JPH01502480A

JPH01502480A - ブタ成長ホルモンアナログ

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Publication number: JPH01502480A
Application number: JP63502797A
Authority: JP
Inventors: スーザ，ローレンス・エム
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド; スミスクライン・ベツクマン・コーポレイシヨン
Priority date: 1987-03-12
Filing date: 1988-03-07
Publication date: 1989-08-31
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: CA1277933C; EP0282319A2; KR970009159B1; ZA881751B; PH23502A; KR970009158B1; MY103229A; ES2059504T3; AU614956B2; EP0282319A3; US5104806A; DE3884241T2; ATE94903T1; AU1496988A; KR890700673A; JP2619036B2; US5356877A; CN1033759C; CN88102023A; DE3884241D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ブタ　ホルモンアナ口先ｉへＬＬ本発明は一種の新規ブタ成長ホルモンアナログに係る。

特に本発明は、天然に産生ずるブタ成長ホルモンのアミノ酸配列中の３２〜３８位の残基に対応する残基が１個以上欠失している、組換により作製されたブタ成長ホルモンのアナログに係る０本発明は更に、このようなアナログを含む組成物、並びに哺乳動物の成長を増進するためのこのようなアナログ及び組成物の使用に係る。

正常な哺乳動物の下垂体は成長ホルモン（にＨ）と呼称される物質を産生じ、血流中に分泌する。ヒト（ｈｃＨ）、ウシ（ｂにＩＩ）及びブタ（ｐｃｔ）成長ホルモンのアミノ酸配列は類似している。これについては、Ｄａｙｂｏｆｆ、＾ｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅ　ｕｅｎｅｅａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｖｏｌｕｍｅ　５．５ｕｐｐｌｅ＋ｅｅｎｔ　６．　ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｉ＋ｌａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１２０−１２１（１９７６）　；及びＳｅｅｂｕｒｇ他、エム、　Ｌ、　３７−４５　（１９８３）を９照されたい、サケ成長ホルモン（ｓｃＢ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列も知られている（Ｓｅｋｉｎｅ他、　Ｐｒｏｅ、　Ｎｉｔ’１．＾Ｃｉｄ。

針」１」Ｊ旦υ−９旺、　４３０６−４３１０　＜１９８５＞）、これらの成長ホルモン間の相同度が最も高いｂｃＢ、　ｈｃＨ，ＯにＢ、　ｐｃＨ及び５ｃｔｌの配列の７ラインメントに基づいて、安定性が高い領域を同定することができる（前出のＤａｙｈｏｆｆ及び前出の５ｅｋｉｎｅ他の文献を９照）。

組４お！において成長ホルモンは、アミノ酸からのタンパク質の構築、投与後の血漿グルコースの初期低下、初期低下後の血漿グルコースの漸増、及び脂質から脂肪酸への分解を促進する。成長ホルモンに関連する効果は夫々成長促進（即ち体重増加）、インシュリン節約作用、糖尿病誘発及び脂質分解効果と呼称される。抗脂質分解効果も報告されているが、これはホルモンのインシュリン類似作用の一面であると思われる（Ｃｏｏｄｓ＋ｉｎ、　Ｎｅｔａｂｏｌｉｓ（１９，８４９−８５５（１９７Ｏ））。

更に、成長ホルモンは催乳ホルモンと構造が顕似しており、同様の効果を誘導することが可能である０例えば、ｈＧＢは残基の約１５％がヒト胎磐性催乳ホルモンと異なる（Ｍａｌｌｉｓ他、（：ｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｅ　ｔユｄｅｓ、Ｐｅｅｉｌｅ他編、　Ｅｘｃｅｒｐｔ―暦ｅｄｉｃａ、＾−ｓｔｅｒｄａｍ、　１−１３　（１９７６））、ヒト成長ホルモンは残基の約２５％がしトプロラクチンと異なる（前出のＭａｌｌｉｓ他の文献）、　ｂｃｎ又は組換ｂ［；Ｂ（ｒｂｃＩｌ）を皮下注射すると、ウシ、ヤギ及びヒツジの乳汁の生産量が増加する（Ｅｐｐａｉｒｃｊ他、　Ｊ、Ｄａと１士症、　６８．１１０９−１１１５　（１９８５）；Ｂａｕｍａｎ他、Ｊ、Ｄａｉｒ　Ｓｃｉ、、６８．　１３５２−１３６２　（１９８５）：　ｌ１ａｒｔ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｔｒ、　Ｓｏｃ、、　４２．１８１−１９４　（１９８３）；及びＤａｒｔ他。

Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｊ、、２１８．　５７３−５８１　＜１９８４））。

下垂体から成長ホルモンを単離するには、ホルモンの産生に関連する下垂体細胞を溶解させなければならない、しかしながら、細胞の溶解によってタンパク質加水分解酵素（プロテアーゼ）が放出され、天然に産生ずる下垂体成長ホルモン（＋）にＢ）の少なくとも一部をフラグメントに分割しがねない、更に、ｎＧＨは血流中に一旦分泌されると、ｎｃＢを同−又は異なるフラグメントに分割し得るプロテアーゼの作用を受ける。成長ホルモンフラグメント研究の最大の研究対象は、既に抽出されている成長ホルモン又は血流中を循環している成長ホルモンに関連する作用を生じるのがｎＧＢであるのか又はそのフラグメントであるのが又はその両方であるのかを決定することに向けられている。この点に関して、リジン又はアルギニン残基を化学的に修飾することにより、ｂｃＢのアナログをプロテアーゼトリプシンによる消化に対して耐性にすると、はっきりとはわがるか弱い成長促進、糖尿病誘発及びインシュリン類似作用を生じることに着目することができる＜Ｃ・ａｍｅｒｏｎ他、　Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ａｃｔａ、　２５４−２６０　（１９８５））、一方、ｎＧＢ分子の個々の部分（領域）はｎＧＨの効果のいずれかに関与すると考えられている。

ｎｃＢの作用への関与がこのように局限され得る程度までは、タンパク質合成、インシュリン節約、糖尿病誘発及び脂質分解効果を選択的に変化させたフラグメント及びアナログを作製することができる。

以下の文中において、成長ホルモンのフラグメント又はアナログ中に存在するアミノ１１残基の位置は下付き文字で示し、数字は対応するｎＧＢの同一の位置に見いだされる残基の存在を示し、欠失はコンマで表す０例えば、天然に産生ずるブタ成長ホルモンはｐｌ；Ｌ−＋＊ｏで表す。

下垂体から単離され得、且つ）ＩＣＥＩ−３１＋４２−Ｉｌ＋に対応するｈｃＢ（２２０００ダルトン）の２００００ダルトン変異体（２０Ｋ）は、下垂体を切除したラットの成長を促進し、イヌでは高血糖症又は高インシュリン血症を誘発せず、江ハ心！又はｉｎ　ｖｉｔｒ。

でインシュリン節約作用も脂質分解作用も生じず、ｂＧＨのラジオイムノアッセイによるとｂＧＨ自体よりも低反応性である（Ｌｅｗｉｓ他、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５３．２６７９−２６８７　（１９７Ｂ）；Ｆｒｉｇｅｒｉ他、　Ｂｉｏｃｂｅｓ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　９１．７７８−７８２　（１９７９）；　Ｌｅｗｉｓ他、Ｂｉｏｅｂｅｍ、Ｂｉｏ　ｂ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ＠診ｕｎ、。

