JPH01502190A

JPH01502190A - インフルエンザ菌用ワクチンおよび診断法

Info

Publication number: JPH01502190A
Application number: JP88501089A
Authority: JP
Inventors: デイチ，ロバート　エイ; ジロトニック，ガリー; グリーン，ブルース
Original assignee: アメリカン　サイアナミド　カンパニー
Priority date: 1986-12-31
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1989-08-03
Anticipated expiration: 2014-03-17
Also published as: KR890700030A; AU1154188A; JPH11146797A; ATE159170T1; CA1335655C; AU615429B2; DE3752131T2; JPH1057059A; EP0294469A1; DK482788D0; EP0294469B1; DE3752131D1; JP3066339B2; DK482788A; WO1988004932A1; JP2872254B2; JP2534529B2; JP3124753B2; JPS63502314A; JPH11253160A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】４４、請求の範囲第３６項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。

４５、請求の範囲第３８項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。

４６、請求の範囲第３９項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。

４７、請求の範囲第４０項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。

４８、請求の範囲第４１項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。

４９、請求の範囲第４２項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。

５０、請求の範囲第３５項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５１、請求の範囲第３６項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５２、請求の範囲第３８項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５３、請求の範囲第３９項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５４、請求の範囲第４０項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５５、請求の範囲第４１項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５６、請求の範囲第４２項に記載の組換えベクターを含有する微生物。

５７、ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８５４を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５０項に記載の細菌。

５８、ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８１５５を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５０項に記載の細菌。

５９、ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８６を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５０項に記載の細菌。

６０、ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８７を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５１項に記載の細菌。

６１、ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８５を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５１項に記載の細菌。

６２、有効量の請求の範囲第２０項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６３、有効量の請求の範囲第２１項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６４、有効量の請求の範囲第２２項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６５、有効量の請求の範囲第２３項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６６、有効量の請求の範囲第２４項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６７、有効量の請求の範囲第２５項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６８、有効量の請求の範囲第２６項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

６９、有効量の請求の範囲第２７項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対スるヒトの保護方法。

７０、有効量の請求の範囲第２８項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

７１、有効量の請求の範囲第２９項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能またトの保護方法。

７２．有効量の請求の範囲第３０項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

７３、有効量の請求の範囲第３１項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

７４、有効量の請求の範囲第３２項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

７５、有効量の請求の範囲第３３項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能へモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。

７６、ワクチン処決を皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または鼻腔内の投与経路を介して投与する請求の範囲第６２項に記載の方法。

７７、有効量のへモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザに対するヒトの保護方法。

７８、抗体がヘモフィルスインフルエンザＰＢＯＭＰ−１タンパク質の抗原性決定子に特異である請求の範囲第７７項に記載の方法。

７９、抗体がヘモフィルスインフルエンザＰＢＯＭＰ−２タンパク質の抗原性決定子に特異である請求の範囲第７７項に記載の方法。

８０、酵素結合免疫吸着剤検定、ラジオイムノアッセイ、ゲル拡散沈降反応検定、免疫拡散検定、凝集検定、螢光イムノアッセイ、プロティンＡイムノアッセイおび免疫電気泳動検定からなる群から選ばれる検定システムにおいて抗原として請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載のペプチドまたはタンパク質を用い、かついずれの反応も試料におけるヘモフィルスインフルエンザの存在を示す抗体とのいずれかの反応を検査することからなる組織または体液の試料におけるヘモフィルスインフルエンザの検査方法。

８１、ヌクレオチドハイブリダイゼーション検定においてプローブとして、第１１図に示されたヘモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に関連するペプチドまたはタンパク質またはそのフラグメントをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を用い、かついずれの反応も試料におけるヘモフィルスインフルエンの存在を示す該プローブとのいずれかの反応を検査することからなる組織または体液の試料におけるヘモフィルスインフルエンザの検査方法。

８２、ヌクレオチドハイブリダイゼーション検定においてプローブとして、第１５図に示されたヘモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に関連するペプチドまたはタンパク質またはそのフラグメントをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を用い、かついずれの反応も試料におけるヘモフィルスインフルエンの存在を示す該プローブとのいずれかの反応を検査することからなる組織または体液の試料におけるヘモフィルスインフルエンザの検査方法。

８３、ヌクレオチドハイブリダイゼーション検定がサザンプロット、ノーザンプロットおよびコロニープロットがら成る群から選ばれる請求の範囲第８１項または第８２項に記載の方法。

浄書（内容に変更なし）明　細　書インフルエンザ画用ワクチンおよび診断法１、発明の分野本発明は、インフルエンザ菌（Ｈａｅａ＋ｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の外膜と結合したタンパク質およびペプチドの組成物および製造方法に関するものである。特に、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１およびＰＲＯＭＰ−２を含む約１６００ダルトン分子量のｂ型および分類不可能な外膜タンパク質のクラスに関連したタンパク質およびペプチドの組成物および製造方法を目的とするものである。このタンパク質およびペプチドは、能動免疫法用および受動免疫法において使用される抗体の発生用のワクチン配合物中の免疫抗原としておよび診断法における薬剤として使用される。

このタンパク質およびペプチドは、インフルエンザ菌から新規な改良された精製法により得られるか、あるいは組換えＤＮＡ法または化学的な合成法により製造できる。また、本発明は、タンパク質およびペプチドに関連したＰＲＯＭＰ−１およびＰＲＯＭＰ−２の発現用に有用な、新規なりＮＡ配列およびベクターに関するものである。ヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーション法における試薬として使用される。

組換えＤＮＡ技術は、特異ＤＮＡ配列のＤＮＡベヒクル（ベクター）内への挿入を伴い宿主細胞中に複写し得る組換えＤＮＡ分子を形成する。一般的には、組換えＤＮＡ配列は受領ＤＮＡベヒクルと異質である。すなわち挿入ＤＮＡ配列とＤＮＡベクターは、遺伝子性情報を全く変換しない生物から誘導されるかあるいはＤＮＡ配列が完全にあるいは部分的に合成され得る。いくつかの組換えＤＮＡ分子の構造を可能にする一般的方法が開発されている。例えば、コーヘンおよびボイヤー（Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ）の米国特許第４，２３７．２２４号は、制限酵素での分裂のプロセスを用い公知の結紮の方法によりリゲージを結合する数組換えプラスミドの産生を記載している。これらの組換えプラスミドをついで転換により導入し組織借地にて生長した原核生物および真核生物細胞を含む単一細胞培養液に複写する。この特許に記載の技術の一般的適用性のため米国特許第４，２３７．２２４号をここに本明細に関連として取り入れる。

単一細胞生物中に組換えＤＮＡ分子を導入する他の方法は、コリンズおよびホーン（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈｏｈｎ）による米国特許第４，３０４．８６３号に記載されておりこれも関連として本明細書に取り入れる。この方法は、バクテリオファージベクター（コスミド）でのパーケージング／形質導入システムを利用する。

組換え遺伝子を５また、ワタシニアウィルス等のウィルス中にも導入する。組換えウィルスは、ウィルスで感染された細胞内へのプラスミドのトランスフェクションにより発生することができる。

組立てに使用する方法に関係なく、組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞と適合性でなければならない。すなわち宿主細胞に自律性複写できるかあるいは、宿主細胞染色体に安定に一体化されることができるかである。組換えＤＮＡ分子またはウィルス（例えばワクシニアウィルス組換体）はまた、所望の組換えＤＮＡ分子またはウィルスの選択を許めるマーカー作用を有すべきである。加えて、好ましい複写、転写および翻訳シグナルのすべてが正確に組換えＤＮＡ上に配列された場合、異質細胞は、バクテリア発現プラスミドの場合よくあることだが転換バクテリア細胞においてまたは、複写の真核源（ｏｒｉｇｉｎ）をもたらす組換えウィルスまたは組換えプラスミドで感染した任意の細胞系において適切に発現する。

異質遺伝子シグナルおよびプロセスエベントは、遺伝子発現の多くのレベル、例えば、ＤＮＡ転写およびメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）翻訳をコントロールする。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導くことによってｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に依存する。真核プロモーターのＤＮＡ配列は、原核プロモーターのものと異なる。さらにまた、真核プロモーターおよび付随遺伝子シグナルは、原核システムに認識されないかまたは作用せず、さらに原核プロモーターは、真核細胞に認識されず作用しない。

同様に原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なる適切な原核シグナルの存在に依存する。原核生物における効果的な翻訳は、ｔｔｒＲＮＡ上のシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）　（Ｓ　Ｄ　）配列と呼ばれるリポソーム結合部位を必要とする。この配列は、開始コドンの前に配置される、一般にはタンパク質のアミノ末端メチオニンをコード化するＡＵＧである、ｍＲＮＡの短かいヌクレオチド配列である。このＳＤ配列は、１６ＳｒＲＮＡ（リポソームＲＮＡ）の３′末端に相補性でありまたおそら＜　ｒＲＮＡで二重化する（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）ことによりリポソームに■ＲＮＡを結合するのを促進しリポソームを正確に配置する。遺伝子発現の最大化に対するレビューに関して、ロバーツおよびラウアー（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ａｎｄ　Ｌａｕｅｒ　１９７９　。

Ｍｅｔｈｓｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８　：　４７３　）参照のこと。

適当なシグナルが挿入され適切に配置された後でさえも、多くの他の因子は、原核生物における異質遺伝子の発現を複雑化する。このような因子の１つとしてエシェリキアコリ（Ｅ、　Ｃｏ１１　）および他の微生物における活性タンパク分解性システムの存在がある。このタンパク質退化システムは、選択的に「異常」または異質タンパク質を破壊するらしい。従って原核退化から微生物に発現される原核タンパク質を保護する手段の発展により多大な利用がもたらされる。ひとつの方策として、異質配列を原核遺伝子で相に（すなわち正確な読取り枠に）結紮するハイブリッド遺伝子を構成することがある。このハイブリッド遺伝子の発現は、融合タンパク質産生物（原核および異質アミノ酸配列のハイブリッドであるタンパク質）をもたらす。

クローン遺伝子の首尾よい発現は、効率的なりＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻訳および数例においてはタンパク質の翻訳後変性を必要とする。発現ベクターを好適な宿主における遺伝子を発現するためおよびタンパク質産生を増加するために用いられている。クローン遺伝子は、転写を必要の開始めることができるようコントロール可能な強力なプロモーターの次に配置される。細胞を高密度に成長することができ、ついでプロモーターを誘導して多数の転写を増加することができる。

これは効率的に翻訳される場合、高収率のタンパク質をもたらすであろう。このことは、異質タンパク質が宿主細胞に有害である場合特に有効なシステムエシェリキアコリに共通に用いるほとんどのプラスミドクローニングベクターは、Ｃｏ１Ｅｌタイブリプリフンの誘導体である［付加的情報に関しては、才力ら（Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７９、Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔ、１７２　：１５１−１５９）を参照のこと］。

Ｃｏ１Ｅ１プラスミドは、１染色体につき約１５〜２０コピーのコピー数を有する単量性分子としてエシエキアコリ菌株に安定に保持される。種々のレベルのプラスミド中に挿入された異質遺伝子のヒトおよび動物タンパク質産生物の発現を得ている。しかしながら高発現レベルを異質タンパク質産生物の産生を経済的に実行可能になるためシステムに対して適切に得るべきである。

多量のある遺伝子産生物を得る１つの方法として細菌細胞中で非常に高いコピー数を有するプラスミド上に遺伝子をクローンすることがある。理論上は、特定遺伝子のコピー数を増加することによって組換えウィルスの増加産生を導＜　ｍＲＮＡレベルも増加する。

ワクシニアウィルスをクローニングまたは発現ベクターとして用いることができる。該ウィルスは、感染細胞の細胞形質内で転写する１８７ｋｂ程度の線状二重線維ゲノムを含有する。これらのウィルスは、ウィルス感染性に必要なウィルスコア内で完全な転写酵素システム（援軍（ｅａｐｐｉｎｇ）、メチル化およびポリアデニル化酵素を含む）を含有する。ワクシニアウィルス規制配列は、ワクシニアＲＮＡポリマラーゼによる転写の開始に関しては許めるが真核ＲＮＡポリマラーゼによるものは許めない。

組換えウィルスにおける異質遺伝子の発現は、異質遺伝子をコードするタンパク質へのワクシニアプロモーターの融合を必要とする。挿入ベクターとも呼ばれるプラスミドベクターは、ワクシニアウィルス内にキメラ遺伝子を挿入するように構成されている。１つのタイプの挿入ベクターは、（１）転写開始部位を含むワクシニアウィルスプロモーター；　（２）異質ＤＮＡフラグメントの挿入に関する転写開始部位から下側のいくつかの唯一の制限酵素エンドヌクレアーゼクローニング部位；　（３）ウィルスゲノムの相同性非本質的領域にキメラ遺伝子の挿入を導くプロモーターおよびクローニング部位の側面にある非本質的ワクシニアウィルスＤＮＡ　（例えばＴＫ遺伝子等）；および（４）エシェリキアコリにおける複製および選択に関する複製および抗生レジスタンスマーカーの細菌源から構成される。

このようなベクターの例は、マツタケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）組換えウィルスは、ワクシニアウィルスで感染された細胞内への異質遺伝子を含む組換え挿入プラスミドのトランスフェクションによって産生される。相同性組換は、感染細胞内で生じウィルスゲノムへの異質遺伝子の挿入をもたらす。組換えウィルスをスクリーンすることができ続いて免疫学的技術、ＤＮＡプラークハイブリダイゼーションまたは遺伝子選択を用いて単離することができる。これらのワクシニア組換体は、その根本的機能あるいは感染性を保有できかつ３５ｋｄ程度の異質ＤＮＡを受け入れるように構成されることができる。

異質遺伝子の発現は、酵素的または免疫学的検定法［例えば、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイまたはイムノブロッティング］により決定される。加えて、組換ワクシニア感染細胞から産生される自然発生的糖タンパク質は、グルコシル化され細胞表面に移送され得る。高発現レベルを適当なベクターまたは好適な宿主における強力なプロモーターまたは単一遺伝子のクローニング多発性コピーを用いて得ることができる。

２、　１．　３　発現ベクターとしてのバキュロウイルスオートグラフィカカリフオルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａｃａｔ　１ｆｏｒｎｉｃａ）核発汗症ウィルス（Ａ　ｅＮＰＶ）のようなバキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）もまた、クローニングまたは発現ベクターとして用いることができる。ＡｃＮＰＶからの感染性は、ウィルス閉塞に通常見い出される。この構造は、ウィルス粒子がぎっしり取り込まれたポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）ペプチドより主に構成される。ポリヘトリン遺伝子発現は、感染サイクルの非常に後期、成熟ウィルス粒子が形成された後に生じる。従ってポリヘトリン遺伝子発現は、不要な機能である。すなわちポリヘトリン遺伝子発現の不存在下産生された未閉塞ウィルス粒子が十分に活性でありまた培地中の細胞を感染することができる。スミスら（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、）による欧州特許出願シリーズ番号第８４１０５．８４１．５によると、組換えバキュロウィルス発現ベクターは、バキュロウィルスＤＮＡを分裂してポリヘトリン遺伝子またはそのタンパク質からなるフラグメントを産生じ該フラグメントをクローニングベヒクル内に挿入した後、ポリヒドリン遺伝子プロモーターのコントロール下であるように発現された遺伝子を挿入することによって調製される。この方法にて形成された組換え転移ベクターをバキュロウィルスヘルパーＤＮＡと混合し培養液中の昆虫細胞をトランスフェクションするのに使用しノくキュロウイルスゲツムのポリヒドリン遺伝子位置で選択遺伝子の組換え並びに取り込みを行う。得られた組換え／くキュロウィルスで被感染性昆虫または培養昆虫細胞を感染するの２つのグループ分けられる。

公知のカプセルを有するこれらの菌株を関連抗血清とカプセルの血清学的反応によって定型化する。タイプａ　−ｆは既に同定されている。いずれの関連抗血清とも反応しない菌株は、分類不能として知ら衆国において新生児の髄膜炎および他の侵略的感染の最も多発する症例である。［フレーザーら（Ｆｒａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７４、　Ａｍｊ、Ｅｐｌｄｅｍｉｏｌ、　１００　：　２９−３４）　］　、幼児髄膜炎は、主に１〜５才の間に発生する。Ｈｉ　ｂによるこれらの髄膜炎の６０％が２才未満の幼児に発生する（フレーザーら、前述）。

分類不能Ｈ，インフルエンザ（Ｈｌ）もまた、成人における肺炎、画面症、髄膜炎、産後の敗血症および急性発熱性気管気管支炎等の症病を引き起こすことが現在十分に確立されている［マーフィーら（Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８５゜２０〜４０％を引き起こす幼児および若年成人における中耳炎の頻発病因因子である。幼児は、感染が長期持続性免疫を与えないので同一生物による種々の感染を受けるであろう。慢性または反復性中耳炎に対する現在の治療法として抗生物または内耳をからにするための管の挿入がある。

Ｈ１菌株はまた、洞炎の主要病例として挙げられる［チェリー　ジエイ、ディー、およびジエイ、ピー、ダドレイ。

（Ｃｈｅｒｒｙ　Ｊ、Ｄ、ａｎｄ　Ｊ、Ｐ、Ｄｕｄｌｅｙ、　１９８１　、　ｉｎ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｆｅ１ｇ１ｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｒｙ　ｅｄｓ、。

ｐｐ１０３−１０５）］。加えて、分類不能Ｈ１は、新生児の敗血症を引き起こす。

ポリリボンルリビトールホスフエ−）（ＰＲＰ）からなる分類ｂＨ，インフルエンザ（Ｈｌ　ｂ）のカプセル性ポリサッカライドに対して産生ずる抗血清は、Ｈｉ　ｂに対して殺菌性または保護性であることが示されている［スミスら（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９７３．　Ｐｅｄｉａｔｒｉｅｓ５２　：　６３７− ６４４）；アンダーメンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、　１９７２　。

ヘモフィルスワクチンへの理想的候補は、３つの性質を有するであろう。すなわち（ａ）２〜６ケ月の幼児に免疫原性であること、（ｂ）分類可能および不能Ｈ，インフルエンザによって引き起こされた感染に対して保護する抗体を引き出すことおよび（ｃ）Ｈ，インフルエンザ菌株の表面に見い出される決定因子に対する抗体を引き出すことである。

Ｈｉ　ｂ感染に対して保護する現在利用されるワクチンは、主にＰＲＰ、分類互カプセル性ポリサッカライドからなる。

精製ＰＲＰポリサッカライドは、年齢１８ケ月以上の幼児には免疫原性であるが１８ケ月未満の幼児においては保護抗体応答を引き出さない。一般に、ポリサッカライドは、年齢１８ケ月未満の幼児には免疫原性が乏しいことが示されている。

この問題に向けると、種々の研究所は、ＰＲＰをタンパク質キャリヤー分子に化学的に結合させる［アンダーメンら　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１　９８　５．　Ｐｅｄ、Ｒｅｓ、１　８　：　２　５　２Ａ）コまたはタンパク質分子と混合する［モンジーら（Ｍｏｎｊｉ　ｅｔａｌ、、１９８６．　Ｉｎｆｅｅｔ、Ｉｍｍｕｎ、５１　：　８６５−８６７）コかのいずれかを研究し始めており、動物またはヒトに投与されている。タンパク質へのＰＲＰの接合は、６ケ月程度のヒト幼児におけて抗ＰＲＰ抗体応答を引き出すことが示されており一方ＰＲＰのタン白質との混合は、幼年動物における抗ＰＲＰ抗体を産生じている（モンジーら、前述）。

接合または混合ワクチン処方がＰＲＰワクチンの１つの困難、すなわち１８ケ月未満の幼児を保護することが不可能であることに目を向けられているが、これらは、ＰＲＰワクチンの他の主要な問題に目を向けていない。抗ＰＲＰ抗体は、ＰＲＰカプセルの明確さが欠ける分類不能Ｈ，イ１８ケ月以下の幼児において保護免疫応答を引き出すワクチンを確立する必要が望まれていた。

本発明の１つの目的は、６ケ月以下の子供における並びに６ケ月以上の子供および成人における分類すおよび分類可能Ｈ，インフルエンザを含むＨ，インフルエンザに対する保護的免疫応答を引き出すワクチン処方を提供することにある。本発明のアプローチは、ヘモフィルスの表面上に露出されるタンパク質または、そのフラグメントでワクチン化することである。最適の候補は、Ｈ，インフルエンザの外膜タンパク質（ＯＭＰ）である。外膜タンパク質は、通常表面露出分子である。これらは、幼児において通常免疫原性であるタンパク質より成り、他の細菌系において保護抗体を引き出すことができることが示されている［スガサワラら（Ｓｕｇａｓａｗａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．１ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ。

４２　：　９８０−９８５）　コ　。

加えてＨｌおよびＨｌ　ｂ菌株は、同様なＯＭＰ外形を有することが示されているｃロエブおよびスミス（Ｌｏｅｂ　ａｎｄヘモフィルスのＯＭＰへの抗体は、抗ＰＲＰがＨｌ　ｂに対して殺菌性およびオプソニンであることが示されている［アンダーメンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７２．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　５１　：　３ｌ−３８）　；キャテスら（Ｃａｔｅｓ　ｅｔ、。

ａｌ、、１９８５．　Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｕ＋ｕｎ、４８　：１８３−１８９）　］と同程度に殺菌性ならびにオプソニンであり得る。外膜タンパク質は、ＨｌおよびＨｌ　ｂに共通であるという不加的利益を有しかつ両タイプの細菌に対して保護し得る。

３、発明の開示本発明は、出願人により同定され「プラクシス・バイオロジクス・アウター・メンプラン・プロティン−１」（’Ｐｒａｘｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ　０ｕｔｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　−１’　）（ＰＢＯＭＰ−１）と命名した分子量約１６．０００ダルトンのへモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に関するおよびこれもまた出願人により同定され「プラクシス・パイロジクス・アウター・メンプラン・プロティン２」（ＰＢＯＭＰ−２）と命名した分子量約１６，０００ダルトンのへモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に抗ドおよびタンパク質をコード化する分子的にクローンされた遺伝子または遺伝子フラグメントを導くものである。本発明はまた、新規の改良された方法を用いて旦エインフルエンザから得られる実際的に純粋なＰＢＯＭＰ−１を導くものである。本発明のペプチドまたはタンパク質は、旦。

インフルエンザ用ワクチン処方における免疫原としてまたはＨ，インフルエンザに対する診断的検定における指薬として用いることができる。

本発明はまた、ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドをコード化する遺伝子または遺伝子フラグメントの分子クローニングする方法を導くものである。該分子的クローン配列をついでコード化ペプチドに関する発現ベクターを含む組換えＤＮＡ技術により他のベクターの別の構造にまたは核酸ハイブリダイゼーションに基づくしインフルエンザに対する診断的検定に用いるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２を得るのに用いる。

