JPH01502659A

JPH01502659A - Ｔ−４レセプターへの結合を阻害し免疫原として作用する小ペプチド類

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Publication number: JPH01502659A
Application number: JP62503520A
Authority: JP
Inventors: パート，キャンデース　ビー; ラフ，マイクル　アール; ファーラー，ウィリアム　エル
Original assignee: United States Department of Commerce
Current assignee: United States Department of Commerce
Priority date: 1986-06-03
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1989-09-14
Anticipated expiration: 2012-11-19
Also published as: FI94352C; DE3787927D1; IE871388L; DE3787927T2; MX172337B; JP2680011B2; NO880479L; IE61725B1; FI885630A0; WO1987007613A1; NO176022C; NO880479D0; PT84992B; PT84992A; ES2061497T3; IL82719A0; DK53288D0; NO176022B; KR930008448B1; NZ220485A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔ−４レセプターへの結合を阻害し免疫原として作用する小ペプチド類発明の詳細な説明本発明は細胞表面上のレセプター部位を阻止して、ヒトＴ細胞のウィルス感染性を予防することによりヒト細胞に結合するＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ　（以下ＨＩＶと称する）を阻害する合成的に製造された類ペプチド配列に関する。これらのペプチドは感染性を防止すると共に、又ＨＩＶウィルスのエンベロープタンパク質に対する抗体産生も誘発する。従って、これらのペプチド類はまた後天性免疫病症候群（ＡＩＤＳ）の発生を予防するためのワクチンとしての用途も有する。これらのペプチド類に対するモノクローナル抗体は、またＨＩＶウィルスを確認するための診断剤として用いることも可能である。従って、これらのペプチド及びこれらのペプチドに対する抗体はＨＩＶ保有者或いはＡＩＤＳを患うヒトの確認のための試験キットの製造における用途も有する。

発明の背景ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）ウィルスの完全なヌクレオチド配列は焼入かの研究者により報告されている〔リー・ラトナー等（Ｌｅｅ　Ｒａｔｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ３１３．２７７頁、１９８５年１月；ミニージング等（Ｎｕｅｓｌｎｇ、ｅｔ　ｍｌ、）Ｎａｔｕｒｅ３１３．４５０頁、１９８５年２月；及びウェインーハブソン（Ｖａｉｎ−Ｈａｂｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、）　％　Ｃｅ１１４０．９〜１７頁、１９８５年１月参照）。エンベロープ遺伝子は特に抗原性及び感染性と関連付けられてきた。しかしながら、エンベロープ部分はまた高度に拡散性である領域を有することも知られている。ＨＩＶウィルスエンベロープ糖タンパク質はヒト、ラット、及びサルの脳膜及び免疫系の細胞に共有的に結合することが示されてきた。

ウィルスが細胞膜レセプター上の高度に特異的部位における付着により細胞及び組織親和性を及ぼすことがあるという理解は研究者が細胞膜のウィルスレセプター部位に結合する試剤を探索してこれらの細胞への特定のウィルスの結合を予防することを勇気付けた。合成ペプチド類により阻止される特別のレセプター−媒介ワクチニアウィルス感染性は従来示されている〔ニブスティン等（Ｅｐｓｔｅｉｎ、ｅｔ　ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ３１８．６６３〜６６７頁）〕ＨＩＭウィルスは１９２８球及びマクロファージを含むＨＩＶ感染にかかりやすい各種細胞上に存在するＣＤ４或いはＴ４領域として知られている表面細胞に結合することが示されている（ＨＴＬＶ−Ｈの親和性（ｔｒｏｐｉｓ■）の議論についてショー等（Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ、）、５ｅ１ｅｎｃｅ２２６．１１６５−１１７１頁、参照〕。

免疫不全から生ずる徴候に加えて、ＡＩＤＳを有する患者は神経心理学的欠陥を示す。中枢神経及び免疫系は多くの神経タンパク質−媒介細胞間連絡のためのレセプターとして働く多くの特異的細胞表面認識分子を有する。

これらの神経タンパク質類及びそれらのレセプターは単細胞生物並びに高等動物において極めて不変の形態で十分に保存されている十分な進化的安定性を示す。

更に、中枢神経及び免疫系はＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）の結合のためのレセプターとして働く共通のＤＣ４（Ｔ４）細胞表面認識分子を示す。同一の高度に保存された神経タンパク質情報物質はＨＩＶのそれと顕著に類似したレセプターを介して免疫及び脳機能を一体化するので、我々はＨＩＶ糖タンパクｊｔｇｐ１２０と、従来エプスタイン−バーウィルスのエンベロープ領域から別の関連において確認されていた環ペプチドの間の極めて類似のアミノ酸配列がウィルスレセプター結合に必須の核ペプチドを示すのではないかと仮定した。その様なペプチドはレセプター細胞と結合し、ＨＩＶｇｐ１２０の結合を阻止することによりＨＩＶによる細胞の感染を予防するのに有用であり、その様なレセプター部位に結合するペプチドはそのペプチド配列に向けられた抗体の産生を生じ、又これらのペプチド類がＡＩＤＳの予防のための免疫学的基礎を与えるのに用いられるであろうと仮定された。

