JPH01502637A - 細胞系統およびその調製ならびに使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞系統およびその調製ならびに使用 本発明は細胞系統のｍ胞に感染可能なレトロウィルスの培養および研究に特に適 合する新規細Ｆ＆系統に関する。

意図されるレトロウィルスのうちではＨｒＶ　（ヒト免疫不全ウィルス）があげ られうる。ＨＩ’Ｖの種々の単離物はこれまでＬＡＶ　（リン／ぞ腺症関連ウィ ルス）　、ＨＴＬＶ−ｍ　（ヒトＴリンパ向性ウィルス■）およびＡＲＶ　（エ イズ関連レトロウィルス）と呼ばれている。

エイズ（後天性免疫不全症候群）の場合、主要な免疫異常はｍａ表面上にＴ４抗 原を表現するヘル／！！−Ｔ細胞サブセットの定量的欠如にあることは明白であ る。種々の）ＩＩｖ単離物の選択的なＴ４！胞同性はインビトロで証明されてい る。ウィルスの複製および高い逆転写酵素活性はＴ４細胞の集団中においては観 察されているが対応するＴ８細胞中では観察されていない（１１）。′ｒ４およ びＴ４Ａ抗原に対するモノクローナル抗体を用いる阻止実験（１２，１５）およ びＶＳ’Ｖ（ＨＴＬＶ　−ｎｌ　）　シュードタイプウィルスのシンシチウム形 成阻害（３）によシ、Ｔ４抗原またはその一部分がＨＩ’Ｖし七ブタ−の重要な 成分を構成することが示されている。

しかしながら幾つかの研究室からのデータでは、ＨＩｖウィルスは非Ｔリンノぞ 球系統の数種のＳ胞にも感染しうろことが示される。へイブリッド形成によシエ イズ患者のａ細胞中におけるプロウィルスＤＮＡの存在が示されている（２６） 。電子顕微鏡では濾胞樹脂状細胞中（ＳＯ）およびマクロファージ中（６）にお けるウィルス粒子の存在が示されている。ウィルスはＨＩＶに感染した個体の末 梢血液半球（９）および肺胞のマクロファージから単離されている。インビトロ での単球のＨＩＶによる感染は記載されている（３４）。

種々のＨＩＶ単離物によるインビトロでの感染は（ａＪ　Ｒ性グリオーマ細飽系 統（２）および（ｂ）エプスタイン−・２−ルウイルスゲツムを担持するＢ細胞 （１６，２２）の場合に報告されている。グリオーマ培養物の場合感染は明らか に潜在性であるがＢ細胞ではウィルスの複製が可能である。

さらに、前骨髄球細胞系統ＨＬ−６０および単球系統Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲ Ｌ　１５９３）もＡＲＶ単離物で感染されている（１３）。

正常な末梢血液単球の生産的なＨＴＬＶ　−ｍ感染は幾度も示されている（４％ ９）。ＨＩＶによシ感染されうる細胞種の範囲は短い時間内で拡大されている。

インビトロでＨＩＶを培養するには、（１）新生物性異数体で細胞系統（３５） および（１１）　９ン・ξ芽球Ｂ細胞系統（５２）が用いられるべきことが特許 文献で提案されている。（１）に関しては、サブクローンＨ９が好ましい細胞系 統としてあ国Ｉｌｌ型調査報告においてスウェーデン特許庁は参考文献３．１３ および３４を特に関連するものとして引用している。参考文献９．３３．３５お よび３６は従来の一殻的状況を限定するものとして引用されている。

本発明の目的は単球様細胞に感染しうるウィルスによシ惹起される疾患の理解を 促進する手段を提供するものである。ここで意図されるウィルスのうちでは、特 にＨＩＶのようなある種のレトロウィルスが注目されうる。

従って本発明は、問題のウィルスによジインビトロで感染されることができ、そ の結果としてインビトロでのウィルス産生、さらになかんずくエイズ病原メカニ ズムの細胞レベルにおける研究および薬物がその疾病の経過に影響する様式の研 究にも利用しうる可能性のあるものであるｉａ＋ａ系統（細胞集団）を提供する ものである。本発明の第一の観点には細胞系統それ自体が包含され、第二の観点 にはかかる細胞系統の開発が包含されそして第三の観点にはかかる細胞系統のイ ンビトロ感染への使用および場合によりウィルスの大規模生産への使用が包含さ れる。もう一つの観点としては、それ自体優れた診断手段（例えばラジオイムノ 沈澱で）であシうるウィルス感染細ａ系統があげられうる。

本発明の細胞系統は単球様野生型の安定したサブクローンであシかつインビトロ で無限増殖しうる。この細胞系統はＴ４抗厘がその集団の細胞の少くとも約５％ 、例えば１０％よシ多くの表面上に発現される点に特徴がある。その好ましい形 態物は生産的に感染されうる。他の特徴は、クラス■の抗原およびＦｃレセプタ ーがその集団の細胞の少くとも幾つか上で細胞表面抗原として存在す明の細胞系 統を本出願の実験の部で示される条件下に研究した場合に証明されうる。

