２３は、ロッ クインレシオアンプ１３４４へ送る信号を発する。基準検出器１３５０２、励起 ビーム１３２６の強度を検出すると共にロックインレシオアンプ１３４４へ送る 信号を発し、そこでは２つの信号は、励起ビーム１３２６０強度変化を補うよう に従来どおりの処理が行われる。

ロックインレシオアンプ１３４４からの信号は、アナログ−デジタルコンバータ １３４５に転送され、そこで、デジタル表示パネル又はシグナルプロセッサ１３ ４６へ加えられる信号を発生する。望ましくは（その溶液とその中に特定の物質 の入っている）バルク螢光を読み取る公知装置からの付加的デジタル信号１３５ ２が発生され、同様に表示パネルやプロセッサに送られる。信号１３５２は１例 えば商標　（ＦＬｕｏｒｏｍｅａｓｕｒｅ）バイオケミテクノロジ社製（マルベ ルン・ペンシルバニア州）の螢光測定器から発せられる。信号１３４５のデータ が信号１３５２のデータから減じられた時、その結果のデータは部材１３５１へ 送られ、溶質の螢光の変動がバルク螢光から減じられるので、その特定の物質の 螢光を表すことになる。

第６．７図は、他の実施例を示すもので、一対の開ロア２．７３を有したチャン バ６７を形成するハウジング６１内に備えられた光ファイバ６２を利用するもの である。

本発明の光学測定の対象となるスラリー（泥状流動体）は、入ロア２から導入さ れ、出ロア３から排出される。好ましくは、チャンバ６７は、流れが層流となる よう設計されることがよい。

前述した、第４，５図の実施例の如く、光ａ１３０１からの光は、レンズ１３０ ２、フィルタ１３０３を通り、光ファイバ６２の終端に導かれる。しかしながら 、光ファイバ６２を通ってまっすぐに伝播する光に関係したエバネセント波を強 化するために、中央の閉じたＯ型の開口を有した板１３４０Ａが円形の切欠きを 有したものよりもむしろ使用される。これは、軸に沿って光ファイバ６２に入射 する光を阻止する。

この構成において、基準検出器１３５０は、励起ビーム１３２６により搬送され る光より、光源１３０１と異なった光路に沿って配設されている。これは、光源 の強度変化を検出でき、ロックインレシオアンプ１３４４に従来の如く供給でき るようにするためである。

光ファイバ６２の末端では、電子検出システム１３２３が配置されており、内部 を伝播して来る光を受信する。検出システム１３２３は、発光ビーム１３２６の 波長の光の強度を検出するように構成されている。その場合、細胞の或いは他の 粒子状の物質から遊離している溶液中の溶質による吸光度を測定するに有益な信 号を発する。吸光度情報は、監視される溶質の濃度に関連するであろうし、また 、有益なデータを提供する他の吸光度の示度数から適当に減じるであろう背景数 であるかも知れない。

上述の代わりに、検出システム１３２３は、溶質により螢光として発光された発 光の波長を検出するために適当なフィルタ又はモノクロメータとともに組立てら れてもよく、その結果結果として生じたデータは第４，５図に示された発明の実 施例によって発生されたものと類似する。

前述した実施例同様、検出システム１３２３からの信号は、ロックインレシオア ンプ１３４４に供給され、それから表示パネル又はプロセッサ１３４６へ直接出 力され、その出力は、図示の如く、例えばチャートレコーダ１３５３へ出力され る。

エバネセント波現像を使用することによって、本発明の実施例１よ、第８図〜第 １１図に示されように、事実上同時読み取りを行うために迅速に代わる連続態様 で吸光度と螢光の双方の測定が可能である。導波管としての平面板１３１６に関 してはら、検出器被覆体１３３２内に収納された装置は、容器１３１２内の含有 物の種々の成分の瞬間的な濃度を測定することを助ける数個の変数をリアルタイ ムで測定するために或いはリアクタ酩酵容器１３１２内で使用されるように特に 構成されている。