目　的本発明の目的はＨＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）の脳膜及び免疫系の細胞のレセプター部位への結合を予防することによりＡＩＤＳの徴候を緩和する作用を行うペプチド類を提供することである。

本発明の目的又はＨＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）に曝されるかもしれないヒトにおけるＡＩＤＳの発生に対して保護する抗体を生ずるために用いられるワクチン用のペプチド類を提供することである。

更に、本発明の目的はＨＩＶ或いはＨＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体の存在を確認する診断手段を提供することである。

発明の詳細な説明ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）におけるオクタペプチドがコンビニー夕の助けを借りた分析により確認された。高スレオニン含量により「ペプチドＴ」と称されるこのペプチドはｇｐ１２０の脳膜への結合を阻害することが示された。このペプチドはＡｌａ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ− Ｔｙｒ−Ｔｈｒの配列を有する。後の分析は同様な結合特性を有する関連ペンタペプチド類の群を開示した。

本発明の第一の側面に従えば、下記一般式（１）で表わされるベブチド：Ｒ−９ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｒｂ　（１）（式中、Ｒはアミノ末端残基Ａ１ｇ或いはＤ−Ａｌ　ａを表わし、及びＲｂはカルボキシ末端残基−Ｔｈｒ或いは−Ｔｈｒアミド或いはそのアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両方における追加のＣｙｓ−残基との誘導体を表わす）、或いは下記一般式（ｎ）で表わされるペプチド：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５（Ｉｆ）（式中、Ｒ１はアミノ末端残基Ｔｈｒ−１Ｓｅｒ−１Ａｓｎ−１Ｇｌｕ −１Ａｒｇ％Ｉｌｅ或いはＬｅｕ−であり、Ｒ２はＴｈｒ、Ｓｅｒ或いはＡｓｐであり、Ｒ３はＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇｓ　Ｇｉｎ。

Ｌｙｓ或いはＴｒｐであり、Ｒ４はＴｙｒであり、及び好ましくはＲ５はカルボキシ末端残基−Ｔｈｒ、Ａｒｇ或いは−Ｇｌｙ或いはそのアミノ末端残基としての対応するＤ−アミノ酸、及び／又はカルボキシ末端残基における対応するアミド誘導体及び／又は更にアミノ酸カルボキシ末端の一方或いは両方におけるＣｙｓ−残基との誘導体である）が提供される。Ｒ５における好ましいアミノ酸が示されたが、この位置におけるアミノ酸特表平１−５０２　ｂ　Ｌ）９　（４）は広範に変ることが知られている。事実、Ｒ５が存在しない場合には、このペプチドをカルボキシ末端アミノ酸としてＲ４（チロシン）でこのペプチドの末端を形成することが可能である。その様なペプチド類は萩に教えられる基の結合特性を保持する。セリン及びスレオニンは蔵に教えられる生物学的性質の目的で交換可能であるように思われる。本発明の活性化合物はこれらのペプチド類の生理学的に許容可能な塩として存在してよい。

このペプチド類はＴ４ウィルスレセプターに結合することが判明した。

最も好ましいペプチド類並びに上記ペプチドＴは下記一般式（１）のオクタペプチド類：Ｄ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ及びＤ −Ａｌａ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−アミド、及び下記一般式（Ｉｒ）で表わされるペンタペプチド類：Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＴｈｒ−Ｔｈｒ− Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ。

及びアミノ末端残基としてのＤ−Ｔｈｒ及び／又はカルボキシ末端におけるアミド誘導体とのそれらの類似体である。

本発明の化合物は分子の血液−脳障壁の通過を高めることが知られている方法により有益に変成される。このペプチドの結合活性を高めるためにアセチル化が特に有用であることが判明した。末端アミノ及びカルボキシ部位が特に好ましい変成部位である。

このペプチド類は又拘束立体配座において変成されて、改良された安定性及び経口利用可能性を与える。

以下、次の略号を用いるニアミノ酸　三文字記号　−文字記号アルギニン　ａｒｇ　Ｒアスパラギン　ａｓｎ　Ｎアスパラギン酸　ａｓｐ　Ｄシスティン　ｃｙｓ　Ｃグリシン　ｇｕｙ　Ｇセ　リ　ン　ｓｅｒ　Ｓスレオニン　ｔｈｒ　Ｔチロシン　ｔｙｒ　Ｙ特に断りのない限り、示されるアミノ酸は勿論Ｌ−ステレオアイソマーの天然形態にある。

１２個のペンタペプチド類のアミノ酸配列の比較を表１に示す。歴史的には我々の初期のコンピュータ探索はペプチドＴ　（ＡＲＶ単離体に含有）が関連部分であることを示したが、追加のウィルス配列が利用可能となるにつれて関連する生活性配列は各目的にペプチドＴ（４−８〕、或いは配列ＴＴＮＹＴを含んでなるより短いペンタペプチドではないかということが明らかとなった。これらの単離体において、我々は比較を行い（表１）、実質的な類似性がこのより短い領域にのみ認められた。変化の大部分は二つの密接に関連したアミノ酸、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）の相互転換である。ペプチドＴの７位のチロシンはこれらの造成物の不変の特徴であり、それが生活性を担うものであることを示している。