本発明のペプチドまたはタンパク質は、旦エインフルエンザから純化されるか、いずれかのベクター宿主系における組換えＤＮＡ技術を用いて産生されるかあるいは化学的方法により合成される。従って１、本発明はまた、ペプチドおよびタンパク質が純化され得る適当な宿主細胞におけるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドまたはタンパク質を導くのに用いられる新規のプラスミドＤＮＡまたはヒトウィルス、動物ウィルス、昆虫ウィルスまたはバクテリオファージを含むウィルス性ＤＮＡの構成体を導くもノテある。ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドおよびタンパク質の化学的合成を記載する。

ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドおよいるサブユニットワクチン処方における免疫原として用いることができる。サブユニットワクチン調製用ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連タンパク質またはペプチドを化学的合成、Ｈ，インフルエンザからの純化または組換え発現ベクターからの純化により得ることができる。別に、ＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドおよびタンパク質自身を産生ずる組換えウィルスまたは、数組換えウィルスで感染された細胞の抽出物をウィルスワクチン処方における免疫原として用いることができる。このようなＰＢＯＭＰ−１またはＰＲＯＭＰ−２タンパク質は、宿主動物において「異質」として認定されるであろうからＰＢＯＭＰ−１またはＰ　Ｂ　ＯＭＰ　−２に対して導かれる体液のおよびおそらく細胞媒介免疫応答を導く。適切に調合されたワクチンにおいては、連続的Ｈ，インフルエンザ感染に対して保護すべきである。さらに本サブユニットワクチン処方は、現在有効なＰＲＰワクチンと適合性である。

本発明のＰＢＯＭＰ−１関連および／またはＰＢＯＭＰ−２関連配列は、ヒト医学的検定に用いることができる。

これらは、血液検体、体液および組織等におけるしインフルエンザの決定用診断器具として有効なＥＬＩＳＡ試験およびラジオイムノアッセイ等の免疫検定における試薬としての本発明のペプチドおよびタンパク質の使用を含む。

ＰＲＯＭＰ−１：Ｉ−ド化および／＊タハＰ　Ｂ　ＯＭＰ　−２：１−ド化遺伝子配列を且、インフルエンザの同様な診断的検査に対するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡノ）イブリダイゼーションに用いることができる。加えて、これらのすのに有効な器具を提供する。

さらに、本発明は、受動免疫摂生および診断免疫検定に有いる抗ＰＲＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ−２モノクローナル抗体を導く。

実施例並びに添附図面を参照することにより十分に理解することができる。

第１図は、ＰＲＯＭＰ−１のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）検定を表わす。サンプルおよびゲルを第６．１節に記載のごとく調合した。レーンＡは、約５μｒＰＲＯＭＰ−１を含む。

レーンＢは、予め着色した低益子量（ＭＶ）標準、すなわちオバルブミンアルファーーキモトリプシノーゲン（ｃｈｙｓｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ）　、ベーター−ラクトグロブリン、ｌノソチーム、ウシトリプシン禁止剤およびインスリン（ＡおよびＢ鎖）を含む。関連分子量を側面に示す。

第２図（ＡおよびＢ）は、ポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１抗体およびモノクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１抗体ンザの全細胞溶解産物の反応性を表わす。第２Ａ図において、溶解産物をポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１抗体と反応した。各レーンは、次のとおりである。すなわち（１）エシェリキアコリＨＢＩＯＩ　；　（２）エシェリキアコリＪＭ８３　；　（３）分子量標準；および（４）培養旦エインフルエンザ細胞から得られた純化ＰＲＯＭＰ−１である。

第２Ｂ図において、溶解産物をモノクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体と反応した。レーンは、第２Ａ図に記載のとおりである。

第３図は、ｐＬＧ３３９の誘導体であるｐＧＤ１０３の第４図（ＡおよびＢ）は、ｐＧＤ１０３内にクローンされたＨ、インフルエンザＤＮＡの４．２ｋｂフラグメントからなるｐＡＡ１５２のマツプを表わ゛す。遺伝子コード化ＰＲＯＭＰ −１を７３７見虹■−見間ＨＩフラグメントに局在定位する。第４Ａ図は、ｐＡＡ１５２の循環制限マツプである。第４Ｂ図は、ｐＡＡ１５２の挿入フラグメントの決定検定を示す。遺伝子欠如誘導体における残余且、インフルエンザを黒線で示す。

第５図は、ＰＢＯＭＰ−１の異なるエピトープと反応する個々のモノクローナル抗体とのｐＡＡ１５２含有エシエリキアコ１ハ　ＪＭ８３の全細胞溶解産物の反応性を表わす。

レーンは、次のとおりである。すなわち（Ａ）モノクローナル抗体Ｇ１−１　；　（Ｂ）モノクローナル抗体Ｇ９４−３　。

（Ｃ）モノクローナル抗体Ｇ１８−３；　（Ｄ）モノクローナル抗体２５−２；および（Ｅ）モノクローナル抗体Ｇ２−３である。

第６図は、組換えプラスミドｐＡＡ１３０およびｐＡＡ１５２を含有するＤＳ４１０微小細胞（ｍｉｎｉｃｅｌ　Ｉｓ）のラジオオートグラム検定を表わす。分子量標準を同図の左に示した。レーンは、（Ａ）ＤＳ４１０　（ｐＡＡ１３０）；（Ｂ）ＤＳ４１０　（ｐＧ１０３）；および（Ｃ）　ＤＳ　４１０（ｐＡＡ１５２）を示す。カナマイシンアミノグリコシダーゼ（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）の位置を同図の右（こ示した。

第７図（ＡおよびＢ）は、ｐＧＤ１０Ｂ内にクローンされたＨ、インフルエンザの５．７ｋｂフラグメントからなるｐＡＡ１３０のマツプを示す。第７Ａ図は、ｐＡＡ１３０の循環制限マツプを示す。第７Ｂ図は、且エインフルエンザ挿入ｐＡＡ１３０フラグメントの遺伝子欠如検定を示す。

黒一色の線は、遺伝子欠如誘導体における残余用エインフルエンザＤＮＡを示す。ＰＢＯＭＰ表現型を右に示す。遺伝子コード化ＰＢＯＭＰを７８１ｂｐＢｓｔＥＩＩ−ＸｍｎＩフラグメントに局在定位する。

第８図は、ポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１抗血清とのエシェリキアコリＪＭ８３およびｐＡＡ１３０含有エシェリキアコリＪＭ８３の全細胞溶解産物の反応性を表わす。

レーンは、（Ａ）ｐＡＡ１３０含有ＪＭ８３；　（Ｂ）ｐＡＡ１３０含有ＪＭ８３　；　（Ｃ）ＪＭ８３　；　（Ｄ）ＪＭ８３；（Ｅ）同図の右側にキロダルトンで表示された分子量標準；および（Ｆ）Ｈｉｓ−２を表わす。

第９図は、種々クローンから決定された発生源、方向および範囲を示すｐＡＡ１５２の７３７挿入フラグメントのＤＮＡ配列法を示す。底部の矢印は、主要読み取り枠（ＯＦ　Ｆ）の位置を示す。

第１０図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を含有する７３７ｂｐフラグメントのヌクレオチド配列を表わす。予想読み取り枠（ＯＲＦ）を下線を引いた配列で示し転写方向を矢印で示す。

第１１図は、ＰＢＯＭＰ−１の推定アミノ酸配列を示す。

ヌクレオチド配列を下線上に描き、相当アミノ配列を下側に示す。四角で囲んだアミノ酸は、タンパク質からの成熟した予想Ｎ末端アミノ酸を示す。

第１２図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子の誘導アミノ酸配列の部分（上側）とともにＰＢＯＭＰ−１から誘導されたペプチドの部分的アミノ酸配列（下側）の列を表わす。四角で囲んだ残基は、不適当な組合せを表わす。

第１３図は、各クローンから決定された発生源、方向および配列の範囲を示すｐＡＡ１３０の７８９ｂｐ旦旦■−第１４図は、ＰＢＯＭＰ−２遺伝子を含有するｐＡＡの７８９ｂｐＢｓｔｎ−ＸａｎＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す。予想ＯＲＦを下線を引いた配列で示す。転写の方向を矢印で示す。ｒＮＪで表わした２つの塩基は、未知ヌクレオチドを表わす。

第１５図は、ＰＢＯＭＰ−２の推定アミノ酸配列を示す。

ヌクレオチド配列を上側に示しまた相当アミノ酸配列を下側に示した。四角で囲んだ残余は、タンパク質からの成熟した予想Ｎ−末端アミノ酸である。

第１６図は、ＰＲＯＭＰ−１の脂肪酸の気液クロマトグラフィーを用いて得られたクロマトグラムである。ノナデカン酸（Ｃ１９）を内部標準として含めた。

第１７図は、組換プラスミドｐＡＡ１３０およびｐＧ１０３含有エシェリキアコリＪＭ８３細胞並びにｐＧＤ１０３含有対照エシェリキアコリＪＭ８３細胞ラジオオートグラフ５ＤＳ−ＰＡＧＥ検定を表わす。レーンは、（１）　ｐＡＡ１３０；　（２）ｐＡＡ１５２および（３）ｐＧＤ１０３を示す。分子量約１５，０００のバンドの位置を同図の左側に示す。

第１８図（ＡおよびＢ）は、グロボマイシン（ｇ　Ｉｏｂｏｍｙｃｉ　ｎ）の存在下または不存在下ｐＡＡ１３０またはｐＡＡ１５２含有エシェリキアコリＪＭ８３の全細胞溶解産物のウェスタンプロットゲル検定を表わす。分子量標準を第１８図（ＡおよびＢ）の左側に示す。第１８Ａ図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を含有するｐＡＡ１５２含有細胞の溶解産物を表わす。レーンは、（１）グロボマイシン不存在および（２）グロボマイシン存在を表わす。

第１８Ｂ図は、ＰＲＯＭＰ−２遺伝子を含有すルｐＡＡ１３０含有細胞の溶解産物を表わす。レーンは、（１）グロボマイシン不存在および（２）グロボマイシン存在を表わす。

第１９図は、ＰＢＯＭＰ−１（５，２μｇ）からなるワクチン処方をヒト成人に投与した際得られた抗体応答を示す。

第２０図は、モノクローナル抗体Ｇ２０４とのエシェリキアコリＪＭＩ０１またはＪＭ１０３の全細胞溶解産物の反応性を表わす。レーンは、（Ａ）ｐＰＸ１６６含有ＪＭ１０３；　（Ｂ）、ｐＰＸ１６０含有ＪＭ１０３；　（Ｃ）ｐＵｃ１９含有ＪＭＩＯＩ　、（Ｄ）同図の左側にキロダルトンで表示した分子量標準；および（Ｅ）Ｈエインフルエンザからの自然発生ＰＢＯＭＰ−１を表わす。

第２１図は、ＰＲＯＭＰ−１シグナル配列欠如配列をコードするＰＢＯＭＰ−１タンパク質含有プラスミドの構成の概略図である。プラスミドｐＰＸ１６７において、シグナル配列欠如ＰＢＯＭＰ−１をＩ　ａｃプロモーターから下側に挿入する。血漿ｐＰＸ１６３は、ポリリンカーにおけるＢａｍＨＩ部位でｐＰＸ１６７１：：ＰＢＯＭＰ−１＝ｒ−ド配列を分裂し、プラスミドｐＩ　Ｎ■−０ｇ１ｐＡ３のＢａｍ旦Ｉ中に得られたフラグメントをクローニングすることにより構成される。プラスミドｐＰＸ１６８は、エシェリキアコリｏｍｐＡタンパク質のシグナル配列へのアミノ末端でリンクされた成熟ＰＢＯＭＰ−１に関してコードするキメラ配列を含有する。

第２２図は、プラスミド含有エシェリキアコリ菌株ＰＲ１３の細胞質抽出物の上澄フラクションの逆相Ｃ−４高性能液体クロマトグラフィーを用いて得られたクロマトグラムを表わす。

第２３Ａ図は、クマーシー染色で染色されたプラスミドｐＰＸ１６７を含有するエシェリキアコリＰＲ１３がら得られたシグナルレスＰＢｏＭＰ−１の５Ｄｓ− ＰＡＧＥを表ワス。レーンは、（１）細胞質フラクション、（２）ＤＥＡＥ溶比物；および（３）逆相溶出物を表わす。分子量標準をレーン１の左側まで操作し、関連Ｍｗ８　（キロダルトン）を同図の左側に示した。第２３Ｂ図は、抗ＰＢＯＭＰ−１モノクロナール抗体との該フラクションの反応性を表わす。

第２４図は、１　ａｃプロモーターから下側に挿入されたＰＢＯＭＰ−２タンパク質の完全コード配列を含むプラスミドｐＰＸ１６３の構造の概略図である。

第２５図は、Ｉ　ＰＴＧの存在下または不存在下生長したｐＰＸ１６３含有エシェリキアコリの全細胞溶解産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ検定を表わす。レーンは、（１）分子量標準二キロダルトン；　（２）ＩＰＴＧなしで生長したｐＰＸ１６３含有ＪＭ１０３の溶解産物；および（３）レーン２において４時間Ｉ　ＰＴＧ　（５ｍＭ）の存在で生長したものを表わす。矢印はＩＰＴＧにより誘導された３つのＰＢＯＭＰ−２反応性バンドを示す。

５、発明の詳細な説明本発明は、分子量１６．０００ダルトン程度のＨ，インフルエンザ外膜タンパク質のエピトープに関連するタンパク質またはペプチドすなわちＰＢＯＭＰ−１および分子量１６．０００ダルトン程度のＨ，インフルエンザ外膜タンパク質関連のものすなわちＰＲＯＭＰ−２を導く。５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定されるとおりの明らかな分子量は、いずれの翻訳後変質（例えば脂肪アシル化およびアセチル化等）を含む総分子量の成熟（すなわちタンパク分解性加工された）形態を表わす。本発明のタンパク質およびペプチドを組換えＤＮＡ方法によりあるいは化学的合成により産生ずることができる。補足的に、本発明のタンパク質またはペプチドを単離および純化の新規かつ改良された方法形態にて得ることができる。且エインフルエンザのエピトープを特定するＰＲＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ −２のタンパク質並びにペプチドを且エインフルエンザ細菌性髄膜炎、中耳炎、喉頭蓋炎、および肺炎等の病因因子での感染に対して保護する種々のワクチン処方における免疫原として用いることができる。該ワクチン処方は、ａ、ｂ、ｃ。

さらに、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列並びにＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２およびそのポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列に関する。

本発明のある実施態様によると、組換ＤＮＡ技術をＰ　ＲＯＭＰ−１およびＰＲＯＭＰ−２エピトープをコード化するヌクレオチド配列を好適なホスト細胞において該配列の制限を導く制限ベクター内に挿入するのに用いる。該制限ベクター宿主細胞系をＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２並びに関連タンパク質およびペプチドを産生ずるのに用いることができる。遺伝子産生物を培養液中の細胞から純化することができサブユニットワクチン処方における免疫原として用いることができる。必要により、ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプチドのアミノ酸配列から単離される実質的に純粋なタンパク質または（２）免疫原性ＰＢＯＭＰ−１またはＰＢｏＭＰ関連タンパク質およびペプチドを発現する組換体に含まれるＨ、インフルエンザヌクレオチド配列のいずれかから推定できる。

このれらのタンパク質およびペプチドをついで化学的に合成し、合成サブユニットワクチン処方に用いる。

ＰＢＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ−２配列を発現する発現ベクターが組換えウィルスである際に、ウィルスそれ自身をワクチンとして用いることができる。ＰＢＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプチドを発現しかつ宿主において疾病を引き起こさない感染性組換えウィルスを生ウイルスワクチン調合に用いて実質的免疫性を提供することができる。他に、不活性ウィルスワクチンをＰＢＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプチドを発現する「殺された」組換えワ゛　クチンを用いて調合することができる。

さらに、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ−２に対する多価抗血清およびモノクローナル抗体並びに受動免疫用談免疫グロブリンの使用方法および旦エインフルエンザに対する診断的検定を導く。

説明するために、本発明の方法を以下の段階に分けることができる。（１）ＰＢＯＭＰ−１タンパク質の単離および純化；　（２）ＰＢＯＭＰ−１の部分的アミノ配列化；（３）制限ベクター内への遺伝子または遺伝子フラグメントの挿入ヲ含ｂ　Ｐ　Ｂ　ＯＭ　Ｐ　−１オヨびＰＢＯＭＰ−２をコード化する遺伝子および遺伝子フラグメントの分子クローニングおよび組換え遺伝子産生物の純化、（４）　ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列化；および（５）純化および組換えタンパク質およびペプチド産生物に対する抗体の産生によるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２タンパク質および関連タンパク質の免疫潜在能の決定。さらに、該方法は、（６）ワクチンの処方および（７）体液試料におけるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２遺伝子または遺伝子産生物（および従っフルエンザの他の菌株において、外膜タンパク質ＰＢＯＭＰ−１を外膜細胞壁複合体と結合する。ＰＢＯＭＰ−１の純化における必要段階は、外膜および細胞とかたく結合する外膜タンパク質を保持する結合の破壊である。これは、次の２段階、すなわち（１）　Ｈ，インフルエンザの物理的に破壊された細胞からＰ　Ｂ　ＯＭＰ−１豊富不溶性細胞膜フラクシヨンを単離し、ついで（２）ヒトへの投与に好適な洗浄剤の存在下加熱または洗浄剤の存在下または不存在化のいずれかにてリソチームで細胞壁フラクションを消化することにより細胞壁フラクションからＰＢＯＭＰ−１を可溶化する段階からなる本発明の新規かつ改良された方法により達成される。

本発明の新規改良方法は重要なエピトープを破壊し得、かつヒトへの投与のためのワクチン用の好ましくない成分であるドデシル硫酸ナトリウムおよび２−メルカプトエタノール等の変質剤および還元剤の使用［マンソンら　（Ｍｕｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．１ｎｆｅｃｔ、１ｍｍｕｎ、　４９　：　５４４− ４９）コを避ける。

５、　１．　Ｌ　Ｈ，インフルエンザからのＰＢＯＭＰ−１豊富不溶性細胞膜物質の単離総細胞膜フラクションをこれに限定されないがフレンチプレス他均質化装置からの排除による音波振とう（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）および粉砕を含む且エインフルエンザの破壊に伴う特異性沈降により得ることができる。さらに、縁膜フラクションを密度勾配沈降法またはトリトンｘ　−ｉｏ。

（商標）またはＮ−ラウロイルサルコシン、ナトリウム塩（サルコシル）等の一定の洗浄剤で内膜の特異的可溶化により内外膜に分割することができる。外膜は、好ましくは、１％（ｗ／ｖ）サルコシル１０ｍＭヘペス（ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ）　ＮａＯＨ。

ｐＨ７，４溶液中の内膜の特異的可溶化により調製される。

ＰＢＯＭＰ−１の豊富なサブフラクションを他の細胞膜の特異的洗浄抽出により調製することができる。この豊富化は、例えば、１％オクチルグルコシドノニルグルコシド、シイータージエント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）　３−１４　（商標）またはシイータージエント３−１４　（商標）で（前述のごとくトリトンＸ ’１ＯＯ（商標）または、サルコシル抽出後に、残る）外膜−細胞壁複合体を連続抽出しつづいて１％サルコシルでの不溶性物質の抽出を行い、ついで遠心分離してＰＢＯＭＰ−１豊富不溶性物質を単離することにより達成外膜−細胞壁複合体からのＰＢＯＭＰ−１の可溶化は、以下のアプローチ、すなわち（１）ＰＢＯＭＰ−１を限定されないがトリトンＸ−１００（商標）、ツイーン８０、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ，ドデシルマルトシド、シイータージェント３−１４　（商標）およびシイータージエント３−１６　（商標）を含む洗浄剤の１種またはい（つかの洗浄剤のいずれかの組合せで１時間５５〜６０℃でＰＢＯＭ−１豊富フラクシヨンの抽出により可溶化することができる；　（２）ＰＢＯＭ−１を洗浄剤の存在または不在のいずれかの下、リソチームでＰＢＯＭＰ−１豊富フラクシヨンにおける細胞壁の破壊により可溶化することができるということの１つまたはその組合せを用いていくつかの異なる方で達成され得る。好ましい実施態様によると洗浄剤は、デオキシコールエートおよびポリエトキシレートソルビタンモノオレエート（ツイーン８０）から選ばれる。

代わりに、ＰＢＯＭＰ−１をこれに限定するものではないがトリトンＸ−１００（商標）、サルコシル、オクチルグルコシド、ノニルグルコシド、シイータージエント３−１４（商標）またはシイータージエント３−１６　（商標）等の洗浄剤の１種あるいは組合せで全旦エインフルエンザ細胞、外膜またはそのサブフラクションを抽出することによって単離することができる。この抽出を好適な緩衝系内にて５５〜６０℃または室温で行うことができる。

可溶化の後、さらにＰＢＯＭＰ−１の純化を限定するものではないがイオン交換、分子ふるい、疎水性または逆相クロマトグラフィー、アフィーニティークロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、等電点電気泳動および調製的電気泳動等の当該技術分野に公知の標準方法により達成することができる。

チドフラグメントの部分的アミノ酸配列化とともにアミノ酸検定で特定づけすることができる。純化タンパク質におけるアミノ酸の破壊および／または変性を最小化するため１を加水分解することが好ましい［シンプソンら（Ｓｉｍｐｓ。

ｎ　ｅｔａｌ、、１　９　７０．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ１ｅｉ、２５　１　：　１　９３６−４０）］。本発明の１つの実験的実施例において、このようなアミノ酸検定を記載（第６．　１．　１節参照）のとおり単離した新規ペプチドを特徴づけるためにＰＢＯＭＰ−１のトリプシンペプチドフラグメントのアミノ酸配列化と組み合せた。ヘモフィルス外膜タンパク質のＮ末端をブロックすることを提案したエドマンケミストリー（Ｅｄｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｅｒｙ）によりＰＢＯＭＰ−１を配列する初期企みの間困難を経験した。

ブラウン（Ｂｒａｕｎ）　（１９７０，Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌ　４　：　３８７−３９１）による研究は、脂肪酸がエシェリキアコリのブラウンのりボタンバク質のＮ末端システィン残基と結合することを示している。パルミチン酸位をＮ末端システィンにアミノ結合する。すなわち２つの付加的脂肪酸もまた、エシェリキアコリブラウンリポタンパク質におけるチオエーテル結合を形成するグリセリル基をを介して同一システィン残基に付着する（同上）。従って、Ｈ，インフルエンザから得られたＰＢＯＭＰ−１は、さらに、脂肪酸検定によっても特性づけされた。゛このような研究は、本発明の外膜タンパク質およびＮ末端残基が脂肪酸残基を共有結合していることを示した。本発明の１実験的実施例において、このような脂肪酸検定は、３つの主要脂肪酸すなわちラウリン酸、パルミチン酸およびパルミチン酸誘導体の存在を明らかにした。共有的に結合する脂肪酸部位を有する本発明のアセチル化タンパク質およびペプチドは、Ｈ，インフルエンザに対するワクチン処方に特別有効であり得る。