９２、５１１−５１６　（１９８０）；及びＬｅｗｉｓ他、　Ｅｎｄｏｃｒ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

亀、　１５５−１６４　（１９８１））、　ｂｃｌｌの２０に変異体は転写後修飾産物である（ｌｖ出のＬｅｗｉｓ他、　Ｂｉｏｃｂｅｓ、　Ｂｉｏ　ｂ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）、ｂｃｎの２０に変異体は、その二量化傾向、即ち腎機能低下を免れる傾向により、匡す１■−生物活性から予測される以上に重要な成長促進物質である（Ｂａｕｍａｎｎ他、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　。

１１７、１３０９−１３１３　（１９８５））。

２０Ｋ　ｂＧＢに欠けている残基を含むｈＣＨのフラグメントも文献中に開示されている。これらのフラグメントのうちで成長を促進することが報告されているものはないが、フラグメントによっては成長ホルモンの糖尿病誘発及び脂質分解特性に関係の深い特性を有するものもある。

１１ＣＢの３１〜４４位の残基に対応する合成フラグメントは絶食させた動物における鑞４山！及び匡畦立！で脂質分解性である［Ｙｕｄａｅｖ他、　Ｂｉｏｋｈｉｍ上ＬＬ、　４１．８４３−８４６　（１９７６）コが、非生理的状態でＣＢの不在下にｉｎ　ｖｉｔｒｏでブレインキュベーションした後に限りグルコースの取り込みを刺激する（即ちインシュリン節約作用を示した）（Ｙｕｄａｅｖ他＊　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１１０．８６６−８７２　（１９８：ＩＩ））、　ｂＧＨジペプチドアナログには糖尿病誘発性のものもあるが、ｈにｌ１ｓ２−１．のアナログはそうではない（Ｌｏｓｔｒｏｈ他、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　２７゜５９７−５９８　（１９７８）、　ｈｌ；Ｌ。−４１から構成されるペプチドは活性を欠いている（Ｒｅａｇａｎ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　２７．８８３−８８８　（１９７８））。

ｂｃＢ＋−ｓｓから構成されるペプチドは血液グルコース又は成長に対して効果がない（Ｃｂｉｌｌｅｍｉ他、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄユ並月±１．　Ｐｅｃｉｌｅ他編、　Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｅａ。

Ａ−ｓｔｅｒｄａ＋＊、５０−６３　（１９７６））。

一方、ｈＧＨｓｚ−＊ａに対応するペプチドは血清遊離脂肪酸を減少させ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｆｒｉ＠ｅｒｉ他、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ、　６４ｔｈ＾ｎｎ−ｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｓｉｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ。

１０１（＾ｂｓｔｒｉｃｔ　８８）　（１９８２）］及びｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｒｕｄｍａｎ、υ、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４，５５８，０３３及び５ｔｅｖｅｎｓｏｎ他、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３３゜１４９＾（＾ｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、　５７２）　（１９８４）コにおいてインシュリンと同時に投与するとインシュリン節約作用を示す、　ｈＧＨｓｚ−４、のフラグメント及びアナログ（異種アミノ酸又は立体異性体の置換を含む）も同様に、ｉｎ　ｖｉｖｏでインシュリンと同時に投与するとインシュリン節約性である（Ｊｏｎｅｓ他の同時係属中及び同時譲渡の米国特許出願第５０１，０２４号）。

１１α１１本発明は、天然に産生ずるブタ成長ホルモンの生物活性及び特性を維持しながら成長速度、飼料効率、脂肪分解又は乳汁生産量を増加するような一種のブタ成長ホルモンアナログの頚に係る。

特に本発明は、アミノ酸の１個以上が欠失しているアミノ酸配列Ｚ−ＯＧＢ＋−３＋−（Ｘ）ｅ−ｐＧＨｓｓ−＋ｓ。

（ｎは０又は１であり、Ｚは水素、ＮＥＴ、ＡＬＡ又はＮＥＴ−＾ＬＡ−であり、ＸバーＧＬＵ−ＡＲＣ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−（：ＬＵ−ヲ含ｔｒ　７　ミ／　１！　残基のペプチドである）を含む組換ブタ成長ホルモンアナログ、及びその対立遺伝子型に係る。

本発明は更に、上記配列を有するブタ成長ホルモンアナログをコードする合成遺伝子にも係る０本発明はまた、ＤＮＡ配列を含む各種の複製可能なりローニングベクター、並びに形質転換細菌又はトランスフェクトしたＩＩＩＩＷ＆系でブタ成長ホルモンアナログを作製するのに有用なりＮＡ配列を含む発現ベクターの構築方法にも係る。更に、本発明は上記アミノ酸配列を有するブタ成長ホルモンのアナログをコードする遺伝子も提供する０本発明は更に、各種の複製可能なりローニングベクター、発現ベクター及び形質転換細菌又は細菌培ＩＩ物も包含し、これらはいずれも本発明のブタ成長ホルモンアナログを作製するのに必要な改変遺伝子情報を含む。

本発明のブタ成長ホルモンアナログは実質的に純粋な形態で作製され、従って、ブタに由来する他のタンパク質を本質的に含まない、ブタ成長ホルモンアナログは、宿主動物への有効な運搬を助長できるように許容可能な組成物を構成するべく、他のタンパク質、例えば血清アルブミンを含む従来の好適なキャリア及びアジュバントと調合され得る。

本発明は更に、有効量の本発明のブタ成長ホルモンアナログを動物に投与する段階を含む動物の成長を促進するための方法も提供する。

区ｍ口１４Ｒｊ− 第１図はｐＢＲ３２２４ｒｐ−ｐＧＢプラスミド構築の概略図、第２図はｐｃＦＮ　４１４−Ｔｒｐ−ｐＧＢプラスミド構築の概略図、第３図はｐｃＩｌ及びｐにドアの構築に使用されるｘｂａｌ〜＾ｐａ　ｉ　ｐＣＢ　ＤＮＡフラグメントを作成するために使用されるオリゴヌクレオチドアセンブリの図解、及び第４図はｐｃＦＭ　８４６−ｐＧＢプラスミドの構築に使用される成分の図解である。

色乱虹Ｌｉ上述のように、成長ホルモンの生理的活性は完全なポリペプチドの各領域に起因し得る。このような活性は、完全なポリペプチドの特定の折り畳み又は修飾、仲介因子の放出、又は例えばそれ自体が脂質分解に関与し得るα−及びβ−リボトロピンのような他の下垂体ペプチドによる「汚染」にも起因し得る［Ｋｕｂｎ他、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｈｅｔａｂ、。

５６、１３３８−１３４０　＜１９８３）：　Ｆｒｉｇｅｒｉ他、　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓ、、　１７゜１９７−２０１　（１９８３）］。

精製したホルモンの効果から汚染物の効果を分離するためには、他の下垂体成分、例えば組換ｐｃＩＩ（ｒｐＧＩＩ）から単離することにより作製される成長ホルモンの活性を試験する方法がある。　ｐ（：ＩＩの遺伝子は既に配列決定されており、種々の形態で原核及び真核細胞中に発現されている［Ｋｅｓｈｅｔ他、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．１９−３０　（１９８１）；　Ｍｏｙｃｈｉｋ他。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１０．７１９７−７２１０　＜１９８２）；　Ｓｅｅｂｕｒｇ他。