本発明の細胞系統は癌組織に由来しかつ無限増殖しうる単球様細胞系統をり一一 エングすることによシ得ることが可能でちる。例としては組織球起原のものであ るＵ　−９５７があげられうる。このものは５ｕｎｄｓｔｒろｍおよびＮｉ１ｓ ｓｏｎによシはじめて記載され（２Ｂ）そしてＡＴＣＣにＡ　ＡＴＣＣＣＲＬ　 １５９３として寄託されている。本発明の細胞系統の例（クローン１．２および １６）は英国５ａｌｉｓｂｕｒｙのＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　 ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　に寄託されている。これ らは以前、クローン１８６１２１９０１、クローン２８６１２１９０２およびク ローン１６８６１２１９０５．で示された。再寄託が行われて現在それぞれ８７ １００８０５．８７１００９０６および８７１００８０７で示されている。これ らは１９７７年のプダはスト条約によるものであるとして受託されている。Ｕ　 −９５７は細胞遺伝学的に異常である。その核型の研究によシ、その染色体の変 化が進行性でおることが示されている。本発明の細胞系統における染色体補体の 詳細な研究は現在進行中であシそしてあらゆるクローンが明確なｆａ型を有する ことが示されると予想される。

用いられるクローニング技法はそれ自体知られている。

我々は寒天ゲル中でクローニングを実施してうまく行った。クローン細胞が相互 に独立して生長できるいわゆる限界希釈法のような他の可能な技法も用いられう る。りローユング後本発明の特徴を満たす増殖性クローンを選択する。勿論本発 明の範囲には野生型の最初のクローニングで得られたサブクローンを再クローニ ングして得られるような細胞系統も包含される。

好ましい野生型Ｕ　−９３７から得られうるクローンの大部分はウィルス感染後 に安定してウィルスを産生ずる系統を形成し従ってウィルス産生に関してはるか に変動のあるＨ９および他のＴｉ１ｌ胞系統とは異なる。本発明による好ましい クローン、すなわち高いＴ４含量を有するクローン（例えばクローン１６）は、 ウィルス感染によシ大量のウィルスが産生され、従ってその細胞の死（＝細胞変 性効果）がもたらされるものである「古典的」なウィルス細Ｆａ系統に固有のす べての性質を有しうる。その結果、ｂ２大重のウィルスが放出されるか予測する ことが可能である。これは大規模産生にとって重要な前提条件である。すなわち 細胞死の直前に翰胞が大量のウィルス抗原を有する「ウィルス工場」に変換され 、これらウィルス抗原は容易にアイソトープ標識を付けられてう・ジオイムノ沈 澱操作に使用されうる。

本発明の細ａ系統においては、Ｔ４抗原を有する細胞の量≦（−Ｔ４含量）は５ ％から１００％または１００％直下、例えば９５％まで変動しうる。ウィルス産 生にとって好ましい細胞系統、すなわち産生性感染を生ずるものは５０％を越え る、例えば６０または７０％を越えるいＴ４含量を有する細胞系統も使用されう る。

本発明の１ｓ胞系統はＵ　−９３７に普通に用いられるような培地中でまたは満 足できる生長をもたらす他の何らかの培地中でインビトロで培養される。細ａ系 統の感染は用いられる各個々のウィルスの場合に普通に実施されるような方法で 遂行され、細胞系統は適当なウィルス接種原、例えばＨＩＶに曝される。いくつ かの場合には、実際上の便宜的な手段は細胞系統に第一回目のウィルス接種原を 加えた幾日か後に、未感染かつ本発明による性質を有する新鮮な細胞が添加され ることにある。約５０−６０％よシ低いＴ４含量を有する細胞系統がウィルス− 細胞相互作用の研究にとって第一番目に適する。ウィルス産生性細胞系統から、 それ自体知られた方法でウィルスを単離し、精製しそして所望の場合はフラグメ ント化および誘導体形成させることも可能である。得られるウィルス生成物は相 当するウィルス感染の治療および予防のための薬剤、例えばワクチン、の開発、 および／またはウィルスの免疫化学的アラ七イ用試薬および／または相当する対 応抗体の開発に用いられうる。

本発明は明細書とは一体の部分を構成する添付の請求の範囲に定義される。

本発明の基調をなす科学的操作によシ本発明をさらに説明する。

実施例　１ 細胞：組織球リンパ腫（２８）に由来するＵ−９３７細胞系１００ＩＵ／＊、ス トレプトマイシン５０β／ｄ　）を補充したＲＰＭＩ　１６４０またはＦ−１０ 中で生育させた。この細胞系統は１９７６年のその樹立以来連続継代によシ保持 されておシそして未熟単球のそれに相当する基本的な表現型を保持している。こ の細胞系統は分化を受ける正常単芽球のそれと同様に種々の薬剤によシ誘導され て表現型の変化を生じうる（５．１９．２０）。かくの如（Ｕ　−９５７は誘導 されてさらに分化した場合でも高度の正確さを以って単球細胞マーカーを表現し 、それゆえヒト単球細胞にとっての非常に有用なモデルであると思われる（１９ ．２０）。

アガロースクローニングによるＵ　−９３７クローンの樹立：細胞（ＩＸ１０’ ）個を３５鴎のはトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ　、○ｘｎａｒｄ。

Ｃａ、米国）中に均一に塗抹した。このハトリ皿には、１０％ＦＣ８（Ｂ、ｒＢ ＣＯＥＵＲＯＰＩＣ，英国）、グルタミン□ｍＭ）、はニジリン（１００ＩＵ／ ｄ）、ストレプトマイシン（１５０μｇ／―）、および最終濃度０．５％のアガ ロースＡ　（ＰｈａｒｍａｃｉａＡＢ　、　Ｕｐｐａａｌａ　、スウェーデン） と−緒のＨａｍ’ｓ　Ｆ−１０のボトム層が含有される。