５．３　ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２をコード分子量（ＭＷ）１６．０００ダルトンのＯＭＰを全試験さレタ且エインフルエンザ菌株（現在数百）においてドデシル硫酸ナトリウム電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンプロット検定の両方で検定した。モノクローナル抗体データは、このタンパク質が非常に保護されることを示す［マーフィーら（Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｉｎｆｅｃｔ。

ンフルエンザ菌株もＰＢＯＭＰ遺伝子源として提供する。

多くのＨ，インフルエンザが検出可能プラスミドまたは誘・導可能前期染色体を含有しないのでＰＢＯＭＰ遺伝子は、おそらく染色体である。従って、ＰＢＯＭＰ類をコード化するＤＮＡ配列のクローニングにおける第１段階は、Ｈ。

インフルエンザ染色体ＤＮＡからの該配列の単離である。

以下、Ｈ，インフルエンザ遺伝子をコード化するＤＮＡをｒＨｉ　ＤＮＡＪと呼びまたＰＢＯＭＰ類をコード化するＤＮＡをｒＰＢＯＭＰ　ＤＮＡＪと呼ぶ。

Ｈｉ　ＤＮＡフラグメントを発生するため、Ｈｉ　ＤＮＡを種々の制限酵素を用いて特異部位で分裂することができる。

代わりに、ＤＮＡをフラグメント化するため低濃度のＤＮＡアーゼＩを用いることができあるいはＤＮＡを例えば音波振とうで物理的に分けることができる。線状ＤＮＡをついで、これに限定されないがアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー（例えば分子ふるいまたはイオン交換クロマトグラフィー）またはショ糖勾配の速度沈降等の標準技術により寸法に従って分離する。

いずれかの制限酵素または制限酵素の組合せを用いてＤＮＡがＰＢＯＭＰ遺伝子産生物の免疫潜在能を破壊しない条件でＰＢＯＭＰ含有Ｈｉ　ＤＮＡフラグメントを発生する。例えば、タンパク質の抗原部位は約７〜１４のアミノ酸からなることができる。従ってＰＢＯＭＰペプチドの寸法のタンパク質は、分泌抗体部位を有することができ従って多くの部分的ＰＲＯＭＰポリペプチド遺伝子配列は、抗原部位に関してコードすることができる。その結果、多くの制限酵素組合せは、好適なベクター内に挿入された際、異なる抗原決定子からなるＰＢＯＭＰ特定アミノ酸配列の産生を誘導することのできるＤＮＡフラグメントを発生するのに用いられる。

ひとたびＤＮＡフラグメントを発生すると、ＰＢＯＭＰ遺伝子含有特定ＤＮＡフラグメントの同定を数多くの方法で達成することができる。

ＰＢＯＭＰ遺伝子含有ＤＮＡ配列を合成オリゴヌクレオチドプローブとのＨｌ　ＤＮＡフラグメントのハイブリダイゼーションにより同定することができる。余剰合成オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＢＯＭＰタンパク質のペプチドフラグメントのアミノ酸配列に基づいて抗生される。例えば、合成オリゴヌクレオチドプローブを第５．１節に記載のＨ，インフルエンザから単離された実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて合成される。これらの合成プローブを３２Ｐ−アデノシントリホスフェートで放射線標識することができＰＢＯＭＰ特異遺伝子配列含有クローンに関するＨｉ　ＤＮＡライブラリーをスクリーンするのに用いることができる［アンダーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０　：　６８３８−４２）を参照のこと］。

別にＰＢＯＭＰ遺伝子を「ショットガン」アプローチでクローニングベクター内に挿入後同定および単離することができる。当該技術分野に公知の数多くのベクター−宿主系を用いることができる。ベクター系は、プラスミドまたは変性ウィルスのいずれかであり得る。好適なりローニングベクターとしては、これに限定されないがラムダベクターシステムｇｔ　１１．ｇｔＷＥｓ、ｔＢおよびカーロン（Ｃｈａｒｏｎ）　４等のウィルスベクター類およびｐＢＲ３２２゜ｐＢＲ３２５，ｐＡｃＹｃ１７７、ｐＡｃＹｃ１８４゜ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＵｃ１８．　ｐＵｃ１９．　ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０，ｐＫＣ３７およびｐＫｃｌｏｌ等のプラスミドベクター類および他の同様の系がある。ベクタ−系は、用いる宿主細胞と適合性でなければならない。組換え分子を変換、トランスフェクションまたは接種を経て細胞内に取り込むことができる。

ＰＢＯＭＰ遺伝子または遺伝子フラグメント含有ＨｉＤＮＡをクローニングベクター内に挿入しかつ好適宿主細胞を転換するのに用いる際ＰＢＯＭＰ遺伝子または遺伝子フラグメントの多数のコピーを発生することができる。これは、相補性末端を有するクローニングベクター内にＨｉＤＮＡフラグメントを結紮することによって達成される。

しかしながら、相補性制限部位が存在しない場合、ＤＮＡ分子の終点を変性する。このような変性として終点をプラントエンド結紮できるので単線維ＤＮＡ末端を消化するかあるいは単線維ＤＮＡ末端を満たすことによってプラントエンドを産生ずることを含む。代って、いずれかの所望部位をＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカ−）を結紮することによって産生ずることができる。これらの結紮リンカ−は、制限部位認定配列をコード化する特定の化学的合成オリゴヌクレオチドから成ることができる。例えば、マニエーティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のＤＮＡ変性方法（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ、　１０７−１１４を参照のこと）によると、分割ＤＮＡを制限メチラーゼ（例えば、Ｍ、Ｅｃｏ　Ｒ１）で処置し、該酵素に関する制限部位をコード化する合成りＮＡクリンカに結紮する。ＤＮＡを末端リンカ−を分裂する（しかしながら変性内部制限部位を分裂しない）制限エンドヌクレアーゼで処置し、好適なベクターアームに結紮する。別法において、分裂ベクターおよびＰＢＯＮＰＤＮＡフラグメントをホモポリマー性後尾づけ（ｔａｉｌｉｎｇ）で変性することができる。

クローンＰＢＯＭＰ遺伝子の同定をベクターシステムにおけるＨｉの染色体遺伝子バンクを確立しこれに限定されないがＰＢＯＭＰ類に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体での特異反応等の本明細書に記載のいずれかの方法のよりＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯＭＰ−１関連タンパク質に関する個々のクローンをスクリーニングすることによって達成することができる。

ＰＢＯＭＰ類またはそのタンパク質に関してコードするヌクレオチド配列を好適な発現ベクター、すなわち挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に関する必須要素を含有するベクター内に挿入する。種々の宿主−ベクター系をタンパク質コード化配列を発現するのに利用することができる。主として、ベクター系は、使用宿主細胞に適合性でなければならない。宿主−ベクター系としては限定されないが次のものを含む。バクテリオファージＤＮＡで転換した細菌；プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ　、酵母ベクター含有酵母等の微生物；ウィルス（例えば、ツクシニアウィルスおよびアデノウィルス等）で感染された咄乳類細胞系；およびウィルス（例えば、バキュロウィルス）で感染された昆虫細胞系がある。これらのベクターの発現要素は、その強さおよび特異性で変化する。利用宿主−ベクターシステムにより、数多くの好適な転写および翻訳要素のいずれか１つを用いることができる。

遺伝子（または遺伝子のタンパク質）の効率的発現を得るために、プロモーターは発現ベクター内に存在しなければならない。ＲＮＡポリマラーゼは、通常プロモーターに結合し、遺伝子または遺伝子および規制要素群（オペロンと呼ぶ）の転写を開始する。プロモーターは、その「強さ」すなわち転写を促進する能力で変化する。クローン遺伝子を発現するため高レベルの転写を得るため、従って、遺伝子の発現を得るための強力プロモーターを用いるのが望ましい。利用宿主細胞系にもよるが、数多くの好適なプロモーターのいずれか１つを用いることができる。例えば、エシェリキアコリ、そのバクテリオファージまたはプラスミドにおいてクローニングする際、住プロモーター、旦プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リポソームＲＮＡプロモーター、コリファージのＰ　およびＰｔ、プロモーター近接ＤＮＡ区域の転写を導くのに用いることができる。加えて、組換えＤＮＡあるいは他の合成りＮＡ技術により産生したハイブリッドｔｒｐ−Ｄ　ａｃＵ　Ｖ　５　（ｔａｃ）プロモーターまたは他のエシェリキアコリプロモーターを挿入遺伝子の転写を与えるのに用いることができる。

特に誘導されない限りプロモーターの使用を禁止する細菌宿主菌株および発現ベクターを選択することができる。

一定のオペロンにおいて特定のインデューサーの添加は、挿入ＤＮＡの効率的転写に必要である。すなわち、例えば、ρａＣオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−ベーター−Ｄ−ガラクトシド）により誘導される。

る際導かれ；またラムダのＰＬプロモーターは、感温ラムダリプレサー、例えば、ｃＩ８５７含有宿主細胞における温度の上昇により誘導される。この方法で９５％以上のプロモーター誘導転写を未誘導細胞において禁止し得る。従って遺伝子操作ＰＢＯＭＰタンパク質またはそのペプチドの発現を制御することができる。これは、クローン遺伝子のタンパク質産生物が宿主細胞に対して致命的または有害である場合、重要である。このような場合、転移体は、プロモーターを誘導しない条件下培養され、また細胞が生長培地において好適密度に達した際、プロモーターをタン、＜り質の産主に関して導くことができる。

このようなプロモーター／オペレータ系の１つは、言わシステムである［ラッセルおよびベネット（Ｒｕｓｓｅｔ　ａｎｄＢｅｎｎｅｔ、１９８２．　Ｇｅｎｅ２０　：　２３１−２３４）　；デボア−（ＤｅＢｏｅｒ）　、１９８２年５月１８日出願欧州特許願第６７．５４０号コ。このハイブリッドプロモーターは、 −３５ｂ、ｐ、　（−３５領域）の」圧プロモーターおよび一１０ｂ、ｐ、　（ −１０領域またはプリブナウボックス（Ｐｒｉｂｎｏνｂｏｘ））の（ｌ　ａｃプロモーターを結合することにより構成される（ＲＮＡポリマーラーゼ結合部位であるＤＮＡの配列。）トリプトファンプロモーターの強いプロモーター特性の維持に加えて、ｔａＣもまたΩａｅレプレッサーで制御する。

真核生物宿主細胞におけるクローニングの際、強化配列（例えば、７２ｂｐタンデン繰返しの５Ｖ４０ＤＮＡまたはレトロウィルス長末端繰り返しまたはＬＴＲ等）を挿入して転写効率を増加することができる。強化配列は、隣接遺伝子に関するその位置および方向に比較的無関係な方法で転写効率を増加するらしい真核生物ＤＮＡ要素の一組である。すぐに遺伝子に５′を配置しなければならない古典的プロモーター要素（例えば、ポリマラーゼ結合部位およびゴールドバーグーオネス（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　Ｈｏｇｎｅｓｓ）　ｒ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｊボックス）とは違い、強化配列は、真核生物遺伝子から上側、内部または下側から作用する著しい能力を有しており、従って、挿入遺伝子に関する強化配列の位置は、危険性が少ない。

特定開始シグナルもまた、真核生物細胞における効率的遺伝子転写および翻訳に必要である。これらの転写および翻訳開始シグナルは、遺伝子特異性メツセンジャーＲＮＡおよび合成タンパク質の各々の量により測定された「強さ」で変化する。プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターもまた種々の「強力な」転写および／または翻訳シグナルのいずれの組合せを含む。例えば、エシェリキアコリにおける効率的翻訳は、リポソーム結合部位を与えるため開始コドン（ＡＴＧ）にシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）（ＳＤ）配列約７〜９塩基５′を必要とする。従って、宿主細胞リポソームにより利用し得るいずれかの５Ｄ−ＡＴＧ組合せを利用できる。このような組合せとしてこれに限定されないがコリファージラムダのｅｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子からのまたはエシェリキアコリトリプトファンＥ、Ｄ。

Ｃ，ＢまたはＡ遺伝子からの５Ｄ−ＡＴＧ組合せがある。

付加的に、組換えＤＮＡ技術または、合成ヌクレオチドの取り込みに関与する他の技術により産生じたいずれの５Ｄ−ＡＴＧ組合せも用いることができる。

ベクター内へのＤＮＡフラグメントの挿入に関して先に記載のいずれの方法もベクター内の特異部位内へのプロモーターまたは他のコントロール要素を結紮するのに利用できる。

従ってＰＢＯＭＰタンパク質またはペプチドに関してコードするＨ、インフルエンザ遺伝子配列領域を含むＨ，インフルエンザ遺伝子配列を組換えＤＮＡ分子が宿主細胞内に取り込まれた際に異質遺伝子を宿主細胞で発現（すなわち転写または翻訳）できるためのペンタ−プロモーターおよびコントロール要素に関して特異部位で制限ベクター内へ結紮することができる。組換えＤＮＡ分子を転換、導入またはトランスフェクション（ベクター／宿主細胞系による）により好適な宿主細胞（これに限定されないが細菌、ウィルス、哺乳類細胞等を含む）に取り込むことができる。

転移体をｐＢＲ３２２における抗アンピシリン性または抗トランスシクリン性または真核生物宿主系におけるチミジンキナーゼ活性等のベクターに通常存在する１種以上の好適な遺伝子マーカーの発現に基づいて選択する。このようなマーカー遺伝子の発現は組換えＤＮＡが損われずかつ複写することを示さなければならない。発現ベクターは、マーカー機能を通常含むクローニングベクターから誘導し得る。このようなりローニングベクターとしてこれに限定されないが以下のものがある。ＳＶ４０およびアデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキユロウィルス等の昆虫ウィルス、酵母ベクター、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、カーロン（Ｃｈａｒｏｎ）　２８．カーロン４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダ　ＢＣ，ラムダｇｔ−１−ラムダＢ、　Ｍ　１３ｉｐ７．　Ｍ　１３ｉｐ８．　Ｍ　１３ｉｐ９等のバクテリオファージベクター、または　ｐＢＲ３２２，ｐＡｃ１０５．　ｐＶＡ５１．　ｐＡＣＹ１７７、ｐＫＨ４７，ｐＡｃＹｃ１８４．　ｐＵＢｌｌｏ。

ｐＭＢ９．　ｐＢＲ３２５，Ｃｏ１Ｅ１．　ｐｓｃｌｏｌ、ｐＢＲ３１３，ｐＭＬ２１．Ｒ３Ｆ２１２４．　ｐｃＲｌ、ＲＰ４、Ｉ）ＢＲ３２８等のプラスミドＤＮＡベクター等。

接合を介して且エインフルエンザとエシェリキアコリの間の耐薬剤因子の転移［スタイ（Ｓｔｕｄｙ、　１９７９　、　Ｊ、Ｂａｃｔ。

１３９：５２０−５２９）］　；およびエエシェリキアコにおけるヘモフィルス染色体遺伝子の翻訳［マン（Ｍａｎｎ。

１９７９、　Ｐｌａｓａ＋ｉｄ　２　：　５０３−５０５）コおよびクローニング［マンら（Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０．Ｇｅｎｅ　３　：　９７−１１２）］は、少なくともいくつかの遺伝子が両生物において効率的に発現し得ることを示し；また転写または翻訳コントロールの基礎メカニズムが同様であり得ることを示す。

本発明の実施例における特定の実施態様において、エシェリキアコリプラスミド系を発現ベクターとして選択した。

しかしながら本発明は、このようなエシェリキアコリ発現ベクターの使用に限定されるものではない。

遺伝子操作技術もまた、クローン遺伝子をさらに特性づけおよび／または適合するのに使用し得た。例えば、ＰＢＯＭＰタンパク質をコード化する遺伝子の変異誘発を導く部位は、保護抗体応答の発生に応答性のタンパク質の部位を同定するのに使用し得た。また、これは、例えば、タンパク質の可溶性を高めより容易に純化するために保護領域外領域におけるタンパク質を変性するのに用いることができた。

５、　３．　３　発現遺伝子産生物の同定および純化異質遺伝子挿入物含有発現ベクターを以下の３つの一般的アプローチで同定し得る。（１）異質挿入遺伝子と相同性である配列からなるプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（２）「マーカー」遺伝子機能（例えば、耐抗生物質性、転換表現型、およびチミジンキナーゼ活性等）の存在または不存在；および（３）遺伝子産生物の物理的、免疫学的または機能的性質に基づく挿入配列の発現。

ＰＢＯＭＰ遺伝子を発現する組換体を同定すると、遺伝子産生物を検定すべきである。究極の目標がワクチン処方におけるこのような産生物を発現するおよび／または診断的免疫検定における抗原として遺伝子産生物または組換えウィルスを使用することであるので免疫学的検定は、とりわけ重要である。

種々の抗血清、例えばこれに限定されないが後述の第６．２節に記載の多価抗血清およびモノクローナル抗体は、産生物の免疫反応性を検定するのに有効である。

本発明のタンパク質およびペプチドの同定は、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドがＰＢＯＭＰまたはその類縁体および誘導体に対して誘導される種々の抗体に免疫反応性であることを必要とする。

タンパク質またはペプチドが遺伝子配列の部分である全ＰＢＯＭ遺伝子配列の発現から生じようと融合タンパク質の産生のため結紮される２以上の遺伝子配列から生じようとタンパク質またはペプチドは、免疫反応性であるべきである。この反応性は、放射線免疫沈降、放射線競合、ＥＬ　Ｉ　ＳＡまたはイムノプロット等の標準免疫学的技術でマドグラフィー（例えば、イオン交換、アフイーニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、沈降および溶解度差等の標準方法でまたはタンパク質の純化用の他の標準技術で単離および純化し得る。

別に、組換体により産生じた免疫反応性且エインフルエンザＰＢＯＭＰ関連タンパク質をひとたび同定すると、免疫反応性タンパク質のアミノ酸配列を組換体中に含有されるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推定できる。その結果、タンパク質を当該技術分野に公知の標準化学方法で合成できる［例えばバンカピラーら（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、。

１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１０：１０５−１１１）参照のこと］。

本発明の特定の実施態様において、組換ＤＮＡ技術あるいは化学的合成法のいずれかにより産生じた該ペプチドとしてこれに限定されないが機能的に等しいアミノ酸残基をわずかな変化を生じる配列内の残基に置き換えた改良配列を含む第１１図および／または第１５図に実質的に表わされた全または部分的アミノ酸配列がある。例えば、配列内の１以上のアミノ酸を機能的に等しく作用する同様の極性の別のアミノ酸で置き換える結果わずかに変更する。配列内でのアミノ酸の置き換えは、アミノ酸の属する類の他のメンバーから選択され得る。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがある。極性天然アミノ酸としてセリン、トレオニン、システィン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。陽性帯電（塩基性）アミノ酸としてアルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。陰性帯電（酸性）アミノ酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸がある。

５．４　ＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列化ＰＢＯＭＰ遺伝子含有ＤＮＡのフラグメントをひとたび同定したら、これらの遺伝子の実際のヌクレオチド配列をＤＮＡの配列検定により確認できる。塩基対の配列順序をマクサムおよびギルバー）　（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　１９８０　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５　：　４９　）の方法またはデオキシ法［サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ７４　：　５４６３）コのいずれかの方法で決定できる。ＰＢＯＭＰ遺伝子の実際の開始および停止シグナルを読み取り枠のヌクレオチド配列の検定により確認できる。［ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、。

１９７９　、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｔ、よ３：３１９）］。より多くの読み取り枠を特定ＤＮＡフラグメントに見い出した際、実際の遺伝子の同一性をＰＢＯＭＰのアミノ酸配列に遺伝子産生物の予想アミノ酸配列を比較することにより確認できた。好適な読み取枠の配置もまた遺伝子融合の使用により確認できる。

すなわちＰＲＰへの抗体での実験は、インビトロ検定において細菌を殺しかつ動物モデル系におけるＨｉ　ｂでの免疫テストに対して保護する抗体の能力は、ヒト幼児において保護免疫応答を引き出す能力とほぼ相関することを示している。

本発明のＰＢＯＭＰタンパク質およびペプチドへの応答において引き出される抗ＢＯＭＰ抗体は、ＨｌおよびＨｉｂの両方を殺しＨｉ　ｂでの免疫テストからの動物モデル系において保護する能力を示すため同様のインビトロ検定システムおよび動物モデル系を用いて試験し得る。これらのシステムからの結果は、保護免疫応答を引き出しヒト幼児、小児および成人用ワクチンとして利用するため各ＰＢＯＭＰの潜在能と同様な相関を示すべきである。

Ｈ，インフルエンザに対するＰＲＰおよびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の抗体の細菌活性を予め用いられているインビトロ補体媒介細菌検定システム［マツシャーら（Ｍｕｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９７２．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、５１　：　３１−３８）］は、特定ＰＢＯＭＰペプチドまたはそのフラグメシトに対して誘導される抗体がｂ型Ｈ，インフルエンザおるか否かを決定するのに用いられた。これらの検定を広範囲の菌株を殺すかどうかを決定するために比較的多数の両タイプ細菌の臨床単離体に対して実施できる。このようなインビトロ細菌を説明する実施例については後述の第７．１゜節を参照のこと。

さらに保護抗体応答を引き出すＰＢＯＭＰの能力に対するデータを幼年ラット髄膜炎モデル系の使用によりもたらすことができる［スミスら（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９７３゜型を受けたものであり、ヒト幼児に見られるのと同様な画面症および致命的髄膜炎を成長させる。対抗菌株に対して細菌性である抗体を対抗前に幼年ラットを受動的に免疫化するのに用いる場合、ついでこれらを髄膜炎および死亡から保護する。ｂ型へモフィルス用最新ワクチンに対して誘導される抗体、ＰＲＰは、この幼年ラットモデル系において保護的である。ｂ型へモフィルス髄膜炎に対する受動的保護をラビットポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ抗体で幼年ラットを免疫化し、ひきつづきラットを致死量のＨ，インフルエンザｂ型で対抗することによって示すことができた。

本発明のタンパク質およびペプチドにより引き出されたこ後述の第７．２節を参照のこと。

Ｈｉに対して保護する特定ＰＲＯＭＰへの抗体の能力に対するデータをチンチラ（ｃｈｉｎｅｈｉｌｌａ）中耳炎動物モデルシステムを用いて得ることができた。［バーレンカンブら（Ｂａｒｅｎｋａｍｐ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ、５２　：５７２−７８）］。この動物モデルにおいて、チンチラをＨｉで内耳管の接種により対抗する。ヒトに見られるのと非常によく似た中耳炎が発達する。ＨｉＯＭＰで活性的またはＨｉ　ＯＭＰに対して導かれた抗体で受動的にのいずれかで免疫化されたチンチラをＨｉでの聴覚対抗に対して保護する（バーレンカンプら前述）。この動物モデル系をＨｉに対して保護するＰＢＯＭＰへの抗体の能力を示すのに用いることができた。