検出器被覆体１３３２は、リアクタ容器１３１２の壁から延設された公知のパイ プ状取付ロ１３６２内に配設されている。取付口１３６２の末端はグロメット１ ３３３と係合するようにねじきられており、該グロメットは被覆体１３３２を取 付口１３６２に取りつけそれによってリアクタ器壁１３１２に固定する。

取付口１３６２の長さと検出器ハウジング１３３２が反応混合器１３１４内へ器 壁１３１２を越えて貫入することが望ましい深さとにより、ゴム状の０−リング １３１１は、３つの０−リング溝１３６１のいずれかにはさまれ、ハウジング１ ３３２の保持スリーブ１３５４を取付ロ１３６２内で水封密封する。

螺子のきられた導波管板取付スリーブ１３３６は、保持スリーブ１３５４と係合 され、導波管板１３１６を所定位置に堅固に保持する。数種の長さの中から選択 された一つの長さを有するインサート１３３５は、導波管板１３１６が器壁１３ １２を越えて反応混合器１３１４内へ所定の距離を伸ばすように導波管板取付ス リーブ１３３６を延長する。

螢光囲い１３０８は、器壁１３１２から外方へ延設されており、インサート１３ ３５と螺合している。前述の要素中には、光フアイバエレメント１３０５，１３ １７．１３１９と１３２０が含まれ、該エレメントは、導波管板１３１６へ向か って或いはそこから光を伝達する。光フアイバエレメント１３０５．１３１７． １３１９．１３２０は、螢光囲いカバーリティナーベゼル１３０９によって所定 位置に保持された螢光囲いカバー１３０７を通過する。

光源１３０１、レンズ１３０２、フィルタ１３０３とアパーチャ１３４０は、− ｉに前述した如くである。励起ビーム光チョッパ１３２５は、第１２図に図式的 に、第８図に概略的に示されており、収束された励起ビーム１３２６を通る光路 でエバネッセント波励起ファイバ光１３０５とファイバオプティック１３２０を 交互に連続して干渉している。第９図により詳示する如く、励起ビームライトチ ョッパ１３２５は、半円ミラー１３２９の載置されたディスク１３２８を備えて おり、該ディスク１３２８の他の半分には、励起ビーム１３２６を光フアイバ１ ３２０方向へ通過させるに十分な広さの開口１３４２を有している。

チョッパディスク１３２８は軸１３３ｏにより回転される。ディスク１３２８が 回転すると、励起ビーム１３２６は二つのどちらかの光路に向がう。励起ビーム １３２６がミラー１３２９に投射された時、ビームは、光路１３２６Ａに沿って 、光ファイバ１３ｏ５に向かう。交互的に、ディスク１３２８が励起ビーム１３ ２６が開口１３４２に投射される位置へ回転する時、それは光ファイバ１３２ｏ の方向へ通過する。

光ファイバ１３０５は、密封され光もれのないハウジング１３３１から励起ビー ム１３２６Ａを螢光検出器囲い１３３２へ搬送する。光ファイバ１３０５は、フ レキシブルな透明クラフト１３０６とフレキシブルな不透明外装置３０４に完全 に被覆された数個の独立したファイバから典型的的に成り立っている。透明クラ フデング１３ｏ６の屈折率は、わずかに光ファイバ１３０５のそれより少ない。

グロメット１３３３を通過した後、光ファイバ１３ｏ５の個々の光ファイバは、 第１０図にく示す如く、広げられたマウンティングブロック１３５５を通る。光 フアイバマウンティングブロック１３５５は、約１４０　”Ｃの滅菌温度に耐え ることができるプラスチックの射出成型例えば、ポリヌルフォンが望ましい。

不透明な表面に沿っているプリズム１３１ｏに接続された光ファイバ１３０５の 個々独立のファイバは、ファイバの長手軸に直角に切断されている。マウンティ ングブロック１３５５は、プリズム１３１０の不透明表面に直角に光が入射する ようにファイバ束１３０５を保持している。平面板導波管１３１６と接触するプ リズムの側面に対する１３１０の不透明表面の角度は光ビーム１３２６Ａを平面 板導波管１３１６へ臨界角より大きな角度で導く角度である。