細胞が拡散されるトップ層（１ゴ）には同じ培地が含有されるが、アガロースの 最終濃度はｏ、３裏で゛あるンこのＩ　）　リ皿を湿度調整した雰囲気（空気中 Ｃ０２５％）中３７℃で２〜４週間インキュベーションした。この期間した。適 当なりローンをとシ出して細胞を９６−ウェルのプレートに移し、そして後程２ ４−ウェルのプレート（Ｆａｌｃｏｎ）　に移してさらに増殖させた。２つの実 験で合計１６個のクローンが得られた。

Ｔ４４抗原現がそれらの間で異なる５つのクローン（クローン１．２．３．４お よび１６）を選択しそして多数の他のマーカーに関してさらに特徴を調べた。Ｔ ４およびＨＬＡ−ＤＲ抗原は、問題の抗原に対するモノクローナル抗体を用いる 流動細胞計測法によシ調査された（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　、　Ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ。

Ｃａ、　（１０）　）　Ｆｃ　し七ブタ−の発現はＩｇＧで被覆された赤血球を 用いて測定された。選択された細胞質酵素マーカーは細胞化学的方法（２９）に よりｍ査された。

ウィルス感染：　ＨＴＬＶ−ｍＢで感染したＨ９細胞培養物から得られる細胞を 含有しない培地をウィルス源として用いた。細胞ｌＸ１０６個をウィルス１ｄ中 に再懸濁し、３７°Ｃで６０分間インキュベートしそして２μＩのポリブレン（ ＰＢ　−１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチレン−ポリメトプロミ ド、Ｓｉｇｍａ、米国）および抗生物質を含有する１０％ＲＰＭ　Ｉ培地５ｄ中 に再懸濁した。

モノクローナル抗−Ｔ４抗体を用いる感染の阻止：用いられたＩｇＧモノクロー ナル抗−Ｔ４抗体（１９Ｂ５Ｄ７）はマサチューセッツ州ボストンのＤｒ　Ｅｌ ｌｉｓ　Ｒｅｌｎｈｅｒｚ氏から提供された。細胞（２Ｘ１０５）を合計７５μ ９０ＲＰＭＸ培地中２．５μｓまたは１２５μＩの抗−Ｔ４抗体と３７℃で２０ 分間インキュベートしそして前記した培地で１回洗った。次に細胞をウィルス希 釈物１２５μ中に再懸濁し、そして３７℃で６０分間インキュベーションした。

インキュベーションに続き！ａをもう一度培地で洗いそして２μＩ／−のＰＢを 含有する１０％ＲＰＭＩ培地中に細胞１０５／−の濃度で再懸濁させ、そして２ ４−ウェルプレートで培養した。それぞれ１．２５μＩ／ゴおよび６．２５１４ ／ｓｇ濃度の抗−Ｔ４抗体が初めの４日間存在したが後程除去された。この培地 な８２回収穫して逆転写酵素（ＲＴ）を測定した。

逆転写酵素（ＲＴ）の測定：酵素活性は培地の超遠心分離およびかくして得られ たイレットを０．３％トリトンＸ−１００中に溶解させることによシ得られる溶 液中で測定した。反応混合物（１００μｌ）中には５０ｍＭ　）リス（ｐＨ８， ０）、１５０　ｍＭ　ＫＣＩ　、４　ｍＭジチオトレイトール、６．２ｍＭ　Ｍ ｇＣｌ２．２５μＣ１／ｄ　３Ｈ−ＴＴＰ（５０Ｃｉ／ミリモル）、１００μＩ ／−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μＩ／ｄオリゴ−ｄＴ１２−Ｈｌお よび２μＩ／−ポリＡが含有された。

サザンブロツテイング（２７）　：　染色体ＤＮＡ　１０　Ｉｆを単離し、Ｓａ ｃ　Ｉで開裂させ、［１８％アガロースゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜上に プロットさせそして３２ｐ標識したプローブとへイブリッド形成させた。細胞質 ＤＮＡはＨ１ｒｔ法（８）を用いてｇｌ製し、ミドフンドリアＤＮＡに対して標 準化し、そして１８％アガロースゲル上で操作し、とハイブリッド形成させた。

ハイブリッド形成は厳格な条件下に６８℃で３Ｘ　ＳＳｃ　（水１１当ｋ）　Ｎ ａ（Ｊ　１７５．３１およびクエン酸ナトリウム８８．２．９．　ｐＨ７）およ び標識されたプローブ５　Ｘ　１０６　ｃｐｍ／ｌｄを用いて行われた。洗浄条 件はすべてのプロットにつき６８℃で０．ｌＸ５ＳＣであった。用いられたプロ ーブはＤｒ　ＲＣＧａ１ｌｏ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　、米国）氏によシ提 供されたｐＢＨ１Ｏ−Ｒ３（７）であった。

親細胞系統およびサブクローンの細胞マーカープロフィＬ：もとの細胞系統Ｕ− ９３７およびそのサブクローンはＨＬＡ−ＤＲ，Ｔ　４抗原、ＦＣ−レセプター および酵素の相対的な発現に関して異なっていた（第１表）。親系統（野生型） 、クローン４およびクローン１６がＴ４発現に関し極端であることは特に注目に 値する。親系統およびクローン４培養物はＴ４陽性細胞を１０％未満の童でしか 含有しないが一方クローン１６０９５％がＴ４Ｉｉｉ性でおった。他のすべての クローン系統はＴ４＠性細胞５０〜７０％を有していて中間に位置すると考えら れた。

ＨＬＡ−ＤＲおよびＦｃレセプターは同時発現する傾向を示した。１Ｉａｌ胞が ＨＬＡ−ＤＲおよびＦｃレセプターの両方について陽性である頻度はクローン１ と２で最高であシ、一方この両マーカーは親ａ胞系統’Ｕ−９５７およびクロー ン１６集団で比較的頻度が低かった。増殖性質、形態、食細胞活性、抗体依存性 ′Ｍａ性細胞毒アツ七イにおけるキラー細胞としての機能容量、およびＭ３およ びＯＫＭ１モノクローナル抗体によシ限定される単球関連表面抗厘の発現に関し 、用いられた培養条件下に調査された細胞系統間には何らの相異も示され得なか った。