抗ＰＢＯＭ抗体が幼年動物モデルの使用により抗ＰＲＰ抗体に加えて付加的保護が可能であることを示すことは、可能である。抗ＰＢＯＭＰＩがちはやＨｉ　ｂでの対抗に対して幼年ラットを保護することができない点まで稀釈し、同様の稀釈の抗ＰＲＰ抗体と混合した抗ＰＢＯＭＰＩ抗体は、付加的保護を示すことができ、そしてそれ故に幼年ラットの死亡を防ぐことができる。この付加的保護は、ＰＲＰまたはそのフラグメントまたは接合体とＰＢＯＭＰまたはそのフラグメントから構成される可能混合ワクチンに有効である。

５．６　ワクチンの処方ヒトまたは動物内に後述のワクチン処方を導入するために多くの方法を用いることができる。例えばこれに限定されないが皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻腔内の投与の経路がある。

炎および他の疾病症状に対して保護するワクチン処方における免疫原として用いられるＰＢＯＭＰ−１，ＰＢＯＭＰ−２および関連タンパク質およびペプチドを含む且エインフルエンザの外膜タンパク質に関連するタンパク質またはペプチドを提供することである。サブユニットワクチンは、単に宿主を免疫化するのに必要な適切な免疫原性物質からなる。免疫遺伝子学的処理免疫原、化学合成免疫原および処方され、保護免疫応答を引き出すことのできるワクチンは、受領者の感染の危険がないので特に有効である。従ってＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはそのフラグメントを組換としては、細菌転移体、酵母転移体またはＰＢＯＭＰエピトープを発現する組換体で感染された培養細胞がある（前述の第５．３節および第５．４節を参照のこと）。他にＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドを化学的に合成できる。このため、このようなタンパク質またはペプチドをその発現を誘く遺伝子のヌクレオチド配列から推定できる（前述の第５．４節を参照のこと）。さらに別の実施態様において、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドをＨ，インフルエンザ培養液から実質的に純粋な形態で単離できる（例えば、前述の第５．１節を参照のこと）。

免疫原が組換体から純化されようと化学的に合成されようと、最終産生物を好適濃度に調節しいずれかの好適なワクチンアジュバントで処方する。好適なアジュバントとしては、これに限定されるものではないが、界面活性剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン類（ｐｌｙａｍｉｎｅｓ）例えば、ピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ，ポリアクリル酸、力−ボポール；ペプチド類、例えばムラミルジペプチド、シトチルグリシン、ラフトシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）　；オイルエマルジョン；および鉱物ゲル例えばアルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート等がある。免疫原もまたワクチン処方に用いるためリポソーム内に導入またはポリサッカライドおよび／または他のポリマーに接合することができる。

本発明のこの態様のさらに別の実施態様において、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドは、ハブテン、すなわち同形の抗体と特異的または選択的に反応するものに抗原性であるが免疫応答を引き出せないものに免疫原性でない分子である。このような場合、ハプテンをキャリーヤーまたは免疫原性分子に共有結合できる。すなわち、例えば、タンパク質血清アルブミン等の巨大タンパク質は、免疫原性をそれと結合するハプテンに与える。ハブテン−キャリヤーをサブユニットワクチンとして使用するために処方できる。

は他の疾病症状に対して保護するのに用いられる生組換ウィルス性ワクチンまたは不滑性組換ウィルス性ワクチンのいずれかを提供することである。このため、組換えウィルスをＰＢＯＭＰ関連エピトープを発現するように調合する（前述の第５．３節および第５．４節を参照のこと）。組換ウィルスが免疫化されるが疾病を引き起こされない宿主に感染症である場合、宿主における増殖が長期刺激を導き、従って、実質的に長期持続免疫性を与えるので生ワクチンが好ましい。宿主内に導入した際感染性組換えウィルスは、そのキメラ遺伝子からＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドフラグメントを発現できそしてそれによりＨ，インフルエンザ抗原に対する免疫応答を引き出せる。このようである場合には、生組換ウィルス自身をＨ，インフルエンザ感染に対する抑制ワクチンに用いることができる。このような組換えウィルスの産生は、インビトロ（例えば、組織培養細胞）とインビボ（例えば、未処理宿主動物）系のいずれも含む。例えば疫痢ワクチンを調製し処方する従来の方法をＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはポリペプチドを発現する生組換えワクチンに適応できる。

多価生ウイルスワクチンをＨ，インフルエンザＰＢＯＭＰのエピトープに加えて疾病を引き起こす生物のエピトープを発現する単一またはいくつかの感染性組換ウィルスから調合できる。例えば、ワクシニアウィルスをＨ，インフルエンザＰＢＯＭＰのものに加えて他のエピトープに関するコード配列を含むよう処理できる。このような組換ウィルス自身を多価ワクチンにおける免疫原として使用できる。別に、各々ＰＢＯＭＰの異なるエピトープおよび／または他の疾病を起こす生物のエピトープに関してコード化する異なる遺伝子を発現するワクシニアまたは他のウィルスの混合物を多価ワクチンに処方できる。

組換えウィルスが免疫化される宿主に感染性があるか否かにかかわらず不活性ワクチンを処方できる。不活性ワクチンは、その感染性が通常は化学的処理（例えばホルムアルデヒド）により破壊されているという意味では「死」である。理想的には、ウィルスの感染性をウィルスの免疫原性をもたらすタンパク質を影響することなく破壊する。不活性ワクチンを調合するために、ＰＲＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドを発現する多量の組換えウィルスを必要量の適切抗原を与えるため培養液中生長させなければならない。異なるエピトープを発現する不活性化ワクチンの混合物を「多価」ワクチンの処方に用いることができる。

明らかな例として、これらの「多価」不活性化ワクチンは、互いに投与された生ワクチンの相互干渉による潜在的困難のため生ワクチン処方より好ましい。いずれかの場合において、不活性化組換えワクチンまたはウィルスの混合物は、抗原に対する免疫学的応答を高めるため好適なアジュバントで処方されるべきである。好適なアジュバントとして、これに限定されるものではないが、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リゾレチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ　ｔ。

Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサドデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン類、例えば、ビラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ，ポリアクリル酸、カーボポール；ペプチド類、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリジン、ラフトシン；オイルエマルジョン；および鉱物ゲル、例えばアルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート等がある。

ウィルスまたはサブユニットワクチンで能動的に免疫化するのに代えて、Ｈ，インフルエンザのエピトープに対する予備形成抗体の投与により宿主に対する短期間保護を与えることも可能である。従って、ワクチン処方を受動免疫治療に用いる抗体を産生ずるために用いることができる。

ヒト免疫グロブリンは、異質免疫グロブリンがその異質免疫性成分に対する免疫応答を拒絶するのでヒト医薬に好ましい。このような受動免疫化は、特別の危険にさらされる免疫化されない個体、例えば細菌性髄膜炎患者との接触にさらされる若年幼児の速やかな保護のための緊急の理由において用いられる。他に、これらの抗体をＨ，インフルエンザＰＢＯＭＰエピトープに対する免疫応答を刺激する抗体として交替で使用し得る抗イデオタイプ抗体の保護に使推測される個体の種々の体液においてＰＢＯＭＰ抗原（および従って、Ｈ，インフルエンザ）の検査に対する診断的検定に用いる指薬を提供することである。

５、７．　１　免疫検定この実施態様の１つの態様において、本発明のＰＢＯ）ＩＰ関連タンパク質およびペプチドを種々の患者組繊およびこれに限定されるものではないが血液、を髄液および痰等を含ける抗原として使用できる。

本発明の抗原は、当該技術分野に公知のいずれの免疫検定、すなわちこれに限定されるものではないがラジオイム／アッセイ、ＥＬ　ｒＳＡ検定、″サンドイッチ′検定沈ｆｉ！反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定、凝集検定、蛍光イムノアッセイ、プロティンＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動検定が少ないが挙げられる、に使用できる。

５、　７．　２　核酸ハイブリダイゼーション検定この実施態様の別の態様において、本発明のＰＢＯＭＰ関連タンパク質およびペプチドをコード化する遺伝子の新規ヌクレオチド配列を種々の患者組織およびこれに限定されるものではないが血液、を髄液、および痰等を含む体液における且エインフルエンザの検査用核酸ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして使用できる。

本発明のヌクレオチド配列をこれに限定されるものではないがサザンプロット［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５．　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９旦：５０８）］；ノーザンプロット［トーマスら（Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡヱヱ：　５２０１−０５）］　；およびコロニープロット［グルンスティンら（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７５．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ７２　：　３９６１−６５）コ等を含む当該技術分野において公知のいずれの核酸ハイブリダイゼーション検定にも使用できる。

以下の一連の実施例は、説明の目的で記載したものであり本発明の範囲の限定するためではない。

６、実施例ネイティブおよび組換ＤＮＡ−誘導ＰＢＯＭＰの単離お一連の実験において、他の細胞壁成分が実質的にないＰＢＯＭＰ−１は、次のようにＨ，インフルエンザ（Ｈ。

ｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）から得られた。

Ｈ，インフルエンザイーガン（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｅａｇａｎ）は、− 夜、１０ｇｇ／ｍｌのヘミンおよび１μｇ／ｍ１ＮＡＤ（ＢＨＩ−ＸＶ）を含む脳心輸液媒地かまたはｍＭＩｃ（ヘリオツド等の修正、Ｈｅｒｒｉｏｔ　ｅｔ　ａｔ、、１９７０．　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１０１　：　５１３−１６）媒地で育てた。４℃において１０，０ＯＯｙｇで１５分間遠心分離した後、上澄液をローカル（Ｒｏｃａｌ）　ＩＩ　”消毒薬中に棄てた。沈降物（ペレット）は、重量を測定し、細胞の湿式重量の約５倍食に等しいバッファーを有する１０ＩｏＭヘペスーＮ　ａ　ＯＨ（ｐＨ７，４）、１ｍＭＥＤＴＡに懸濁した。その後、細胞懸濁液をプランランモデル３５０ソニケーターセルデイスラプター（ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｃ　Ｐｏνｅｒ、コネティカット州　ダンバリー）で６０％出力のパルス設定で水浴中１００ｍ１アリコートで５分間音波破砕した。音波破砕後、粉砕した細胞懸濁液を４℃で５分間かけて１０．０ＯＯｙ：ｇで遠心分離にかけて未破砕細胞を除いた。その後、沈降未破砕細胞を計量し、前記の如く未破砕細胞の湿式重量の約５倍に等しい１０ｍＭのヘベスーＮａＯＨ（ｐＨ７，４）１ｍＭＥＤＴＡ中で再び音波破砕した。

全メンプランフラクションは、最終０．５ＭＮａＣｊ７を得るように十分なＮａＣρの添加および約１時間の破砕細胞物質の１００．０ＯＯｙｇの超遠心分離後、沈降物として得た。

その後外部メンプラン細胞壁複合体は、全メンプランフラクションの１０ｍＭＭヘペスＮａＯＨ，ｐＨ７，４，中の１％サルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）で再抽出による、全メンプランフラクションから内部メンプラン成分を除去して得た。

外部メンプラン細胞壁フラクション含有不溶性残留物は、３５０．０ＯＯｙｇで３０分間遠心分離にかけて単離し、５０ｍＭ）リスｐＨ８，０，５ｉＭＥＤＴＡに懸濁させて４℃で一夜貯蔵した。

ＰＢＯＭＰ−１細胞壁複合体は、外部メンプランフラクション中の他のタンパク質の残りのものから、オクチルグルコシドで外部メンプラン細胞壁フラクションを逐次抽出しく２度）、その後サルコシル（２度）によって抽出して得た。両洗浄剤は、５０ｍＭＭトリス中の１％（ｖ／ｖ）　５ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ８，０で使用した。抽出は、室温（２０℃）で３０分間、それぞれ行なった。その後、混合物を１００．０００Ｘｇで１時間かけて遠心分離した。オクチルグルコシドおよびサルコシルの抽出後、残留する不溶性沈降物質は、ＰＢＯＭＰ−１細胞壁複合体である。

ＰＢＯＭＰ−１は、二法によって可溶化した。すなわち（１）種々の洗浄剤のなかの１種の存在下で１時間かけて６０℃に加熱する方法または（２）洗浄剤の存在化または不存在下で３７℃で１時間リゾチーム消化により細胞壁を破壊する方法である。（１）かまたは（２）の後、可溶性ＰＢＯＭＰ−１を不溶性物質から１５℃で１時間かけて１００．０００　ｘｇで遠心分離にかけて分離した。（１）かまたは（２）のいずれの方法においても、可溶化の臨界的に特別な洗浄剤は選択されなかった。事実、今日迄に試験した洗浄剤の全ては（デオキシコール酸塩、トリトンＸ−１００Ｔ町　トウーン−８０、チャプス（ＣＨＡＰＳ）　、チャプソ−（ＣＩＡＰＳＯ）　、ドデシルマルトサイド、トウィッテルジエント３ −１４”およびトウィッテルジエント３３−１６Ｔを含む）、リゾチーム誘導可溶化と同様に加熱依存可溶化に効果的である。加えて、オクチルグルコシドは、リゾチーム誘導可溶化にきわめて有効であり、１％（ｗ／ｖ）最終濃度で定型的に使用されていた。４０ｇの湿式重量の細胞から、ＢＨＩ１ｇの実質的に他の細胞壁成分のないＰＢＯＭＰ−１を単離することが典型的に可能であった。この実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１製剤は、ＳＤＳ　ＰＡＧＥシステムで分析してこのタンパク質の減少変成形態の相対分子量を決定し、そしてその純度を評価した（第１図）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、５×濃縮サンプルバツフアーで０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣΩ、　ｐＨ７，０，２５＋ａＭジチオスレイトールおよび２％ＳＤＳに調節し、そして１００℃で５分間加熱してサンプルを調製した。電気泳動性前に、サンプルの全てを調節して６％（ν／Ｖ）ショ糖および０．００１％ブロモフェノールブルーにした。大部分の定型分析は、バイオ−ラド　ミニプロチアンゲルシステム（カリフォルニア州　レッドモンド）を使用して行なった。ゲルは、１゜５ｍｍ厚であり、アクリルアミドは、２倍比の３０：０．８まで有する１５％アクリルアミド、０．３７５ＭトリスＨＣＤ　（ｐＨ８，８）および０．１％ＳＤＳを含んでいた。積み重ねたゲルは、ゲル当りアクリルアミドの同じ比率、２倍、まで有する４、８％アクリルアミド、１２５ｍＭ）リスＨＣ１（ｐＨ７，０）および０．１％ＳＤＳを含んでいた。電気泳動後、ゲルを少なくとも１時間、エタノール：酢酸：水（５：　１　：　５）中で０．１２５％クマーシーブルーで染色し、その後青色染料なしで同−溶媒系で脱染色した。オボアルブミン４３，０００；α−キモトリプシノーゲン、２５．７００；β−ラクトグロブリン、１８，４００；リゾチーム、１４，３００．ボビントリプシンインヒビター、６．２００．インスリン（ＡとＢ鎖）、２，３００および３、４００　（ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）を含む前染色低分子重量基準物質を用いてＰＢＯＭＰ−１の相対分子量の測定を補助した。

さらに、ＰＢＯＭＰ−１の精製は、イオン交換クロマトグラフィーモレキュラーシーブ、疎水性または逆相りロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、ゲル電気泳動等の標準的な方法で達成し得る。

アミノ酸分析は、シンプソン等の方法によって行なった（Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＩｅｍ、　２５１　：　１９３６−１９４０）。加水分解は、１００　”Ｃで３３時間厚い壁で被覆されたガラス試験管中で、真空下０．１ｍｌの４Ｎメタンスルホン酸中において０．　５〜１ｍｇのタンパク質を加熱して行なった。各アミノ酸量は、既知量の基準アミノ酸を使用して得られた面積を有する各種のピークのもとで、面積の比較によって得られる。得られた結果を第１表に示す。

Ｔ９ペプチドの配列分析の結果は次のようである。

Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−Ａｓｐ −Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ　−Ｉ　１ｅ−Ａｓｐ−Ａｈａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｈａ８の芳香族アミノ酸（５Ｔ　ｙｒ、３　ｐｈｅ）および５の脂肪族側鎖アミノ酸（Ｉ　Ｌｅｕ、２Ｖａｌ、　２１１ｅ）を含むＴ９ペプチドは、極めて疎水性である。このペプチドのチロシン含量は高いが、ＰＢＯＭＰ−１の全アミノ酸組成に対して一定である（第１表）。加えて、ＰＢＯＭＰ−１が、１３のチロシンを含むがメチオニンまたはトリプトファンを含まないことは一般的である。

６、　１．　２　脂肪酸分析によるＰＢＯＭＰ−１の特徴第６．１．１節に示すように、エドマン分解法によるＰＲＯＭＰ−１の配列化の最初の試みは、遮断Ｎ −末端残基のために満足すべき結果を生じなかった。精製Ｈ，インフルエンザ（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　Ｐ　Ｂ　ＯＭＰ　−１の脂肪酸分析は、共有結合性結合脂肪族アシル基がＰＢＯＭＰ−１ペプチド上で同定できるか否かを調査するために行なった。

脂肪酸分析に先立ち、前記第６．１節の記載のように、単離ＰＢＯＭＰ−１タンパク質を有機溶媒混合物、例えばクロロホルム：メタノール（２：　１）およびデオキシコール酸塩洗浄剤で充分に抽出していかなる微量不純物の内因性脂質、ホスホリピド等を除いた。裸のタンパク質は、アセトン沈降法かまたは充分な透析で得て、凍結乾燥法で乾燥した。既知量のノナデカン酸を内部標準物質として乾燥精製ＰＢＯＭＰ−１（１〜３ｍｇ）に加え、その混合物を窒素雰囲気下１１０℃で４時間かけて２００μｇの４ＮＨＣ，Ｑで加水分解した。かかる酸加水分解は、アミドまたはエステル結合脂肪酸を放出する。加水分解物質は、水で２ｍｌに希釈し、同容量のへキサンで３回抽出した。結合したヘキサン相を同容量の食塩水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。脂肪酸は、パーキンエレマ− モデル８５００ガスクロマトグラフに注入する前に、ジアゾメタン（Ｓｃｈｌｅｎｋ、１９６０．　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、　３２　：１４１２−１４１４）で対応するメチルエステルに変化させた。脂肪酸メチルエステルの分離は、５ＰＢ −１溶融シリカキヤピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ会社製、ペンシルバニア州ベルフォンテ）で行なった。得られたピークは、既知標準物質と比較して同定した。得られた結果を第１６図に示す。

第１６図に示すように、３種類の主要な脂肪酸、即ち、ラウリン酸（Ｃ１２）、パルミチン酸（１６）およびまだ明確に同定されるパルミチン酸誘導体（Ｃ１６ ’）は、ＰＢＯＭＰ−１と結合している。０１６′は、恐ら＜１６個の炭素数を有する分岐脂肪酸である。

実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１は、イムノゲンとして抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体の調製に使用した。部分的に純粋なＰＢＯＭＰ−１の豊富なフラクションは、第６．１節で記載したように調製し、１０℃において３５鱈の一定電流のもとて１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。タンパク質バンドを第６．１．１節で記載したように固定し染色した。ＰＲＯＭＰ−１バンドは、ゲルから切除し、平衡になるまでリン酸塩バッフアート食塩水（ＰＢＳ）（２０畦リン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣＮ、ｐＨ７，４）で透析した。ＰＢＯＭＰ−１含有アクリルアミドゲルフラグメントをＰＢＳ中で２５ゲージニードルで切りきざんだ。そのフラグメントを二ニーシーラント　ホワイトラビットの多部位に筋肉注射した。

各々のラビットは、全量で約２０化の後に、２週問および３週間に再免疫化した。最終免疫化後１週間で動物の血を流し、その血清を回収した。動物にアクリルアミド中２０μｇのＰＢＯＭＰ−１を２ケ月毎に投与して抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体の高力価を維持した。

またＰＢＯＭＰ−１は、第５．１節で記載したように単離したものであり、不完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して乳化した。ラビットにフロインドアジュバント中の約２０μｇのＰＢＯＭＰ− １を筋肉注射した。動物は、最初の免疫化後２週問および３週間に再免疫化し、最終免疫化の１週間に採血した。

６、　２．　２　抗−ＰＢＯＭＰ−１モノクローナル抗体ＰＢＯＭＰ−１に対する抗体を排泄するハイブリドーマ細胞系は、マウス骨髄腫細胞系、Ｘ６３．Ａｇ８．６５４３とＨ，インフルエンザに対して免疫化したＣ　５７／Ｂ　１マウスから得た牌蔵細胞系との融合によって、次のようにして得た。即ち、雌Ｃ５７／Ｂ　１マウスにｌＸ１０６Ｈ，インフルエンザ菌株Ｓ２細胞を、２ケ月間に４回、腹腔内注射した。３ケ月後、そのマウスは、第６．２．１節に記載したように、５ＤＳ−ＰＡＧＥバンドから単離した実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１で免疫化した。１ケ月後、そのマウスは、Ｓ２から全外部メンプランの静脈注射を受けた。細胞融合は、静脈注射後第４日に、当業者に一般的な標準的ハイブリドーマ細胞培養上澄液は、抗体としてＨ，インフルエンザ外部メンブランタンパク質を使用する、標準的なエリザ（ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングした。検定は、４℃で一夜ＯＭＰ被覆した９６ウエルポリスチレンプレートで行なった。

プレートは、４０ｍＭＴｒｉｓ　（＋）Ｈ８，０）、１５０１ｏＭＮａＣｊ７゜５％ノンフ７７トドライミルク（ｎｏｎｆａｔ　ｄｒｙ　５ｏｉｌｋ　）（ＢＬＯＴＴＯ）（第６．４．４節参照ノコと）でブＤツクし、そしてＰＢＳｌｏ、１％トウイーン２０で洗浄した。

ＰＢＳ／トウィーン２０で１：１０に希釈した培養上澄液を加え、２５°において６０分間インキュベートし、そして前述のように洗浄した。結合抗体は、アルカリ性ホスファターゼーゴートＦ　（ａ　ｂ’　）　２抗−マウス（ＩｇＧ。

ＩｇＭ）およびアルカリ性ホスファターゼ基質で検出した。

その後、正の上澄液は、精製ＰＢＯｋｉＰ−１，Ｅ、　コリーＯＭＰ’　ＳおよびＳ２リポポリサツカリド（ＬＰＳ）を有する、ドツトプロット分析でスクリーニングした。所定のハイブリドーマを制限希釈法（ＭｃＫｅａｒｎ　、１９８０．　ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｋｅｎｎｅｔｔ、　ＭｃＫｅａｒｎ　ａｎｄ　Ｂｅｃｈｔｏｌ。

ｅｄｓ、、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ　３７４　）で再クローン化し、Ｈｉ　ｂ　ＯＭＰ’　Ｓを有するウェスターンプロット法でスクリーニングした。

選択ハイブリドーマは、標準的な方法で、腹水として成長させるためにＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した（Ｂｒｏｄｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８４．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ。

抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清の反応性に関するウェスターンプロット分析法は、後述の６．４．４節に記載のように行なった。２−メルカプトエタノール含有試料製剤バッファー中に溶解した１０Ｈｇのにわか細菌培養を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各レーンに塗布した。電気泳動およびニトロセルロースへの転換後、そのプロットをラビットポリクｏ−ナル抗ＰＢＯＭＰ−１（１’）１　：　２５０希釈液でプローブした。ヤギ抗−ラビットＩ　ｇＧ　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ラリーランド州　ゲイセルバーブ）と接合したセイヨウワサビ　ペルオキシダーゼとのインキュベーションは、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清がヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉ　１ｕｓ）中のＰＢＯＭＰ−１とＥ、コリー中の１８０００ダルトンタンパク質を分別することを示す（第２Ａ図）。

Ｅ、コリーの１８０００ダルトンタンパク質と交差反応するＰ　Ｂ　ＯＭＰ　− １のエピトープを確認するために、ＰＢＯＭＰ−１に対して作られたモノクローナル抗体は、Ｅ、コリータンパク質に対する反応性用にスクリーニングした。スクリーニングされた大部分のモノクローナル抗体がＥ、コリーと反応しなかったけれども、あるクラスのモノクローナル抗体は、モノクローナルＧ１−１で例証されるように、ヘモフィルス属のＰＢＯＭＰ−１およびＥ、コリー中の１８０００ダルトンタンパク質と強く反応した（第２Ｂ図）。このことは、ＰＢＯＭＰ− １に存在する少なくとも１つのエピトープがＥ、コリータンパク質のエピトープと交差反応することを示す。このことは、Ｈ，インフルエンザＰＢＯＭＰ−１に対する抗血清があるＥ、コリーに対する感染を保護するだろうということを示す。

６、４．　１　制限酵素消化用条件制限エンドヌクレアーゼは、ＢＲＬ　（メリーランド州ベセスダ）、ＩＢＩ（コネチイカット州　ニューヘブン）。

ニューイングランド　バイオラプス（マサチューセッツ州ベバーリー）またはＵＳバイオケミカルコーポレーション（オハイオ州　クレーブランド）から購入した。

制限酵素消化は、ＤＮＡを適切な制限バッファーに懸濁させ、制限エンドヌクレアーゼを加え、適切な時間インキュベートして完全消化を行なうように実施した。１単位の酵素は、２０Ｈｇの全反応混合物において１時間かけて１、　０μｇのファージラムダＤＭＡを完全に消化するために必要な量と規定される。各種酵素とともに使用されるバッファー類は、下記に示される。即ち、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、１０ａ＋ＭＭｇ　Ｃ１２および１０畦ジチオスレイトール（ＤＴＴ）から成るＣＩａＩ、ＨｐａＩ。

ＨｐａＩＩ、およびＫｐｎＩ消化用に使用される低塩バッファー。

５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８，０）、１０ｍＭＭｇＣΩ　、５０ｄＮａＣｆ１および１０ｍＭつＴＴから成るＡｌｕｌ、　ＡｖａＩ。

ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、　ＨａｅＩＩ、　ＨａｅＩＩ［、Ｈｉｎｃ　ｍ、　Ｈｉｎｄｍ、ＰｓｔＩ、５ａｕ３ＡＩ、５ｐｈＩ、５ａｔＩ、５ｓｔＩＩ、Ｔａｇ■、およびＸｈｏＩ消化用として使用される中塩バッファー。

５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐ）１８．０）　、１０ａＭＭｇ（、ｆ１２　、１５０ｍＭＮａＣ，Ｑおよび１０ｄＤＴＴから成るＢａｍＨＩ　、　ＥｅｏＲＩ　。

ＰｖυＩ、５ａｌＩおよびＸｂａＩ消化用として使用される高塩バッファー。

Ｓ　ｍａ　Ｉ消化用に使用したバッファーは、１０＋ｏＭトリス（ｐＨ８，０）、２０ｍＭＫＣｇ、１０ｍＭＭｇ（Ｊ）２および１０ｍＭＤＴＴから成っていた。制限消化の全ては、６０℃制限酵素消化後、種々のサイズのＤＮＡフラグメントは、分離し、５０１トリス−アセテート１ｍＭＥＤＴＡバッファーｐＨ７，８を使用する低融点温度アガロース（ＦＭＣＬＧＴアガロース）中で、１０ボルト／　ｃｍの条件でゲル電気泳動して精製した。

アガロース濃度は、回収すべきフラグメントの大きさによって０．８％〜１．５％で変化した。ＤＮＡバンドは、エチジウムブロマイド螢光で視認化でき、ゲルを切断した。

ＤＮＡは、６５℃でアガロースを溶融し、４容積の６５ＭＮａＣＮ　、１０ＨＴｒｉｓ（＋）Ｈ８，Ｏ）、１ｍＭＥＤＴＡを加えて混合物の最終濃度を０．５ＭＮａＣ１とし、０．　５ｍＭＮａＣｇ、１０ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ８，ｏ、１ｍＭＥＤＴＡ　（ｏ−ディングバッファー）で平衡にしたＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ　。

メリーランド州　ベセスダ）上にＤＮＡを負荷し、そのカラムを３〜５容積の負荷バッファーで洗浄し、そして２〜３容積の２ＭＮａＣρ、１０ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴＡで溶出させて回収した。ＤＮＡ溶出物を二度蒸留Ｈ２０で１：１に希釈し、３容積のエタノールで沈降させた。沈降物は、７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥し、１ＷＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ）バッフｙ−（ＴＥバッファー）に再懸濁させた。

６．４．３　ＤＮＡ連結連結の全ては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて行なった。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ＢＲＬ　（メリーランド州　ベゼスタ）、ユナイテッドステーツバイオケミカルス（オハイオ州　クレーブランド）またはベーリンガー（インジアナ州　インジアナポリス）から購入した。１単位（Ｕ）のＴ４ＤＮＡリガーゼは、５’−ＤＮＡチルミニ（ｔｅｒｍｉｎｉ）濃度が０．１２ｄＭ　（３００μｇ／ｍｌ）において、２０ｄｇ容積リガードバッファー中１６℃で３０分間かけてバクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍフラグメントの５０％連結を形成するために必要な量と規定される。ＤＮＡ連結は、５０ＩＤＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣｌ１２．１０ｄ　ＤＴＴ、１ｍＭ７デノシントリフオスフエートからなるリガーゼバッファー中で行なった。一般に、２０〜３０μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度およびベクターの挿入物に対するモル比１：１であった。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、２０μｇ反応容積当りＩＵの比率で加えた。インキュベーションは、１８〜２４時間行なった。結合端連結温度は、１５℃。

プラント（ｂｌｕｎｔ）端連結温度は２２℃であった。もし充分な物質が利用できるならば、アガロースゲル電気泳動によるある部分の反応混合物を分析して連結を調べられる。

６．４．４　タンパク質免疫プロット分析（ウエスタタンパク質は、独特な適用法に依存するが、種々の方法による免疫プロット分析用にニトロセルロースシートに固定する。ファージプラークは、徐々に無菌８．　１ｃｍ直径ニトロセルロース盤を配置することによって、アガープレートから１０ｃｍ直径のファーシカ価プレートの表面に移した。

そのシートを完全に湿らせ、無菌針でフィルターを介してパンチングして位置を記し、そしてそのフィルターを２分後に持ち上げた。

コロニープロットは、細菌コロニーをニトロセルロースシートに移し、そのシート（コロニー面）を栄養素アガー上に４〜６時間載置することによってそのコロニーを生長させ、そのシートをクロロホルム蒸気に３０分間さらしてコロニーを溶解させることによって行なった。タンパク質ＰＡＧＥゲルをニトロセルロースシート上に載置し、ホエファートランスホー（Ｈｏｅｆｆｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ）装置で０．５Ａ。

１４時間の条件で２５ｍＭＴｒｉｓ　０．　３８ＭグリセリンｐＨ８，８バツフアー中で水平電気泳動法を応用して行なった。

タンパク質移動が完全になるや否や、フィルターは、コロニープロットを除いて、すべての場合に３７℃で１時間かけて５０ｓａＭＴｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、１５０ｍＭＮａ（Ｊ）　、５％ノンファツトドライミルク（ＢＬＯＴＴＯ）に浸した。コロニープロットが実施されると、そのフィルターは、１　ｍｇ　／　ｍｌリゾチーム含有ＢＬＯＴＴＯに４℃で１晩浸して細胞デブリス（ｄｅｂｒｉｓ）を消化した。その後、該フィルターは、３７℃で３時間かけてＢＬＯＴＴＯ中で適切な希釈度（試行錯誤によって決定する）において第１抗体プローブで吸収し、ＢＬＯＴＴＯで１５分間かけて３回洗浄し、３７℃で１時間かけてＢＬＯＴＴＯ中１　：　５００の希釈度でセイヨウワサビ　ベルオキシターゼ接合第２抗体で吸収し、そしてＢＬＯＴＴＯで３回、１５分間かけて洗浄した。フィルターは、５０＋ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，０）、１５０ｍＭＮａＣＤ　、０．１％ハイドロジエンパーオキシダーゼ中に置き、そしてメタノール中の０．０６％４−クロロ−１−ナフトール（シグマケミカルコーポレーション、ミズーリー州　セントルイス）を加えた。もし青色が２０分間以内に展開しないならば、その反応は負であると考えられた。その反応は、そのフィルターを蒸溜水に移し、そして乾燥をプロット（ｂｌＯｌ）シて止めた。

６、４．　５　遺伝子融合ＰＢＯＭＰタンパク質またはそのペプチドをコード化する遺伝子または遺伝子と他の遺伝子、例えばアルカリ性ホスファターゼ（Ｐ　ｈｏＡ　）をコード化する遺伝子、との融合は、マノイルおよびベックウィズによって記載されたように行なった（Ｍａｎｏｉｌ　ａｎｄ　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ　、１９８５．　Ｐｒｏｃ。

組換えプラスミドは、天然Ｐ　ｈｏＡを欠き、Ｆ−プライムプラスミド上にＴｎ　５の左末端繰り返し中に挿入したアルカリ性アスファターゼ遺伝子、即ちプロモーターとメンプラントランスポート信号配列の両者を含まない、を含むトランスポゾンＴｎ　５の誘導体（Ｔｎ　ＰｈｏＡ）を運搬するＥ。

コリー菌株中に導入した。それ故、活性アルカリ性フォスファターゼ酵素の産生には、ＴｎＰｈＯＡの転移を必要とするので、Ｐ　ｈｏＡ遺伝子はフレーム中で融合してメンプラン転移信号ペプチド含有活性転写遺伝子中に入るかかる転移は、４０ｄｇ　／　ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＸＰ、シグマケミカルコーポレーション、ミズーリー州　セントルイス）の存在下に細胞を平板培養することにより検出した。この染料の存在下において、活性アルカリ性ホスファターゼ酵素を産生ずるコロニーは、ＤＮＡフィルターハイブリダイゼーション分析は、サザンの方法に従って行なった（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１Ｂｉｏ１．　９８　：　５０８）。フィルターハイブリダイゼーションにより分析すべきＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、９０　ｍＭＴ　ｒｉｓ−ボレート、８ＵＩＭＥＤＴＡバ’／７７−を使用する０、８％アガロース（Ｓｅａｋｅｍ　Ｐｏｒｔｌａｎｄ。

ＭＥ）中１０ボルト／ｃｍでアガロースゲル電気泳動法で分離した。ゲル中のＤＮＡは、そのゲルを１．５ＭＮａＣｆｌ１０．５ＭＮａＯＨ中に１時間浸し、そして１．５ＭＮａＣｆ！／１．　ＯＨＴｒｉｓ−ＨＣｌ）に１時間浸して中和することによって変性した。変性ＤＮＡは、プロッティングにより、ニトロセルロースフィルター紙に移した。ＤＮＡの転移後、フィルターは６ｘＳＳＣ（１７５，５ｇＮａＣΩと８８．２ｇクエン酸Ｎａ／リッターを含む２ＯＸＳＳＣ株から希釈して調製した）で洗浄し、空気乾燥した。ＤＮＡフラグメントは、真空下８０℃で２時間ベーキングしてフィルターに固定した。

ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、リグバイ等の方法によるニックトランスレーション法で調製した（Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、　Ｊ、Ｍｏ、　Ｂｉｏｌ、、１１３　：　２３７−２４４）、ブｏ−ブ用ＤＮＡ　（１ −２ｔ−ｔｇ）　１００Ａｔ＝ツクトランスレーシヨンバツフアーに溶解した（５０ｍＭＴ　ｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ）　、　ｐＨ７，４，１０ｍＭＭｇＳＯ４，１０ｍＭＤＴＴ。

５μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンおよび２０μｍ各ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）。この反応混合物に、１００μＣ１のα３２Ｐ−ｄＡＴＰ（アメルシャム、２−３ｏｏ。

Ｃｉ　／　ｍモル）、１．０μｇデオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマケミカル　コーポレーション、ミズーリー州　セントルイス）およびＩＯＵ　Ｅ、コリーＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー）を加えて、その混合物を１５℃で４５分間インキュベートした。反応は、ＥＤＴＡを５０１１ＩＩＭ加え、そして１０分間で６０℃に加熱して酵素を不活性化することによって止めた。標識化ＤＮＡは、３容積のエタノールを加えて沈降させ、そして５０μｇの０．３Ｍアンモニウムアセテート（Ｎ　Ｈ４０Ａ　ｃ　）に再懸濁した。試料は、０　、　３　Ｍ　Ｎ　Ｈ、ｉ　０　Ａ　ｃで平衡にした１ｍｌのバイオゲルＰ−５０スピンカラムに加え、５００ｘｇで５分間かけて遠心分離して溶出させた。そのカラムを１００μΩの０．３ＭＮ　Ｈ４０Ａ　ｃおよび結合溶出物で洗浄し、そして３容積のエタノールで沈降させた。標識化ＤＮＡ沈降物、即ち、ベックマン（Ｌ　Ｓ　９０００）シンチレーションカウンタでチェレンコーワ分散（Ｃｈｅｒｅｎｋｏｖ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法によって測定した放射性合体を真空乾燥し、そしてＴＥバッファーに再懸濁した。

ハイブリダイゼーション用に結合ＤＮＡを有するフィルＳ　Ｄ　Ｓ　／　５　ｘデンハルト溶液／　１００　ｕ　ｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡでもって６８℃で２時間かけてプレハイブリダイズしてフィルターの余分の結合能力をブロックした（ｌｘデンハルト溶液は、水中の０．０２％フィコル、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミンである。）。

ハイブリダイゼーション反応は、Ｏ，ＯＩＭ　ＥＤＴＡおよび５−１０．０００．ｏｏＯｃ　Ｐ　Ｍ（Ｃｈｅｒｅｎｋｏｖ）標識化プローブを加えた同一バッファー中で行なった。プローブ溶液は、適用前に１０分間で９０℃まで加熱してＤＮＡ鎖を変性し、６８℃に冷却し、そして６８℃で１８〜２４時間、フィルターとインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、非特異結合プローブ除去のため、６８℃で種々に変化した０、１ｘＳＳＣ１０，５％ＳＤＳで洗浄した。使用条件下で、９０％以上のＤＮＡ相同性は、ＤＮＡプローブの正結合性を示すだろう。フィルターを空気乾燥し、スクリーンを増度するデュポンクロネックス“ライティングプラス″を使用して一７０℃でコダックＸＡＲフィルムに曝露した。

ＰＢＯＭＰ遺伝子のクローニング用Ｈ，インフルエンザ染色体ＤＮＡ源は、菌株互−イーガン（Ｅａｇａｎ）からタイプｂ十にＤＮＡによって転換したＨｉの非エンカプセル化２０　ｂ）　（Ｍｏｘｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、１９８４．　Ｃｌ１ｍ、Ｉｎｖｅｓｔ、７３　：２９８−３０６）かまたはＨｌ　ｂイーガンの突然のカプセルなしの突然変異体であるＨ、インフルエンザ５２（ＨｉＳ２）であった。

ファージラムダライブラリーを生成するために、Ｈｌからの染色体ＤＮＡを平均長さ約１５０００塩基対（ｂｐ）にずらし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる処理によってブラシベクターカロン４にクローン化する。

プラスミドライブラリーを生成するために、ＨｉＳ２の染色体ＤＮＡは、Σａｕ３Ａで部分的に開裂し、このように生成した３〜８キロベース（ｋｂ）長制限フラグメントを単離し、そしてＢａｍＨＩ制限部位においてプラスミドベクターｐＧＤ１０３に結合した。このプラスミドは、ｐＬＧ３３９誘導体（第３図および５ｔｏｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２゜びプラスミドｐＵ　Ｃ８からのポリリンカー領域を含む；それ故に、適切なＥ、コリー菌株０Ｍ８Ｂ）に形質転換すると、Ｌａｃ＋フ二ノタイノタイプをスクリーニングすることによって組換えプラスミドの選択を許容する。普通の配向でクローン化すると、Ｅ、コリー中で不完全に表わされるクローン化遺伝子が強く調節されたｆｌ　ａｃプロモーターの制限のもとで生ずるだろう。組換えプラスミド含有Ｅ、コリーは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清のプール化混合物を使用するＰＢＯＭＰの産生用にスクリーニングされた。

６．５．１ＨＩプラスライブラリーの構成ＰＢＯＭＰ−１タンパク質がラムダファージと表わせずまたはラムダファージと両立しないことも可能である。このことを調べるために、我々はＨｉＳ２のプラスミド染色体ライブラリーを構成した。Ｅ、コリーＯＭＰ遺伝子の高コピー数プラスミドのクローニングは、毒性であることをている（例えば、Ｂｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０　、　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、８：３０１１−３０２４参照のこと）。この問題を避けるために、低コピー数プラスミドｐＧＤ１０３を使用した（第３図参照のこと）。

Ｈ１Ｓ２からの染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ　（ＢＲＬ、メリーゴーランド州　ベセスダ）で部分的に修飾した。５００　ｍｇのＤＮＡは、５ｍｌの制限ノ（・ソファ−中で３７℃において１時間かけて５０ユニツトの Σ些３Ａで消化した。フラグメントは、ベックマン５Ｗ２８０−ター中で１０ｍＭＴｒｉｓ　（ｐＨ８，０）　、１ｍＭＥＤＴＡ、　ＩＭＮａ（Ｊ）含有１０− ４０％ショ糖グラジェントでもって１４０　、０００ｘ　ｇで２４時間かけて速度沈降法によって分離した。

２ｍｌのフラクションを集め、アリコートをアガロースゲル電気泳動法により分析した。長さ３〜８ｋｂの制限フラグメント含有フラクションをプールし、ＴＥバッファー中で濃縮した。プラスミドｐＧＤ１０３　ＤＮＡは、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで消化し、仔ウシアルカリ性ホスファターゼ処理した（ベーリンガー、インジアナ州　インジアナポリス）（１ユニット／μｇＤＮＡ、制限バッファー中で３７℃で３０分間）。反応混合物からフェノール抽出およびエタノール沈降法によってＤＮＡを精製し、ＴＥバ・ノファーに再懸濁した。ＢａｍＨＩと５ａｕ３Ａ制限酵素が付着端を形成するので、連結前にさらにＤＮＡ処理を行なう必要Ｔ４−リガーゼ（ベーリンガー、インジアナ州　インジアナポリス）含有リゲーションバッファ−５００ｍ１で混合し、１５℃で１８時間かけてインキュベートした。２０μｇアリコートの反応混合物は、連結反応を実証するために、アガロースゲル電気泳動法によって分析した（出発物質は隣接レーンで行なった）。その後、連結混合物は、３７℃においてＬＢ−ブイヨン中で１時間かけてインキュベートした成分Ｅ、コリーＪ　Ｍ８３　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８２゜）１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐ。

２５０）に転換し、５０μｚ　／　ｍｌカナマイシンサルフェート（シグマケミカルコーポレーション、ミズーリー州　セントルイス）および４０μｇ　／　ｍｌ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベーター−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ　−ｇａｌ　、ＢＲＬ、メリーランド州　ベセスダ）を含有するＬＢ− アガー板上で平板培養し、そして３７℃で２４時間かけてインキュベートした。

約５０％のカナマイシン１０の白いコロニーを無差別に選択し、増強し、そしてべ８ｋｂ大きいプラスミドを含むことが示される。

１５２５の白いコロニーを採取し、それぞ゛れ増強し、９６ウ工ル微少力価皿において１８％の無菌グリセロール含有ＬＢブイヨン中で一７０℃で凍結して貯蔵した。

６、　５．　２　ＨＩＢラムダ遺伝子バンクの構造Ｈ１ＫＷ２０ｂからの高分子量染色体ＤＮＡは、２００μｇ／ｍｌ濃度でＴＥバッファーに懸濁させ、２５ゲージ針を通過させて平均１５０００ｂｐ長に剪断した。５０畦Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，８）、１０ｍＭＭｇＣｆＩ２．２０ｍＭ（ＮＨ４）　２Ｓｏ４゜１０＋ＭＤＴＴ、５０μＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ中で３７℃で２０分間かけてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって突出端を除いた。その後、１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８，０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭ５−アデノシル −メチオニン中において３７℃で３時間かけてＥｃｏＲＩＤＮＡメチラーゼ（ＩＵ／μｇＤＮＡ）（ＢＲＬメリーランド州　ベセスダ）で処理してＤＮＡを修飾した。ＤＮＡのメチル化は、反応から１μｇのＤＮＡを除去し、１μｇの未修飾ラムダＤＮＡと混合し、そして２０μｇの高塩制限バッファー中で３７℃において１時間かけて５単位のＥｅｏＲＩを消化することによって立証した。これらの条件下において、修飾Ｈｉ　ＤＮＡは消化されないが、添加ラムダＤＮＡは完全に消化された。

１００μｇの反応混合物中において７４ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ）を使用した２０ μｇの修飾Ｈｉ　ＤＮＡは、１μｇの化学的に合成されたＥｅｏＲＩリンカ−（ＢＲＬメリーランド州　ベセスダ）と連結した。１８時間後、２０分で６０℃まで加熱してその反応を停止し、最終濃度１５０ｍＭになるようにＮａＣｆＩを加え、そして混合物を６時間かけて１０Ｕ　ＥｅｏＲＩで消化した。−前記のようにアガロースゲル電気泳動法によって開裂および未連結リンカ−から修飾Ｈｉ　ＤＮＡとリンカ−を分離した。

調製Ｈｉ　ＤＮＡは、ラムダカロン４ＤＮＡの左および右そして１８時間かけてＴ４ＤＮＡポリメラーゼと連結した。

インビトロバッキング反応を使用して、連結化ＤＮＡ混合物をラムダファージ粒子中に詰めた。４μｐＨ２０中の５ｔ、ｔｇの連結ＤＮＡを７ｔｔｆｌの２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）　、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）　、３ｍＭＭｇＣｆ）２　。