その結果光ビーム１３２６Ａは平面板導波管に閉じ込められ、導波管１３１６と 導波管と接触するアリクション媒体との界面でエバネソセント波を発生させるで あろう。

プリズム１３１０は、矩形で平面板導波管１３１６と同じ屈折率を有している。

光ファイバ１３０５からプリズム１３１０へ伝達する間の励起ビーム１３２６の 強度損失は、光ファイバ１３０５の直径よりも大きいプリズム１３１０の側部を 有することにより、また、光ファイバ１３０５とプリズム１３１０と等しい尿性 率を有した液体１３２４に被われた傾斜したプリズム１３１０の表面との間の過 渡的な界面を有することによって最小にされる。

プリズム１３１０の平坦な透明側は、平面板導波管１３１６の末端面にプリズム １３１０及び平面板導波管１３１６と同屈折率を有した透明接着剤を用いること により接合されている。プリズム１３１０の傾斜表面の実際の角度は、プリズム １３１０と平面板導波管１３１６に使用される物質の屈折率の関数である。平面 板導波管１３１６は、断面円形で、気泡がなく、歪みのない物質、例えば石英が 作られている。２つの平行面１３３７と１３３８は、光学的に高度に磨かれてお り、通常の製造公差内において真の平行である。平面板導波管１３１６の円筒状 側壁は、その直径よりも高さが極めて高い。平面板導波管１３１６は、側壁に沿 ってＰＴＦＥポリマー（例えばテフロン等）の不透明シール１３５６によって音 封されており、光の損失を阻止するとともに封止剤として作用する。平面板導波 管１３１６の前面１３３８は、非常に薄くて硬い透明な層、溶着ダイアモンド等 、例えばサーリン（Ｓｕｒｌｙｎ）　（デュポン社製）で被覆されている。導波 管コーティング１３１５の厚さは、エバネフセント波１３３９の媒体１３１４内 への浸透に何ら影響を及ぼさない。導波管コーティング１３１５は、媒体１３１ ４中の不純物や粒子物質１３１３により作られる細胞上の生成物の付着を防ぐこ とが望ましい。導波管コーティング１３１５は、また、平面板導波管１３１６の 前面１３３８へのかき傷等の損傷を防ぐ。

エバネソセント波１３３９は、平面板導波管１３１６内に励起ビーム１３２６が ２つの非鏡面１３３７と１３３８の間をそれぞれ繰り返し反射された時に発生す る。そのように発生したエバネッセント波１３３９は、平面板導波管１３１６の 前面１３３８を通って監視のもとて媒体１３１４内へ浸透する。上述した如く、 エバネソセント波は、監視下で媒体１３１４内へ励起ビーム１３２６の約半波長 までの距離しか浸透しない。媒体１３１４中に現れる胞体のような離散粒子物質 １３１３は、実質的にエバネンセント波１３３９には影響を与えない。

第８．１２図に示す如く、平面板導波管１３１６の反対側端にはその末端側１３ ３７に沿ってプリズム１３１０に類似したプリズム装２１３４１が備えられてい る。平面板導波管の厚さと、プリズム１３１０．１３４１１間の距離は投射光ビ ーム１３２６Ａが時間の積分数で屈折され、プリズム１３４１から出射するよう になされている。光ファイバ１３１７の個々のファイバの終端は、ファイバの長 軸に対し直角に切断されている。マウンティングブロック１３５５は、　ファイ バの長手軸がプリズム１３４１の不透明表面に直角となるようにファイバ束１３ １７を保持する。