５位における置換はＴ、Ｇ、Ｒ或いはＳを含む。４及び６位は先ず、（一つの例外をもって）Ｓ、Ｔ及びＮに制限され、全てのアミノ酸は極めて類似の立体特性を有する未荷電極性基を含有する。五つの各種ＡＩＤＳウィルス単離体（９，１０）の中の一般的配列一致の評価はペプチドＴの周り及びそれを含む領域は極めて可変性の領域であることを示す。その様な可変性はこの位置に規定される機能の強い選択的多様化による分化を示す。麻酔薬（ｏｐｉａｔｅ）ペプチド類と同様に、これらのペプチドＴ類似物はｍｅｔ及びｌｅｕエンケファリンを想起させる多数形態で存在するように思われる。これらの各種ＡＩＤＳウィルス単離体に表わされるこれらのペンタペプチド類は生物学的に活性であり、従来Ｔヘルパー細胞の表面「マーカ」として良く知られていたＣＤ４レセプターの作用薬として相互作用することができる。

表１．多数ＡＩＤＳウィルス単離体からのＥＮＶの配ペプチドＴ　ＡＳＴＴＴＮＹＴ　Ｐｅｒｔ、Ｃ，Ｂ、、ｅｔ　ａｌ。

ＰＮＡＳ　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）ＩＡＲＶ（１９５−１９９）　ＴＴＮＹＴ　Ｖｌｌｌｅｙ、Ｒ，Ｌ、、ｅｔＬＡＶ　ＴＴＳＹＲａｌ、　ＰＮＡＳ　Ｉ１８．ｐ。

２３　５ＳＴＹＲ５０３ｇ、１Ｈ６ＮＹ５　ＮＴＳＹＴＢＩＯ（ＨＴＬＶ−ｍ）　ＴＴＳＹＴ　５ｔａｒｃｌｃｈ、Ｂ、Ｒ，、ｅｔＷＭＪ−Ｉ　５ＳＴＹＲａｌ、ｃｅｌｌ　４５．１）−ＨＡ　Ｔ　−３Ｎ　Ｔ　Ｓ　Ｙ　Ｇ　６３７．１９８６配列単離体　ＳＴＮＹＲＷＭＪ−Ｉ　５ＳＴＹＲＨａｈｎ、Ｂ、Ｌ、、ｅｔａｌ。

ＷＭＪ−２５ＳＲＹＲ５ｃｉｅｎｃｅ　２３２゜ＷＭＪ−３５ＳＴＹＲｐ、１５４８．１９８６ＴＳＹＳ１　番号はＡＲＶｅｎｖ配列（９）内のアミノ酸の相対位置を指す。

７個のアミノ酸ペプチドＣＹＳ−ＴＨＲ−ＴＨＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＴＨＲ−ＣＹＳも又活性である。核へのシスティン類の添加は活性に悪影響を及ぼさない。

これらのペプチド類はＰｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓにより本発明者等と製造者間の秘密合意の下に注文合成された。

固相ペプチド合成のＭｅｒｒｌｒｉｅｌｄ法が用いられた（本発明において準用する米国特許第３，５３１．２５８号明細書参照）。これらの合成されたペプチド類は特に好ましい。ペプチドＴ及びその一部であるペンタペプチドはウィルスから単離することが可能であったが、Ｍｅｒｒｌｒｉｅｌｄに従って調製されたペプチド類はウィルス及び細胞残片がない。従って、合成ペプチド類が用いられる場合には汚染物質に対する厄介な反応が起こらない。

本発明のペプチド類はペプチド合成の常法により製造される。固相及び液相方法の両方が用いられる。我々はＭｅｒｒｉｆｌｅｌｄの固相方法が特に便利であることを見出した。

この方法において、ペプチドは鎖のカルボキシ末端が不溶性支持体に共有的に結合されながら段階的に合成される。中間合成段階に際し、ペプチドは固相に残るので、従って操作が便利である。固体支持体はクロロメチル化スチレン−ジビニルベンゼン共重合体である。

カルボキシ末端アミノ酸のＮ−保護形態、例えばｔ−ブトキシ力力水ボニル保護Ｂｏｃ−）アミノ酸をクロロメチル化スチレンジビニルベンゼン共重合体のクロロメチル残基と反応させて、アミノ酸がベンジルエステルの樹脂に結合した樹脂の保護アミノアシル誘導体を生成する。これを脱保護し、次の必要なアミノ酸の保護形態と反応させて樹脂に結合した保護ジペプチドを生成する。

このアミノ酸は一般的に活性化形態、例えばカルボジイミド或いは活性エステルを使用して用いられる。この配列を繰返すと必要なペプチドが樹脂上に組立てられるまでペプチド鎖が必要なＮ−保護アミノ酸とアミノ末端で縮合することにより一度に一つの残基を成長させる。このペプチド−樹脂を次いで無水フッ化水素酸で処理して必要なペプチドを放出させるために組立てペプチドを樹脂に結合するエステルを切断する。合成操作中に、保護されなければならないアミノ酸の側鎖官能基も又同時に除去される。そのカルボキシ末端にアミド基を有するペプチドの合成は、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いて、常法により行うことができる。

