JPH01502640A - ウシ成長ホルモン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シ　ホルモン 本発明は１９８７年３月１２日付第０２４．８３８号明細書の一部継続出願であ る。

ｉ量 本発明は成る種のウシ成長ホルモン類似体に関する。特に本発明は、天然ウシ成 長ホルモンのアミノ酸配列の３３番から３９番にある１つ以上の残基が欠失して いる、組換え生産される成る種のウシ成長ホルモン類似体に関する。更に本発明 は上記類似体を含有する組成物及びこのような化合物及び組成物の使用に関する 。

正常な哺乳動物の下垂体は成長ホルモン（”ＧＨ”）と称される物質を産生して 血流中に分泌する。ヒト（ｈＧＢ’″）、ウシ（′″ｂＧＢ”）及びブタ（”ｐ ＧＢ”）成長ホルモンのアミノ酸配列は類似である（Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔ１ａ ｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅ　ｕｅｎｅｅ　ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖ ｏｌｕｍｅ　５．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　６．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄ ｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントン、１２０−１２ １（１９７６）　；及びＳｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、ｉ、３７−４ ５（１９８３）参照）、サケ成長ホルモン（”８にＨ”）のアミノ酸及びヌクレ オチド配列も公知である（Ｓｅｋｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１ ．＾ｃａｄ、５ｃｉｕＳ＾、８２．４３０６−４３１０（１９８５）１）照）こ れらの成長ホルモンの中でも高度な相同性を示すｂＧＨ，ｈにＢ、　ｐにＩＩ及 びｓＧＢの配列を整列させると、非常に保存された成る領域を同定することがで きる（例えばＤ　＊　ｙ　ｈ　ｏ　ｆ　ｆ　、ｕツ＊及び５ｅｋｉｎｅ　ｅｔ　 ｍｌ、、鮎見■會照）。

少なくともＬ！料μで成長ホルモンは、アミノ酸からタンパク質を構成したり、 投与に際して血漿中のグルコースを一時低下させたり、一時低下させた後に次第 に血漿中のグルコースを増加させたり、脂肪を脂肪酸に分解したりするのを促進 する。成長ホルモンと関係するこれらの作用はそれぞれ、成長促進作用（例えば 体重増加）、インシュリン節約作用（ｉｎｓｔ＋Ｉｉｎ−ｓｐａｒｉｎｇ）、糖 尿病誘発作用及び脂肪分解作用と称される。抗脂肪分解作用も報告されているが 、これは該ホルモンのインシュリンのような活性の一つの局面であると思料され る（Ｇｏｏｄｍａｔ＋Ｊｅｔｉｂｏ１ｉｓｍ、１９，８４９−８５５（１９７Ｇ ））。

更に、成長ホルモンは構造において泌乳刺激ホルモンに類似であって、同様の作 用を誘発できる０例えば、ヒト成長ホルモンはヒト胎盤性ラクトゲンとはその残 基の約１５％が興なる（Ｍｉｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍ ｏｎｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ＄、Ｐｅｃｉｌｅ　ｅｔ　ｍｌ、、ｅｄｓ、、 Ｅｘｃｅｒｐｔａ　１４ｅｄｉｃａ、アムステルアム、１−１３（１９７Ｂ）） 、ヒト成長ホルモンはヒト１０ラクチントハその残基の約２５％が異なる（Ｗａ ｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、拙ツ）。

ｂＧＨ若しくは組換えｂｃａ　（”ｒｂｌ；ＩＩ”）を皮下注射をするとウシ、 ヤギ及びヒツジではミルクの出がよくなる（Ｅｐｐａｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｊ、Ｄａｉｒ　Ｓｃｉ、、６８．１１０９−１１１５（１９８５）；Ｂａｕ＠ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｄａｉｒ　Ｓｃｉ、、６８．１３５２−１３６２（１９８５）；Ｈａｒｔ、 Ｐｒｏｃ　Ｎｕｔｒ、Ｓｏｃ、。

４２．１８１−１９４（１９８３）　：及びＨａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、Ｊ、、２１８．５７３−５８１（１９８４）参照）。

下垂体から成長ホルモンを単離させるには、該ホルモンの産生に関係する下垂体 細胞を溶解す番、シかし、細胞を溶解すると、天然下垂体成長ホルモンの少なく とも一部をフラグメントに切断し得るタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）が遊 離する。更に、一旦血流中に分泌されると天然下垂体成長ホルモンは、天然下垂 体ホルモンを同じ若しくは異なるフラグメントに切断し得るプロテアーゼに暴露 される。成長ホルモンフラグメントの研究における主な調査領域は、天然成長ホ ルモン若しくはそのフラグメント又はその両方が、抽出された成長ホルモン又は 血流中で循環する成長ホルモンと関係する作用を起こすかどうかの決定に係って いる。この点について言えば、リシン若しくはアルギニン残基を化学的に修飾す ることによって、プロテアーゼトリプシンによる消化に対する耐性を与えられた ヒト成長ホルモンの類似体は、希釈されているとは言え、著しい成長促進性、糖 尿病誘発性及びインシュリンのような活性を所持することに留意されたい（Ｃａ ｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｂｉ−、Ｂｉｏ　ｂ　ｓ、＾ｅｔａ、２５４−２６０（１９８５））、 　Ｌかし、天然成長ホルモン分子の個々の部分（”ドメイン“）は成長ホルモン のいずれかの作用の要因となると考えられている。天然成長ホルモンの作用につ いての要因がこのように局所的に特徴付けられるならば、タンパク質合成、イン シュリン節約、糖尿病誘発及び脂肪分解の各作用を選択的に入れ代えたフラグメ ント及び類似体を産生ずることができる。

本明細書では、ウシ成長ホルモンのフラグメント若しくは類似体に存在するアミ ノ酸残基の位置を、対応する天然ウシ成長ホルモンにおいて同じ位置に見られる 残基の存在を数字で示し且つ欠失部分をコンマで示した下付き文字で同定する０ 例えば、天然ウシ成長ホルモンはｂＧＨ＋−＋＊＋と表す。

下垂体から単離することができてｂに［１−２ｔ、ｙ−＋ｓ＋に対応するｈＧＨ （２２，Ｇｏｏドルトン）の２０．Ｇｏｏドルトン変異体（”２０に″）は下垂 体を切除したラットにおいて成長を促進するが、イヌにおいては血糖もインシュ リンも上昇させず、ｉｎ　ｖｉｖ。