それに代わる構造として、平面板導波管１３１６と、プリズム１３１０．１３４ １は単一ユニットとして組立られるかもしれない。更に、ここに図示された関係 に替えて、プリズム１３１０．１３４１の表面は、導波管１３１６０表面上に引 き上げられ、プリズムの斜面は、導波管の表面に凹設されてもよい。更に、他の 例として、導波管板の２つの正反対に対向する端部は斜めにし、プリズム１３１ ０゜１３４０の斜端と同機能を果たすのに役立つようにしてもよい。

光フアイバ１３１７０個々のファイバは、プリズム１３４１の斜面に接合されて おり、平面板導波管１３１６の屈折率に近い液体フィルム１３２４からトランジ ショナルインターフェースは、成り立っている。光ファイバ１３１７は、光フア イバマウンティングブロック１３５５を通り抜けその断面は円形となる。光ファ イバ１３１７は、次に、グロメッ）１３３３を通り抜は光源と検出器ハウジング １３３１に入る。第８図に示す如く、光ファイバ１３１７の直接光路内には、光 チヨツパアセンブリ１３１８が存在し、それは、励起光チョッパ１３２５に類似 した構成となっている。同方向における光チヨツパアセンブリ１３１８の隣では 、すべての非螢光を取り除く醗酵ビームフィルタ１３２１があり、電子検出シス テム１３２３上で発光ビーム１３２７を収線させる発光ビームレンズ１３２２に より導かれている。

第１２図は、第８図に示す本発明の実施例の光路を図式的に示すものである。光 源１３０１からの光ビーム１３２６は光が光ファイバ束１３０５．１３２０に適 当に接続されるようにレンズ１３０２で収束される。光ファイバや導波管に光を 接続するに際し、光ファイバや導波管の開口数（ＮＡ）に注意を払う必要がある 。開口数（ＮＡ）と、ファイバの直径、又はファイバ束又は、水晶導波管に対し てレンズ１３０２をマツチングすることは問題である。

ファイバクラツディングが導波管として作用するのを注意深く阻止しなければな らない。これは、クラッデングを不透明外装で被うことにより達成される。均一 な光の分配を得るため、レンズは、ファイバ又は導波管の入射面で光が一様にな るように制限しなければならない。光は、次に、スリット又は、ダイアフラムを 通過し、そこからチョッパ１３２５へ至る。

チョッパ１３２５は交互にさしはさんだり、励起光ビーム１３２６からミラー１ ３２９を取り除くことにより、光ビーム１３２６を２つの光路１３２６Ａと１３ ２６Ｂに分配する。

ビーム１３２６Ａはプリズム１３１０ヘファイバ束１３０５を通って導かれ、そ してそれは平面板導波管１３１６へ光ビームを適当に接続し、その結果導波管を 通る複数の内部反射により光ビームが案内される。エバネフセント波は、選択さ れた波長の光と相互に作用することのできる溶液成分により吸収される。エバネ ッセント波は、リアクション媒体１３１４内で浮遊した粒子１３１３と光学的に 相互作用せずあるいは螢光を励起しない。これらの螢光を発することができる溶 液成分は平面板導波管１３１６の表面で又は、表面近傍からそれらの螢光を発す る。

発光光の一部は、導波管に接合され、光路１３２７Ａを通ってチョッパ１３１８ へ伝送される。光ビーム１３２６Ｂは、ファイバ束１３２ｏを介して窓の働きを する平面板導波管１３３７の内表面へ伝送される。これは、光が表面に直角に突 き当たるので、光は直進し、平面板１３１６近くのバルク懸濁液を照明し、がく して溶液１３１４と螢光を発することができるその中で浮遊した粒子又は細胞１ ３１３の双方を螢光を発するように励起している。

発光した螢光ビーム１３２７Ｂの一部は平面板１３１６を通って戻り、ファイバ 束１３１９へ入り、チョッパ１３１８へ案内される。チョッパ１３１８は、シン クロナイザ１３４８を通りチョッパ１３２５と同期され、その結果チョッパ１３ ２５が光ビームを径路１３２６Ａ上に転じるとき、チョッパ１３１８は径路１３ ２７Ａを通る光をフィルタ１３２１、レンズ１３２２を通り検出器１３２３へ至 らす。チョッパ１３２５が径路１３２６Ｂ上に光ビームを転じるとき、チョッパ １３１８は径！１３２７Ｂを通る光をフィルタ１３２１とレンズ１３２２を通り 検出器１３２３へ至らす。