親系統およびサブクローンのＥｉＴＬＶ−１［Ｈによる感染：すべでのａｍ系統 はＨＴＬ’Ｖ−ｍＢ単離物で感染できた（第２表）。しかしながら、これら系統 はウィルス産生に要する時間に関し、およびウィルスの細胞変性効果（シンシチ ウム形成およびｍａ死）に対するそれらの感受性の点で大きな相異を示した。

親Ｕ　−９５７およびクローン４は同様の／ζターンを示した。ウィルス感染に 続く最初の６週間はＵ−９３７の培養液体中においては何らＲＴ活性が検出され なかった。事実、培養物は感染２か月後にはじめてＲＴＳ１性となシそして以後 培養を継続した全期間（１年以上）にわたシ陽性を保っていた。

クローン４細胞の感染は親系統紅胞の感染より困難である。何故なら他のすべて の？ａ胞糸系統ウィルス産生性感染を招来するウィルスの量（ＲＴ活性において １５０Ｘ１０５ｃｐｍ　）ではクローン４を産生性感染させることができなかっ たからである。全観察期間（３か月）中クローン４はＲＴ陰性のままであった。

しかしながら、１０倍多量のウィルス（ＲＴ活性１８００ｘＩ　Ｑ３ｃｐｍ　） は１週間以内でウィルス産生体培養物を生じた。従ってクローン４細胞は親系統 よシ感染困難であるが、しかしこの困難は感た。親系統とクリーン４は感染され た培養物中において細胞変性効果が全く観察されないか、わずかにしか観察され ず、場合によシシンシチウム形成が観察される点で類似していた。

Ｕ　−９３７サブクローンのうち、りＨ−ン１６がＨＴＬ、Ｖ−ｍＢでの感染に 対し最も感受性であった。ＲＴ活性および細胞変性効果は感染６日後には早くも 示され得た。しかしながらウィルスｖＩ製および細胞溶解が著明なので培養物は 完全に死滅した。たとえ感染した培養物に新鮮な未感染ｍｓが反復して添加され た場合でもウィルス産生性細胞系統を得ることはできなかった。ＨＴＬＶ−ｍ　 Ｂ感染に対する感受性に関しては、クローン１．２および３は２つの極端、すな わち親系統とクローン１６０間にある中間物でおる。クローン２細胞の培養物中 においては、ｆａ胞変性効果およびＲＴ活性は感染後１０日以内に現われた。ク ローン１６と興なシ、未感染クローン２ｋｄ胞を添加すると１か月後に安定した ウィルス産生体ｍｌ胞系統が樹立された。クローン２は前年の間に再クローニン グされそして得られた？ＳＳ糸系統１種（クローン２ａ）が１（ＩＶのさらに良 好な産生体であって、最小限の細ｒ！を変性効果しか示さない。クローン１およ び３はウィルスの細胞変性効果に対してクローン２よシ感受性が少ない〇一時的 な細胞変性効果はその培養物がすでにウィルスを産生じている場合（ＲＴ陽性培 養プロス）に感染５〜４週後に観察された。クローン１の場合新鮮な未感染細胞 な付加することは安定してウィルス産生ずる細胞系統を樹立するには必要でない が、一方クローン３は細胞死を補償するためにかかる付加を必要とした。クロー ン１６を除くすべての系統が６か月を越え１年以上までの期間安定したウィルス 産生体のまま存続した。これらのうちどれもこの期間中何ら細胞変性効果を示さ なかった。

Ｕ　−９３７細胞およびサブクローン中のＨＴＬＶ−ｍＢ　ＤＮＡ　（７）ると 、すべての感染された細胞系統が線状形の朱組み込みプロウィルスＨＴＬＶ−ｍ Ｂ　ＤＮＡを含有していることが示された。その上いくつかの？Ｊ胞糸系統クロ ーン１６および４）はさらに他の種頑のプロウィルスＤＮＡ　、恐うくハ単位長 さの環状ＤＮＡ　（単位長さの珊）からなる超らせん（スー・ξ−フィル）を含 有した。予想されるバンドに加え幾つかのかすかなバンドが見られた。これらは 長時間の露出後にのみ出現した。恐らくこれらはＨＴＬＶ−ｍＢプロウィルスの 欠損形または変異体であろう。

細胞系統は感染された細胞の細胞質中に存在する遊離のゲノムコピーの故が異な る。コピー数の概算は、ｐＢＨＩ。

−Ｒ３中にＳａｃ　Ｉによシ挿入された９ｋｂフラグメントの連続希釈物を感染 された細胞の高分子量Ｓａｃ　Ｉ　７ラグメントとあるｂはＥｉｒｔ溶解物ＤＮ Ａと比較することにょシ行うことができた。クローン１６細胞は１細胞当シ約１ ００コピーを含有するが、一方親系統はＴＮＪ胞陽性対しか含有しなかった。他 の細胞系統はコピー含量に関して中間であった。最も分子量の高いバンド（＞１ ２ｋｂ）は恐らくミトコンドリア中に浸透したＨＴＬＶ−ｍＢ　ＤＮＡであろう 。プロウィルスＤＮＡは未感染クローン１６細胞中には存在が示され得なかった 。