若しくはｉｎ　ｖｉｔｒｏのインシュリン節約作用も脂肪分解作用も示さず、ｈ ＣＨのラジオイムノアッセイにおいてはｈＣＨ自体よりも反応性が低い（Ｌｅｗ ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３゜２６７９−２６８７ （１９７Ｂ）；Ｆｒｉｇｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｂ　 ｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、９１．フッ８−７８２（１９７９）：Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、９２，５１１−５１６（１９８０） ；Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｎｄｏｃｒ　、Ｒｅｓ　、Ｃｏｍｍｕｎ　、　、　８　、１５５−１６４　（ １９８１））、このｈｃｎの２０に変異体は転写後修飾の産物である（Ｌｅｗｉ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、加…）、　２０に変異体は、三量化 して腎臓劣化を免れる傾向によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物活性から予測されるより も重要な成長プロモーターとなり得ることも事実である（Ｂａｕｍａｎｎ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、１１７．１３０９−１３１３（１９８５ ））。

２０Ｋ　ｈａｌｌが欠失している残基を含むｈＣＢのフラグメントが調製された 。これらのフラグメントのいずれも成長を促進するとは報告されていないが、成 長ホルモンの糖尿病誘発性及び脂肪分解特性との潜在的関連特性を示すものもあ る。

ｈＧＯの残基３１−４４に対応する合成フラグメントは、飢餓死の動物において はｉｎ　ｖｉｖｏ脂肪分解作用を示し、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

でも同様であるが（Ｙｕｄａｅｖ、ｅｔ　ａｌ、、肚殖■旦ｎ、４１，８４３− ８４６（１９〕６））、ＧＨの不在、即ち非生理学的状態においてｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ予備インキュベート後にのみグルコース取込みを剰激する（即ちインシュリ ン節約作用を示した＞（Ｙｕｄａｅｖ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅ−、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｓ＋ｓｕｎ、、 １１０，８６６−８７２（１９８３））、ｈｃＢのペプチド類似体の成るものは 糖尿病誘発性であるが、ｈＧＨｓｓ−ｔｔの類似体は糖尿病誘発性ではない（Ｌ ｏｓｔｒｏｈ。

ｅｔ　ｍｌ、、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２７，５９７−５９８（１９７Ｂ））、　ｈ にＢ２ｏ−４＋から成るペプチドには活性がな（（Ｒｅａｇａｎ、Ｄｉａｂｅｔ ｅｓ、２７，８８３−８８８（１９７８））、ｂｆ；Ｈ＋−３ｓから成るペプチ ドには血液グルコース若しくは成長における作用がない（Ｃｂｉｌｌｅｍｉ、ｅ ｔ　ａｌ、、ｉｎＣｒｏｗｔｂ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐ ｅ’　ｔｉｄｅｓ、Ｐｅｃｉｌｅ、ｅｔ　ａｌ、。

ｅｄｓ、、Ｅｘｅｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、アムステルダム、５Ｇ−６３（１ ９７６））。

しかしｈＧＨｓｔ−４ｇに対応するペプチドは血清中の遊離脂肪酸を減少させ、 インシュリンと一緒にｉｌ　ｖｉｔｒｏ投与するとインシュリン節約作用があり （Ｆｒｉｇｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、ｉｎＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、６４ｔｈ　Ａ ｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔ ｙ、サンフランシスコ、１０１（＾ｂｓｔｒａｃｔ　８８）（１９８２））、ｉ ｎ　ｖｉｖｏでも同様である（Ｒｕｄｍａｎ、米国特許第４，５５８，０３３号 明細書及び５ｔｅｖｅｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３３，１４ ９＾（＾ｂｓｔｒａｃｔ５７２）（１９８４））、　ｈｃＨ３ｔ−４＠の（外来 アミノ酸若しくは立体異性体の置換を含む）フラグメント及び類似体も、インシ ュリンと一緒にＬ！■Ｖ投与するとインシュリン節約作用を示す（Ｊｏｎｅｓ　 ｅｔ　ａｌ、、同時係属及び同時譲渡の米国特許出願第５０１．０２４号明細書 ）。

１匪段且１ 本発明は、天然ウシ成長ホルモンの生物学的な活性及び特性を保持しており且つ 成長速度、飼料効率、脂肪分解及び／又はミルク産出量を増大させる、組換えに よって誘導される成る種のウシ成長ホルモン類似体に関する。

特に本発明は、アミノ酸配列： ｚ−ｂＧＨｌ−３□（ｘ）ｎ−ｈＣＨ４゜−１９、（１）［式中、ｎは０若しく は１であり、 ２は水素若しくはメチオニンであり、且つＸは、 −ＧＬυ−＾Ｒに−ＴＩＩＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−にＬＵ−（ここで、１ つ以上のアミノ酸は欠失している）から成るアミノ酸残基のペプチドである］で 表される組換えウシ成長ホルモン類似体及びその対立遺伝子異形体に関する。

更に本発明は、形質転換細菌若しくはトランスフェクション細胞系において本発 明のｂｃＢ類似体の生産を指示するのに有効なりＮＡ配列を含む、種々の複製可 能なりローニングビヒクル及び発現ビヒクルの構成の方法に関する。更に本発明 は、上記アミノ酸配列を有するｂＧＢの本発明のｂｃＢ類似体をコードする遺伝 子を提供する。更に本発明は、本発明のｂｃｌ類似体を生産するのに必要な変更 遺伝情報を含む、種々の複製可能なりローニングビヒクル、発現ビヒクル及び形 質転換細菌若しくは細胞培養体を包含する。

本発明のｂＧＨ類似体はほぼ純性に生産され、従ってウシ由来のその他のタンパ ク質は実質的に含まない、ｂｃｎ類似体は、宿主動物へききめを容易に与えるよ ゛うに使用可能な組成物を製造するために、例えば血清アルブミンのようなその 他のタンパク質を含有するその他の通常のキャリヤ（担体）及びアジュバント（ 補助剤）と−緒に調合することができる。

更に本発明は、本発明のウシ成長ホルモン類似体若しくは該ウシ成長ホルモン類 似体を含有する組成物を有効量で動物に投与することから成る、動物における成 長を促進する方法も提供する。