シンクロナイザ１３４８は、また、チョッパ位置とシグナルプロセス手順を同意 させるのにその結果シグナルプロセッサは例えばバルク螢光の測定に関するエバ ネンセント波螢光の測定のようにシグナルの発生モードを専有するようにシグナ ルを処理する。

検出器１３２３とシンクロナイザ１３４８からのシグナルは、例えばＡＣ−ＤＣ コンバータとリニアライザ１３４３に入力され、それからロックインレシオアン プ１３４４へ入力され、そしてそこではシグナルの振幅が基準検出器１３５０に より検出された励起ビームの振幅における変化に合わせて訂正され、次にアナロ グ−デジタルコンバータ１３４５に至り、その後デジタル表示又は、シグナルプ ロセッサ１３４６へ出力され、次にデジタルメモリ又は記憶装置１３４７へ出さ れる。

もし、フィルタ１３２１が発光された螢光波長を通過さするよう構成されている なら、本発明の装置は螢光を測定する。もしフィルタ１３２１が励起ビーム１３ ２６と同波長を通過させるよう構成されているなら、本装置は溶液１３１４の光 学的吸光度を測定する。

光学的吸光度でない螢光のみが測定されることを望む場合には、図示しないそれ に代わる実施例は第１３．１６図のチョッパ１３１８を省略してもよい。その結 果、光ビーム１３２７Ａは、フィルタ１３２１と検出器１３２３へ導かれるより むしろ単に捕捉される。ファイバ光１３１７は係る実施例において、省略され、 または、光トラップと置換してもよい。あるいはファイバ光１３１７は、それ自 身光トラップとして光を平面板導波管１３１６から離れて伝える。光ビーム１３ ２６Ｂにより励起されたバルク螢光と平面板導波管１３１６の表面でエバネ７セ ント波を発している光ビーム１３２６Ａにより励起された溶液螢光の双方とも、 光路１３２７Ｂを越えてフィルタ１３２１へ伝達される。フィルタ１３２１は、 唯、発光された螢光波長のみ通過させるよう選択される。

第１３図は他の実施例を示し、第８図の実施例のハウジング１３３１の中味の代 わりのハウジング１３６ｏの中身を代用している。この実施例は、低速の光ビー ムの遮断に適しており、例えば数ヘルツ（Ｈｅｒｔｚ）或いは１ヘルツの何分の １とういような場合である。第１３図中の矢印１４方向に示したチョッピング装 置は第１４図に示されている。

平面板１８２は、軸１８１に付加されており、該軸１８１は、減速クラッチ１８ ３に取付けられている。平面鏡１７１は板１８２に取りつけられている。

鏡１７１の取りつけられた板１８２は、第１３図に実線で示す位置或いはそうで なければ破線で示す位置の間を回動自在に軸支されている。ストッパ１７２は、 板１８２がそれに隣接するようにミラー１７１の移動を制限し、何度も正確に鏡 の位置を固定する固定点の如き働きをする。ミラー１７３は、同様にミラー１７ １と相反及び同期するように取りつけられ、−ｉに、第８図、１２図の実施例で 述べたのと同様である。