Ｓａｃ　Ｉで消化された高分子ＤＮＡは、ＨＴＬＶ−ｍＢから組み込まれたＤＮ Ａを表わす主に２つのバンドを示した。感染された各細胞系統は、ＨＴＬＶ−ｍ Ｂからの組み込まれたプロウィルスＤＮＡコピー約１〜５個を含有していた。そ れぞれ５．５および３．５′Ｋｂの２個の７ラグメントは内部Ｓａｃ　Ｉ部位な らびにプロウィルスＬＴＲかラノＳａｃ　Ｉ　５　位を含有するプロウィルスＤ ＮＡに相当した。これらのバンドすべては対照として吊込られた感染されたＴ細 胞系統中にも見出される筈であった（Ｍｏｌｔ−３）。未感染クローン１６細胞 はプロウィルスＤＮＡの組み込まれた形態に関しては陰性であった。

つＨＴＬＶ−［３３による溶解に対し極度に感受性が高いゆえに阻止実験に選択 された。Ｈ９細胞系統がＴ細胞対照として用いられた。２つの実験の結果を第３ 表に示す。阻止効果を得るには、細胞を抗体で処理した直後にウィルス感染が続 くことが非常に重要であった。Ｈ９細胞はウィルスの１：１００希釈物で感染３ ２日後にウィルスを産生じ始めた。ＭＥ胞を１２，５μＩの抗−Ｔ４４抗で予め インキュイージョンすると完全に感染を阻止した。他方２．５μｌの抗体は何の 効果もなかった。クローン１６細胞培！物をＨ９細胞に用いられたと同じ量で感 染させたならば（１１００希釈物）、それらは第１５８目には早くもウィルスを 産生じた。よシ大量のウィルス（１：１００希釈物または未希釈）では第８８目 に早くもウィルス産生を生じた。抗−で４抗体１２．５μＩを用いると、未希釈 ウィルスでの感染は遅延されうるのみで完全には阻止できなかった。一方それよ シ少量のウィルスを用いる感染は抗体２．５μ９によってすらも完全には止でき た。従ってこれらの結果によシ、この特定の抗体によシ認識されるエピトープが ウィルスによる４胞表面の認識にとって重要であることが示される。

実施例　２ ラジオイムノ沈澱アッセイ（ＲＩＰＡ）　：ウイルス関連タン、５り質に対する 抗体をＲＩＰＡによシ同定した（抗原は感染された細胞からの５５８−システィ ン標識された溶解物）（１７）。　クローン１６およびヒトＴ細胞系就ＨＵＴ− ７８が抗原の調製に用いられた。かくしてクローン１６（Ｎｉ胞１０７個）　ニ ＲＣＧＡＬＬＯ氏から得られたＨＴＬＶ−ｍＢ　（逆転写酵素活性３００ｘ１０ ’ｃｐｍ　）を感染させた。この感染された培養物を細胞変性性変化、逆転写酵 素活性（１）およびウィルス抗原発現についてｐ２４およびｐ１９に対するモノ クローナル抗体を用い、続いてこれをフルオライドｇＧによ少検出することによ る免疫螢光にょシ監視した（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、タンマ ーク）。培養物は感染７日後に著明な細胞変性効果が明白でｌ）かつ約９０％の 細胞力；ウィルス抗原を発現したところでアイソトープ標識した。

標識培地（システィン不含ＲＰＭＩ　１６４０）中で３０分間Ｒ＃！、させたの ちクローン１６ｍＦｍおよび未感染対照細胞を新たに添加されたシスティン不含 の培地Ｓｔｄ中の０．５ｍＣ１の５５Ｂシステイン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｃｉｕｃｔｓ　、　Ｂｏｓｔｏｎ　、 米国）に６時間、あるいはグルコース不含（７）　ＲＰＭＩ　１６４０培地中の １．０　ｍｃｉのＤ（６−３Ｈ）−グルコサミン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ ｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に１２時間露出させた。

ＨＵＴ−：ｉ’ｓ　Ｎａ胞の標識は同様の方法で行われ、標識時間は１２時間で ちった。代謝による標識後細胞を水冷ＰＢＳ中で３回洗い、そして可溶性細胞溶 解物は細胞なＲＩＰＡ緩衝液（２５）（０，１４Ｍ　Ｎａ（Ｊ、０．００１Ｍジ チオトレイトール、０．０１Ｍ）リスＨｃｔ　（ｐＨ８，０）、０．０３５％フ ェニルメチル−スルホニルフルオライド、およヒＯ，Ｓ％　ＮＰ　４０　）　ｉ −を用Ｌｎで崩壊させ続イテ１５００ＣＩＩｉで１５分間遠心分離することによ シ生成させた。

前記上澄み液からの一部分１０〜３０ｐ／（１０５ｃｐｍに相当）を血清試料４ μｊと一夜インキユベーションした。免疫複合体はもしそれが形成された場合− 夜装置して低温で６μ９のタンツク質入−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ■ ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に結合させ 、次に注意深く洗浄しく　０．５　Ｍ　ＮａＣ／　ｓ　ａ　００１　Ｍ　ＥＤＴ Ａ　％　０．０２Ｍ　）リスＨＣＩ　（ｐＨ７，６）％　１％デオキシフール酸 ナトリウムおよび３０％スクロース中で３回、そして０．０１Ｍ）リスＨＣＪ（ ｐＨ７，６＞中で１回）、乾燥し、試料緩衝液（ｐＨ６，８のＩＭ）リスーＨ５ ＰＯａ中の３％ＳＤＳ、１Ｍ尿素および３％α−メルカプトエタノール）中に再 懸濁させ、そして３分間沸騰させた。これら試料を９〜１６％ポリアクリルアミ ドグラジェントゲル上２．２５％の試料添加用ゲルを用いＰＡＧＥによシ分析し た・。このゲルを３０％メタノールおよび１０％酢酸を含有する溶液中で１時間 固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉ ｒｅ、英国）中に２０分間浸漬し、乾燥しそしてフィルム（ＸＡＲ−５０，Ｋｏ ｄａｋ　）に３〜７日間露出させた。１４（標識されたタン／ξり質混合物（ホ ｘｚｌｔ！Ｊラーゼ１）９７，０００、ＢＳＡ６９，０００、卵７Ａ／ブミン４ ６，０００、カルボニックアンヒドラーゼ３０，０００、ラクトグロブリンＡＩ ８，５００）　を分子量標準物として各ゲル上で平行操作した。