更に本発明は、本発明のウシ成長ホルモン類似体を有効量で動物に投与すること から成る、動物におけるミルク産出を促進する方法にも関する。

１１塁塁皇１１１ 第１図は本発明の２１Ｋ　ｂＧＨ類似体を投与して得られたギンザケ（Ｃｏｂｏ 　Ｓａｌｍｏｎ＞における体重増加を示すグラフであり、 第２図は本発明の２１Ｋ　ｂＧＨ類似体を投与して得られたギンザケにおける体 長の増加を示すグラフであり、第３図はｂＧＢのラジオイムノアッセイにおける 本発明の２１にｂＧＨの効能を示すグラフであり、第４図はｐｃＦＭ４１４ｂＧ ）１２１にの構成図であって、プラスミド構成に使用する成分を示しており、 第５図はｐｃＦＮ７５６ｎｓｂＧＨ２１にの構成図であって、プラスミド構成に 使用する成分を示している。

１員盈朋 上記のように、成長ホルモンの生理学的活性は無傷のポリペプチドの種々の領域 に属すると考えられる。また、この活性は無傷のポリペプチドの特定の折りたた み若しくは修飾、仲介因子の遊離、又はその他の下垂体ペプチド、例えばそれ自 体が脂肪分解活性の要因となり得るα−及びβ−リボトロピン（Ｋｕｈｎ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｅｒｉｎｏｌ、Ｎｅｔａｂ、、５６゜１３３ ８−１３４０（１９８３））による「汚染」に起因するとも言える（Ｆｒｉｇｅ ｒｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｊｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓ、、１７，１９７−２０１（１９８ ３））。

精製ホルモンの作用から汚染物の作用を分離する１つの方法は、他の下垂体成分 から単離して生産される成長ホルモン、例えば組換えｂｃａ（”ｒｂＧＨ”）の 活性を調査することである０種々の形態の原核細胞及び真核細胞中でｂＧＨのた めの遺伝子が配列されて発現された（Ｋｅｓｈｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅ ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、劃、１９−３０（１９８１）；Ｍｏｙｃｈｉｋ　ｅｔ 　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１０．フ１９７−７２１０（ １９８２）；Ｓｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ　、ａｌ、、ＤＮＡ、≦。

３７−４５（１９８３）；Ｋｏｐｃｈｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、４．２３ −３１（１９８５）；及びＧｅｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、４，２７３− ２８１（１９８５））、組換えｂｃｎはラジオイムノアッセイにおいてはｎｂＧ ｌｌと免疫学的に同一であって、小マウス（ｄｗａｒｆ　ｍｏｕｓｅ）バイオア ッセイにおいてはおおよそ同じ成長促進活性を有し、ヒツジにおけるインシュリ ン耐性テストでは幾分低い糖尿病誘発性を示す（Ｈａｒｔｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｊ、、２２４．９３−１００（１９８４））。

本発明は、天然ｂＧＨの生化学的特性（例えば免疫学的特性及びｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ生化学的活性）及び物理的特性（例えば分子量）を１つ以上有する精製及び単 離ポリペプチド生成物及びその対立遺伝子異形体を提供する。更に前記ポリペプ チドは、ゲノム若しくはｃＤＮ＾クローニング又は遺伝子合成によって得られる 外因性ＤＮＡ配列の、化学的合成処理又は原核若しくは真核の宿主発現（例えば 細菌、酵母、高級植物、昆虫及び培養液中の哺乳動物細胞）の産物であることに よっても特徴付けられる。一般的な酵母（例えば５ｉｃｃｈａμｍ■懸ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）若しくは原核生物（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（ Ｅ、ｃｏｌｉ））宿主細胞の産物はいかなる哺乳動物タンパク質との関係もない 、を推動物（例えばヒト以外の哺乳動物及び鳥類）の細胞における微生物発現の 産物はいかなるヒトタンパク質とも関係がない、使用する宿主に応じて、本発明 のポリペプチドは哺乳動物若しくはその他の真核炭水化物を用いてグリコジル化 してもよいし、未グリコジル化でもよい０本発明のポリペプチドは最初のメチオ ニンアミノ酸残基を（位置−１に）含有することもできる。

本明細書中「アミノ酸残基のペプチド」とは、１つ以上のアミノ酸が欠失したア ミノ酸残基ＧＬυ−へＲに−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵを意味す る一本発明のためのペプチドにおけるアミノ酸の欠失は順次でもランダムでもよ い。

本明細書中、ＤＮＡ配列及び遺伝子について用いられる「人工（ｓ＋ａｎｕｆａ ｃｔｕｒｅｄ）　Ｊとは、ヌクレオチドベースの組み立てによって全体として化 学的に合成されるか又はこのように化学的合成された生成物の生物学的複製から 誘導される産物を意味する。従って、上記語は、最初に生物学的起源の出発材料 を含むゲノムクローニング方法論のｃＤＮＡ法によって「合成」される産物は含 まない。

本明細書中「対立遺伝子異形体」とは、本発明のｂｃ■類似体の生物学的活性を 変化させることなく該類似体の配列において１つ以上のアミノ酸を修飾したもの のことである。

このような対立遺伝子異形体は当業者には容易に確認できる。

（無傷のｒｂＧＨである）組換えｂｌ：Ｂ＋−＋□は、下垂体を切除したラット においても小マウスにおいても成長を促進することが立証された（Ｍａｌｌｉｓ 、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、５６，２３５−２４３（１９７ ３））、組換えｂＧＨｌ−ｓｓ、＜。−１，１類似体は替歯目動物において成長 を促進することが分かった０組換えｂＧＨ＋　−、ｓ　ｒは、全体として体重増 加が維持されるところを見ると少なくとも天然すにＨｌ−＋□と同程度に有効で あった。