図示された要素のりスト ４０　軽量棒 ４１　螢光検出器金属ハウジング ４２　光ファイバネ透明外装 ４３　光ファイバ透明クラッデング ４６　ハウジング内の開口 ４７　ハウジング内のチャンバ ６５　外装 ６６　チャンバ内の液体媒質 １７１　鏡回動枠 １７２　ゴム緩衝ストツバ（移動制止）１７３　鏡 １８１　電気モータ軸 １８２　カウンターウェイト １８３　鏡の過トルク防止摩擦クラッチ１８４　低トルク可逆電気モータ １３０１　光源 １３０２　励起ビームレンズ １３０３　励起ビームフィルタ １３０４　典型的光ファイバの不透門外装置３０５　励起ファイバ光−エバネフ セント波１３０６　光ファイバの透明クランデング１３０７　螢光囲いカバー １３０８　螢光囲い １３０９　螢光囲いカバーリテーナベゼル１３１０　励起ビームプリズム １３１１　０−リング １３１２　リアクタ容器壁 １３１３　粒子物質 １３１４　リアクション媒体 １３１５　エバネッセント波ガイドコーティング１３１６　平面板エバネッセン ト波ガイド１３１７　発光ファイバ光−エバネソセント波１３１８　発光ビーム 光チョッパ １３１９　発光ファイバ光−直接波 １３２０　励起ファイバ光−直接波 １３２１　発光ビームフィルタ １３２２　発光ビームレンズ １３２３　１を予検出システム １３２４　プリズムと励起ファイバ光と発光ファイバ光−エバネ７セント波との 間の液体分離器 １３２５　励起ビーム光チョッパ １３２６　励起ビーム １３２７　発光ビーム １３２８　光チヨツパディスク（典型的形状）１３２９　光チョンパ鏡 １３３０　光チヨツパモータ軸 １３３１　光源及び検出器ハウジング １３３２　螢光／吸光度検出器囲い １３３３　グロメット １３３４　螢光検出器リテーナフランジ１３３５　導波管板の位置調整挿入面（ 種々のサイズの）１３３６　導波管のマウンティング用スリーブ１３３７　導波 管の末端側 １３３８　導波管の前端側 １３３９　エバネッセント波 １３４０　開口を有した板 １３４１　発光ビームプリズム １３４２　光チョッパディスクの開口 １３４３　ＡＣ／ＤＣコンバータとリニアライザ１３４４　ロンフィンレシオア ンプ １３４５　アナログ／デジタルコンバータ１３４６　デジタル表示パネル又はシ グナルプロセ、す１３４７　デジタル記憶装置 １３４８　チョッパシンクロナイザ １３４９　ダイクロイックミラー １３５０　基準検出器 １３５１　媒質螢光に修正された細胞螢光１３５２　バルク螢光検出装置からの デジタル化信号１３５３　ストリップチャートレコーダ １３５４　リテーナスリーブ １３５５　光フアイバ装着ブロック １３５６　導波管のふち部シール １３５８　発光−励起ビームレンズ １３６０　光源と検出器ハウジング １３６１　０−リング溝 １３６２　装着口 ４４〒噛シ＾１２１　ｌ誓ゴ量ロゴｒｌ　士巨中堂　を吐キ観２辻＄ま　ＩＱ／ ｌ　名の　９１轄十／７１　’Ｅ’Ｆ＋　Ｅヨ 補止吾の与しく翻訳又ノ従ＯＪ晋Ｌ　’ｌ；Ｆ　ｉｉ’ｔ　？ム矛１０’に宋力 ０）昭和６３年７月１４日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０　ＯＯ８Ｂ ２、発明の名称 エバネッセント波背景螢光／吸光度の検出３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　ペンシルバニア州１９１０３フィラデルフィア　スウィ ート　２７０６チエスナツト　ストリート　１９１９ 氏名　レビン　バーマン　ダブリュ 国籍　アメリカ合衆国 ４、代　理　人　郵便番号１０２　電話（０３）　２３８−００３１住所　東京 都千代田区麹町６丁目１番１８号１９８７年８月１４日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１　通二のように記述された私の発明によれば 、レターズパテント（特許証）により保護を望んでいるところの請求の範囲は下 記の通りです。