ＤＮＡ、　２．３７−４５　（１９８３）；　Ｋｏｐｃｈｉｃｋ他、　ＤＮＡ、　４．２３−３１（１９８５）及びＣｅｏｒｇｅ他、　ＤＮＡ、　Ｌ、　２７３ −２８１　（１９８５）］。

本発明は、天然に産生するｐｃＨの生物学的特性（例えば免疫特性及びｉｎ■幻！の生物学的活性）及び物理的特性（例えば分子量）の１つ以上を有するポリペプチド精製物及び単離物を提供する。これらのポリペプチドは、ゲノムｃＤＮ＾クローニング又は遺伝子合成により得られる外因性ＤＮＡ配列の化学的合成方法による又は原核もしくは真核宿主発現（例えば培養基中の細菌、酵母、高等ｍ？ｌＪ、昆虫及び哺乳動物細胞による）産物であることも特徴とする。典型的な酵ｔ（例えばＳａｃｃｂａｒｏｍ　ｅｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は原核生＊（例えば大腸菌Ｅｓｃｂｅｒｉｅｂｉａ　ｃｏｌｉ：　Ｅ、Ｃｏ１１）宿主細胞の発現屑物は、哺乳動物のタンパク質と会合しない、を椎動物（例えばヒト以外の哺乳動物及び鳥類）細胞の微生物発現産物はヒトタンパク質と会合しない、使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコジル化してもよいし、しなくてもよい０本発明のポリペプチドはイニシャルメチオニンアミノ酸残基（−１位）を含み得る。

本文中において、アミノ酸残基の「ペプチド」なる用語は１個以上のアミノ酸が欠失しているアミノ酸ＧＬＵ−＾ＲＣ−＾Ｌ＾−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＣＬ υを含むペプチドを意味する０本発明の目的で、該ペプチド中のアミノ酸の欠失は逐次的でもランダムでもよい。

ＤＮＡ配列又は遺伝子に適用される場合の「人造（ｍａｎｕｆａｅｔ−ｕｒｅｄ）　Ｊなる用語はヌクレオチド塩基のアセンブリにより完全に化学的に合成された生成物又は合成された誘導体を意味する。従ってこの用語は、もともと生物に由来する材料を出発物質とするゲノムｃＤＮ＾クローニング法により「合成された」生成物は除外する。

本文中において、「対立遺伝子型」なる用語はアナログの生物活性を改変することなしに本発明のブタ成長ホルモンアナログの配列中で１個以上のアミノ酸が修飾されていることを意味する。このような対立遺伝子型は当業者により容易に予想されよう。

２がＮＥＴ−＾Ｌ＾の場合、好ましくはＮＥＴ残基は２が＾Ｌ＾であるようなアナログを得るように処理されることに留意すべきである１本発明の好適なブタ成長ホルモンアナログは、ｎがＯであり且つ２が＾Ｌ＾であるような式（１）のブタ成長ホルモンアナログを含む、別の好適なブタ成長ホルモンアナログは、ｎが１であり、Ｚが＾ＬＡＮ’あり、Ｘが−ＧＬＵ−ＡＲＣ−ＡＬＡ−ＣＬυ−の配列を有する残基であるような式（１）のブタ成長ホルモンアナログ（＾Ｌ＾−ｐＧＬ−ｐｎ＋ｓｓ−＋＊。）を含む。

本発明の更に好適なブタ成長ホルモンアナログは、ｎが１であり、２がＡＬＡＴアｌ：）　、ＸがＣＬＵ−ＡＲＣ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＧＬｔｌノ配列を有する残基であるような式（１）のアナログ（＾Ｌ＾−ｐＣＢ、−コ藝、コ・− ８−０）を含む０本発明の別の好適なブタ成長ホルモンアナログは、わが１であり、２がＡＬＡであり、Ｘが−ＣＬト＾Ｌ＾−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−（：ＬＵ−の配列を有する残基であるような式（１）のアナログ（＾Ｌ＾−ｐＧＢ＋− ３ｇ＋３ｇ−＋＊、）を含む。

第１表は天然に産生ずるｐｃＨのアミノ酸配列を示す。

本発明の組成物及び方法は、有効量の本発明のブタ成長ホルモンアナログを使用する０本文中においてブタ成長ホルモンの「有効量ｊなる用語は、成長又は関連する特性、即ち飼料効率、赤み肉の多い組成、乳汁生産量等を増加させるために動物に投与すべきブタ成長ホルモンアナログの量を意味する。このような有効量は当業者により容易に予想されよう。

以下の実施例は本発明の態様を更に詳細に説明するものである。

医１ｊ１− ６０、、のポリアデニル化ＲＮ＾を１９のブタ下垂体から単離した。　Ｏｋａｙａｍａ他、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｌ、　１６１　（１９８２）に記載の方法に従ってポリ（＾）ＲＮＡからｃＤＮＡを形成し、コンピテント大腸菌（８８１０１株）に形質転換させた。ＩＰで１！識し、ニック翻訳した４９３ｂｐ　ＰｖｕＩＩ　ｃＤＮＡ　ｂｃＨプローブを使用して５０００個のコロニーをスクリーニングした。ハイブリダイズした２００個のコロニーに、二次スクリーニング、ＤＮＡ単離及び制限酵素マツピングを実施し、５個のコロニーを選別した。２個の単離体は約５ｏｏｂ、のｐ（Ｊ　ｃＤＮ＾ＤＮＡ１．４）を含んでおり、３個の単離体は約７００ｂｐ（２，３，５）を含んでいた。

クローン番号１に８１３　ＤＮＡ配列決定を案施し、ｐＢＲ３２２−Ｔｒｐ発現ベクターに転写した。この構築を得るために、クローン１からのプラスミドＤＮＡをインサートの５°末端の近傍のｔｌａｅｌ［部位及びクローン１のｐＢＲ３２２領域のｅＤＮ＾ＤＮＡ−トの３゛末端の外側のＨｕｅ　Ｉｆ部位で切断し、１１００ｂｐフラグメントを形成した。この１１００ｂｐセグメントをＳｌヌクレアーゼで処理し、Ｘｂａ　ｌプラントリンカ−を両端に連結した０次に、Ｘｂａ　ｌではさんだＤＮＡセグメントを、先にＸＢａ　ｌで切断したｐＢＲ３２２ −Ｔｒｐ発現プラスミドに連結した（第１図）。

Ｘｂａ　ｌプラントリンカ−は、５’　Ｘｂａ　１部位及び３′プラント末端、並びにへＴＣ開始コドンを形成した。

Ｂａ　１５’　ＣＴＡＣＡに＾＾ＴＣＣＣ３’ ３”　ＴＣＴＴＡＣＣＧ　５’ 上記発現プラスミドをＰｖｕ　］ｌ及びＥｃｏＲｌで消化することにより３“末端のポリ（＾）テールを除去し、Ｔｒｐ／ｐＧＢ　３５５　ｂｐフラグメントを分離した。このために、Ｐｖｕ　ｎ　−Ｂａｗｌ　Ｉリンカ−をＰｖｕ　ｌで切断した３°末端に連結させ、次にこれを制限酵素ＥｃｏＲｌ及びＢａ５ａｌ　ｌで切断したｐｃＦＭ　４１４発現プラスミドに連結した（第２図）。