本発明の好ましいｂＧＨ類似体は、ｎが０の場合の式（１）のｂｃＨ類似体であ るじｂにＢ＋−１ｏｎｏ−ｔｓ＋”）、その他好ましいｂＣＢ類似体を表１に示 す。

宍」２ ＵＵ　！！　Ｘ ｂｃＬ−ｓｓ、ｓｓ−＋＊＋　１　−にＬＵ−八Ｒに−ＴＢＲ−にＬυ−ｂＧＨ １−ｓｔ、ｓ＊−＋＊＋　１　−にＬＵ−＾ＲＣ−ＴＩＩＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ− ＣＬυ−ｂＣＬ−ｓｚ、３ｓ−ｓｓ、ｎｏ−＋ｓｔ　１　−ＴＨＲ−ＴＹＲ−Ｉ ＬＥ−ＰＲＯ−ｂＧＨｌ−ｓｓ＊ｓｓ−＋□　１　−にＬυ−ＴＨＲ−ＴＹＲ− ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＣＬυ−組換えｂＧＨｌ−＋ｓ＋をコードする人工遺伝子を生 産するのに使用するプロトコルは＾Ｉｔｏｎ、ｅｔ　ａｌ、によるＰＣＴ公告１ １１０８３１０４０５３明細書に開示されており、該明細書は参照により本明細 書に包含するものとする。遺伝子は、最初に成分オリゴヌクレオチドを複数の二 重体に組み立て、次いでその二重体を２つの別個のセクションに組み込むように 設計された。これらのセクションは容易に増幅されるように設計してあり、増幅 系から切り離して、順次に組み込むこともできるし適当な発現ベクターへ複数の フラグメントを連結するように組み込むこともできる。

本発明の組成物及び方法は、本発明のウシ成長ホルモン類似体を有効量で利用す る０本明細書中ウシ成長ホルモン類似体の「有効量」とは、成長を増大する若し くは関連特性、即ち飼料効率、赤み肉組成、ミルク産出等を増強するために動物 に投与されるウシ成長ホルモンの量を意味する。

このような有効量は当業者には容易に確定される。

以下の実施例によって本発明を更に説明する。

え胤■ユ 本実施例ではＥ、ｅｏｌｉ優勢コドンを含有する２２Ｋ　ｒｂＧＨをコードする 人工遺伝子の調製を説明する。

２２Ｋ　ｒｂＧＢをコードする遺伝子を２つの合成りＮＡ二重体から構成した。

これらの二重体、３４４　ｂｐ　Ｘｂａ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［［フラグメント（フ ラグメント＾）及び２５４　ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ［［−５ａｌ　Ｉフラグメント（ フラグメントＢ）は、それぞれ２６及び２０合成オリゴデオキシリボヌクレオチ ドを酵素組み込みし、次いでｐＢＲ３２２誘導プラスミドにクローン化すること で得た。フラグメント＾は表２に示したオリゴヌクレオチド１９から４４を含有 し、フラグメントＢは表２に示すオリゴヌクレオチドＩＢから２２を含有する。

更に表２は人工遺伝子の全ヌクレオチド配列も示す。

セクション＾によって形成されるＸｂａ　ｌからＨｉｎｄｌｌフラグメントを、 Ｘｂａ　ｌ及びＢｉｎｄｌｌｌを用いて開いたＮ１３ｍｐＨファージベクターに 連結する０次いでベクターを、Ｈｉｎｄｍ及び鉢ＩＩを用いて消化することによ って再び開き、１１ｉｎｄｌ［［を用いてセクションＢによって形成される５ａ ｌｌフラグメントに連結する。こうするとセクション＾及びＢは適当な向きで連 結された。セクション＾及びＢを含有するベクターをＸｂａ　１及び５ａｌｌを 用いて消化する。この消化によって得られたフラグメントをｐＢＲ３２２誘導プ ラスミドに連結する。この反応の生成物は、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ翻訳開始のためのア ミノ末端メチオニンコドン（＾ＴＧ）を有する組換えｂＧＨｌ−＋ｓｔポリペプ チド全体をコードする、表３に示した連続ＤＮＡ配列を含有する発現プラスミド である。

表２ 表３ ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧ 塞１１１２ ｂｃｕ−−ｓの ｐｃＦＭ４１４ｂＧＩＩの大フラグメント（Ｓｓｔ　ｌ［からＢａ１ＩＩＩＩ） と、ｐｂｃＢ　Ｓｙｎ　２−２の小フラグメント（ｆｌｉｎｅ　ＩＩからＢａｇ 　ＩＩ）と、リン酸化合成リンカ−１ ５°ににＡＣＡＣＴＴＴＣ＾＾＾Ｃ＾＾ＴＴＴににＴＣ３゜３”ＣＧＣＣＴにＴ Ｃ＾＾＾ＧＴＴＴＣＴＴ＾＾＾ＣＣＡに５゜との３つの成分を連結してプラスミ ドｐｃＦＭ４１４ｂＧＩＩを生産することによってｂＧｌｌ−１２，４゜−１１ 類似体を構成した（第１図）。

ｐｃＦＭ７５６ｎｓｂＧＨ２１にプラスミドを構成するためには４つの成分の連 結が必要であった（第２図）、成分１は一端に＾ａｔ■制限部位を、他端にＨｄ ｅ　１部位を有するｄｓ’ＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、即ち ５°　ＣＡにＡＴＣＣＡＴＡ＾＾ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧにＴにＴＴにＡＣＡ Ｔ＾＾＾τ＾Ｃ−３’　Ｔｌ；ＣＡに丁ＣＴＡＧＧＴＡＴＴＴ＾＾ＴＡＧＡＧＡ ＣＣＧＣＣＡＣ＾＾ＣＴＧＴＡＴＴＴＡＴＧ−−ＣＡＣＴＧＧＣＩＣ；Ｔ１１； ＡＴ＾＾ＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧ＾＾ＧにＡにＧＡ＾ ＴＡＡＣ＾　５゜−ＧＴＣＡＣＣＣ：ＣＣＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴにＴＡＧＣ Ｔ＾＾＾ＣＴ＾＾（１；ＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴにＴＡＴ　３゜である 。

成分２は、ｓｐＨ／ｂにＩＩ／Ｎｄｅ　Ｉプラスミドから単離した、ｂｃ■遺伝 子の５′末端を含有するＨｄｅ　ｌからＳｓｔ田ｄｓ　Ｄ１４＾フラグメントで ある。　ｓｐＨ／ｂＧＢ／Ｎｄｅ　Ｉプラスミドを構成するためには、■ｐＨハ ＣＢプラスミドについて部位に特異的な突然変異を誘発してＮｄｅ　１部位（Ｃ ＡＴＡＴＧ）を生成した。ここで、Ｎｄｅ■部位中の＾ＴＧはｂＧＢ遺伝子のメ チオニンアミノ酸第１番となる。