１、（ａ）光学的に検出可能な波長で螢光を発する成分からなる連続相と、 （ロ）前記光学的に検出可能な波長で螢光もまた発する成分からなる非連続相と からなるス、ラリ−の光学的な分析方法において、（ｉ）前記成分の開光を励起 する波長を有するエバネッセント波で同時に前記スラリーを光学的に励起する工 程と、（ｆｉ　）そこから生じる螢光の強度を検出する工程と、及びそれから （ｆｆｉ）螢光の前記検出された強度は前記連続相における前記成分の濃度と関 連し、その結果螢光の前記検出された強度は螢光もまた発する前記非連続相にお ける成分の濃度と独立してなる２、（ａ）光学的に検出可能な波長で螢光を発す る成分からなる連続相と、 （ロ）前記光学的に検出可能な前記波長で螢光もまた発する成分からなる非連続 相と からなるスラリーの光学的な分析方法において、（ｉ）前記成分の螢光を励起す る波長を有するエバネッセント波で同時に前記スラリーを光学的に励起する工程 と、（ｉｉ）そこから生じる螢光の強度を異なった時間であるが接近した時間で 検出する工程と、 （ｉｊ）非エバネフセント波でシステムを同時に照射する工程と、（ｉｖ）そこ から生じる螢光或いは吸光度の強度を検出する工程と、及びそれから （ｖ）２つの強度値間の相違を決定する工程と、及び（ｖｉ）前記相違は前記非 連続相における前記成分の濃度と関連し、その結果前記相違は螢光もまた発する 前記連続相における成分の濃度と独立してなる工程と からなる方法。

３、連続相はバイオリアクタ中の水成溶液からなり非連続相は生きている細胞か らなる請求の範囲第２項記載の方法。

４、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの螢光が測定される請求の範囲第３項記載の方法。

５、励起ビームは約３６６　ｎｍであり螢光は約４６０　ｎｍで測定される請求 の範囲第４項記載の方法。

６、本装置によって放射された光学的に検出可能な波長で光により励起或いは照 射されたとき螢光もまた発し或いは光を吸収する連続相を有するシステムの非連 続相の螢光或いは吸光度を決定する装置において、 （ａ）前記波長でエバネッセント波を有する連続相を励起する手段と、 （ト）連続相の励起から生じる螢光或いは吸光度の強度を測定する手段と、 （Ｃ）前記波長で非エバネッセント波を有するシステムを照射する手段と、 （向システムの照射から生じる螢光或いは吸光度の強度を測定する手段と、 （ｅ）前述の測定手段の１つによって発生した強度の大きさを前述の測定手段の 他のものによって発生した強度の大きさと比較し、それらの間の相違の表示を行 う手段と、その結果前記相違値は前記非連続相における前記成分の濃度と関連し 、そして前記値は螢光もまた発する前記連続相における成分の濃度から独立して なる装置。

７、さらに、 げ）測定手段（ｄ）を動作する前に前記エバネッセント波励起手段”（ａ）を非 動作にし、そして測定手段（ｂ）を動作する前に前記照射手段（Ｃ）を非動作に する手段と、 その結果測定手段（ｄ）は照射手段（Ｃ）によるシステムの照射の間のみ作動し 、そして測定手段（ロ）はエバネッセント波励起手段（ａ）を有する連続相の励 起の間のみ作動する請求の範囲第６項記載の装置。

８、さらに、 （−前記波長の光源と、 （ハ）前記光源から前記励起手段（ａ）と前記照射手段（Ｃ）へ交互に光を導く 手段と、 （ｉ）検出された前記波長の光の強度と関連する値を有する信号を発生する手段 と、 ０）システムから前記信号発生手段（ｉ）へ光を導く手段と、（ロ）光導出手段 口が前記励起手段（ａ）へ光を導いているとき、及び前記照射手段（Ｃ）へ光を 導いているときを検出し、光が励起手段（ａ）と前記測定手段（ｄ）へ導かれる ときは常に、及び光が照射手段（イ）へ導かれるときは常に、前記信号発生手段 （ｉ）から前記測定手段（ロ）へその代わりに信号を導く手段とからなる請求の 範囲第７項記載の装置。