Ｐｖｕ　ＩＩ　−ＢａｍＢ　Ｉリンカ−はＰｖｕ　１部位の半分、終止コドン（Ｔ＾＾）及びＢａｍＢ　１部位を含んでいた。

Ｐｖｕ　ｌ　ＢａｍＨＩ５°ＣＴにＣにＣＡＴＴＣＴΔ＾Ｇ３゛３’にＡＣＩＩ；Ｃに　Ｔ＾＾Ｃ＾丁ＴＣＣＴＡＣ５゜配列決定データに基づいて２つの興なる二重鎖（ｄｓ）のオリゴヌクレオチド配列（Ｐ（：Ｂａｔ、　ＰにＢ−７）を上述のように化学的に合成した。３つのＤＮＡの各々が５゛末端に独工■制限部位を有し且つ３°末端にＡｉＬＩ制限部位を有するように割り当てた。ＡＪｉＩ部位のすぐ下流に虹と」制限部位を加え、５ｐ１９バクテリオフアージへのクローニングを助長するよう要約すると１人造遺伝子を構築するために以下の実施例で使用さ、れるプロトコールは、豐考資料として本発明の一部に加えるＡｌｔｏｎ他名義のＰＣＴ公開−０８３１０４０５３に一般論として開示されている通りである。遺伝子の構築は、成分オリゴヌクレオチドをまず多数の二重型にアセンブリし、次いでこの二重型を個々のセクションにアセンブリするようにした。これらのセクションは容易に増幅できるようにし、増幅システムから除去後、逐次又は多重フラグメント連結を介して適当な発現ベクターにアセンブリした。

寒」Ｕ烈」１ブタ成長ホルモンの２つの遺伝子フラグメントを同様に構築した。一方の遺伝子フラグメント（フラグメント１−ｐｃＩＩｗｔ）は、ｃＤＮ＾ＤＮＡ定により推測されるように２２にブタ成長ホルモン遺伝子配列を含んでいた。第２の遺伝子フラグメント（フラグメント２−ｐＧドア）は、「欠失ペプチドＪ（ＤＰ）領域中の７個のアミノ酸を欠失する２２にブタ成長ホルモン配列（以下、２１にブタ成長ホルモンと呼称する）をコードした。オリゴマー１５．１６．１７及び１８はｐにドアのＤＰコード領域の始めと終わりの間にギャップを形成し、この遺伝子型に加えられるアミノ酸をコードする０両方の遺伝子型に共通のオリゴヌクレオチドセグメントは１．２．３．５．６、ア、８．９．１０．１２．１３．１４．１６及び１８であった（第３図）。

２つの遺伝子フラグメントの構築に必要な２０個のオリゴヌクレオチドをへＢＩＤＮＡシンセサイザーで合成し、標準方法を使用してゲル電気泳動により精製し、第２表にリストした。各精製オリゴヌクレオチド（オリゴ）を１１１１のＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ　ＢＣｌ、　ｐＨ７，２，０，１Ｊ　ＥＤＴ＾）に溶解させ、２６０ｎ−の吸光度を記録した。吸光度をオリゴの吸光体数計１値と比較し、濃度を計算した０次にピコモル／Ｉ１１で表した濃度を使用して遺伝子構築用の夫々のオリゴを測定した０例えば１３個のアデノシン、８個のシトシン、９個のグアニン及び９個のチミジンを含む３９量体であるオリゴ＃１の場合、２６０ｎｍで計算した吸光係数は４４４７００である。　２６０ｎｍにおける吸光度は０．３７９であり、濃度（ｐｍ／ｕｆ）は０．８５２である。オリゴは、して量り取った。使用量は、構築すべき各遺伝子フラグメントに１００ピコモルの各オリゴが割り当てられるようにした。即ち、オリゴ＃１．２．３．５．６．７．８．９．１０．１２．１３．１４．１６及び１８は２つの遺伝子構造の各々に共通であるため、２００ピコモルを使用した。１５．１７．１９及び２０は遺伝子構造の一方にしか見いだされないので１００モルを使用した。量り取ったオリゴを高速真空乾燥し、８０％エタノール２２０％水あわせて１５０．１を使用して再乾燥した。

オリゴは、完成した遺伝子構造の末端に！＆終的に位置し得るオリゴマーが自己連結し得ないように選択的にホスホリル化した。即ちオリゴ１及び１４はホスホリル化しなかった。他の全オリゴはホスホリル化した。キナーゼ化（ｋｉｎａ− ｔｉｏｎ）及び連結の全操作は５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐｔ１７．６．１０５Ｍ塩化マグネシウム及び１０ｍＭジチオトレイトールから構成される連結用緩衝液ＬＢ中で実施した（ＬＢは１０倍濃縮溶液、ｌ０ＸＬＢとして保存し、必要に応じて希釈した）、オリゴ１及び１４を夫々６０ｕ１のＬＢに溶解させ、必要が生じるまで氷上に１いた。

９２ｕ１のｌ０ＸＬＢ、２０９Ｎのポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉａ、　１０単位／ｕｉ’）、１，１の１０ｍＭ　ＡＴＰのＴＥ浴溶液ｓｏ、ｏｏｏ、ｏｏｏカウント／分の放射活性を含む″２Ｐγリン酸＾ＴＰの１／４ｕＺ、８１０ｕＮの水を含有するキナーゼ混合物を調製した。

キナーゼ混合物の総量は９２０Ｉ１１であった。ホスホリル化すべき乾燥オリゴ１００ｐ１００ｐにつき２０Ｈ１の混合物を加えた。

オリゴ２．３．５．６．７．８．９．１０．１２．１３．１６及び１８（各２００ｐｍｏｌｅ）を４０．１のキナーゼ混合物に溶解させた。オリゴ１５．１７．１９及び２０（各１００ｐｍ１００ｐは２０１１１のキナーゼ混合物に溶解させた０次に、キナーゼ混合物中に溶解させたオリゴを収容する全チューブを３７℃ で４５分間インキュベートした。

１／４，１のアリコートを各チューブから取り出し、ＤＥ−８１紙ストリップに別々にスポットした。次に、溶媒の前端が下向きのストリップの底部に達するまでＤＥ−８１ストリツプをクロマトグラフィーチャンバ内で０．３５Ｍの蟻酸アンモニウム緩衝液で溶出させた８次にストリップをチャンバから取り出し、１００℃の乾燥オーブンで乾燥し、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋ＋ｓａｎ　ＬＳ　６８００）で分析できるように細断した。ストリップを、原料のみを含む第１の断片と、ＤＥ−８１ストリツプの残部を含む第２の断片とに切断した０次にＤＥ−８１ストリツプからのフラグメントをプラスチック製計数バイアル内に配置し、ＬＳ−６８００で乾燥計数した。カウンターは、各ストリップの原料物質に取り込まれた放射活性を示したので、大過剰量の低温＾ＴＰでホスホリル化反応を追跡した。各ホスホリル化反応物に１．１の１０＋ａＭ＾ＴＰを加え、チューブを３７℃で更に４５分間インキュベートした後、ＤＥ−８１分析を実施した０次に、オリゴを収容する全チューブ（ホスホリル化しなかった１及び１４を含む）を５分間煮沸し、迅速に冷却した。この工程によりキナーゼ酵素を破壊した。