成分３は、ｐｃＦＭ４１４ｂＧＩＩ２１にプラスミドから単離した、ｂＧＨ２１ に遺°伝子の３°末端を含有するＳｓｔ　ＩｆからＢａａ　ＩＩ　ｄｓ　ＤＮ＾ フラグメントであった。

成分４は＾ａｔｌｌ及びＢａｍ１ｌｌで切断したｐｃＦＭ７３６ｎｓプラスミド であった。ｐｃＦＭ７３６ｎｓプラスミドは、配列５°　ＧＡＴＣＣＧＣにＣＡ Ｔ＾八＾ＴＡへＣＴ＾八Ｃへ　３’３’　ＣＣＧＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴ ＧＣＴＡＧ　５’を唯一のＢａ−旧部位に挿入することによって調製されるｐＣ ＦＭ７３６プラスミド（ｆ＆述）の誘導体である。

プラスミドｐｃＦＭ７３６は、耐カナマイシン標識を配合するために構成される ｐｃＦＭ５３６（＾ＴＣＣ＃３９９３４）の誘導体及び合成Ｐ１プロモーターと して調製される。まず５ｓｔｌ及びＸｂａ　ｌを用いてｐｃＦＨ５３６を消化す ることによってβ−ラクタマーゼ遺伝子を除去する。これは、標識遺伝子だけで なく「パー（ｐａｒ）　Ｊ若しくは安定性配列全体、Ｐ１プロモーター及び制限 部位の気合体の一部を除去する役目をする。カナマイシン遺伝子配列は、Ｂｅａ ｋ　ｅｔ　ａｔ、によるＧｅｎｅ、１９．ｐｐ、３２７−３３６（１９８２）又 は＾ｕｅｒｓｗａｌｄ　ｅｔ　ｉｆ、によるＣｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏ ｒ汀科」上柱し工唖し、４５１ｐｐ、１０フー１１３（１９８１）によるＴｎ５ プラスミド由来のＳｅａ　ＩからＢｉｎｄｌｌフラグメントとして得ることがで きる。新たなベクターに挿入するためのフラグメントを調製するためには、Ｓｓ ｔ　Ｉリンカ−をＳｅａ　１部位に付加し、Ｎｄｅ　Ｉリンカ−をＨｉｎｄｌＩ 部位に付加する。「パー」遺伝子座配列はＰＳＣＩＯＩのＨｉｎｃＩ［から＾ｖ ａｌ消化フラグメント（＾ＴＣＣ＃３７０３２）として得ることができる。新た なベクターに挿入するための「パー」フラグメントを調製するためには、まずＢ ｉｎｃｌ［を５ａｌｌリンカ−を用いて処理し、次いで＾ａｔｌリンカーを用い て処理する。＾ｖａ１部位をＢａｍＨＩリンカ−を用いて処理し、次いでＮｄｅ 　Ｉリンカ−を用いて処理する。へａｔ■制限部位とＸｂａ　Ｉ制限部位との間 に挿入するための付着端を有するｄｓ　ＤＮ＾オリゴヌクレオチドの化学的合成 によって得られる合成Ｐ１プロモーターを含有するＤＮＡ配列を次のように付加 した。

（以下余白） ５’　ＣＡにＡＴＣＣＡＴ＾＾＾ＴＴＡＴＣＴＣＴにＧＣＧＧＴにＴＴＧＡＣＡ Ｔ＾＾＾ＴＡＣ−３°　Ｔ（：ＣＡ（：ＴＣＴＡＣにＴＡＴＴＴ＾＾ＴＡＧＡＧ ＡＣＣＧＣＣＡＣ＾＾ＣＴにＴＡＴＴＴＡＴに−−ＣＡＣＴＧにＣＧＧＴにＡＴ ＾＾ＴにＡに（：ＡＣＡＴＣ（：ＡＴＴ　３’−［；ＴＧＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡ ＴＴＡＣＴＣＧＴにＴＡＧＣＴ＾＾ＧＡＴＣ５’連結後、プラスミド構成物（ｐ ｃＦＭ７５６ｎｓｂＣＨ２１にと称される）を株ＦＭ６　（ソース／寄託）のＥ 、ｅｏｌｉ細胞に形質転換した。　ＦＮ６は、幾つかの未知のバクテリオファー ジに対するファージ耐性を与えられた八８７（＃ＣＧ６０８１５９）の誘導体で あり、テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子と、染色体に組み込まれるλバ クテリオファージリプレッサー遺伝子、Ｃｌ８５７及び旺牝を含有する。

ｂＧＬ−３２，４Ｏ−ＩＩ＋類似体を、膿プロモーター系と一緒に適当な遺伝子 配列が挿入された」無拘束（ｒｕｎａｗａｙ）プラスミドを有するＥｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株、ＦＭ６から単離した。

Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎプレスを用いて採取した細胞を切断した後に生物学 的に活性なりＧＨｌ−ｉｉ、−０−１□類似体を回収した。成長ホルモンは、細 胞溶解物の遠心分離によって得られた小球画分中に不溶性で存在した。切断され た細胞小球画分をデオキシコレート、ＥＤＴ＾及びリゾチームを用いて抽出した 。

抽出した小球中のｂＧＨｌ−３２＋４１１−１１１類似体をＴｒｉｓｌｌ衝液ｐ Ｈ８，５中の６Ｎグアニジン−ＢＣＩを使用して溶解した。それを更に、６Ｍグ アニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，５中で平衡させた５ ｅｐｈａｅｒｙｌ　５−Ｚｏｏカラムを使用したゲル濾過によって精製した。カ ラムからゲル内に取り込まれたピークに溶出した１）ＣＨＩ−２２＋４Ｏ−ＩＩ ＋類似体を、０．２パーセント（ｗ／Ｖ）ラクトース、０．２パーセント（ｗ／ ｖ）マンニトール、０．２５パーセント（ｗ／Ｖ）重炭酸ナトリウムの緩衝液ｐ Ｈ８，５に対して透析した。