本発明の化合物は、細胞のレセプター部位を有効に阻止し、及びサル、ラット及びヒト脳膜及び免疫系の細胞におけるＨＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）による細胞感染性を予防することが判明した。

従って、本発明の一側面として、我々は、ヒト或いは獣医学用に適した薬学的に許容可能な担体或いは賦形剤と組合わされた本発明のペプチド化合物を含んでなる薬学的組成物を提供する。その様な組成物は１種以上の生理学的に許容可能な担体或いは賦形剤と混合して、常法にて使用するように提供される。これらの組成物は必要に応じて異なった抗ウィルス剤であってよい１種以上のその他の治療剤を任意に含んで良い。

即ち、本発明のペプチド類は経口、口腔内、非経口、局所或いは直腸投与用に配合されてよい。

特に、本発明によるペプチド類は注射或いは注入用に配合されてよく、又、防腐剤を添加してアンプル内における単位投与形態或いは多投与容器内において提供されてよい。これらの組成物は、油性或いは水性稀釈液内の懸濁液、溶液或いはエマルジョンなどの形態をとって良く、又、懸濁、安定化及び／又は分散剤などの配合剤を含有してよい。或いは又、この活性成分は使用前に適当な稀釈剤、例えば無菌、発熱物質のない水で戻されるような粉末形態であってよい。

本発明に従う薬学的組成物は又抗微生物剤酸いは防腐剤などのその他の活性成分も含んで良い。

これらの組成物は０．００１〜９９％の活性物質を含有することができる。

本発明は更に本発明のペプチドを薬学的に許容可能な賦形剤或いは担体と合体することを特徴とする薬学的組成物の製造方法を提供する。

注射或いは注入による投与のために、約７０ｋｇ体重の大人の治療に用いられる毎日の投与量は、例えば、投与経路及び患者の状態に応じて、１〜４回の投与で投与される。

親和定数は、モルヒネのそれらと同様であると仮定された。この親和性に基づき、毎日、＋　３３−．０００３ｍｇ／ｋｇの投与量が示唆された。これは有効であることが判明した。１０〜１０−１１モル血液濃度が示唆される。サルにおいては、毎日３ｍｇ／ｋｇが１５０×１０−９Ｍの血清濃度を達成する。この濃度は１０−”Ｍの濃度を達成するのに必要なものより１５倍大きい。霊長類は通常ヒトに用いられる投与量の１０倍を必要とする。

本発明の更にもう一つの側面は、ＡＩＤＳウィルスによる感染に対して保護を与えるための、本発明のペプチドを含有するワクチン調剤に関する。このワクチンは任意に適当な稀釈液、例えば無菌水、塩水或いは緩衝化塩水中のヒト血清アルブミンなどのタンパク質に複合化された有効な免疫原的量、例えば宿主のｋｇ当り１Ｍｇ〜２０ｍｇのペプチドを含有する。水酸化アルミニウムゲルなどのアジ；バントが用いられてよい。投与は、例えば筋肉内、腹腔内、皮下或いは静脈内などの注射によって行われる。投与は、１回或いは、例えば１〜４週間間隔で複数回行われる。

カニからの抗原配列並びにその他の無を推動物からのタンパク質も又、抗原性を促進するために、本発明のペプチド類に添加することができる。

本発明の更にもう一つの側面は、抗原源としての本発明のペプチド或いは本発明のペプチドにより顕在化されたモノクローナル抗体を含有するＡＩＤＳウィルス及びＡＩＤＳウィルスに対する抗体の検出のための試験キットに関する。例えば、本発明のペプチドはＡＩＤＳ感染を検出するため、及びそれを酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）或いは酵素イムノドツトアッセイにおいて試験試薬として用いることにより、ＡＩＤＳ及び前−ＡＩＤＳ状態を診断するための試験キットに用いられる。その様な試験キットは抗原性ペプチド或いはモノクローナル抗体が予備吸着或いは共有的に結合された不溶性の多孔性表面或いは固体基体（その様な表面或いは基体は好ましくはマイクロタイタープレート或いはウェルの形態が好ましい）、試験血清、表面或いは支持体に吸着された抗原或いは抗体に特異的に結合し飽和するペテロ抗血清、各種稀釈液及び緩衝液、特異的に結合した抗体を検出するための標識化複合体（ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｃｏ−ｎｊｕｇａｔｅ）及びその他の酵素基質、コファクター及びクロモゲンなどのシグナル発生試薬を含むものである。

本発明によるペプチドは、通常の技術を用いてＡＩＤＳウィルスのエンベロープ配列Φ関連部分に特異的に結合するモノクローナル抗体を顕在化する免疫原として用いられ、その様なモノクローナル抗体は更に本発明の特徴を形成するものである。

ＨＩＶのＨＴＬＶ−ｍｂをＨ９細胞内で増殖サセ、ｇｐ１２０をイムノアフィニティクロマトグラフィ及び調製ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥにより単離した。精製ｇｐ１２０をクロラミン−Ｔ法により１２５！で標識化した。