１μＮの１０ｍＭＴｒｉｓ　、　ｐＨ７，５，１ｍＭスペルミジン、２硅プトレシン、１０＋＋＋ＭＭｇ（Ｊ）　、１．５ＩＩＭＡＴＰ、５ｍＭ２ＭＥおよびＥ、コリーＢＨＢ２６９０　（−１ｉｎ＋ｍ　４３４゜Ｃ１ｔＳ、　ｂ２．　ｒｅｄ　３．　Ｅａｍ１５．　Ｓａｉ＋７）溶解産物からの５μｇの音波抽出物に加えた（Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４　：　３２５９）　ｏ反応混合物は、２２℃で１時間インキュベートし、ベックマン５Ｗ５０．１０−ター中で４時間２５０．０００ｘｇで３Ｍ　〜５Ｍ　Ｃｓ　Ｃｆｌ　［１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭＭｇ（，１，０，２％ゲラチン（ＴＭＧバッファー）中でステップグラジェント中で遠心分離してパッケージ化ファージを分離した。ファージを界面から除き、ＴＭＧに対して透析した。このように調製されたファージの力価を測定すると、Ｈｉゲノムの２５−３００００独立クローンのライブラリーが生成したことを示している。ファージホストとしてＥ、コリーＫＨ８０２を使用してプレート増強によってファージライブラリーを増強して１０−９プラーク形成ユニツト（ＰＦＵ）／ｍｌ含有ファージサスペンション５ｍｌを産生じた。

ＬＢカナマイシン（５０μｇ　／　ｍｌ　）アガー上のニトロセルロースシートにＨｉプラスミドライブラリーを移し、３７℃で２４時間かけて成長させ、プローブとしてのＰＢＯＭＰ−１に対する５の非競合モノクローナル抗体混合物を利用するコロニープロット法により分析した。混合モノクローナルプローブと反応するクローンを単離し、そしてそのプラスミドをｐＡＡ１５２と指定した。

第４図は、ベクターｐＧＤ１０３に挿入した４、２ｋｂＨｉ　ＤＮＡを含有するｐＡＡ１５２の制限マツプを示す。

ウェスターンプロット分析は、クローンｐＡＡ１５２がポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１および同様にプール化モノクローナル抗体プローブによって認識される１６００ダルトンタンパク質を発現することを立証する。その後、クローンｐＡＡ１５２は、最初のプールにおいて使用された個々のモノクローナル抗体によって認識されるタンパク質を産生ずることが示される（第５図）。

ｔ、たＰＢＯＭＰの発現の損失を生じた。ポリリンカーのＨｉｎｃＩＩ部位からＨｉ挿入ＤＮＡのＸｂａＩかまたは旦１■部位への欠失は、ＰＢＯＭＰ発現を保持した（第４図）。

これらの結果から、我々はＰＢ−ＯＭＰをコード化する遺伝子がｐＡＡ１５２のＨｉ　ＤＮＡ挿入物内のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ７３７塩基対フラグメント中に在ると結論づける。

ｐＡＡ１５２を運搬する小細胞の分析（Ａｅｈｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７９、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：４８３７−４１）は、クローン化Ｈｉ　ＤＮＡがそれぞれ１６０００および４００００ダルトンの２タンパク質をコード化することを示した（第６図）。ＪＭ８３　（ｐＡＡｌ　５２）のウェスターンプロットは、ＰＢＯＭＰ−１に対して生じたプール化モノクローナル抗体が１６０００ダルトンタンパク質と反応することを示す。４００００ダルトン分子量領域内において、交差反応は無い。

６、６．　２　ポリクローナル抗−ＰＲＯＭＰ−１抗血第６．　５．　１節で記載したように調製した増強ファージライブラリーは、１ｍｌのＴＭＧにおいて１ −２０００ｐＦＬＩに希釈し、そして５０μｇのＥ、コリーＫＨ８０２（５Ｘ１０９細胞／ｍｌ）を加えた。その混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、ＮＺＹＣＭ媒地、即ち１０ｇＮＺアミンＡ、５．０ｇＮａ　Ｃ１，２，０ｇＭｇ５０　．７Ｈ２０，５ｇイースト抽出物、１ｇカザミノ酸（１リットル当り）を含む、を含有するアガープレート上の３ｍｌの軟アガーで平板培養した。プレートは、−夜インキユベートし、３０〜６０分間４℃に冷却し、そしてプラークをニトロセルースに移した。上記第６．４．４節で記載したように、ポリクロナール抗−ＰＢＯＭＰ−１でフィルターをプローブした。この方法で種々の正プラークを検出した。しかしながら、ＰＢＯＭＰ−１モノクローナル抗体をプローブとして使用した場合には正プラークは検出されなかった。プレートから正プラークを採取し、Ｅ、コリー（Ｅ、Ｃｏ１１）ＫＨＳＯ３における成長によって増強した。溶解産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル／ウェスターンプロット分析によってクローンを立証した。正クローンの全ては、ＰＢＯＭＰ−１ポリクロ一ナル抗体と反応する見掛分子量１６０００ダルトンのタンパク質を発現した。

このタンパク質は、カロチン４フアージ対照溶解産物中に存在しなかった。類似実験において、正クローンからの溶解産物は、モノクローナル抗体と反応してＰＢＯＭＰ−１となること失敗した。

ある正ファージ、それはラムダ１６−３と称されるが、次の分析のために選択した。このファージ単離は、ＮＺＹＣＭブイヨン中のＥ、コリーＫＨ８０２中の成長によって増強され、２０％ポリエチェングリコール６０００による沈降によって回収され、そしてセシウムクロライド平衡グラジェントにおいてバンドを示した（ＴＭＧ中の４ＭＣ５ＣΩ。

ベックマン５Ｗ５０．ｌｏ−ター、３０００．０００ｘｇで２４時間）。０．１％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌブロティナーゼＫ（シグマケミカルコーポレーション、ミズーリー州　セントルイス）処理を５５℃で行ない、その後フェノール抽出およびエタノール沈降によってファージＤＮＡを単離した。

ＥｅｏＲＩでラムダ１６−３ＤＮＡを消化し、そしてＨｉ染色体挿入物の部分物理マツプを得た。その挿入物のＥｃｏＲ１フラグメントを単離し、プラスミドベクターｐＧＤ１０３にサブクローンした。細胞溶解産物のウェスターンプロット転写分析法によって、１６０００ダルトンタンパク質に交差反応性ＰＢＯＭＰ− １を発現するフラグメントを運搬するクローンを同定した。これらの１つをｐＡＡ１３０と指定した。第７図は、ｐＧＤ１０３プラスミドにクローン化したＨｌ　ＤＮＡからの５．７ｋｂフラグメントを有するプラスミドの制限マツプを表わす。

ＰＢＯＭＰ−１に対するモノクローナル抗体は、ｐＡＡ１３０から発現した１６０００ダルトンタンパク質とは反応しなかった（データは示されていない）。この組換えプラスミドによって発現されるタンパク質は、しかしながら、ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって認められた（例えば、第８図参照のこと）。

ｐＡＡ１３０を運搬する小細胞の分析（Ａｃｈｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

前記）は、クローン化Ｈ１ｂＤＮＡが見掛分子量１６０００および１７０００ダルトンのタンパク質をコードすることを示した。ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ −１によって、標識化１６０００ダルトンタンパク質は、特異的に免疫沈降化した（データは示されない）。このように、プラスミドｐＡＡ１３０は、１６０００ダルトン分子量ＰＢＯＭＰの発現を教える。

■の間に挿入されたＤＮＡの切除によって生じた内部欠失は、交差反応タンパク質の発現に影響を与えなかった。類似方法によって、このプラスミドのＸｂａＩフラグメントを除去し、そしてＰＢＯＭＰ−１交差反応性タンパク質の発現が保持された（第７図）。二内部Ｂｇ１ｍ部位の再連結化によって、このプラスミドの付加的欠失誘導体を生成し、そしてこの誘導体もＰＢＯＭＰ−交差反応性タンパク質発現を維持した。

低融点アガロースゲルからフラグメントを単離し、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのフレノウフラグメントでＥｓｔＥＩ［端を満たし、そのフラグメントをｐＧＤ１０３のＨｉｎｅＩＩ部位−ＰＢＯＭＰ−１を使用するウェスターンプロット分析は、このプラスミドが１６０００ダルトンＰＢＯＭＰの発現を維持することを示した。ｐＡＡ１３０の場合のように、このプラスミドから産生じたＰＢＯＭＰは、モノクローナル抗体と反応してＰＲＯＭＰ−１とならなかった。

このＰＢＯＭＰ遺伝子の局在を立証する独立の方法として、ｐＡＡ１３０の大ＥｃｏＲＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメントは、ｐＬ　Ｇ　３３９のＥｃｏＲＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメントと連結してｐＡＡ１３６と指定された新規なテトラサイクリン耐性プラスミドを生成する。このプラスミドは、ウェスターンプロット法で立証されるようにＰＢＯＭＰを発現する。染色体のアルカリ性フォスファターゼ遺伝子（Ｐ　ｈｏＡ　）の欠失でこのプラスミドは、Ｅ、コリー菌株に転換され、そして移動性元素ＴｎＰｈｏＡを運搬する。アルカリ性フォスファターゼ活性を再貯蔵するｐＡＡ１３６へのＴｎＰｈｏＡ元素の３つの独立移動は単離された。Ｔｎ　ＰｈｏＡ部位のｐＡＡ１３６への挿入は、ＴｎＰｈｏＡの左末端領域近傍の単−Ｄ　ｒａ　Ｉ制限部位およびｐＡＡ１３６のＨｉｎｄｍ、旦ｓｔｍ　。

挿入の全ては、ｐＡＡ１３６のＢｓｔＥＩＩ−Ｘａ＋ｎＩフラグメント内に入ると決定された。３種のＴｎＰｈｏ挿入の全ては、３種のＴｎＰｈｏＡ移動の全ては、ウェスターンプロットで検出されたように、ポリクローナル抗−ＰＲＯＭＰ −１抗血清によって検出された１６０００タンパク質の損失を生じた。ある融合は、ウェスターンプロット上ポリクローナル抗−ＰＲＯＭＰ−１抗血清によって検出された６００００ダルトンにおいて新しいバンドを生成した。この大きさは、アルカリ性フォスファターゼ（４５０００ダルトンＭＷ）から１６０００ダルトルＭＷタンパク質の融合によって生成したであろう融合タンパク質の予想範囲内である。これらの移動におけるＰｈｏＡ活性の回復は、ＰＢＯＭＰタンパク質がメンプラン移動、それ故にメンブランタンパク質であろう、のペプチド信号を保持することを立証する。

ＴｎＰｈｏ融合は、ＴｎＰｈｏＡとＨｉクローン化ＤＮＡ配列間の結合をＭ１３にサブクローンすることにより配列化した。すべての場合において、Ｐ　ｈｏＡコード配列は、ｐＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ−２遺伝子用の予想読み取り枠を有する枠であると決定された（後述の第６．　７．　２節参照のこと）。

６．７　ＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列決定ｐＡＡ１５２によって発現されるＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、ｐＡＡ１５２の７３７ｂｐＢｇ１ｍ　−ＢａａＨＩフラグメントのジデオキシヌクレオチド配列化（Ｓａｎｇａｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　ｌ　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵＳＡ　７４　：　５４６３−５４６７）　、即ち、Ｍ１３ファミリー、Ｍ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９の単一鎖ファージへのサブクローン後であるが、によって得られた。　これらのサブクローンから決定された配列の位置および方向は、第９図に示されている。見■ｎ−ＢａｍＨＩフラグメントの完全ヌクレオチド配列は、第１０図に示されている。

ｐＡＡ１５２の７３７　Ｂｇｌｌｌ−見間ＨＩフラグメントは、１５３のアミノ酸のポリペプチドをコードする単−読み取り枠（ＯＲＦ）を含む（第１１図）。

ＤＮＡ配列から決定されたＰＢＯＭＰ遺伝子のアミノ酸組成は、ＰＲＯＭＰ−１精製タンパク質のアミノ酸組成に極めて匹敵する（第１表および第２表参照のこと）。

第　２　表アスパラギン酸　９６ａ　成熟ＰＢＯ〜ＩＰ−１の見掛分子量は１４．２３８ダルトンであった。アミノ酸残基数は１３４であった。

ｂ　成熟ＰＢＯＭＰ−２の見掛分子量は１３．４６１であった。

アミノ酸残基数は１３６であった。

加えて、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子は、Ｔ９ペプチド配列がなＬ）Ｌｅｕ−６８残基が許容されるならば、アミノ酸がＰＢＯＭＰ−１のＴ９内部ペプチドのアミノ酸配列に参加する（３０／３３）内部ペプチド配列（ＡＡ４８−８１）を有する（第１２図）。同様に、ＰＢＯＭＦ−１のアミノ末端領域は、他のメンプラン移動ペプチド配列と類似性を示すアミノ酸配列を含有する（Ｗａｔｓｏｎ、　１９８４　、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１２：５１４５−５１６４）、これらのデータおよびモノクローナル抗体結合データから、我々は、この遺伝子がＰＢＯＭＰ−１タンパク質をコードすると結論ｐＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｍ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９ファージへのサブクローン後ｐＡＡ１３０の７８９塩基対のＢｓｔＥ　ＩＩ　−Ｘｍｎ　Ｉフラグメントのジデオキシヌクレオチド配列化（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、前記参照）によって決定した。これらの組換えファージは、それぞれＭ１８００１およびＭ１９００１と指定されている。一般の１７塩基オリゴヌクレオチド配列化プライマーにューイングランド　バイオラプス）は、ＢｓｔＥＩＩ−ＸｍｎＩフラグメントの両端からの配列を決定するために使用された（第１３図参照のこと）。２つの付加的なオリゴヌクレオチドは合成され、ジデオキシヌクレオチド配列用のプライマーとして使用された（Ｍ２Ｓ　Ｐ　ＲＩ　、　Ｍ１９　ＲＲ２）。

他の配列化プライマーの全ては、ニューヨーク州ロチェスターブラクシスバイオロジックスにおいてアプライドバイオシステム３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーで作られた。

それらのプライマーは、ベータシアノエチルホスフェート保護基化学特性を有する１μモル対照ポアーガラスカラムで製造された。オリゴヌクレオチド産出物は、十分に純粋であり、さらに精製することなくカラムから直接的にプライマーを使用することを許容する。第１３図に示されるように、２合成オリゴヌクレオチドブライマーは、フラグメントの各端において約２００ヌクレオチド配列に結合する。ｐＡＡ１３０のＢｓｔＥＩＩ−ＸｗｎＩフラグメントの全７８９ｂｐＤＮＡ配列は、第１４図に示される。ＯＲＦは、第１５図に示されるようにアンダーラインで示される。このようにＯＲＦは、１５４のアミノ酸ポリペプチドをコード化する。アミノ末端１８残基ペプシドは、他のタンパク質を決定するメンプラン運搬信号配列に似ている（Ｗａｔｓｏｎ。

１９８４、前記した）。加えて、ｐＡＡ１３０においてＴｎ　ＰｈｏＡ融合からの配列データは、３種の移動の全てが１５４アミノ酸ポリペプチドの読み取り枠の中であることを示した。

ｐＡＡ１３０のＯＲＥのＤＮＡ配列から推定されるように、提案された成熟遺伝子のアミノ酸組成は、精製ＰＢＯＭＰ−１のアミノ酸分析によって決定されたものと著るしく異なる（第１表および第２表）。ｐＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺伝子のアミノ酸配列を精製ＰＢＯＭＰ−１タンパク質からのトリプシンペプチドＴ９と比較すると、顕著な相同性は見い出されなかった。加えて、この遺伝子によってコード化された生産物がポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって認識されるけれども、ＰＢＯＭＰ−１へのモノクローナル抗体によって認識されない。これらの観察から、ｐＡＡ１３０によって発現されるＨ１遺伝子がＰＢＯＭＰ−１用の遺伝子ではないことは、明らかである。このようにｐＡＡ１３０によってコード化されたＰＢＯＭＰ−遺伝子は、ＰＢＯＭＰ−２と指定された。

第６．１．２節で記載したように、Ｈ，インフルエンザから単離されたＰＢＯＭＰ−１は、ラウリン酸、パルミチン酸およびパルミチン酸誘導体を含む脂肪酸に共有結合的に付着するので、細菌リポタンパク質として分類し得る。

次の実験は、組換えＥ、コリーによって発現されるＰＢＯＭＰかりボタンバク質として存在するか否か調査するために行なった。２種の異なるインビボ方法は、発現ＰＢＯＭＰのリポタンパク質の性質を立証するために使用した。

一連の実験において、ＰＢＯＭＰ発現性組換えプラスミド含有細胞は、放射性標識化脂肪酸の存在化で培養した。

かかる条件下で、共有結合的に付着した脂肪酸を含有するように形成されたいずれのりボタンバク質も、特異的に放射性標識化されるだろう。

ＰＢＯＭＰ−１発現性プラスミドｐＡＡ１５２かまたはＰＢＯＭＰ−２発現性プラスミドｐＡＡ１３０のいずれかを含有するＥ、コリーＪＭ８３細胞は、５０　ｕ　Ｃｆｌｍｌ”Ｃ−パルミチン酸含有Ｍ９最少培地で２時間かけて増殖した。

゛全細胞溶解産物（１００００トリクロロ酢酸沈降性ｃｐｍ／レーン）を３５ｍＡの一定電流値でもって１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。そのゲルは、サリチル酸ナトリウムで飽和しく５×ゲル容積ＸＩＭ溶液で２０分間）、乾燥し、そして−７０℃においてＸＡＲ−５フイルムで感光した（イーストマンコダックカンパニー、二ニーヨーク州　ロチニスター）。同様に培養した正常Ｅ、コリーＪＭ８３細胞の細胞溶解産物の全ては、対照とした。得られた結果は、第１７図に示す。

第１７図に示されるように、約１５０００ダルトンの放射性標識タンパク質は、ｐＡＡ１５２および対照Ｅ、コリー細胞の溶解産物中では見い出されなかったｐＡＡ１３０を含有するＥ、コリーの溶解産物中で観察された。このように、ＰＲＯＭＰ−１および組換えＥ、コリーによって発現されたＰＢＯＭＰ−２は、特異的に放射性標識化される。

他の一連の実験において、ＰＢＯＭＰ発現性組換えプラスミド含有細胞は、グロボマイシン、抗生物質の存在下で培養し、リポタンパク質信号ベプチターゼの阻害によって既知細菌性リポタンパク質の全てのプロセスを特異的にブ０７りする（Ｉｎｕｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９７８．　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｔｏｋｙｏ）旦：１２０３−１２０５）。

ｐＡＡ１５２かまたはｐＡＡ１３０のいずれかを含有するＥ、コリーＪＭ８３細胞は、２５μｇ／ｍｌグロボマイシンの存在下で１時間かけて培養されるにューヨーク州ピスカタウエイ、ロバートウーズションソンメディカルデ　。

ンタルスクールのＤｒ、Ｍ、　イノウニから得たものである）。

グロボマイシン非処理類似培養を対照とした。細胞溶解産物の全ては、１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移し、そしてポリクローナル抗−Ｐ　Ｂ　ＯＭＰ　−１抗血清でプローブした。得られた結果を第１８図を示す。

第１８図に示されるように、ＰＢＯＭＰ−１かまたはＰＢＯＭＰ−２のいずれかを発現するグロブマイシン処理細胞の溶解産物において、対照または非処理細胞の溶解産物においては検出されない約１６５００ダルトンバンドが観察された。

両方の一連のインビボ実験で得られた実験に基づくと、ＰＢＯＭＰ遺伝子含有組換えＥ、コリー（Ｅ、　ｃｏｌｔ）にょッテ発現されるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２は、リポタンパク質である。

抗−ＰＢＯＭＰ−１ポリクローナルラビツト抗血清は、第６．２節の記載のように調製されたものであり、インビトロ補体介在殺菌性アッセイシステムにおいてＨｉ　ｂおよびＨｌの殺害能力について試験した（Ｍｕｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、。

３１−３８参照のこと）。アッセイシステムで使用する補体源は、プレコロストラル牛血清（ＰＣＯ２，Ｐｒｅ−ｃｏｌｌｏｓｔｒａｌｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）かまたは予め存在する抗へモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉ　Ｉｕｓ）抗体を除去するために予め非タイプＨ１菌株、Ｓ２で吸着した正常ラビット血清（ＮＲ８）のいずれかであった。ｐｃｃｓは、そのままで使用し、ＮＲ８は、Ｈｌ　ｂに対して１：４．非タイプＨ１に対して１：８に希釈して使用した。希釈液の全ては、ホスファターゼバッファードサリーン［２０ｍＭホスフェートバッファー（ｐＨ７，４）。

０、　１５ｉ＋ＭＭｇ　Ｃ１２および０．　５＋＋＋ＭＣａ　Ｃｆｌ　２含有０．１５Ｍ　ＮａＣ１（ＰＣＭ）］を使用した。被試験細菌性菌株は、４９０ｍｍにおいて光学密度で測定されるようにＩ　Ｘ　１０９細胞／ｍ！濃度に達するまでＢＨＩ−ＸＶで増強する。細菌は、ＰＣＭ中で最終濃度１２５０細菌／２０μ ｇに希釈した。ＰＣＭ中の２０Ｍｇの適切な抗体希釈液は、氷上２４ウ工ル微少力価プレー）　（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルで２０Ｍｇの補体源と混合した。微少力価プレートは、氷から除き、そして２０Ｍｇの試験希釈細菌を各ウェルに加えた。

抗体非含有ウェルを負対照とした。３７°で３０分間インキュベーションした後、８００μ、Ｑ　（７）ＢＨＩ−ＸＶは、５６℃で０．７５％アガーを含んでいる、各ウェルに加え、そして室温で固化した。そのプレートは、３７℃で一夜インキユベートシ、そして次の日に研究した抗血清のＢＣ力価は、非抗体対照ウェルと比較して、試験細菌の５０％殺害可能な最も高い希釈液の逆数として研究した。

抗−ＰＢＯＭＰ−１は、種々のＨｉ　ｂ臨床および実験室単離体に対する殺菌性（Ｂ　Ｃ’）活性について試験し、その結果を第３表に示す。

第　３　表ヘモフィルス属インフルエンザの実験室および臨床菌株に対する抗−ＰＢＯＭＰ −１抗血清のＢＣ活性へモフィルス属インフルエンザ　＋／ｂ／タイプｃＨ５Ｔ −５ヘモフィルレス属インフルエンザ　＋タイプｂ　Ｈ５Ｔ−３ヘモフィルス属インフルエンザ　＋タイプｂ　Ｈ８Ｔ−１０ヘモフィルス属インフルエンザ　＋タイプｂ　Ｈ３Ｔ−１２Ｎ、Ｔ、ヘモフィルス属インフルエンザＳ−２＋Ｎ、Ｔ、臨床菌株Ｎ、Ｔ、ヘモフィルス属インフルエンザ　＋５Ｔ−３１Ｎ、Ｔ、ヘモフィルス属インフルエンザ　士５Ｔ−３５ＨＩ　Ｂ、臨床菌株１１２　試験菌株　１１２菌株は殺害されたａ　＋＝試験細菌の５０％殺害ｂ＋り−＝約５０％の生存試験細菌第３表から明らかなように、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体は、タイプ（例えば、ａ、ｂ、ｃ）および非タイプＨ，インフルエンザ菌株の両者の広範な臨床単離体に対してＢＣ活性を有した。１１２Ｈｉｂ臨床単離体からの１１２は、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって殺害した。これらの菌株は・南西米国、北東米国および西部カナダで単離されたものであった。