透析中に出現した沈澱物を遠心分離よって除去し、調製物を限外濾過によって濃 縮し、凍結乾燥させた。

クーマシープルーＲ２５０で着色したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）ポリア クリルアミドゲルをデンシトメーターを使用して走査することによって判定する と、得られたｂＣＨ，−０１，。、□調製物は９０％以上純性であった。天然成 長ホルモンと同様にｂＧＩＩ＋−ｓｚ＋ｉｏ−＋ｓ＋類似体は、ラクトース−マ ンニトール−重炭酸ナトリウム緩衝液中で実施したゲル濾過によって測定すると 構造がモノマー若しくはダイマーであった。ゲルー過及び非還元条件下でのＳＯ Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果を基にすると、ｂＧＨｔ −ｓｚ、＜。−１□類似体は実質的に高分子集合形態ではなかったく即ち、この 形態は２％未満のｒｂＧＩｌを表した）　＊　ｂＧＨｌ−２２＋４０−＋＊＋類 似体は、等電集束ゲル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｇｅｌｓ ）における移動では逆相ＨＰＬＣからｎｂＧＨより幾分早く溶出し、Ｅｌｌｍａ ｎによる＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、＆Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、、８２．７Ｏ−７７（ １９５９）に記述された方法によって検知された遊離チオールのレベルで溶出す る。全ての公知の天然成長ホルモンは２つの鎖内ジスルフィド結合を有しており 且つ遊離システィン残基を有していないので、生来の配列を有するホルモンに期 待されるように、遊離チオールのレベルはホルモンモノマー１モル当たり０．１ モル未満である。　ｒｂにＨ＋−＋ｓ＋（２２Ｋ　ｒｂＧＨ）のアミノ酸配列を 表４に示す。

長手 叉」目１旦 上記方法において種々のリン酸化合成リンカ−を置換すると次の類似体を構成す ることができる：惺工山田二と ５’　ＧＧＡＣＡＣＴＴＴＣ＾＾＾Ｃ＾＾ＴＴＴＧ＾＾ＣＧＴＡＣＣＧ＾＾ＧＧ ＴＣ３’リ　ンカー：　３°ＣＧＣＣＴ（１；ＴＧ八へ八へＴＴＴＣＴＴ八へへ ＣＴＴＣＣＡＴにＧＣＴＴＣＣＡＣ５″匹Ｌ」ｈ■ニム ５°ＧＧＡＣＡＣＴＴＴＣ＾＾＾Ｇ＾＾ＴＴＴＧ＾＾ＣＧＴＡＣＣＴＡＣＡＴＣ Ｇ＾＾にＧＴＣ３’リンカー：３″ＣＧＣＣＴＧＴ１１：＾＾＾（：ＴＴＴＣＴ Ｔ＾＾＾ＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣ：ＴＡＧＣＴＴＣＣＡに５’１し上−とルＪ 二と ５°［；ＧＡＣＡＣＴＴＴＣ＾＾＾Ｃ＾＾ＴＴＴＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＣＡにＧ ＴＣ３’リンカー：　３’ＣＣＣＣＴＧＴＣＡ＾＾ＧＴＴＴＣＴＴ＾＾＾７１１ ：にＡＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＡＧ５’吠り址り址ユム ５°ＧＧＡＣＡＣＴＴＴＣ＾＾＾Ｇ＾＾ＴＴＴＧ＾＾＾ＣＧＴＡＣＡＴ（：ＣＣ ＡＧ＾＾ＧＧＴＣ３゜リンカー：３’　Ｃ（：ＣＣＴＧＴＧ＾＾ＡＧＴＴＴＣＴ Ｔ＾＾ＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＡＧににＴＣＴＴＣＣＡＧ５’に１且Ａ Ｈａｒｔ、ｅｔ　ｍｌ、によってＨｏｒｎ　、Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｓ、　、　７． ３５−４０（１９７５）に記述された方法にＴｉｎｄａｉ、ｅｔ　ａｌ、によっ てＨｏｒｍ、Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｓ、。

１４．４２５−４２９（１９８２）に記述された変更を加えた方法に従って、反 椰動物成長ホルモンについてのラジオイムノアッセイにおいてｂＧＩＡｌ−ｓｘ −ａ。−Ｉｌｌ類似体を評価した。

第３図に特性、即ち線の傾斜及びゼロパーセント結合における相違によって示し たように、ウシ成長ホルモンのラジオイムノアッセイにおいて組換えｂＧＬ−ｓ ｚ、＜。−、、ＩＷ似体に対する非平行交差反応及び不完全な競合に留意された い。

第３図に示すデータは以下のように解釈することができる。即ち、１）２１にｂ ＧＨは天然ｂｃ■と幾つかの共通抗原決定基を共有する：２）両方の分子は関連 抗原部位を共有する（僅かな構造の相違が異なる親和性を生じさせる）：及び３ ）天然ｂｃ■の幾つかの構成成分は２１ＫｂにＨ上に存在しない。

罠１■５ 本発明のｂｃｎ類似体調製物の成長促進活性を小マウスを検定することによって 決定した（Ｍａｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、　、５６．２３５−２４３（１９７３））、組換えｂ ｌ；Ｌ−＋ｓ＋は成長を促進して、この検定では活性が１．４υ／ｍｇであった （Ｈａｒｔｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｅｈｅｓ、Ｊ、、２２４，９３−１００（１９ ８４））。

＆’ｌ：ｌｌ−３１＋４１−１□類似体及び天然ｂＧＢの小マウス検定の結果は 以下の通りである。

表５ 処置　２６日間の体重増加 伯ｌｕ　−一−ムＬ−−− コントロール 標準ウシ成長ホルモン （ＮＩＢ−ＧＨ−Ｂ１５．υ／ａ＋ｇ）　１０　１．９４０　２．９ １６０　３．９ ｂＧＬ−ｉｉ、４゜−＋ｓ＋　２０　３．４８０　４．８ ｍｌ 組換えウシ成長ホルモン調製物を下垂体を切除したラットの体重増加についての バイオアッセイにおいて比較した。

バイオアッセイに使用した動物は、体重が１００〜１１０グラムの、下垂体を切 除した雌のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｍ　Ｉｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅ ｒ、Ｐｏｒｔａｇｅ、ｉｆ＾）であった、懸吊したワイヤケージに試験動物を４ 〜５匹ずつ入れた。到着してから調査の開始まで試験動物には補充飼料を全く与 えなかった。７〜１１日間にわたって基準体重を記録し、次いでラットをランダ ムにグループ分けした（１グループ当たり９〜１０匹）。