１５＋１７１６＋１８各二重型は対の最初のほうのオリゴの番号で呼称することにした。チューブ１．２．３．５．６．７．１５．１６及び１９を混合し、５分間煮沸した後、室温まで徐冷した。

次に、これらのアニールした二重型を結合して四量体：を形成した。

これらの四量体は、対の最初のほうのチューブの番号、即ち夫々３及び５として呼称することにした。四量体３及び５を収容するチューブの各々に５．１の１０ｍＭ＾ＴＰを加えた（＾ＴＰ濃度を約２００マイクロモルにした）。四量体を３７℃で１０分間アニールした。５ｕ１のリガーゼ（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ（１単位／ｕｊりを各チューブに加えた。連結物を３７℃で５分間インキュベートした後、氷上に１時間置いた。

二重型１６の２分の１を二重型１５と結合し、残りの１７２は二重型１９と結合した。これらの四量体の各々に２ｕｌの１０ｓ＋Ｍ＾ＴＰを加えた。四量体を３７℃で１０分間アニールした後、２．１のりガーゼを各チューブに加えた。混合物を３７℃で５分間インキュベートし、氷上に１時間置いた。

別の二重型を加えてより長い二重型とし、即ち二重型７を四量体５に加えて六量体＃５とし、二重型１を四量体３に加えて六量体＃３とし、２．５ｕｌの１０ｍＭ　ＡＴＰ及び２．５．１のりガーゼをこれらの六量体に加えた０次に２本のチューブを混合し、３７℃で１０分間インキュベートし、氷上に１時間置いた。

夫々ｐ（ニド７及びｐｃＨの中心オリゴを収容するチューブ１５及び１９の各々に六量体＃５の３分の１を加えた。チューブ１５及び１９を３７℃で１０分間インキュベートし、氷上に２時間置いた。

次に六量体＃３を１／２ずつチューブ１５及び１９の各々に加えた。

１０ＭＭ　ＡＴＰ及び５，１のリガーゼの構築に必要な全オリゴをチューブの各々に加えた。連結物混合物を含むチューブを３７℃で１０分間及び４℃で５日間インキュベートした。

３つの連結物の各々からの５．１を取り出し、７Ｍ尿素を含む厚さ０．７５ｍ− の分析用５％ポリアクリルアミドゲルで検査した。２２Ｐで標識しＨｐａ　］１で切断したｐＢＲ３２２を標準として隣接するレーンに展開させた。各連結物からのアリコート及びＨｈ　■標準を、０．１％キシレンシアツール及びブロムフェノールブルー染料（８０％ホルムアミド＋染ｆｌ）を含む８０％ホルムアミドと２０％水との溶液２０ｕ１に希釈した。サンプルを５分間煮沸後、氷上で５分間迅速に冷却し、ゲルに充填した。

ゲルを（ブロムフェノールブルーがゲルスラブの底部に達するまで）４００ボルトで４５分間泳動させた後、ガラスプレートから取り出し、サランラップに包み、ｐｕｐａｎＣｒｏｎｅｘχ線フィルムシートと共にフィルムパトローネに容れた。−７０℃で露光し、フィルムを現像した処、連結したＤＮＡがオートラジオグラム上に現れた。レーン１５には２７２塩基対二重型に対応するバンドが現れた。レーン１９には２９３塩基対二重型に対応するバンドが現れた。これは、各連結により夫々ｐ（：Ｈ−７及びｐｃｔｌに必要なりＮＡ構築物の一部が得られたことを意味する。

ゲル分析結果に基づいて、３つの連結混合物から大規模ゲル精製を行った。’４０．１の３Ｍ酢酸ナトリウム及び１１１の１００％エタノールを使用し、−７０ ℃で一晩冷却することにより、各連結物をエタノール沈降させた。　１００００ｘｙで１０分間遠心分離後、上滑を除去し、ｔｏｏｕｌの水冷８０％エタノールで湿ぐことにとよりＤＮＡペレットを単離した。濯いだペレットを高速真空乾燥した１次に各ペレットを５ｏｕｌの８０％ホルムアミド＋染料に溶解させた。５分間煮沸し、氷上で迅速に冷却した０次に、各連結混合物の１７２を、７Ｍ尿素を含む厚さ３簡−の５％ポリアクリルアミドゲルに充填した。ゲルを２５０〜３００ボルトで２時間泳動させた０次にゲルをフィルムパトローネに容れ、室温でオートラジオグラフィにかけ、バンドを可視化させた０次に現像したフィルムをパトローネ中のゲルの近くに置き、完全に連結した遺伝子フラグメントに対応する各レーンのバンドの位置をマークし、カミソリの刃を使用して所望のバンドをゲルから切り取った。　３ｚｌの注射器（針なし）でＥｐｐｅａｄｏｒｆチューブに押し出すことにより各ゲルスライスを砕いた。砕いた各ゲルスライスを０．７ｚｌのゲル溶離緩衝液（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、０．０１Ｍ酢酸マグネシウム、　０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．１％酢酸アンモニウム、０．０ＩＮ酢酸マグネシウム、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）で覆い、３７℃で一晩インキユベートした。

注射器の筒にガラス繊維フィルターパッドを挿入してゲル−溶液混合物を一過し、ｎ−ブタノールで３回洗浄した。２と１７２容量のエタノールを加え、−７０ ℃で１時間保存することによりＤＮＡを沈降させた。　１０００Ｘｙで１０分間遠心分離した処、上滑を傾瀉することによりペレットを単離した。ペレットを５分間高速真空乾燥した。ペレットをｚｏｏｕｌのＴＥに再溶解させ、遠心分離してポリアクリルアミド残渣を濃縮した後、２０ｐ１の３Ｍ酢酸ナトリウム及び５５ｈ４の１００％エタノールで再沈降させた。乾燥したＤＮＡベレットを液体シンチレーションカウンターで計数した処、各遺伝子フラグメントを約１ピコモル含有していることが認められた。

各ＤＮＡペレットを、２．ｆの１０×ＬＢ及び１ｔ＋１の放射性標識＾ＴＰ（３０，０００，０００ｃｐｍ／ｕｆ）を含有する溶液２０ｐｌに再溶解させた。

１／４，１のアリコートを各チューブから取り出し、ＤＥ−８１ストリツプにスポットした。ＩＨｌのポリヌクレオチドキナーゼを各チューブに加え、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。　１／ｈｌのアリコートをホスホリル化反応物から取り出し、別のＤＥ−８１ストリツプの組にスポットした０次に全部で６個のストリップを０．３５Ｍの蟻酸アンモニウムで溶離させ、その由来の放射活性保持能力を比較した。各二重型の前後のＤＥ−８１ストリツプを比較した処、ホスホリル化が生じていたのでｌｕｌの１０ｍＭ＾ＴＰで各反応を追跡し、反応を完了した。３７℃で４５分間インキュベーション後、チューブを５分間煮沸し、室温まで徐冷させた。連結緩衝液中のアニールしたホスホリル化二重型を、適当なりローニングベクターに連結できるようにした。