新鮮なヒト、サル及びラット海鳥を１００容の水冷却５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，４）中で迅速にホモジナイズした（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、Ｂｒｌｎｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　ｏ遠心分離（１５，０００Ｘｇ）により集めた膜を元の緩衝液容量中で洗浄し、そのまま用いるか或いは一７０℃に貯蔵した。使用前に、脳膜及び高度に精製したＴ細胞（ｒｅｆ、１６；Ｌａｒｒｙ　Ｗａｈｌの贈物）をリン酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）中において１５〜３０分間ブレインキュベートした。２０ｍｇ　（初期湿潤重量）の脳（α１００μｇのタンパク質）から得られた膜を２８，０００ｃｐｍの１２５Ｉｇｐ１２０と共に０．１％のウシ血清アルブミン及びペプチダーゼ阻害剤バシトラシン（０，００５％）アプロチニン（０，００５％）、ロイペプチン（０，００１％）、及びキモスタチン（０，００１％）を含有する２００１　（最終容量）の５０ｍＭＨｅｐｅｓ内で３７℃において１時間インキュベートした。インキュベート物を迅速に真空枦遇し、計数してレセプター−結合物質をめた。

免疫沈澱。免疫沈澱は０．５％　Ｔｒｌｔｏｎ　Ｘ　−１００／ＰＢＳ可溶化、ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ／ｌ−ヨード化脳膜或いは完全Ｔ細胞を示されたｍＡｂと反応当り１０μｇでインキュベージジン（４℃で一晩）することにより調製した。固相免疫吸着剤（イムノビ７ズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて免疫複合体を沈澱させてからそれらをＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥにより分割した。対照インキュベージジンは一次ｍＡｂ或いはサブクラス対照ｍＡｂ　（ＯＫＴ８）を含有していなかった。

化学約神経解剖及びコンビニータ補助濃度測定。新鮮−凍結ヒト、サル及びラット脳のクリオスタットー切断２５μｍ断片をゼラチン被覆スライド上に解凍−搭載し、乾燥させ、レセプターを説明されているようにして可視化した（１８）。

Ｔ４、Ｔ４Ａ、Ｔ８、及びＴｌｌに対する抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に或いは無しに、ＲＰＭＩ培地中でインキュベージジンを０℃で一晩行い、それらの抗原に架橋させ、及び１２５Ｉ−標識化ヤギ抗−マウス抗体で可視化した。抗原−レセプターをｔ２５Ｉ−ｇｐ１２０で標識化するためのスライド−搭載組織断片のインキュベージジンを未標識化ｇｐ１２０或いはｍＡｂ　０ＫＴ４　（１０ｕｇ／ｍｌ）　（ＯｒｔｈｏＤｌａｇｎｏｓ−ｚｌｃｓ）と共に（１ＭＭ）或いは無しに５ｍｌｍｌスライド中にて行った。

Ｔ−リンパ球サブセットの分離。Ｔ細胞のサブセットをｐｅｒｃｏ＋　１密度精製末梢血液Ｔ細胞を特定のモノクローナル抗体（７４或いはＴ８）で１０μｇ／ｍｌにて処理することにより得た。これらの処理細胞を次いでヤギ（Ｆ　（ａｂ ’　）２）抗−マウス免疫グロブリンＣ３ｅｒ。

Ｌａｂ、Ｅａｓｔｂｕｒｙ、メリーランド州）で被覆されたプラスチックベトリ皿上で４℃で３０分間パン処理した（２１）。

非付着細胞を次いで除去し、洗浄し、フローシトメトリー　（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｓｅｔｒｙ）により反応性を分析した。分離されたＴ４及びＴ８細胞集団は他のＴ細胞サブセットのく５％の汚染を有する。細胞を次いでファイトへマグルチニン（１μｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養し、下記の如きＨＩＶに曝露した。細胞毒性アッセイが行われた際に感染細胞を表現型的に特性化した。

ウィルス感染。感染に用いられたＨＴＬＶ−ｍウィルスは新鮮なＡＩＤＳ患者物質から確立され、許容可能なＩＬ−２−非依存性細胞系統であるＨｕＴ７８中に継代したインターロイキン２（ＩＬ−２）　−依存性培養Ｔ−細胞系統から単離された。

図面の簡単な説明第１Ａ図は１２５１−ｇｐ１２０の脳膜及びＴ細胞への架橋を示す、（ａ）　Ｉ −ｇｐ１２０のみ：（ｂ）サル；（Ｃ）ラット＝（ｄ）ヒトの脳；及び（ｅ）ヒトのＴ細胞。

第１Ｂ図及びＩＣ図は、それぞれ１２５１−標識化サル脳膜及びヒトＴ細胞の免疫沈澱を示す；　（ｆ、ｉ）−次抗体のない対照例；　（ｇ、ｊ）ＯＫＴ４　Ｍａｂ　；　（ｈ。

ｋ）ＯＫＴ８　Ｍａｂ。

第２Ａ図は新鮮なラット海馬膜への特異的１２５ｘ−ｇｐ１２０結合の転位を示す。各測定は三重に行われた。

その一つの実験の結果が示されている。この実験は３回行なわれ同様な結果かえられた。１０Ｉｇ／ｍｌの０ＫＴ４及び４Ａにより転位可能な特異的結合は示される実験においては２２０１±７４ｃｐｍであった全結合の２７〜８５％の範囲にあった。