殺害が抗−ＬＳＰ抗体の結果であるとする可能性を除くために、ＢＣアッセイは、各ウェル中でイムノゲンを調製するために使用したＨｉ　ｂ菌株からの２００ｎｇのＬＰＳを加えて行った。実験結果は、第４表に示す。

ＰＢＯＭＰ−１＋Ｎ、Ｔ、Ｈ，インフルエンザ　４０−　Ｎ、Ｔ、Ｈ，インフルエンザ　１６０十　旧ｂイーガン（Ｅａｇａｎ）　４０−　Ｈｉ　ｂイイーガン　４０ＰＲＰ−ＣＲＭ　＋Ｎ、Ｔ、Ｈ，インフルエンザ　１０−　ＩＩ！、Ｔ、Ｈ，インフルエンザ　１０＋　Ｈｉ　ｂイーガン　４００ −　）Ｉｉ　ｂイーガン　８００ａ　零または２００ｎｇＨｉ　ｂイーガンＬＰＳをウェル当り使用した。

ｂ　５０％細菌生存率を示す抗血清の高い希釈の逆数として表示した。

ＬＰＳは、抗ＰＲＰ力価を１／２に下げ、Ｈｉに対する抗−ＰＢＯＭＰ−１力価を１／４に下げそしてＨｉ　ｂに対する抗−ＰＢＯＭＰ−１力価を全く下げなかった。ＬＰＳが抗−ＰＢＯＭＰ−１のＢＣ活性を低下させるけれども、それを除去することはできなかった。抗−ＰＲＰ　ＢＣ力価減少によって示されるように、観察された減少のなかのあるものは、疑いもなく、ＬＰＳの抗−相補活性の結果で幼児ラット保護の研究は、スミス等の方法に従って行なった（ＳＩＩｌｉｔｈ　ｅｔ　ａｔ、、１９７３．　Ｒｅｄｉａｔｒｉｃｓ　５２：　６３７−６４４）、スプラグーダーレイ−（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）幼児ラットは、ＰＣＭ中の０．１ｍｌの希釈度の変化するラビット抗血清を用いて生存第４日に腹腔内接種によって受動免疫化した。免疫化１８時間後、そのラットは、０．１ｍｌのＰＣＭ中の１０４〜１０６Ｈｉｂ細胞で腹腔内に対抗を受けた。感染７２時間後における対抗ラットの生存は、保護を示した。実験結果を第５表に示す。

ＨＳ　Ｔ　−６０Ｎ　ＲＳ　１／１０　’１０６０／６ＰＢＯＭＰ−１１／１０　１０６５１０６５１５ＰＢＯ１／３０　１０６Ｂ／６ＰＢＯＭＰ−１１／９０　１０６６／６ＨＳ　Ｔ　−６１Ｎ　ＲＳ　１／１０　１０５０１０５０１５ＰＢＯ１／１０　１０５６／６ＰＢＯＭＰ−１１／３０　１０５６／６ＰＢＯＭＰ −１１／９０　１０５３１５イーガン　Ｎ　ＲＳ　ｌ／１０　１０４０／４（Ｅ　ａｇａｎ）　ＰＢＯＭＰ　−１１／１０　１０４３１０４３１５ＰＢＯ１／３０　１０’　５１５ＰＢＯＭＰ−１１／９０　１０’　Ｏ１５第５表の結果は、幼児ラットが受動トランスファーされた抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体によって致死量で対抗に対して保護されることを示す。付加的な臨床Ｈｉ　ｂ菌株は、対抗菌株として幼児ラット髄膜炎モデルにおいて抗−ＰＢＯＭＰ−１が異種Ｈｉ　ｂに対して臨床的単離体を保護することを示すために使用された。

抗−ＰＢＯＭＰ−１が抗−ＰＲＰの保護効果をブロックし、または付加的な効果を有するか否か決定するために、幼児ラットは、保護終点内に希釈された抗−ＰＲＰおよび抗−ＰＢＯＭＰ−１で受動免疫化した。Ｈｌ　ｂで対抗すると、抗血清とともに、上記のいずれか１つより高希釈液を保護できた（第６表）。第６表に示される結果は、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体および抗−ＰＲＰ抗体が互いに干渉せず、そして幼児ラット髄膜炎モデルにおいて付加的な保護を与えることが可能なことを示す。

第　６　表抗−ＰＲＯＭＰ−１＋抗−ＰＲＰ幼児研究−１：２０００　２／６＋　１：１０００　６／６＋　１：３０００　５／６十　１：４０００　４／６ａ　ＰＣＭ中で希釈されたポリクローナルラビット抗−ＰＢＯＭＰ−１ｂ　ポリクローナルラビット抗−ＰＲＰ　：　ＣＲＭ１９７接合体ｃ　７２時間対抗後の幼児スプラグーダーレイラットの生存７．３　ヒト成人におけるＰＢＯＭＰ−１の免疫抗原性６人のヒト成人有志者は、唯１回の接種を受けた１人を除き、１ケ月間隔で第６．１節で記載したようにＨ，インフルエンザから単離したＰＢＯＭＰ−１から成るワクチン組成を有する二種の接種を受けた（ミョウバンなしで５．２μｇＰＢＯＭＰ−１）。血液サンプルは、最初の接種直前およびその後１ケ月間隔で得た。ワクチン化成人の特異抗体応答性は、Ｈ，インフルエンザＰＢＯＭＰ　（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）。

ジフテリアトキソイド（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）　（Ｅｎｇｖａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７２、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　１０９　：　１２９−１３５に記載のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイの一般的記述を参照のこと）およびＨｉｂ　ＰＲＰポリサツカリド（Ｆａｒｒ−タイプＲＩＡ）（Ｐａｒｒ、１９５８．　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１０３　：　２３９−２６２のファー（Ｆａｒｒ）タイプＲＩＡの記述を参照のこと）の抗体力価測定によって評価した。ＰＢＯＭＰ−Ｉ　ＥＬＩＳＡアッセイで得られた結果を第１９図に示す。

第１９図に示されるように、６人のうち３人は、ＰＢＯＭＰ−１に対する抗体力価において顕著な増加を示した。抗体力価のこの上昇は、ジフテリアトキソイドかまたはＨｌ　ｂＰＲＰのいずれかに特異な抗体の力価では顕著な変化は観察されなかったけれども（結果は示されていない）、イムノゲンとして使用したＰＢＯＭＰ−１に極めて特異的であった。

後述の第８．１節の記載のようにプラスミドｐＰＸ１６７含有Ｅ、コリーＰＲ１３細胞から得た組換え信号なしＰＢＯＭＰ−１（以後ｒＰＢＯＭＰ−１と称する）は、ホワイトニューシーラントラビットを免疫化するためにイムノゲンとして使用した。ｒＰＢＯＭＰ−１は、不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化かまたは水酸化アルミニウムと結合した。ｒＰＢＯＭＰ−１は、０．８５％食塩水において５００μｇ／ｍｌ濃度のｒＰＢＯＭＰ−１と５００μｇ　／　ｍｌ濃度のミョウバンを１＝１の比率で混合することによって、ミョウバンと結合する。その混合物は、３７℃で３時間撹拌し、そしてミョウバンを遠心分離して沈降させた。未結合タンパク質検定用にＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアースケミストリーコーポレイション、イリノイ州　シカゴ）によって上澄液を検定した。何も検出されなかった。ミョウバンは、５０ａｇ　／　ｍｌで生理食塩水に再懸濁した。ｒＰＢＯＭＰ−１をＩ　Ｆ　Ａ　（Ｄｉｒｃｏ）に１：１の比率で乳化した。動物は、４週間間隔でいずれかの製剤５０μｇで筋肉内免疫した。動物は、０．６週および各免疫前に採血した。

得られた抗−ＰＢＯＭＰ−１ポリクローナルラビツト抗血清は、前述第７．１節で記載したように、インビトロ補体介在殺菌アッセイシステムにおけるＨ１殺害能のために試験した。最初の免疫化前、０週から第２免疫化の後２週間、６週、に抗血清は、試験した。抗血清の殺菌（Ｂ　Ｃ）活性は、Ｈ，インフルエンザ（ “ネイティブＰＢＯＭＰ−１”と指定された）から単離したＰＢＯＭＰ−１に対して作って抗血清のそれと比較した。試験細菌は、非タイプＨ。

インフルエンザ菌株Ｓ−２であった。結果は、第７表に示す。

０週　１：５　１：５　１：１０６週　ＮＴ　１：１６０　１：８０ａ　試験微生物：非タイプ　Ｈ，インフルエンザ５−２ｂ　抗血清を得るために使用した免疫化の詳細なテキスト用Ｃハイパーイムユン抗血清は、ネイティブＰＢＯＭＰ−１の多投専用に作られた抗血清のＢＣ力価は、非抗体対照ウェルと比較して、試験細菌の５０％殺害可能な最高希釈の逆数として研究された。

両ラビットが免疫前に低レベルのＢＣ活性、即ち力価１：５および１：１０を有するが、６週に得られた血清のＢＣは、ＢＣ活性において顕著に増加していた。

ＩＦＡ中のｒＰＢＯＭＰ−１で免疫化したラビットは、１　：１６０の力価、ミョウバン中のｒＰＢＯＭＰ−１で免疫化したラビットは、１：８０の力価を示した。ハイパーイムユン抗血清は、ラビットがネイティブＰＢＯＭＰ−１の多投与を受けた後に得られただ。ハイパーイムユンラビット抗−ＰＢＯＭＰ−１血清は、１　：１６０の力価を示した。これらの結果は、ｒＰＢＯＭＰ−１がヘモフィルス居中のネイティブＰＢＯＭＰ−１を認識する抗体を引き出し、そして殺菌アッセイシステムにおいて生理学的に活性であることを明らかに示す。

ＰＢＯＭＰ−１タンパク質は、たぶんネイティブプロモーターのコントロールのもとで、ｐＡＡ１５２の７３７ｂｐＢａｍＨＩ　−ＢｇｌＩＩフラグメントから発現させられる。その配列は、良質なコンセンサスリポソーム結合部位およびＰＢＯＭＰ−１遺伝子の開始コドンを含む。このフラグメント含有プラスミドを有するＥ、コリー中で発現したＰＢＯＭＰ−１がウェスターンプロット分析法によって簡単に検出されるけれども、かかる産生タンパク質量は、１％の細胞タンパク質よりも少なかった、即ちネイティブ遺伝子含有Ｈ，インフルエンザ細胞中で作られたＰ　Ｂ　ＯＭ　Ｐ−１の量よりも少なかった。

Ｅ、コリー中で高レベルのＰＢＯＭＰ−１を産生ずるための最初の試みとして、クローン化遺伝子、高タンパク質産生を得るために既知のプロモーターＬａｃとラムダＰＬのコントロールのもとに置いた。プロモーターは、ＰＢＯＭＰ−１開始コドン上流の旦ｓｔＮ　Ｉ部位に結合した（第４図）。この部位の開裂は、ネイティブＰＢＯＭＰ−１プロモーターを除くがリポソーム結合部位をそのまま残す。

これらの組み立ては、次のように行なわれた。

第１に、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子運搬１）ＡＡ　１５２（７）　７３９子を運搬するクローンは、ｐＰＸ１６０と指定する。Ｅ。

コリーＪＭ１０３中のｐＰＸ１６０からのＰＢＯＭＰ−１の発現は、ネイティブプロモーター調節の条件であり、Ｄ　ａｅ調節条件のもとではなかった。即ち、明らかにＢｇｌＩＩ部位およびＰ　Ｂ　Ｏｈ、ｉ　Ｐ　−１の翻訳開始コドン間の２４０ｂｐにおける転写終結コドン（信号）によるからである。その後、プラスミドｐＰＸ１６０は、ＢｓｔＮＩで開裂した。そのＢｓｔＮＩは、ＰＢＯＭＰ −１開始コドンと遺伝子のコンセンサス翻訳開始部位間を開裂するが、コード化領域に付着したリポソーム結合部位を残す。その末端は、Ｅ、コリーＤＮＡポリメラーゼエ（フレノウフラグメント）で満たしたｐＵｃ１９に連結した。ｐＰＸ１６６と称するその後生じたプラスミドは、ウェスターンプロット法により、Ｅ。

コリーＪＭ１０３のｆｌ　ａｃプロモーターの調節条件のもとてＰＢＯＭＰ−１を発現することが見い出された。

ＰＢＯＭＰ−１がＥ、コリーＪＭ１０３またはＨＢＩＯＩ菌株のｆｌ　ａｃまたはＰＬプロモーターから発現すると、唯低レベルのＰＢＯＭＰ−１が発現した。

モノクローナル抗体Ｇ−２０４、これは成熟ＰＢＯＭＰ−１のアミノ末端２０アミノ酸に結合する、を有するこれらの細胞からの溶解産物のウェスターンプロット分析は、このモノクローナル抗体によって認識された４０００−５０００ダルトンペプチドの存在を示した（第２０図）。誘導Ｐ、プロモーターの調節のもとてＰＢＯＭＰ−１を発現する細胞において、Ｇ−２０４結合活性の９０％以上は、この予想分解生成物中であり、Ｅ、コリー中で高いレベルで発現されたＰＢＯＭＰ−１が不安定であることを示した。

プラスミドｐＰＸ１６０およびｐＰＸ１６６は、外部タンパク質の安定化が報告された突然変異体を含有する種々のＥ、コリー菌株に転換した。これは、ＡＴＰ −従属プロテアーゼ（４２ｏｎ−）突然変異体、熱衝撃応答（ｈｔｐ）およびｍＲＮＡ−安定化突然変異体（ｐｎｐ）を含む。加えて、リポタンパク質としてのＰＢＯＭＰ−１のプロセスがその安定性を高めるので、プラスミドは、重要なネイティブＥ、コリーリポタンパク質、ムレインリポタンパク質（Ωｐｐ−）を欠＜Ｅ、コリー菌株中に置かれた。試験された菌株の全てにおいて、モノクローナル抗体Ｇ−２０４によって認識されるＰＢＯＭＰ−１分解生成物は、はとんど同一レベルで存在した。それ故に、Ｅ、コリーのＰＢＯＭＰ−１の分解かある他の未同定によることは、明らかである。

第２の解決手段として、遺伝子のネイティブ信号配列を除去することによって修飾ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を生成した。かかる組み立ては、ネイティブＰＢＯＭＰタンパク質に二つの潜在的な利益をもたらす。第一に、信号のないＰＢＯＭＰ− １の過多発現による毒性効果は、減少するだろう、第二に、極めて疎水性の脂質基によって修飾されないので、信号無しＰＢＯＭＰ−１は、溶液中の単離または吐風に洗浄剤の使用を要求しないだろう。

ＰＢＯＭＰ−１の信号無し形態の構成は、第２１図に示される。第２１図に示されるように、プラスミドｐＰＸ１６０からのＰＢＯＭＰ−１遺伝子は、ＡＩｕＩ制限エンドヌクレアーゼでコドン１９において開裂する。生成するフラグメントは、ｐＵｃ１９ポリリンカー領域内のΣｍａＩ制限部位に連結する。生成する遺伝子は、ネイティブＰＢＯＭＰ−１のアミノ酸配列にアミノ末端におけるｐＵｃ１９ポリリンカー領域からの付加的な１８のアミノ酸を加えたものの全てを含有するハイブリッドタンパク質を発現した。このプラスミドは、ｐＰＸ１６７と指定された。

更に第２１図に示されるように、ＰＢＯＭＰ−１を発現する第二の組換えプラスミドは、ポリリンカーのＢａｍＨＩ部位において開裂し、そしてそのフラグメントをプラスミドｐｌＮｍ−ｏｍｐＡ３のＢａｍＨＩ部位にクローニングすることによって、プラスミドｐＰＸ１６７から誘導された。生成するプラスミドｐＰＸ１６８は、アミノ末端においてＥ。

コリーＯＭＰ　Ａタンパク質の信号配列に連結した成熟ＰＢＯＭＰ−１をコード化するハイブリッド遺伝子を含む。

このハイブリッド生成物は、リポタンパク質修飾を欠きかつそのアミノ末端において８個の付加的アミノ酸を含有する成熟ＰＢＯＭＰ−１を生成するために、ＯＭＰＡ信号配列によってメンプランから処理した。

プラスミドｐＰＸ１６７およびｐＰＸ１６８は、Ｅ、コリーＪＭ１０３に転換し、組換えＰＢＯＭＰ−１合成につ　゛いて調べた。５ＤＳ−ＰＡＧＥウェスターンプロット分析により、両プラスミドは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって認識されたタンパク質をコード化することを示した。ｐＰＸ１６７から合成された修飾ＰＢＯＭＰ−１は、イソプロピルチオベーターｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と誘導性であり、細胞質中に位置し、そして洗浄剤の不存在下で溶解する。

その修飾ＰＢＯＭＰ−１は、Ｉ　ＰＴＧ誘導細胞からの全細胞溶解産物のクマーシーブルー染色によって検出されず、１％以下の全細胞タンパク質から成り立っている。ｐＰＸ１６８から合成された修飾ＰＢＯＭＰ−１は、同様にＩ　ＰＴＧと誘導性であり（ハイブリッドライラックプロモータの制御のもとて）、媒地に排泄され、同様に洗浄剤の不存在下で可溶性である。十分に誘導されると、この修飾ＰＢＯＭＰ−１は、約１〜２＋ｎｇの細胞レベルで産生された。　プラスミドｐＰＸ１６７およびｐＰＸ１６８は、同様に発現レベル用に種々のＥ、コリー菌株中で試験した。

最も好結果な組み合せは、Ｅ、コリーＰＲ１Ｂに転換したｐＰＸ１６７キメラプラスミド、ｍＲＮＡ安定化突然変異体！含有菌株であった。この菌株において、ｌ　ａｃ誘導後、約２〜３％の全細胞タンパク質においてｌ　ａｃプロモーターの調節のもとて組換えＰＢＯＭＰ−１は発現する。

この組換えＰＢＯＭＰ−１は、Ｄ　ａｃα−ペプチドおよびＰＢＯＭＰ−１遺伝子のアミノ末端に融合した多クローニング配列からの約１７アミノ酸を含有する細胞質融合タンパク質として発現する。

８、　１．　１　信号無しＰＢＯＭＰ−１の精製および特徴次の実験は、信号無しＰＢＯＭＰ−１を精製しかつ特徴づけるために行なった（ここではｒＰＢＯＭＰ−１と称する）。

ブイヨンで増強したｐＰＸ１６７含有Ｅ、コリーＰＲ１３の一夜培養からの細胞は、４℃でＧＳＡＳ−ローター中いて８．ＯＯＯｒｐｍで１０分間沈降させた。

ペレットは、１／１０容積の１０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｆｌ　、　ｐＨ７，５で洗浄し、そして１０　ｕ　ｇ　／　ｍｌ　Ｄ　Ｎアーゼおよび１０μｇ／ｍ１ＲＮアーゼを含有する１／１００容積の１０ｍＭＴｒｉｓ　、　ｐｌ（７，５に再懸濁した。細胞は、４０Ｗで１０分間氷上で音波破砕かまたは２０，０００ｐｓｉでフレンチプレッシャーセルに３回通すことのいずれかにより破砕した。未破砕細胞は、５Ｓ−３４０−ターを用いて４℃において１０分間かけて１０、ＯＯＯｒｐｍで遠心分離して除去した。全細胞メンプランは、４℃において６０Ｔｉローターで５５．００Ｏｒｐｍ、３０分間遠心分離して、除去した。メンプランを棄て、上澄液を保持した。

細胞出力抽出物のＤＥＡＥ分別　上澄液は、１０叶Ｔｒｉｓ　、ｐＨ７，５で平衡にしたイオン交換ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（バイオラド　ラボラトリーズ、カリフォルニア州　リッチモンド）カラムを通した。本質的にタンパク質の全ては、これらの条件下でカラムに結合した。結合ｒＰＲＯＭＰ−１および他のタンパク質を８０ｍＭＮ　ａ　Ｃｆｌ含有１０ｍＭＴｒｉｓ　、　ｐＨ７，５を用いて徐々に溶出このバッファーによって溶出したタンパク質の全ては、プールしそして４℃で６０％飽和硫酸アンモニウムを用いて沈降させて濃縮した。そのペレットを遠心分離して集め、残留硫酸アンモニウムを除去するために同一バッファーに対して透析した後１０ｍＭＴｒｉｓ　、　ｐＨ，７，５に溶解した。

ｒＰＢＯＭＰ−１の逆相クロマトグラフィー　上澄液含有ｒＰＢＯＭＰ−１は、ｄＨ２０中の０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）含有バッファー中に希釈後、４．６×１５＋ｏｍＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムに流した。そのカラムは、同一バッファーを用いて流速２ｍ１／分で流れた。タンパク質の大部分は、これらの条件下でカラムに結合した。結合ｒＰＢＯＭＰ−１は、２０分かけて０．１％ＴＦＡの０〜９５％アセトニトリルグラジェントによって単一ピークとして溶出した。　ｒＰＢＯＭＰ−１含有巨大ピーク（第２２図、ビーク１参照のこと）は集め、フラクションをプールし、溶媒を蒸発して濃縮した。乾燥ｒＰＢＯＭＰ− １は、ｄＨ２ｏに再溶解した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥは、前記のように、細胞質抽出物、ＤＥＡＥ溶出物およびプラスミドｐＰＸ１６７含有Ｅ、コリーＰＲ１３細胞から得た逆相溶出物に基づいて行なった。

電気泳動後、そのゲルは、クマーシーブリリアントブルー染色で約２時間かけて染色した。モノクローナル抗体ＧＤ２０４を使用するエラスターンプロット分析は、同様に行なった。得られた結果は、第２３図ＡとＢに示す。

第２３Ａ図に示すように、ｒＰＢＯＭＰ−１は、クマーシー染料で染色する際に、プラスミドｐＰＸ１６７含有Ｅ。

コリーＰＲ１３細胞の細胞質抽出物中に存在する主要なタンパク質である（第２３Ａ図、レーン１）。ウェスターンプロット反応性で評価されたように、９５％以上のｒＰＢＯＭＰ−１は、細胞質抽出物に位置する。細胞質抽出物の調製に洗浄剤が使用されていなかったので、その結果は、これらの細胞から得たｒＰＢＯＭＰ−１が洗浄剤なしで１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｇ、ｐＨ７，５に可溶性であることを示す。このことは、Ｈｉ　ｂ細胞から得られたＰＢＯＭＰ−１からそれたものをリポタンパク質として表わす。

細胞質抽出物を使用する主要な実験は、ｐＰＸ１６７含有Ｅ、コリーＰＲ１３細胞から得られたｒＰＢＯＭＰ−１が、それ自身かまたは他の細胞質タンパク質とのいずれかの複合体として水溶液中に存在するだろうということを示す。アクリルアミド−アガロースポリマーまたはセファデックスビーズを用いるゲルフィルトレージョンクロマトグラフィーがこのｒＰＢＯＭＰ　１を使用して行なうと、そのｒＰＢＯＭＰ−１は、１００，０００ダルトン以上の見掛は分子量の位置で溶出した（データは示されていない）。

ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（バイオラド　ラボラトリーズ。

カリフォルニア州　リッチモンド）を使用するイオン交換クロマトグラフィーは、ｒＰＢＯＭＰ−１が特有の塩濃度で単一ピークとして溶出しなかった事実を示した。ｒＰＢＯＭＰ−１は、１０ｍＭＴｒｉｓ　、　ｐＨ７，５において約２０ＩＤＭ〜７５１ＩＩＭのＮａ（Ｊｌ濃度範囲にわたって溶出した。溶ｔｒ　ｒＰＢＯＭＰ−１が８０ｍＭＮａＣ４Ｊ洗浄液中の多くの溶出タンパク質の１種であるけれども、残留する多くの細胞質タンパク質は、８０ｍＭ以上の塩濃度でカラムに結合した。このように、上記のようにＤＥＡＥクロマトグラフィーは、ｒＰＢＯＭＰ−１から多くの不純物タンパク質を除去するだめの主要なステップとして使用した。

第２３Ａ図に示されるように、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、細胞質物質中に見い出された多くのタンパク質を極めて減らしく第２３Ａ図、レーン２）、そしてｒＰＢＯＭＰ−１とモノクローナル抗体との反応性を変更しなかった（第２３Ｂ図、レーン２）。

ｒＰＢＯＭＰ−１のアミノ酸配列は、相対的に疎水性タンパク質であるべきことを示す。そのことは洗浄剤なしで細胞質抽出物に可溶性であることを示すけれども、ｒＰＢＯＭＰ−１が多くの細胞質タンパク質より疎水性であることが期待される。ｒＰＢＯＭＰ−１含有ＤＥＡＥ溶出物は、前記のようにＣ−４疎水性相互作用カラムでクロマトグラフィーにかけ、アセトニトリルの増加するグラジェントを使用して溶出した。このシステムにおいて、より多くの疎水性トリルの高濃度において溶出するだろう。ｒＰＢＯＭＰ−１が多くの不純物タンパク質よりも強く結合し、そしてそれらの多くのものの後から溶出すると考えらられる。フラクション含有ｒＰＢＯＭＰ−１をＣ−４カラムでクロマトグラフィーにかけると、ＰＢＯＭＰ−１は、カラムから溶出した主要ピークであることが見い圧され（第２１図）、そして驚くべきことに、低アセトニトリル濃度で最初に溶出した。

第２３Ａ図、レーン３に示されるように、ｒＰＢＯＭＰ＝１ピークは、５ＤＳ− ＰＡＧＥ後の１０μｇのタンパク質におけるクマーシーブリリアントブルーＲ− ２５０染色によって測定されたように、純粋であった。そのピークは、クマーシー染色で主および副の２バンドを示し、両者は、ＰＢＯＭＰ−１のアミノ末端２０アミノ酸を認識するＰＢＯＭＰ−１のモノクローナル抗体と反応した（第２３Ｂ図、レーン３）全サイズｒＰＲＯＭＰ−１よりも約２０００キロダルトン小さい副バンドは、より小さなタンパク質が精製プロセスの副産物ではないことを示すＰＨ１０（ｐＰＸ１６７）の全細胞抽ａ物中にも存在した。溶媒蒸発による濃縮後、精製ｒＰＢＯＭＰ−１は洗浄剤なしでも水性溶媒に可溶性であった。

ラビットの免疫法　ニューシーラント　ホワイトラビットは、不完全フロインドアジュバント中で乳化かまたは水酸化アルミニウムに結合したｐＰＸ１６７を含有するＥ。

コリーＰＲ１３細胞から褥たｒＰＢＯＭＰ−１で免疫化した。ｒＰＢＯＭＰ−１は、ｒＰＢＯＭＰ−１を０．８５％食塩水中５００μｇ／ｍｌの濃度でミョウバン（ａｌｕｍ）を５００μｇ　／　ｍ？濃度で、１：１の比率で混合して、ミョウバンと結合した。その混合物は、３７℃で３時間振盪し、そしてミョウバンを遠心分離によって沈降した。上澄液は、未反応タンパク質に関してＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース　ケミカル　コーポレーション、イリノイ州　シカゴ）で検定した。何も検出されなかった。ミョウバンは、生理食塩水に５００μｇ／ｍｌで再懸濁した、ｒＰＢＯＭＰ＝１は、不完全フロインドアジュバント（Ｄｉｒｃｏ）に１：１の比率で乳化した。動物は、４週間間隔で５０μｇのいずれかの製剤で筋肉内に免疫化した。動物は、０．６週および各免疫化前に採血した。

血清は、エリザ（ＥＬＩＳＡ）およびウェスターンプロット分析を用いて抗−ＰＢＯＭＰ−１および抗−ｒＰＢＯＭＰ−１抗体を目的として検定した。

組換えＰＢＯＭＰ−１を用イル免疫化は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法によって決定されたように、Ｈ，インフルエンザ（ネイティブＰＢＯＭＰ−１と称する）から得たＰＢＯＭＰ−１および組換えＰＢＯＭＰ−１に対する抗体力価を引き出した。

結果は、第８表に示す。

第　８　表ｒＰＢＯＭＰ　１に対する抗血清のＥＬＩＳＡ力価に対するＥＬ　Ｉ　ＳＡ力価３抗ゴＰＢＯＭＰ−１ネイティブ抗　血　清　アジュバント　ｒＰＢＯＭＰ−Ｉ　ＰＢＯＭＰ−１０週　ミョウバン（Ａｌｕｍ）　８００　８００６週　ミョウバン　１２．８００　１２．８０００週　ＩＦＡ　８００　８００６週　Ｉ　Ｆ　Ａ　１２．８００　１２．０００ａ　ＥＬＩＳＡ力価は、バックグランドの２倍を生ずる抗血清の最高希釈の逆数を表わす。

第８表に示されるように、ミョウバンかまたはＩＦＡのいずれかのｒＰＢＯＭＰ −１を用いる動物の免疫化は、免疫後６週間においてｒＰＢＯＭＰ−１とネイティブＰＢＯＭＰ−１の両者に反応性の抗体の大きな力価を引き出した。

８．２Ｅ、コリー中のＰＲＯＭＰ−２の発現高揚ＰＲＯＭＰ−２は、プラスミドｐＡＡ１３０から低濃度（セルタンパク質の１％未満）で同様に発現した。ＰＢＯＭＰ−２の発現は、明らかにネイティブプロモーターの制御のもとである。

ＰＢＯＭＰ−２の生産性を高めるために、ｐＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ−２遺伝子ハ、ＰＢＯＭＰ−２開始コドンへｐＵ　Ｃ１９のＳ　ｍａ　Ｉ部位に連結する。

連結は、全ＰＲＯＭＰ−２０ＲＦ　（信号配列を含む）にｐＵｃ１９からの１８コドンおよび遺伝子融合部位からの２コドンを含むハイブリッド転写解読枠（ＯＲＦ）を生ずる。この融合遺伝子のタンパク質生成物は、１７９９９ダルトンの分子量予想し、そして（ｌ　ａｅプロモーター制御のもとで発現される。このプラスミドは、　ｐＰＸ１６３と称される。

プラスミドｐＰＸ１６３がＥ、コリーＪＭ１０３へ転換しそしてＩ　ＰＴＧで誘導すると、１７，５００ダルトン見掛分子量のタンパク質は、発現した。加えて、１５，０００ダルトン分子量のタンパク質双極子（ｄｏｕｂｌｅｔ）は、観察された。３種のタンパク質の全ては、ウェスターンプロット上の抗−ＰＢＯＭＰ −１抗血清によって認識された（第“２５図）。５ＤＳ−ＰＡＧＥのクマーシーブルー染色によって、組換えＰＢＯＭＰ−２の３種の形は、（ｌ　ａｅ誘導後の約１５％全細胞タンパク質から成っていた（第２５図、レーン３）。ｐｐ　Ｘ　１６３から発現した組換えＰＢＯＭＰ−２の３種は、単離され、Ｎ−末端ペプチド分析は次のことを示す。

１．１７，５００ダルトン見掛は分子量バンドは、予想ｐＵｃ１９／ＰＢＯＭＰ −２ハイブリッドタンパク質である。

２．１５．０００ダルトン分子量以上のバンドは、ＰＢＯＭＰ−２信号配列の第１メチオニン残基から出発しく即チ、ＰＢＯＭＰ−２０ＲＦ（７）開始コドン）ソして、この点における翻訳の再開始によることが明らかである。そして３．１５０００ダルトン分子量より少ないバンドは、Ｎ−末端分析にブロックし、そして１４Ｃ−パルミテートで標識化し得る。従って、このバンドは、ＰＢＯＭＰ−２を処理したりボタンバク質からなる。

９、　微生物の寄託表にしたプラスミドをもたらす次のエシェリキアコリ菌株をアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）、ペオリア、Ｉ　Ｌ　（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ）　、　Ｐｅｏｒｉａ。

ＩＬ、）で寄託し以下の受入れ番号を得ている。

ＪＭ　８３　ｐＡＡ１５２　Ｂ−１８１５５ＪＭ　８３　ｐＡＡ１３０　Ｂ−１８１５４ＪＭ　８３　ｐＧＤ１０３　Ｂ−１８１５３ＪＭ　１０３　ｐＰＸ１６３　Ｂ−１８２８５ＰＲ１３ｐＰＸ１６７　Ｂ−１８２８６ＪＭ　１０３　ｐＰＸ１６８　Ｂ−１８２８７寄託された実施態様は、本発明の一態様の単なる説明として意味され、また機能的に等しい微生物は、本発明の範囲内であるので、本発明は、寄託微生物による範囲に制限されるものではない。事実、本明細書に示しまた記載したものに加えて種々の変更は、先の記載および添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更を添附の請求の範囲内にあることを意図する。

また、ヌクレオチドに対して与えられた全塩基対は、概算であり説明のために用いられたことを理解すべきである。

＋２３４　１２３４ＦＩＧ、４ドーーーー−ＰＥ３０ＭＰ− ：　ＰＢＯＭＰ“ ：　ＰＥ３０ＭＰ　” Ｈ＝ＨｉｎｃｌＩ、　Ｂ；旦ｏｍＨＩ、　Ｘｂ＝ＸｊｏＩ、　８ｇ＝ＢａｌｌＦＩＧ、７Ｂ。

ＡＴＧ　ＡＡＣＡＡＡ　ＴＴＴＧＴＴ　ＡＭＭｅｔ　Ａｓ＊　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　ＬｙｓＡＧτ　τＣＡ　ＴＣＴ　ＡＡＣＡＡＣＣＡＴＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｒｒ　ＡｓｐＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＡＣＡＡＶａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ＧｌｎＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＧＴＴ　ＣＡＡＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＧｉｎＧＣＴ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＧＡＡＡｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＧｌｕτＴＡ　ＧＧＣＣＡＡ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　にＣＡＬａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＡｌａＧＧＴ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＧＧＣＡＣＡ　ＧＴＡＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＶａｌＧＣＴ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡ−Ａ　ＡＡＣＡＬａ　Ａ１．ａ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ）　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　コーｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ’−ＣＧＴ　ＴＡＣＡＡＴ　ＡＣＣＧＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＣＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＣＡＴＴＩＡｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｙ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＩＩｓ【：　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＧＣＡ　ＧτＧττＡ　ＧＣＧ　ＴＡＣＴＡＡＩＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＥｎｄＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ：　ＡｌａＡＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＧＣＧＧＴＡｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＩＩｅＰｈｅ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＡＴＴ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＡにＴ　ＧＴＴＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＶａｌＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴＶａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＧＧＴ　ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＣＡＧ、１ｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＩＩｓ　ＡｌａＡＡＡ　ＡＴＣＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＣＴＬｙｓ　ＩＩｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｅ　５ｅｒＧＧＴ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＴＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴＧｌ−ｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｉｃｅ　Ｖａｌ　ＶａＩＶａｌＣにＴ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡｒｇ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒへｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ■ ？〜八ＡＧＣＴＴＡ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　ＴＡＡｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｅｎｄ都、　ＰＢｏｘＰ −１抗将ｍ　Ａ　ＬｊＦＩＧ　２３Ａ　クマジー　４・色　ＦＩＧ　２３Ｂ、ｆ塗ＰＢＯＭＰ−ｆ　／）　％、９乙　ｂＥｌ’ＱＢＯＭＰ−１ｔｐｌ！ｔＵ乙ＰＢＯＭＰ−２勺ｆカロー〉１”ＡＣｐＵｃ　１９−ＰＢＯＭＰ−２ｐＰＸ１６３　函り敷石　イア　ンノ＼ ′クヘε特許庁長官　吉　１）　文　毅　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８７１０３４２３２、発明の名称インフルエンザ画用ワクチンおよび診断法ロチェスター、コーポレート　ウッズ　３０名　称　プラクシス　バイオロジックス。

インコーホレーテッド代表者　スミス、デビット　エイチ国　籍　アメリカ合衆国自発補正（２）委任状（３）代表者資格証明書（４）明細書の翻訳文の浄書国際調査報告　− １町ＩＩす＾、曙Ｉ＋ｍ）＾Ｉ・０訃番＾ＩＩ−−＋ｒ＋ｗｒｑτｃ悩’７＋ｒｌ’ＹＬプ１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヘモフィルスインフルエンザのエピトープに関連する実質的に純粋な抗原性ペプチドまたはタンパク質。
２．ヘモフィルスインフルエンザのエピトープか外膜タンパク質からなる請求の範囲第１項に記載のペプチドまたはタンパク質。
３．外膜タンパク質が分子量約１６，０００ダルトンの外膜タンパク質ＰＢＯＭＰ−１である請求の範囲第１項に記載のペプチドまたはタンパク質。
４．外膜タンパク質が分子量約１６，０００ダルトンの外膜タンパク質ＰＢＯＭＰ−２である請求の範囲第１項に記載のペプチドまたはタンパク質。
５．アミノ酸残基２０〜１５３まで第１１図に実質的に表わしたとおりのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列またはその抗原性部分を有する請求の範囲第１項に記載のペプチドまたはタンパク質。
６．アミノ酸残基１９〜１５４まで第１５図に実質的に表わしたとおりのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列またはその抗原性部分を有する請求の範囲第１項に記載のペプチドまたはタンパク質。
７．該ペプチドまたはタンパク質を該ペプチドまたはタンパク質を培養細胞から発現するために遺伝子発現を規制する第２ヌクレオチド配列のコントロール下で、ペプチドまたはタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含有する培養細胞から純化したものである請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載のペプチドまたはタンパク質。
８．培養細胞が微生物である請求の範囲第７項に記載のペプチドまたはタンパク質。
９．微生物が細菌である請求の範囲第８項に記載のペプチドまたはタンパク質。
１０．微生物が酵母である請求の範囲第８項に記載のペプチドまたはタンパク質。
１１．培養細胞が動物細胞系である請求の範囲第７項に記載のペプチドまたはタンパク質。
１２．培養細胞が昆虫細胞系である請求の範囲第７項に記載のペプチドまたはタンパク質。
１３．該ペヌチドまたはタンパク質が化学的に合成されたものである請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載のペプチドまたはタンパク質。
１４．該ペプチドまたはタンパク質を、（ａ）ヘモフィルスインフルエンザの物理的破壊細胞から外膜タンパク質豊富不溶性細胞フラクションを単離し；かつ（ｂ）（ｉ）ヒト投与に適する洗浄剤の存在下、該フラクションを加熱するか（ｉｉ）該洗浄剤の存在または不存在のいずれかの下、リソチームでフラクションを消化するかのいずれかで不溶性細胞壁フラクションから可溶性形態でペプチドまたはタンパク質を得ることからなる段階によりヘモフィラスインフルエンザの細胞培養液を得る請求の範囲第１項、第２項、第３項または第５項に記載のペプチドまたはタンパク質。
１５．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８１５４を与えられたエシェリキアコリ細菌、その変異体、組換体および遺伝子操作誘導体より産生された１以上のヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質の抗原性決定子を有するペプチドまたはタンパク質。
１６．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８１５５を与えられたエシェリキアコリ細菌、およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体より産生された１以上のヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質の抗原性決定子を有するペプチドまたはタンパク質。
１７．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８６を与えられたエシェリキアコリ細菌、およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体より産生された１以上のヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質の抗原性決定子を有するペプチドまたはタンパク質。
１８．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８７を与えられたエシェリキアコリ細菌、およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体より産生された１以上のヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質の抗原性決定子を有するペプチドまたはタンパク質。
１９．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８５を与えられたエシェリキアコリ細菌、およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体より産生された１以上のヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質の抗原性決定子を有するペプチドまたはタンパク質。
２０．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項または第６項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２１．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第７項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２２．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第８項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２３．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第９項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２４．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１０項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２５．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１１項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２６．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１２項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２７．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１３項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２８．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１４項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
２９．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１５項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
３０．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１６項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
３１．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１７項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
３２．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１８項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
３３．免疫原が製薬学的キャリヤーと混合した有効量の請求の範囲第１９項に記載のペプチドまたはタンパク質からなるサブユニットワクチン処方。
３４．ヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質の抗原性決定子に関してコードするＤＮＡ配列からなる組換えペグター。
３５．該ＤＮＡ配列が実質的に第１１図に示されたとおりの１以上のヘモフィルスインフルエンザＰＢＯＭＰ−１タンパク質の抗原決定因子を含有するアミノ酸配列少なくとも７つの連続したアミノ酸からなるまたはそのいずれかの部分を有するヘモフィラスインフルエンザ外膜タンパク質に関してコードする請求の範囲第３４項に記載の組換えベクター。
３６．該ＤＮＡ配列が実質的に第１５図に示されたとおりの１以上のヘモフィルスインフルエンザＰＢＯＭＰ−２タンパク質の抗原決定因子を含有するアミノ酸配列少なくとも７つの連続したアミノ酸からなるまたはそのいずれかの部分を有するヘモフィラスインフルエンザ外膜タンパク質に関してコードする請求の範囲第３４項に記載の組換えベクター。
３７．該ＤＮＡ配列が発現コントロール要素のコントロール下である請求の範囲第３４項に記載の組換えベクター。
３８．該ベクターがｐＡＡ１５２またはその変異体、組換体または遺伝子操作誘導体である請求の範囲第３５項に記載の組換えベクター。
３９．該ベクターがｐＰＸ１６７またはその変異体、組換体または遺伝子操作誘導体である請求の範囲第３５項に記載の組換えベクター。
４０．該ベクターがｐＰＸ１６８またはその変異体、組換体または遺伝子操作誘導体である請求の範囲第３５項に記載の組換えベクター。
４１．核ベクターがｐＡＡ１３０またはその変異体、組換体または遺伝子操作誘導体である請求の範囲第３６項に記載の組換えベクター。
４２．該ベクターがｐＰＸ１６３またはその変異体、組換体または遺伝子操作誘導体である請求の範囲第３６項に記載の組換えベクター。
４３．請求の範囲第３５項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
４４．請求の範囲第３６項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
４５．請求の範囲第３８項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
４６．請求の範囲第３９項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
４７．請求の範囲第４０項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
４８．請求の範囲第４１項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
４９．請求の範囲第４２項に記載の組換えベクターを含有する単細胞生物。
５０．請求の範囲第３５項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５１．請求の範囲第３６項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５２．請求の範囲第３８項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５３．請求の範囲第３９項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５４．請求の範囲第４０項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５５．請求の範囲第４１項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５６．請求の範囲第４２項に記載の組換えベクターを含有する微生物。
５７．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８５４を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５０項に記載の細菌。
５８．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８１５５を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５０項に記載の細菌。
５９．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８６を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５０項に記載の細菌。
６０．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８７を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５１項に記載の細菌。
６１．ＮＲＲＬで寄託され受入番号Ｂ−１８２８５を与えられたエシェリキアコリ細菌およびその変異体、組換体および遺伝子操作誘導体からなる請求の範囲第５１項に記載の細菌。
６２．有効量の請求の範囲第２０項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６３．有効量の請求の範囲第２１項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６４．有効量の請求の範囲第２２項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６５．有効量の請求の範囲第２３項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６６．有効量の請求の範囲第２４項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６７．有効量の請求の範囲第２５項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６８．有効量の請求の範囲第２６項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
６９．有効量の請求の範囲第２７項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
７０．有効量の請求の範囲第２８項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保証方法。
７１．有効量の請求の範囲第２９項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
７２．有効量の請求の範囲第３０項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
７３．有効量の請求の範囲第３１項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
７４．有効量の請求の範囲第３２項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
７５．有効量の請求の範囲第３３項に記載のサブユニットワクチン処方をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザによる感染に対するヒトの保護方法。
７６．ワクチン処法を皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または鼻腔内の投与経路を介して投与する請求の範囲第６２項に記載の方法。
７７．有効量のヘモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体をヒトに投与することからなる分類可能または不能ヘモフィルスインフルエンザに対するヒトの保護方法。
７８．抗体がヘモフィルスインフルエンザＰＢＯＭＰ−１タンパク質の抗原性決定子に特異である請求の範囲第７７項に記載の方法。
７９．抗体がヘモフィルスインフルエンザＰＢＯＭＰ−２タンパク質の抗原性決定子に特異である請求の範囲第７７項に記載の方法。
８０．酵素結合免疫吸着剤検定、ラジオイムノアッセイ、ゲル拡散沈降反応検定、免疫拡散検定、凝集検定、螢光イムノアッセイ、ブロテインＡイムノアッセイおび免疫電気泳動検定からなる群から選ばれる検定システムにおいて抗原として請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項または第６項に記載のペプチドまたはタンパク質を用い、かついずれの反応も試料におけるヘモフィルスインフルエンザの存在を示す抗体とのいずれかの反応を検査することからなる組織または体液の試料におけるヘモフィルスインフルエンザの検査方法。
８１．ヌクレオチドハイブリダイゼーション検定においてプローブとして、第１１図に示されたヘモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に関連するペプチドまたはタンパク質またはそのフラグメントをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を用い、かついずれの反応も試料におけるヘモフィルスインフルエンの存在を示す該プローブとのいずれかの反応を検査することからなる組織または体液の試料におけるヘモフィルスインフルエンザの検査方法。
８２．ヌクレオチドハイブリダイゼーション検定においてプローブとして、第１５図に示されたヘモフィルスインフルエンザの外膜タンパク質に関連するペプチドまたはタンパク質またはそのフラグメントをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を用い、かついずれの反応も試料におけるヘモフィルスインフルエンの存在を示す該プローブとのいずれかの反応を検査することからなる組織または体液の試料におけるヘモフィルスインフルエンザの検査方法。
８３．ヌクレオチドハイブリダイゼーション検定がサザンブロツト、ノーザンブロットおよびコロニーブロットから成る群から選ばれる請求の範囲第８１項または第８２項に記載の方法。