ラット１四ツたりＯ，ｌｓＺの皮下注射を連続して１０日間毎日実施した。

最後の注射をした翌日にラットの最後の計量を行って、各投与グループについて 平均体重を算出した０Ｍ衝液液コントールグループ平均体重増加を各処置グルー プの体重から差し引いた。第一実験の結果を表６に示す（１グループ当たり試験 動物１０匹）、この実験にはｒｂＧＨ２２にの２種類の独立サンプル（サンプル ＾、Ｂ）及びｒｂＧＨ２１にのサンプル（２１にサンプルＣ）が含まれる。第二 実験（１グループ当たりラット９匹）では、ｒｂＧ８２１にの２種類のサンプル （２１にサンプルＣ１２１にサンプルＤ）、ｒｂＧＨの１種類のサンプル＾及び 下垂体ｂＧＩＩ調製物を比較した（表６）、いずれの実験においても、組換えＧ Ｈ調製物を３種類の投与量（３０，１００，３００ｐｇ／Ｋｇ）でテストした。

第二実験においては、種々のＯｉｌ調製物の効能を、ｂｃ■２２にサンプル＾を 「標準」として１■／ｓｇの相対効能で算出した。

各ラットの個々の体重変化を回帰方程式（対数（投与量）と体重増加との間の投 与量相関関係）に代入し、１グループ当たりの各投与量での平均とした。　ｒｂ にＨ２１にサンプルＤについての曲線は２２にサンプル＾の曲線とは平行でなく 、サンプルＤがサンプル＾よりも強力であるのは明らかであり、テストした３種 類の投与量間の分散は大きい、２２にサンプルＣ及び２２にサンプルＤをより多 く投与すると２１にサンプル＾よりも成長が大きく、推定「当量」は、外挿する と２１にサンプル＾の曲線の端、部をはるかに越えて１６０〜２０ｈｇ／日の投 与量に達し、この点では前記曲線は低投与量の曲線とは線がつながらない、テス トした下垂体ＧＯの投与量は２１にサンプル＾の曲線の範囲内である。第二実験 おけるｒｂＧＨ２１にサンプル＾との単位当量を表５に示す、このデータは、下 垂体を切除したラットの体重増加モデルにおいてｒｂｌ：Ｈ２１には「未修飾」 ｒｂＧＨ２２に若しくは下垂体ｂｃｏより２〜４倍も強力であることを示す。

表６ ＢＹＰＯＸラット（体重増加） コントロール　−２，２３，８÷／−１，０下垂体ｂＧＢ　１０　ＮＴ’　１０ ．５＋／−１，３ｒＭ：ｆｌ　２１Ｋ（サンプルＢ）　３　６．５　ＮＴ１０　 ９．８　ＮＴ ３０　１５．１　ＮＴ ｒｂｃｌ　２１Ｋ（サンプル＾）　３　フ、４４．７＋／−０，６１０１１，１ ９，１÷／−１，６ ３０１７，３１４，６＋／−１，２ ｂにＨ１−３２，ｏ−１９１３１２，３９，２＋／−０，８ｒｂＧＨ２１Ｋ（サ ンプルＣ）　１０　１９．１　１６．０＋／−１，２３０２５，１２２，４＋／ −１，８ ｒｂにＨ２１Ｋ（サンプルＤ）　３　ＮＴ　７．４＋／−１，１１０ＮＴ　１３ ．５＋／−０，８ ３０ＮＴ　２１．８＋／−１，２ 表７ 成長ホルモン グループｒ−ｂＧＨ２１Ｋ（サンプル＾）との単位当量１Ｚｚｋ　ｊ　ｌ直１ ｒｂＧＨ２１に（サンプル＾）　１．０３±０．０２　３ｒｂＧＨ２１Ｋ（サン プルＣ）　４．６２±０．９９　３ｒｂＧｔ１２１Ｋ（サンプルＤ）　３．３４ ±１．１５　３下垂体ｂｌ；Ｈ１，２３１ （以下余白） 大ＪＪＬＺ ｂｌ：ＢＩ−３１ｓ４＠−１１１類似体を幼年期のギンザケ（吐牲セｎｅｈｕｇ 　Ｋｉｎ％Ｉｔｃｂ）に注射すると、投与量が成長速度の増加に著しく依存する （Ｇｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏ１ｏ■劃、６４３−６４６（ １９８５））、　ｂＣＬ−ｓｘ、−０−１，、類似体をｂＧＩＩ＋−＋ｓ＋と比 較するために以下の実験を実施した。

ｔｈｅ　Ｃａｐｉｌａｎｏ　Ｓａｌｍｏｎ　Ｈａｔｃｈｅｒｙ、Ｂｒ１ｔｉｓｈ 　Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダから得られた小形のギンザケ（各々約３グラム）を ２００リツトルのガラス繊維タンク毎に６０匹ずつ１２０グループにランダムに 分配した。ガラス繊維タンクには空気を含む噴出流水を与えた。天然光周期をシ ミュレートした屋内にサケを保持した。水温は実験を通して１０〜１１℃とした 。

魚には乾燥飼料（Ｎｅｓｔ　Ｖａｎ　３３．水分含有量８〜９％）を１日に２回 充足するまで与えた。飼料の粒径は最大成長速度を得るために魚の平均体重に合 わせた。

ホルモン投与を開始する前に１４日間、魚をこの状態に順応させた。２週間に１ 回２−フェノキシエタノール（１０，０００のうち１）中で魚に麻酔をし、体重 を０．０１ｇまで体長を０．１ｃｍまで測定し、５０ｕ１で体重１ｇ当たり０． ２若しくは２■のいずれかに等しい投与量を含有するように、０．６５パーセン ト（替／ｖ）ＮａＣ１、１パーセント（ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンの緩衝液中 のｂｃＨＩ−１ｍ＋若しくはｂｃＨＩ−３ｘ１゜−８９，類似体を腹腔内に注射 した。各週毎にホルモンの投与量を再計算して成長させた。

第一コントロールグループの個体にはＭｆｌｆ液を注射し、第二コントロールグ ループの個体には注射しなかった。この結果を平均値で示す０分散の不均衡一方 向分析（ｕｎｂａｌａｎｃｅｄ　ｏｎｅ−ｗａｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｖ ａｒｉａｎｃｅ）（ＢＭＤＰ統計パッケージ）によって結果を分析し、次いでＢ ｏｎｆｅｒｒｏｎｉの相乗範囲検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ｔｅｓｔ ）によって処置の危険率を確定した。