第２Ｂ図はウィルス感染性がペプチドＴ及びその合成類似体により阻止されることを示す。各測定は二重に行われた。結果は同様な結果をもって３回繰返された単一の実験を表わす。

例　１゜約１８０Ｋｄの単一放射標識化架橋生成物を１２５１−ｇｐ１２０をヒトＴ細胞のそれとは識別不可能なリスザル、ラット或いはヒト脳膜からの膜に特異的結合させた後に得た（第１Ａ図）。この結果はｇｐ１２０は約６０Ｋｄのタンパク質にカップリングさせることができ、未反応１２５１−ｇｐ１２０は膜のない対照例に隣接しである（レーンａ）ことを示す。

放射ヨード標識ヒト脳膜の０ＫＴ４及び０ＫＴ８（１０Ｉｇ／ｍｌ）による免疫沈澱（第１Ｂ図）は脳膜がヒトＴリンパ球上に確認されるそれと識別不可能な約６０ＫｄのＴ４抗原を含有することを示しく第１Ｃ図）、これに対して０ＫＴ８は脳膜（第１Ｂ図）中に存在しないＴリンパ球（第１Ｃ図）からの低（約３０Ｋｄ）分子量タンパク質を免疫沈澱させ、脳Ｔ４が存在リンパ球に由来するものでないことを示している。サル及びラット（示されず）の海馬膜についても同様な結果が観察される。これらの結果はＴ４抗原がウィルスレセプターとして働き、免疫及び中枢神経系により共有される高度に保存された６０Ｋｄ分子であることを示す。

エプスタイン−バー及びＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶが殆んど同一のオクタペプチド配列を共有するという認識が「ペプチドＴ」の合成及び研究を引起こした。第２図は新たに調製したラット脳膜への１２５１−ｇｐ１２０の結合の高い（０，１ｎＭ範囲）親和性及び飽和性（第２Ａ図）を示す。特異性（第２Ｂ図）は０ＫＴ４及び０ＫＴ４Ａによる阻止によって示され、０ＫＴ３　（０，１μｇ／ｍｌ）では示されない。ペプチドＴ及び二つのその合成類似体（しかし、無関連なオクタペプチド物質Ｐ（１−８〕ではない）は０．１ｎＭ範囲において１２５Ｉ−ｇｐ１２０結合を有意に阻止した（第２Ｃ図）。８位におけるＤ−スレオニン−アミドの置換の結果、少なくとも°１００倍のレセプター結合活性の損失を生じた。

〔Ｌ−Ａｌａ）の古典的［Ｄ−Ａｌａ］置換の結果、ペプチドＴよりも首尾一貫してより強力なおそらくより耐ペプチダーゼ性の類似体が得られ、Ｃ末端スレオニンのアミド化も又首尾一貫して幾分より大きい強度をもたらす（第３図）。

合成ペプチドのヒトＴ細胞ウィルス感染を阻止する能力を試験した際に、実験者は結合アッセイ結果に対して盲目にされた。１０−７において結合アッセイにおいて活性な３個のペプチドが検出可能なレベルの逆転写酵素活性を殆んど９倍減少させることができる。より活性の低い結合転位体（Ｄ−Ｔｈｒｅ）　−ペプチドＴは同様に極めて減少したウィルス感染の阻止を示し、有意な阻害を達成するためには、１００倍より高い濃度を必要とした。

この様に、これらの四つのペプチドの強度のランク順序（Ｄ　−（Ａ　１　ａ）　１−ペプチドニーアミド＞Ｄ−（Ａ　１　ａ　）　１−ペプチドＴ〉ペプチドＴ＞Ｄ　−（Ｔｈｒｅ）８−ペプチドニーアミド）のみならず、又それらのレセプター結合及びウィルス感染性を阻害する際の絶対的濃度も又密接に関連している（第３図）。

例　２゜ヒトＴ細胞Ｔ４抗原に同一でないにせよ同様である約６０Ｋｄのタンパク質は、ヒトの脳から調製された膜上に明らかに保存された分子形態で存在した。更に、放射標識化ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（”２５Ｉ−ｇｐ１２０）はその大きさ及び免疫沈澱の性質がＴ４抗原とは識別不可能である三つの哺乳動物の脳内に存在する分子に共有的に架橋するとかできる。脳スライス上の抗体結合レセプターを可視化する方法を用いて皮質神経網に亘って最も高密度であり、全ての三つの哺乳動物脳において同様に組織されている脳Ｔ４の神経解剖分布パターンを提供した。又、放射標識化ＨＩＶウィルスエンベロープ糖タンパク質は隣接脳断片上に同一パターンで結合され、再びＴ４がＨＩＶレセプターであることを示唆した。