合成ｐＧＨ［祭物の各々を８１３ｍｐ１９にクローニングした後、−重ｇ（ｓｓ）及びｄｓＤＮ＾を単離させた。　ｓｓ　ＤＮＡを配列決定した。３つの異なるｐＧＢ福築物祭物°部分を含むｌ１ｌ〜む見１ｄｓＤＮ＾フラグメントのソースとしてｄｓ　ＤＮＡを使用した。

１工Ｌ６　Ｓ’　−ＧＡＧＡＴＣＴＧＡ？ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴ　−３’１０　５’　−ＧＡＡ’！’ＴＣａｒＴＴＧＴＡＡＧτにＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧ費ＧＡＴＧＣ−３゜１２　５’　−ＴＣＴＣＴＧ’！’ＴＧＡＧＣＴ↑ＣＣＴＣＴ’ｌ’ＴＡＣＣＡＧＴＴＧ（、ＣＧＣＣ−３’Ｌ３　Ｓ’　−ＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＣＡＧＣＡにＴ？ＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡ　−３’ｐＣＨ発現ベクターを構築するためには３部分のＤＮＡ連結が必要であった（第４図）、成分１は３つのｐにＢｍｐ１９　ＤＮＡの１つから単離したＸｂａ　ｌ〜ｂ見１　ｄｓ　ＤＮＡフラグメントであった。

成分２はｐａｌｌｅｔ遺伝子の３°を含むＡＢｇ　Ｉ　〜Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　ｄｓ　ＤＮＡフラグメントとしてｐｃＦＭ４１４ｐｃＢベクターから単離した。成分３はＸｂａ　ｌ及びＢａｍＨＩで切り出したｐｃＦＨ８４６７ラスミドであった。　ｐｃＦＭ８４６プラスミドはｐｃＦＮ８３６の誘導体（以下に記載）であって、ｐｃＦＨ８３６の非反復Ｃｂｌ及びＫｐｎ１部位の間の次のＤＮＡ配列：５”ＣにＡＴＴＴにＡＴＴＣＴＡにＡＡＴＴＣにＴＴ＾＾ＣにＣＴＡＣ３”３° 　Ｔ＾＾＾ＣＴ＾＾にＡＴＣＴＴ＾＾ＣＣ＾＾ＴＴにＣ５’を挿入することにより調製した。プラスミドＰＣＦＭ８３Ｂは、カナマイシン耐性マーカー、合成ＰＩプロモーター、ｖｉ限部位の新しいクローニングクラスター、及び全３つの読取フレーム中で翻訳を停止させるための一連の翻訳停止配列を取り込むように構築されたｐｃＦＭ５３６の誘導体（＾ＴＣＣ＃３９９３４）として調製される。

まずｐｃＦＨ５３６を５ｓｔｌ及びＸｂａ　ｌで消化することによりβ−ラクタマーゼ遺伝子を欠失させる。この結果、マーカー遺伝子のみならず完全なｐａｒ又は安定性配列、Ｐ１プロモーター、及び制限部位のクラスターの一部も失う、カナマイシン遺伝子配列は、Ｂｅｃｋ他、Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎＨａｒｂｏｒ　Ｓ　蒙　、　ｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、４５．　ｐｐ、１０７−１１３　（１９８１）のＴｎ５プラスミドからのＳｅａ　Ｉ　Ｓ−１１ｉｎｄｌ［［フラグメントとして得られる。新しいベクターに挿入するためのフラグメントを調製するには、５ｓ１１部位に５ｓｔｌリンカ−を加え、Ｂｉｎｄｌ１１部位にＮｄｅ　ｌリンカ−を加える。カナマイシン耐性遺伝子中に天然に産生ずるＮｅｏ　ｌ制限部位は、カナマイシン耐性遺伝子により特定されるカルボキシ末端ロイシンの上流のスレオニン残基の７６個のアミノ酸のコドンに部位特異的突然変異を誘発することにより、より特定的には＾ＣＣコドンを＾ＣＴコドンに変えることにより破壊した。ｐａｒ遺伝子座配列はｐｓｃｌｏｌの１１ｉｎｅ１１〜＾ｖｉ１消化フラグメント（＾ＴＣＣ＃３７０３２）として得られる。新しいベクターに挿入するためのｐ＆ｒフラグメントを調製するには、Ｈｉｎｅ［をまず５ａｌｌリンカ− で処理し、次にへａｔｌリンカ−で処理する。＾νｍ１部位をＢａｍｔｌ　１リンカ−で処理した後、Ｎｄｅ　ｌリンカ−で処理する。

へａｔｌｌ制限部位とＸｂｉｌｌ＠部位の間に挿入するための付着端を有するｄｓ　ＤＮＡオリゴヌクレオチドの化学的合成により得られる合成ＰＬプロモーターを含むＤＮＡ配列を次のように加えた。

５’　ＣＡＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＴＣ’ｒＣＧＣＣＧＴにＴＴＣＡＣＡＴＡＡＡＴＡＣ−３”　ＴＧＣＡにＴＣＴＡ（ｌｌ：ＴＡＴＴＴＡＡＴＡにＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＴにＴＡＴＴＴＡＴに−−ＣＡＣＴＣＣＣＣＣＴ（：ＡＴ＾＾ＴにＡにＣＡＣＡＴＣ（：Ａｒ１　３″−にＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴにＴＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣ５”全３つのフレームに翻訳停止配列を加えるために、プラスミドをＢａｍＢ　Ｉで切断し、次のｄｓオリゴヌクレオチド＝５°　ＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡにＴＡＡＣ３’３’　ＣＣ（：ＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴにＣＴＡＣ５”を挿入した。

連結後、構築物の各々を大腸菌（Ｆ１ａ株）に形質転換した。

ＦＭ６は数種の未知のバクテリオファージに対するファージ耐性を与えられた八Ｍ７の誘導体（＃Ｃ１１；６０８１５９）であり、テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子、並びに染色体に組み込まれるλバクテリオファージリプレッサー遺伝子Ｃ１８５７及び二を含んでいる。

形質転換後、ｐｃ１］の各型の代表的なりローンを採取した。

共有結合による閉環状（ｅｃｃ）プラスミドＤＮＡを単離し、アルカリ変性ｅｅｅ法を使用して配列決定した。　２１Ｋ　ｐｃｉの合成部分の配列を第３表に示す。

ＣＴＡＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＴＴＣＧ　ＣＴＡＡＣＧＣＴＧＴ’Ｊ’ＣＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＴＴＧＣ（１；ＡＣ八へ１６　１２６ＧＡ八へへＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＧ　ＧＣＣＧＣＧＧＴＴＧ第３表夾ｍ更に、部位特異的突然変異誘発により別の４つのｐｃｔｌアナログを構築することができる。まず最初に、ｐ８４６ｐｃＨ２２ＫからのＸｂａ　ｌ〜Ｂａ＊Ｅ　１の小さいフラグメントをＭ１３ｍｐｌＯにクローニングし、−重鎖ファージＤＮＡを単離する。アナログの各々のプライマーを合成及びキナーゼ化し、アニールして一重鎖ＤＮＡを得る。　ｄ　ＮＴＰ、＾ＴＰ、　Ｔ、ＤＮ＾リガーゼ及びクレナ−（ｋｌｅｎａｒ）酵素の４種を加え、所望の変異を含むＤＮＡの第２のストランドを合成する。　ＤＮＡを宿主株、１Ｍ１０３にトランスフェクトし、プラークを溶菌させる。正しいクローンはアナログ配列のｓｔｐ＠識プライマーへのハイブリダイゼーションにより決定される。ジデオキシ配列決定により配列を確認し、Ｍ１３ｓｐｌＯからのＸｂａ　Ｉ　〜Ｂａ＋ｍＢ　Ｉフラグメントをｐ８４６に再びクローニングする。クローンのプライマーを以下に列挙する。