結果 ６種のウィルス特異的なタンパク質はＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｍＢ陽性の血清を用いて 明確に同定できた。これらはｇｐ６０ｓｇｐ１２０゜ｐｒ５５　、ｇｐ４１、ｐ ２４、ｐ１９であった。ｐｒ５５に関しては、このタン／ぞり質は種々のパッチ で定まらない量で存在しておシ従ってこのものはそれ以上研究されなかった。未 感染細胞溶解物の免疫沈澱によってもあるいはＨＩＶ−特質も検出できなかった 。ＨＴＬＶ−ｍＢにょシコーディングされた数種の生成物に対し反応性を有する 抗体−陽性対照血清はクローン１６およびＨＵＴ　−７８のウィルス感染細胞か ら相当するタンパク質を沈澱させた。バンドの数は２種の細胞のそれぞれについ て同じであったが、最良の品質の沈澱はクローン１６で得られた。何故ならこの クローンからの細胞性タン・ξり質は非常に小規模にしか標識されてないからで ある。

この現象に関する説明は、ＨＵＴ−７８の感染は継続的にウィルスを産生ずるＮ ｉ胞系絖を生ずるがクローン１６Ｍ１胞にとってこのウィルスは致命的であると いうことであろう。３Ｈ−グルコサミンで標識された抗原を用いると、分子量１ ６０Ｋｄおよび１２０Ｋｄを有する２種のタン・ぞり質を沈澱させることができ た。この物質で標識された抗原においては、ｇｐ４１の存在は陽性血清によって は証明できなかった。しかし一方ではかかる証明はｇｐ４１　に対するモノクロ ーナル抗体（ＲＣＧａｌｌｏ氏からの贈物）を用いて容易に遂行できた。ｐ１９ 、ｐ２４およびそれらの前駆物質（ｐｒ　５５およびｐ２４についてのｇｐ４１ 　）の同定もモノクローナル抗体を用いて検査された。

上に論議された６種のタンパク質に加え、患者血清の幾つかは２５Ｋｄおよび２ ７Ｋｄのタン／ξり質を沈澱させた。

これらはｓｏｒ遺伝子およびｏｒｆ遺伝子の産物である。

論　議 実施例　１ 我々の結果は、ヒト単球様起原の細胞がＨＴＬＶ−ｍＢで感染されうろことおよ び長時間産生体細胞系統が樹立されうることを示している。Ｔ４抗原はＨＴＬＶ −ｍＢが単球様細胞の表面に結合しうるために決定的に重要であると思われる。

何故ならサブクローンの１種（クローン１６）の感染はその細胞を抗−Ｔ４抗体 とブレインキュベーションすることによシ阻止されうるからである。興味深いこ とに、Ｔ細胞白血病細胞系統Ｈ９は感染を狙止するのに単球様細胞系統が必要と するよシも高濃度の抗−Ｔ４抗体を必要とする。たとえレセプター密度が単球様 細胞系統においてはＴ細胞系統におけるよシも低いとしても、前記した結果はリ ン・ξ球と単球様細胞上の）（ＴＬＶ−ＩＩＩＢレセプターの間の密接な相似性 を示している。我々の結果はまた、細胞培養物中におけるＴ４−陽性細胞の％が 高くなればなる程、ＨＴＬＶ−ｍ　Ｂ　＠染に対する感受性が高くなるであろう ことをも示している。感受性はウィルス産生が開始する前の潜伏期間の短かさお よび細胞培養物中における細胞変性効果の強さに反映される。親系統（Ｕ−９３ ７）とクローン４における低いＴ４発現と完全に一致して、産生性感染を確立す るには２か月を要するか、あるいはまた大量のウィルス種苗が使用されねばなら なかった。これら培養物のいずれも常に何ら！ｓ胞変性効果を示さなかった。他 方クローン１６は溶解に対して非常れ得なかった。興味深いことに、クローン１ ．２および３はＴ４発現が同様であるが（１および３の場合５０〜６０％、２の 場合６０〜７０％）、溶解作用およびウィルス複製の程度はクローン２において 最も著明である。

Ｕ　−９３７のサブクローンは単球分化の種々のレベルで凍結された細胞を表わ すと思われるので、それらはウィルス感染後のＴ４発現を調節する能力において も相異しうる。

実施例　２ 得られた結果から、本発明の舗胞系統がＨＩＶ陽性血清の検出に有用なウィルス 抗原の生産にとって大きな利点を提供しうろことが推論されうる。

第　１　表 Ｕ　−９３７およびその５種のサブクローンについて選択されたマーカー細　胞 　ＨＬＡ−ＤＲ”　Ｔ４”　Ｆｃ−レセプター”酵素活性０親　十　く１０％　 ３５％　＋ クローン１　＋＋　５０−６０％　１００％　＋＋＋クローン２　＋＋　６０− ７０％　１００％　＋＋＋＋＋−ン３　＋　５０−６０％　５０％　＋クローン ４　＋　＜１０％　５０％　＋クローン１６　＋　＞９５％　１５％　十４＃Ｈ ＬＡ−ＤＲデータはＦＡＣ’Ｓ中のＢＤ−抗−ＤＲＦＩＴＣを用いて得られた。