Ｎ３゜化学的神経解剖、コンピューター補助密度分析。新たに凍結したヒト、サル及びラット脳のクリオスタットー切断２５ミクロン断片をゲル被覆スライド上に解凍搭載し、乾燥させ、及びレセプターをヘルケンハム及びパート（Ｈｅｒｋｅｎｈａｍ　ａｎｄ　Ｐｅｒｔ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｌ、＋　２．１１２９−１１４９頁１９８２年）により説明されているように可視化した。Ｔ４、Ｔ４Ａ、Ｔ８及びＴ１１に対する抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて或いは無しにインキュベージジンをＲＰ　Ｍ　Ｉ中で０℃で一晩行い、これらの抗原に架橋させ１２５１−ヤギ抗マウス抗体で可視化した。抗原／レセプターを１２５１ｇ＋＞１２０で標識化するために、スライド搭載組織断片のインキュベージジンを、膜について上記した如＜、５ｍｌｍｌスライド中で未標識化ｇｐ１２０或いはＭａ　ｂ　０ＫＴ４Ａ　（１０ｕ　ｇ／ｍ　１　）　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｌａｇｎｏｓｔｌｃｓ）を用いて或いは用いずに行った。

オートラジオグラフィフィルム不透明度の定量的色画像へのコンピューター補助転換を行つた。サルの脳断片についての標準的公知増加量の放射能の共曝露はそれから相対的放射能濃度を意味深く外挿することのできるｌｏｇ　Ｏ，Ｄ、対ｃｐｍの線形プロット（４−＞、９９）を生成した。チオニンによる脳断片の細胞染色゛は古典的方法及び染色組織上に重なるレセプターの可視化により行った。

例　４゜リスザルの脳の吻側乃至尾方系列即ち冠状断片上のＴ４抗原の分布をめるために実験が行われた。

これらの実験は脳幹の細胞構築的に意味のある領域（例、黒質）に結合する検出可能なレベルのＴ４モノクローナル抗体があることを示すが、しかし、神経軸のいずれのレベルにおいても皮質富化の顕著なパターンが明らかである。０ＫＴ４と同一のサブクラスからの１９２８球に向けられたモノクローナル抗体である０ＫＴ８は観察可能なパターンを示さない。一般的に、脳皮質内部のより外面上の層は最も高密度のＴ４抗原濃度を有し、小脳偏頭に重なる前頭及び周縁皮質は深層の至る所において特にレセプターに富んでいる。海鳥形成はサル、ラット及びヒトの脳において最も高密度のレセプター濃度を有する。写真エマルジョンに浸漬したリスザル断片の暗視野顕微鏡写真は最も高密度のレセプター標識化のバンドが歯状回及び海鳥本体の分子層（極めて少ないニニーロンを含む）内に位置していることを示した。この様に、レセプターは神経網（樹状突起及び軸索のニニーロンの延長）上に正しく分布されているように思われ、或いは未染負犬ダリア細胞の特定のサブセットに局在化しているかもしれない。

化学的神経細胞の特異性及びＴ４及びウィルスエンベロープ認識分子が識別不能であることを示す結果の証拠がめられた。ラット脳の冠状断片は視覚化に０ＫＴ４或いは１２５１−ｇｐ１２０のいずれが用いられてもレセプター分布の極めて類似の皮質／海馬−濃厚パターンを示した。更に、このパターンはインキュベージジンが未標識化ｇｐ１２０（１ｕＭ）　、０ＫＴ４Ａ　（１０μｇ／ｍｌ）或いは０ＫＴ４　（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で行われた場合には明らかでなかった。０ＫＴ８及び０ＫＴ１１を含むその他のヒトＴ細胞表面抗原に対するその他のマウスＭａｂは二次抗体単独では再現可能な、検出可能な抗原／レセプターが無かったと正に同様に１２５゜ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体により視覚化した際にラット脳上に検出可能なパターンを与えなかった。

Ａ　Ｃａｂｃｄｅ、ｆｇｆｉ　１゜ＦＩＧ、　１％　ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮ　０ＦＳＰＥＣＩＦＩＣ１２町−９９１２０ＢＩＮＤＩＮＧＮ）− ロ　Ｑ　８　８０’１％　ｆＮＨＩＢＩＴＩＯＮ　ＯＦ　ＶＩＲＡＬ　ＩＮＦＥＣＴＩＶＩＴＹ。

（Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ）国際調査報告ｗ齢―崗ｊａ帥−一−ｗ＠ＰｃＴ／ＵＳ８７１０１２７０