アナログ１：　（Ｔｙｒ、　ｌｉｅ、　Ｐｒｏ）　ＴＣに＾＾ＣＧＴにＣＴＣ＾＾ＧＣＴＣＡＣＣＧアナログ２：　（Ｐｒｏ）　ＣＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＣ＾＾ＣＣＴＣＡＧＣＧアナログ３：（＾ｒｇ）　ＣＡ＾＾にＡＡＴＴＣＧＡＡにＣＴＴＡＣＡＴＣＣＣ第４のクローン（−（：Ｉｕ、＾ｒｇ、、、Ｃ１ｕ−）は２つの逐次部位特異的突然変異誘発を必要とする。第１のプライマー（＾）はＣ１ｕ、＾ｒｇを除去する。この部位特異的突然変異誘発後、−重１１ＯＮ＾は精製され、第２のＧｌｕを除去する第２のプライマー（Ｂ）により部位特異的突然変異誘発の第２ラウンドが実施される。

アナログ４プライマー：Ａ　ＴＡＣ＾＾＾Ｇ＾＾ＴＴＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣＣＣにＢ　ＣＴＴＡＣＡＴＣＣＣにににＴＣＡにＣにＴＴ＾寒」Ｌ己」工２２Ｋ及び２１にの各々に発酵工程を実施した。細胞密度は光学密度が６５までとなるようにした。ブタ成長ホルモン又はそのアナログの形成量は５０〜７５ｉｙ１０Ｄ　Ｌ（３〜３．９２＋ｓ／Ｌ）であった。

工程は大腸菌ＦＭ６／ｐｃＦＭ　８５６　ｐＧＢ　＃３（２２Ｋ　ｐｃｔ）及び ≠８（２１Ｋｐｃｔ）を使用して実施した。前記の各々は、つオークアウェイ（ −ａｌｋａｎｅ）プラスミド及びプラスミド安定性のためのカナマイシン薬物マーカーを有する。

ＬＬ」（培地組成）」Ｌ　ベニり坦■　７４二り咀匹酵母エキス　４０ｇ　４００゜（ＮＨ３）ｉＳＯ−３０ｇ　１５ｇに、ＢＰｏ、　５６ｔＫＨｘＰＯ，６４ｔＤｅｗ　Ｉ”２０００　２ｓｌグルコース　４０ｇ１３００゜（ＭｇＳＯ４−７ｆ１２０）（ＩＮ）　３２ｍ１　１０３ｍ１微量金属溶液　１６１１１２８友！ビタミン溶液　１６ｗ１　２Ｆｈｌカナマイシン　２０■／凛！ ″ｉ＠酵工程はパッチ供給式で炭素制限下に実施した。温度３０℃及びｐＨ７，０を維持した。Ｂ素溶解量は５０％の空気飽和に維持した。サンプルを等間隔で取り出し、成長と酢酸レベルを測定した。クーマシー染色５ＤＳ−ＰＡにＥを使用してｐＣＥ濃度を測定した。純粋なｐｃＲは入手し難いので、純粋ｂＣＨ及びＩＦＮ−ａ　Ｃｏｏを標準として使用した。　ＳｂｉｍｏｄｚｕＨ分器／スキャナーを使用してゲルを走査し、２つの原準の平均を使用してｐｃＨの濃度及び総タンパク質の百分率を計算した。

温度を４２℃に上げることにより〜２５のＯＤで細胞を誘導し、封入体を閏微鏡で観察した。誘導から約３〜４時間後の細胞封入体は１〜２個であった。２つのアナログ展開からの予備誘導サンアルにｐｃＦＩは見いだされなかった。第４表及び第５表は野生型（２２Ｋ）及びアナログ（２１Ｋ）の結果を示す。

１生民野生型ｐｃ１１（２２Ｋ）のゲル精巣発酵時間（時間）ＯＤ　総タンパク質の百分率　ａｇ　ｐｃＢｌｏＤ　Ｌ誘導開始　１８．５　２５−４　予備誘導２　６〜１０２１．０　４３．０．　１０〜１５　３０２３．０　４７．０　２０〜２５３５〜４゜２５．５　４８．５　３０　６５２７．５　５２．７　３０〜３５７０〜７５匙ｉ表　アナログｐ（：Ｈ（２１Ｋ）のゲル結果誘導開始　１８．５　２４．８　予備誘導ｏ　ｏ〜微量２１．０　４Ｂ、０　２０　４５２３．０　６３．０　２５〜３０６５２５．５　５７．２　３０〜３５　６５〜７０２７．５　５８．３　３０−３５　６０−６５これらの表に示すように、２２Ｋ　ｐＧＨで最大量（７０〜７５１＃１０Ｄ　Ｌ）のｐｃＩｌが得られた。２１にのｐＧＢアナログでは、アナログの量はＯＤと共にピークに達した後、恐らくタンパク質分解によりＯＤの減少と共に低下し始めることが認められる。！Ａらく誘導から５〜６時間後が発酵を停止するＩｋ３１時間であると判断できる。

ｘ」１ｈｊ− 下垂体から誘導されるブタ成長ホルモンを標準として使用して、１０日間の体重増加バイオアッセイ中に下垂体切除したラットで、組換により作製されるアナログの生物活性を測定した。

本発明の２１Ｋ　ｐＧＨアナログ及び下垂体がら誘導したｐＧＨ（ｐｄ−ｐにＩｔ）調製物を夫々３回の投与量に分け、下垂体切除した雌ラットに１２日間の順応期間後の０〜９日目に、１日に２００．１ｗｌを皮下注射した。凍結乾燥物がらｐＨ９，５の重炭Ｗｌｉ緩衝液（３０ｍＭ）でｐｄ−ｐＧＩ］調製物を復元し、　１ｚｇ／ｍｌの濃度を有するストック溶液を形成しな、全組換サンプルと同様に、世界保健機１１１０１ＨＯ）緩衝液（０，２％ラクトース、０．２％マンニトール、３０ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ、　ｐｌ！８．６）テス）　ツク溶液を３００．１００及び３０ＩＩｇ７Ｍ１に希釈した。サンプルは実験の間４℃で保存した。