＋十−すべての細胞が高度に陽性、十−平均的な＋子細胞と同じ強度の陽性細胞 少数、しかし大多数は陰性。Ｔ４に関する数字は抗−○ＫＴ４抗体を用いる膜螢 光における陽性細胞％として表わす。

→　ＩｇＧについてのＦｃし七ブタ−はＩｇＧで被覆された５ＲＢＣで強力で明 確なロゼツトを形成する細胞の％とじて表わす。

一二ステラーーｔ／　（ＮＡＳＤＡＥ）、コラーゲナーセ、エラスターゼ、リゾ チーム。組織化学的染色の強度は光学顕微鏡中で−１＋、＋＋および＋＋＋とし て採点した。

抗−Ｔ４抗体によるＨＴＬＶ−■Ｂ複製の凪止Ｈ９０１：１００　０２″　１． ０６　０．４　６迭Ｌ２３　１：１００　α５　０．４　０．！１　１０．９１ ２５　１：１００　０．５　２３　０．８　０．６クロー＞１６０　未希釈　１ ４．０７２９．６　ＣＰＥ”″に１：１００　０．４　２Ｂ　５Ｂ ２５　１：１０　０．３　１．８　０．６１：１００　０．５　１．８　０．５ １２５　未希釈　０．７　７５上　１１３．８１：１０　０．３　１．４　０． ３ １：１００　０．６　２．４　０．４ 帯　未希釈−４Ｘ　１０５ｃｐｒｎ／ｍｌ軸　逆転写酵素活性ｘ　１（１３Ｃｐ ｍ、パックグラウンドの１０倍をこえる値を陽性とみなした（アンダーライン） 。

剰蹄細胞変性効果によシ破壊された細胞培養物１、　Ａｓｊ♂、Ｂ０氏民地（１ ９８６）　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ、６６０−２２、ＣＨＩＯＤＩ、Ｆ、民地、　Ｎ ａｔｕｒｅに提出。

＆　ＤＡＬＧＩＪＩＳＨ，Ａ、民地、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７ ６３−７６７４、ＧＡＲＴＮＥＲ，Ｓ、民地、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３５．２１５−２１９５、ＧＩＤＬＵＮＤ、Ｍ、民地％　（１９８１）　Ｎａ ｔｕｒｅ　２９２．８４８−８５０＆　ＧＹＯＲＫＫＹ、Ｆ、民地、（１９８５ ）　Ｌａｎｃｅｔ　１０６７、ＨＡＨＮ＊　Ｂ、　Ｈ，民地、（１９８４）　Ｎ ａｔｕｒｅ　３１２．　’１６６−１６９８、ＨＩＲＴ、Ｂ、（１９６７）　Ｊ 、ＭｏＬ　ＢｉｏＬ　２６，５６５−５６９９、ＨＯ，Ｄ、Ｄ、民地、（１’９ Ｂ６）Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７７．１７１２−１７１５１ｃＬＨＵＢＥ Ｒ，Ｃ，民地、（１９７８）　Ｂｌｏｏｄ　５１．９１１−９２１１１、　ＫＬ ＡＴＺＭＡＮＮ、Ｄ、民地、（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５５＊　５９− ６３１２、ＫＬＡＴＺＭＡＮＮ、Ｄ、民地％　（１９８４）Ｔ−１ｙｍｐｈｏｃ ｙｔｅ　Ｔ４　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｂｅｈａｖｅｓ　ａｓ　ｔｈｅ　ｒｅｃｅ− ｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ＬＡＶ。

Ｎａｔｕｒｅ　５１２．　７６７−７６８１３、ＬＩＩＣＶＹ、、Ｔ、Ａ０氏民 地（１９８５）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４７．４４１−４４９１４、　ＭｃＤＯ ＵＧＡＬ、　Ｓ、Ｊ、民地、（１９８５）Ｊ、ＩｍｍｕｎｏＬ　１３５，３１５ １−３１６２１５、　ＭｃＤＯＵ（）ＡＬ、Ｓ、Ｊ、民地、（１９８６）Ｂｉｎ ｄｉｎｇ　ｏｆ　ｌ１ｉＴＬｖ−１１１／ＬＡＶ　ｔｏ　’ｒａ＋　Ｔ　ｃｅｌ ｌｓ　ｂ７　ａｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　ｔｈｅ　１１０Ｋ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔ４ｍｏｌｅｃｕｌｅ、５ｃｉｅｎｃｅ　２５Ｌ　 ５８２−！１８５１６、ＭＯＮＴＡＧＮＩＥＲ，Ｌ、民地、（１９８４）Ａｌａ ｐｔａｔ、ｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ　ａｓｓｏｃｉａｔ ｅｄ　ｖｉｒｕｓ（ＬＡＶ）ｔｏ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＥＢＹ−ｔ ｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｂ　ｌｙｍ−ｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉ ｎｅｓ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５ｔ　６３−６６１７、　ＭＯＮＴＡＧＮＩＥＲ ，Ｌ、民地（１９８５）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４４．２８３−１ａ　ＮＩＬＳ ＳＯＮ、に、民地、（１９８０）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｙｍｐｏｓｉ ｕｍ　ｏｎ　ｎｅｗ　ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　 ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｍｍｕｎｏ−ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｄｓ　Ｂ。