第１図及び第２図に示すように、ｂｃＨＩ−３ｚ１゜−１，１類似体を用いて処 置した魚はｂＧＩＩ＋−＋ｓ＋を用いて処置した魚と比較すると成長に優勢を示 した。この差はＰ＜、０００１で統計的に有効である。

Ｋ１且１ ６頭の雌ヒツジを対にし、各処置期間中３種類の調製物（ｏｂＧＢ、ｒｂＧｆｌ ＋−＋＊＋及びｒｂ’Ｂｌ−！２＋４０−１１１類似体）の各々を異なる対に使 用した。各処置期間には１日１回試験物質（１日に体重１ｋｇ当たり０．２Ｂ； ＩＢ／ｍ１ラクトース、マンニトール、重炭酸緩衝液、ｐＨ８，５〜９．０）を 皮下注射するが、各々８日間の処置期間と処置期間との間１０日間には雌ヒツジ に緩衝液のみの同様の注射を実施した。

全ての雌ヒツジの産出量が減少し始めた泌乳の３２〜４０日の間に処置を開始す ると、各々連続的なコントロール期間中には産出量は減少し続けた。実験を通し て飼料取り込みを一定に維持するように、雌ヒツジには制限量の濃縮物と刻んだ 干し草とを１日に２回与えた。ただ１頭の雌ヒツジ（番号５５３）のみがいかな る場合にもその濃縮物の支給量を消化できなかった。

８日間の処置期間中ウシ成長ホルモンの種々の調製物を毎日注射してからの６頭 のドーセット雌ヒツジの毎日のミルク産出量における応答を表９に示す。

表９では、応答は、ｂＧＨ注射の最後の４日間の平均ミルク産出量から処置開始 直前の４日間の平均ミルク産出量を差し引いたものを追加ミルクの重量（ｇ）及 び増加パーセンテージで表しである。

通常、産出量応答は、前記実施例の結果及び泌乳の開始時に２頭の予備雌ヒツジ に実施した予備投与応答調査を基にして予期したよりも高かった。比較的に高い 投与量（体重１ｋｇ当たり０．２ｍｇ）を選択すると、はとんどの場合で産出量 が著しく増加した。統計的分析は、（ｉ）泌乳の間ミルク産出量が減少するので コントール基準線の変化に相対した応答を測定する；及び（ｉ）動物の外因性成 長ホルモンに対する応答性が泌乳が進むときに増加することから困難である。

８日間の注射ではミルク産出量が高原状態に達するには十分でなかった場合もあ ったことは明らかであり、高原状態に達した場合には、処理を続けても産出量が 更に増加したか知る方法はない、各処置期間の前及び最後の４日間の平均産出量 を単純に比較すると、主に組換え物質が与えられたときの個々の動物の応答の一 貫性がより高いことから、使用した下垂体ｂＧＨ調製物に対してｒｂＧｔｌ＋− ３ｚ’＋ｎｏ−＋＊＋及びｒｂＣＬ−＋ｓ＋の応答がかろうじて優勢であると言 える。（表５参照）。

ＭＩＧＥＮ襞品１“０キ゛ンデケつへ表イ足唾ＪＬＬ２５　ＡＵＧｉ　１ＵＧ２ ２　５ＥＰ５　Ｅ’Ｗ付 ＡＭ　ｃ４ＥＡ／＠：Ｙａ−ｔ−ｖｖ−ｓ−ｒ＃１ｙ’ｊｉ＆イヌ！透しＪＬＬ ２５　ＡＵＧＥＩ　ＡＵＧ２２　５ＥＰ５　５ＥＰ１９　０ＣＴ３　０ＣＴ１７ ０ムＴＥ −ｔ’ｏ銘をし） ｐｃＦＭ４１４　ｂ０４２１１ 国際調査報告 Ｍｌｍｌ““−’ＰＣＴ／υ５８８１００６９１

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列 Ｚ−ｂＧＨ１−３２−（Ｘ）ｎ−ｂＧＨ４０−１９１［式中、ｎは０若しくは１ であり、 Ｚは水素若しくはメチオニンであり、 Ｘは、 ーＧＬＵ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−（ここで、１つ 以上のアミノ酸が欠失している）から成るアミノ酸残基のペプチドである］を含 有するウシ成長ホルモン類似体及びその対立遺伝子異形体。
2. ２．ｎが０である請求項１に記載のウシ成長ホルモン類似体。
3. ３．ｎが１であり、Ｘが 【配列があります】 である請求項１に記載のウシ成長ホルモン類似体。
4. ４．式 Ｚ−ｂＧＨ１−３２−（Ｘ）ｎ−ｂｇｈ４０−１９１［式中、ｎは０若しくは１ であり、 Ｚは水素若しくはメチオニンであり、 Ｘは、 −ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＣＬＵ−（ここで、１つ 以上のアミノ酸が欠失している）から成るアミノ酸残基のペプチドである］によ って表されるウシ成長ホルモン及びその対立遺伝子異形体をコードする配列を含 有するＤＨＡ配列。
5. ５．請求項４に記載のＤＮＡ配列を発現することができる、トランスフェクトさ れた全ての培養液中の発現ビヒクル。
6. ６．請求項５に記載の発現ビヒクルを用いてトランスフェクトされる細胞培養物 。
7. ７．Ｅ・ｃｏｌｉ株をトランスフェクトすることによって得られる請求項６に記 載の微生物。
8. ８．アミノ酸配列 Ｚ−ｂＧＨ１−３２−（Ｘ）ｎ−ｂＧＨ４０−１９１［式中、ｎは０若しくは１ であり、 Ｚは水素若しくはメチオニンであり、 Ｘは、 −ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＴＹＲ−ＩＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−（ここで、１つ 以上のアミノ酸が欠失している）から成るアミノ酸残基のペプチドである］によ って表されるウシ成長ホルモン類似体及びその対立遺伝子異形体を含有し且つウ シ由来のその他のタンパク質を実質的に含有しない組成物。
9. ９．請求項１に記載のウシ成長ホルモン類似体を有効量で動物に投与することか ら成る、動物における成長を促進する方法。
10. １０．請求項１に記載のウシ成長ホルモン類似体を有効量で動物に投与すること から成る、動物におけるミルク産出を促進する方法。