試験材料の７リコートについてタンパク質同定を実施した。

飯１１１化学分析によると、ｐｄ−ｐｃｔｌはｐＣＢ単量体の８５％に過ぎないことが判明したので、凍結乾燥材料重量で換算した投与量の１．１８倍を投与した。標準としてＢＳＡの■ｏ＠衝溶液を使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより全注射溶液のタンパク質含有量を分析した。配合は予だされるタンパク質酒度に適合するように変化させた（第６表）、　ｐｃＩＩ注射液のタンパク質濃度を吸光係数により決定する正確な方法はないので、全実際値はＢｒａｄｆｏｒｄの結果により示される量とした。

第６表　ソマトトロピン注射液のタンパク質濃度（ｕｇ／ｚｌ）ンプル　”　、Ｂｒａｄｆｏｒｄｐｄ−ｐｃＢ　３５３　３６０ｐＧＨ（２１にアナログ＞　３００　３４２ｐＧＥ（２１にアナログ’）　３００　３９６１００　１３Ｂピット−ｂＧＨ″’ｓｔｄ、”　３００　３２９ｐｃＥ（２１にアナログ）　３００　３１４ｐｉｌＢ（２１にアナログ）　３００　２６Ｂ富ｐＣＥ単量体の８５重量％に過ぎないと算定。

生ｍ駈体重増加の速度は全調製物の投与量に相関して加速した。

従って、Ｏ８目から１０日口の実際の体重変化により生物応答を測定した０本発明の２１Ｋ　ｐｃｎアナログは組換２２Ｋ　ｐｃｎ及びｐｄ−ｐｃｎよりも低い２つの投与量でより大きい体重増加をもたらした。試験投与量のうちで最高の２１Ｋ　ｐｎｃアナログ投与量でも体重増加にそれ以上影響はなく、これは恐らくより低い投与量で最大速度に達したためであると２．われる。

第７表は実際の体重変化を示す、第８表は下垂体標準の回帰係数を使用して対数（投与量）対体重変化の一次回帰分析により決定した各調製物の相対力価を示す。

第７表　Ｂｒａｃｌｆｏｒｌ［タンパク質コ濃度を有する下垂体誘導ブタ成長ホルモンと組換ブタ成長ホルモンが下垂体切除したラットの体重増加に及ぼす効果に関するアッセイＴＲＬ　０３１−０１７（体重変化、平均重量ｇ　＋／−ＳＥＭ）投与量　緩衝液　ｐｉｔ−ｂＧｔｌ標１！　２２Ｋ　＋）にＢ　２１Ｋ　ｐｆ；Ｂ−・・０　１．５−／−０，６７，０１４，３・／−０，７１３，９＋／−１，１７，２２０，７＋／−１，１２３，６１９，４今／−０，８２５，４２３，６吟／−１，２２７，６２Ｂ、４◆／−１，２６８，４３０，２＋／−２，２７２，０３０，２今／−１，６７９，２２９，６”／−３，９第８表　成長ホルモン調製物の相対力価当量（平均上平均の標準誤差）・　ル　゛・　７に対する相対当量ｐｉｔ−ｂＧＨ−５ｔｄ″　ｐｉｔ−ｂｃ１１″ｓｔｄ″　１．０１立０．０５ｐｉｔ−ｂＧＢ″ｓｔｄ”　２２Ｋ　＋）にＨ１，０６±０．０１ｐｉｔ−ｂＣＢ　”ｓｔｄ”　２１Ｋ　＄１にＨ１，４０±０．１５以上１本発明の好適態様について説明したが、当業者はこの開示内容から各種の変形及び改良を想到し得るものと思われる。従って、本発明は特許請求の範囲に該当する限り、このような全変形も包含する。

ｐＧＨｃＤＮＡ　７σ−ン１［百ｍ　ｘ巨１プラント°ルカーｔＦ４７１＄邸εＣロＲ１ｐＥＩＲ３２２−Ｔｒｐ−ｐＧＨ εｃｏＲＩＥｌａｒｎｌ−１１材ソフ゛スフシマａ″１七ンブｔ／ｌ　ＦｉｌＵ〒ＦｔＧ、”３国際調査報告 ″″″′″″″′Ａ″″′＝　”’Ｍ？／１ｌＰｔｆ／ｆｌＱ７＋１１０

Claims

【特許請求の範囲】１．アミノ酸の１個以上が欠失しているアミノ酸配列Ｚ−ｐＧＨ１−３１−（Ｘ）ｎ−ｐＧＨ３５−１３１（ｎは０又は１、Ｚは水素、ＭＥＴ、ＡＬＡ又はＭＥＴ−ＡＬＡであり、Ｘは−ＣＬＵ−ＡＲＣ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ− ＧＬＵを含むアミノ酸残基のペプチドである）を含むブタ成長ホルモンアナログ、及びその対立遺伝子型。２．ｎが０であることを特徴とする請求項１に記載のブタ成長ホルモンアナログ。３．ＺがＡＬＡ又はＭＥＴ−ＡＬＡであることを特徴とする請求項２に記載のブタ成長ホルモンアナログ。４．ＺがＡＬＡであることを特徴とする請求項３に記載のブタ成長ホルモンアナログ。５．ｎが１であり、Ｘが【配列があります】又は −ＣＬＵ−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵであることを特徴とする請求項１に記載のブタ成長ホルモンアナログ。６．ＺがＡＬＡ又はＭＥＴ−ＡＬＡであることを特徴とする請求項５に記載のブタ成長ホルモンアナログ。７．ＺがＡＬＡであることを特徴とする請求項６に記載のブタ成長ホルモンアナログ。８．アミノ酸の１個以上が欠失している式Ｚ−ｐＧＨ１−３１−（Ｘ）ｎ−ｐＧＨ３９−１９１（ｎは０又は１であり、Ｚは水素、ＭＥＴ、ＡＬＡ又はＭＥＴ−ＡＬＡであり、Ｘは−ＧＬＵ−ＡＲＣ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−を含むアミノ酸残基のペプチドである）で表されるブタ成長ホルモン、及びその対立遺伝子型をコードする配列を含むＤＨＡ配列。９．トランスフェクトした全培養基中で請求項８に記載のＤＮＡを列を発現することが可能な発現ベクター・１０．アミノ酸の１個以上が欠失しているアミノ酸配列Ｚ−ｐＧＨ１−３２−（Ｘ）ｎ−ＰＧＨ４０−１９１（ｎは０又は１であり、Ｚは水素、ＭＥＴ、ＡＬＡ又はＭＥＴ−ＡＬＡであり、Ｘは−ＧＬＵ−ＡＲＧ− ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−を含むアミノ酸残基のペプチドである）で表されるブタ成長ホルモン・及びその対立遺伝子型を含み且つブタに由来する他のタンパク質を本質的に含まない組成物。１１．請求項１に記載のブタ成長ホルモンアナログの有効量を動物に投与する段階を含む動物の成長促進方法。１２．アミノ酸配列（Ｍｅｔ）ｍ−Ａｌａ−ｐＣＨ１−１３０（ｍは０又は１である）を含むブタ成長ホルモンアナログ及びその対立遺伝子型。１３．ｍが０であることを特徴とする請求項１２に記載のブタ成長ホルモンアナログ。１４．ブタに由来する他のタンパク質を本質的に含んでいないことを特徴とする請求項１２に記載のブタ成長ホルモンアナログを含む組成物。１５．請求項１２に記載のブタ成長ホルモンの有効量を動物に投与する段階を含むことを特徴とする動物の成長促進方法。