５ｅｒｒｏｕｓ　Ｃ，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｄｏｉｎ　Ｅｄｉｔｅｕｒｓ、Ｐａ ｒｉｓｐｐ、２７１−２９２ １９、ＮＩＬＳＳＯＮ、　Ｋ、民地、（１９８１）Ｍｏｄｅｒｎ　ｔｒｅｎｄｓ 　Ｉｎｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｌａ　ｒｖ、　Ｎｅ　ｔｈ＋　Ｒ，ｒＧａｌｌ ｏ、　Ｒ，Ｃ，ｅ　Ｇｒａｆ＋　Ｔ、＃　Ｍａｎｎｗｅｉｌｅｒｔ　Ｋ、ｚおよ びＷｉｎｋｌｅｒ＋　Ｋ、綱、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ出版、Ｂｅｒｌ ｌｎ＋Ｈｅｌｅｌｂｅｒｇｔ　ｐｐ、２１５−２２１Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ａ ｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　ＶｏＬ　２１２０、ＮＩＬＳＳＯ Ｎ、　Ｋ、民地、（１９８５）Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ 　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｍａｌｉｇｎａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 、Ａｎｄｌｒ６８０ｎｔ　Ｌ−Ｃ−ｓ　Ｇａｈｍｂｅｒｇ。

Ｃ，Ｇ、、およびＥｋｂｌｏｍ、　Ｐ、　＠　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ出版ｐｐ、５７−７２ ２１、Ｎ０８ＩＩＣ，Ｍ、民地、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ印刷中２ ｚＳＡＬＡＨＵＤＤＩＮ、Ｓ、Ｚ、民地、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、印刷 中２＆　５ＡＬＡＨＵＤＤＩＮ、Ｓ、　Ｚ、民地、Ｂｌｏｏｄ、印刷中２４、　 ５ＨＡＷ、Ｇ、Ｍ、民地、（１９８４）２５、　５ＣＨＮＥＩＤＥＲ，Ｊ、民地 、（１９８４）　１５２．１−２６　５ＨＡＷ、ＧｌＭ、民地、（１９８５）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２７７、１７７−１８２２７、　５ＯＵＴＨＥＲＮ１．Ｍ、（ １９７５）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８，５０３−５１７エｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃ ｅｒ　１７＃　５６５−５７７Ｂｒｉｚ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　５７＋ 　４８９−５０１３０、ＴＥＮＮＥＲ−ＲＡＣＺ、　Ｋ、民地、（１９８５）　 Ｌａｎｃｅｚ　１０５−１０６３１、置ＬＥＲ，ａ　Ｋ、民地、（１９８０）　 Ｊ、　ＶｉｒｏＬ　３５．４９４−５０６特許刊行物 ３２、　ＥＰ−Ａ−１６５１２０ Ｃｅｎｔｒｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ａｅ　ｌａ　Ｒｅｃｈｅｒｉｈｅ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ（Ｃ，Ｎ、　ＲＳ、　）　発明者：　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、　Ｌ ｕｃ氏他民地、ＷＯ−Ａ−８５０４８９７ Ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｏｍｍ ｅｒｃｅ。

発明者：　（）ａｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，民地補　遺 外国出願に関連して追加される参考文献３４、ＮＩＣＨＯＬＳＯＮ、　Ｊ、　Ｋ 、　Ａ、民地、（１９８６）Ｊ、ＩｍｍｕｎｏＬ　１３７ ３５、　ＥＰ−Ａ−１１６９４９Ｅｉｓａｉ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ。

３６、　）ＩＡＲＡＤＡ、　Ｓ、民地（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ＋　Ａｕｇｕ ｓｔ　９　＋　５６３−６６国際調査報告 １ｍｆｉｔ１１ｅ＋＋ａ１＾・両・Ｉ−Ｎ・　ＰＣＴ／ＳＥ８７１００６２Ｂ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．単球様野生型のサブクローンであることを特徴とする、インピトロで無限増 殖しうる単球様細胞の細胞系統。
2. ２．５％を越えるＴ４含量を有することを特徴とする、請求項１記載の細胞系統 。
3. ３．前記野生型がＵ−９３７であることを特徴とする、請求項１または２記載の 細胞系統。
4. ４．Ｔ４含量が５０％を越えることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記 載の細胞系統。
5. ５．前記細胞系統がウイルス、特にＨＩＶで感染されうることを特徴とする、請 求項１〜４のいずれかに記載の細胞系統。
6. ６．前記感染が産生性感染を生ずることを特徴とする、請求項５記載の細胞系統 。
7. ７．好ましくは約５０％を越える安定したＴ４含量を有しかつその細胞が産生性 感染を生じ得るものである単球様野生型のサブクローンの細胞をウイルスに感染 させることを特徴とする、ウイルス粒子およびそのフラグメントを産生させるた めに無限増殖しうる細胞系統をインピトロで感染させる方法。
8. ８．前記感染されたサブクローンがＵ−９３７のサブクローンであることを特徴 とする、請求項７記載の方法。
9. ９．ＨＩＶが感染に用いられることを特徴とする、請求項７または８のいずれか に記載の方法。
10. １０．インピトロで無限増殖できかつウイルス、特にＨＩＶにより感染され得る 細胞系統を生成させるに当たり、野生型の単球細胞系統をそれ自体知られた方法 でクローニングし、つぎに５％好ましくは５０％を越えるＴ４含量を有する増殖 性クローンを選択および回収することを特徴とする方法。
11. １１．Ｕ−９３７をクローニングすることを特徴とする、請求項９記載の方法。