９、励起手段（ａ）は少なくとも一部がクラツディングで被覆されていない光フ ァイバからなる請求の範囲第８項記載の装置。

１０、励起手段（ａ）は光学板からなる請求の範囲第８項記載の装置。

１１、本装置によって放射された光学的に検出可能な波長で光によって励起或い は照射されたときに螢光もまた発し或いは光を吸収する連続相を有するシステム の非連続相の螢光或いは吸光度を決定するための装置において、 （ａ）前記波長の光源と、 （ｂ）前記システムと接触する面を存する導波板と、（ロ）前記システムにおい てエバネッセント波を引き起こすために前記面に対して十分に傾斜した角度で前 記光源から前記導波板へ光を導き、その結果システムの第１状態の励起が引き起 こされる手段と、 （Ｃ）前記面に対しほぼ直角な角度で前記光源から前記導波板へ光を導き、その 結果システムの第２状態の励起が引き起こされる手段と、 （ｄ）前記光源から前記導出手段（ｂ）或いは前記導出手段（Ｃ）へ光を交互に 導くチョッパ手段と、 （ｅ）螢光時にシステムによって放射された波長の光を検出する手段と、 （０前記面に対しほぼ直角な角度で前記導波板から前記検出手段（ｅ）へ光を導 く手段と、 （６）前記面に対し傾斜した角度で前記導波板から前記検出手段お前記導出手段 （ｆ）或いは前記導出手段（栃から前記検出手段（ｅ）へ光を交互に導くチョッ パ手段と、 （：１）チョンバ手段（ｄ）をチョフバ手段（社）と同期する手段と、及び（ｊ ）第１状態の励起の間に得られた値と第２状態の励起の間に得られたそれを比較 し、前記値における相違に関連した出力を生じるために検出手段（ｅ）からの信 号を処理する手段とからなる装置。

１２、光を導く前記手段（ロ）、（Ｃ）、げ）及び（局はファイバ状光学部材で ある請求の範囲第１１項記載の装置。

１３、光を導く前記手段（Ｃ）及び（ｆ）は互いに一束の光ファイバからなる請 求の範囲第１２項記載の装置。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 暫く記述された私の発明でレターパテントによって保護を望み、クレームする所 は、 １．エバネッセント波で連続相を励起する工程と、その結果として得られる螢光 を検出する工程を備え、関係する波長で螢光を発し、または光を吸収する不連続 相の存在下に連続相（ｐｈａｓｅ）を有するスラリー（泥状流動体）の連続相の 螢光又は吸光度を検出する方法。 ２．エパネッセント波で連続相を励起する工程と、その結果として得られる螢光 又は吸光度を検出する工程と非エバネッセンス波でシステムを照射する工程と、 その結果として得られる螢光または吸光度を検出する工程と、２つの値の差を測 定する工程とを備え、 関係する波長で螢光を発し又は光を吸収する連続相を有するシステムの非連続相 の螢光又は吸光度を測定する方法。 ３．エバネッセント波で連続相を励起する手段と、その結果として得られる螢光 又は吸光度を検出する手段と、非エバネッセンス波でシステムを照射する手段と 、その結果の螢光又は吸光度を検出する手段と、２つの値の差を測定する手段と を備え、 関係する波長で光を吸収し螢光を発するところの連続相を有するシステムの非連 続相の螢光又は吸光度を測定する装置。 ４．連続してリアルタイムでそれぞれの工程を実行する手段を有する請求の範囲 第３項記載の装置。 ５．エバネッセント波で連続相を励起する手段はクラッディングの一部を除去さ れた光ファイバからなる請求の範囲第３項記載の装置。 ６．エバネッセント波で連続相を励起する手段は光学板かなる請求の範囲第３項 記載の装置。 ７．連続相はバイオリアクタであり非連続相は生きている細胞からなっている請 求の範囲第２項記載の方法。 ８．ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの螢光が測定される請求の範囲第７項記載の方法。 ９．励起ビームは約３６６ｎｍであり螢光は約４６０ｎｍで測定される請求の範 囲第８項記載の方法。