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記一般式で表わされるペプチド類：Ｒａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｒｂ（Ｉ）（式中、Ｒａはアミノ末端残基Ａｌａ或いはＤ−Ａｌａを表わし、及びＲｂほカルボキシ末端残基−Ｔｈｒ或いは−Ｔｈｒアミド或いはそのアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両方における追加のＣｙｓ−残基との誘導体を表わす）、或いは下記一般式（ＩＩ）で表わされるペプチド：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５（ＩＩ）（式中、Ｒ１はアミノ末端残基Ｔｈｒ−、Ｓｅｒ−、Ａｓｎ−、Ｌｅｕ−、Ｉｌｅ−、Ａｒｇ−、或いはＧｌｕ−であり、Ｒ２はＴｈｒ、Ｓｅｒ或いはＡｓＰであり、Ｒ３はＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ或いはＴｒｐであり、Ｒ４はＴｙｒであり、及びＲ５はカルボキシ末端アミノ基或いはそのアミノ末端残基としての対応するＤ−アミノ酸及び／又はカルボキシ末端残基における対応するアミド誘導体及び／又は更にアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両者におけるＣｙｓ−残基との誘導体である）、或いはその生理学的に許容可能な塩。
２．下記一般式で表わされるペプチド：Ｒａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ −Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｒｂ（Ｉ）（式中、Ｒａはアミノ末端残基Ａｌｓ或いはＤ−Ａｌａを表わし、及びＲｂはカルボキシ末端残基−Ｔｈｒ或いは−Ｔｈｒアミド或いはそのアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両方における追加のＣｙｓ−残基との誘導体を表わす）、或いは下記一般式（ＩＩ）で表わされるペプチド：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５（ＩＩ）（式中、Ｒ１はアミノ末端残基Ａｌａ−或いはＤ−Ａ１８を表わし、及びＲｂは−Ｔｈｒ或いは−Ｔｈｒアミド或いはアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両方における追加のＣｙｓ−残基との誘導体を表わす）或いは下記一般式（ＩＩ）で表わされるペプチド：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５（ＩＩ）（式中、Ｒ１はアミノ末端残基Ｔｈｒ−、Ｓｅｒ−或いはＡｓｎであり、Ｒ２はＴｈｒ、Ｓｅｒ或いはＡｓｐであり、Ｒ３はＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、或いはＡｒｇであり、Ｒ４はＴｙｒであり、及びＲ５はカルボキシ末端残基−Ｔｈｒ、Ａｒｇ或いは−Ｇｌｙ或いはそのアミノ末端残基としての対応するＤ−アミノ酸、及び／又はカルボキシ末端残基における対応するアミド誘導体及び／又は更にアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両方におけるＣｙｓ−残基との誘導体である）或いはその生理学的に許容可能な塩。
３．下記一般式（Ｉ）で表わされるペプチド：Ｒａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｒｂ（Ｉ）（式中、Ｒａはアミノ末端残基Ａｌａ−或いはＤ−Ａｌａを表わし、及びＲｂはカルボキシ末端残基−Ｔｈｒ或いは−Ｔｈｒアミド或いはそのアミノ及びカルボキシ末端における一方或いは両方における追加のＣｙｓ−残基との誘導体を表わす）或いは下記一般式（ＩＩ）で表わされるペプチド：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−（ＩＩ）（式中、Ｒ１はＴｈｒ−、Ｓｅｒ−、Ａｓｎ−、Ｇｌｕ−、Ａｒｇ−、Ｉｌｅ− 、或いはＬｅｕ−のアミノ末端残基であり、Ｒ２はＴｈｒ、Ｓｅｒ或いはＡｓＰであり、Ｒ３はＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ或いはＴｒｐであり、Ｒ４はカルボキシ末端−Ｔｙｒ或いはその誘導体である）。
４．下記一般式で表わされる請求項１に記載のペプチド：Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｘ（式中、Ｘはシステインを表わす）。
５．【配列があります】及び、【配列があります】の中から選ばれたペプチド。
６．薬学的担体中に請求項１の少なくとも１種のペプチドを有効成分として含有する組成物。
７．薬学的担体中に請求項２の少なくとも１種のペプチドを有効成分として含有する組成物。
８．薬学的担体中に請求項３の少なくとも１種のペプチドを有効成分として含有する組成物。
９．薬学的担体中に請求項４の少なくとも１種のペプチドを有効成分として含有する組成物。
１０．薬学的担体中に請求項５の少なくとも１種のペプチドを有効成分として含有する組成物。
１１．有効なＴ４レセプター阻止量の請求項６の組成物を投与することを特徴とする哺乳動物の細胞への抗原の結合の防止方法。
１２．抗原がウイルスである請求項１１に記載の方法。
１３．ウイルスがＡＩＤＳの病原体である請求項１２に記載の方法。
１４．有効なＴ４レセプター阻止量の請求項７の組成物を投与することを特徴とする哺乳動物の細胞へのウイルスの結合の防止方法。
１５．有効なＴ４レセプター阻止量の請求項８の組成物を投与することを特徴とする哺乳動物の細胞へのウイルスの結合の防止方法。
１６．有効なＴ４レセプター阻止量の請求項９の組成物を投与することを特徴とする哺乳動物の細胞へのウイルスの結合の防止方法。
１７．有効なＴ４レセプター阻止量の請求項１０の組成物を投与することを特徴とする哺乳動物の細胞へのウイルスの結合の防止方法。
１８．タンパク質に複合した請求項１のペプチドを含んでなる組成物。
１９．タンパク質がヒト血清アルブミンである請求項１８に記載の組成物。
２０．免疫原的に有効量の請求項６の組成物を投与することを特徴とするＡＩＤＳの予防方法。
２１．免疫原的に有効量の請求項１８の組成物を投与することを特徴とするＡｌＤＳの予防方法。
２２．多孔性表面或いは固体基体に結合した請求項１の抗原ペプチドを含有するＴ４レセプターに結合する抗原に対する抗体を検出するための試験キット。
２３．抗原ペプチドがマイクロタイタープレートのウエルに結合している請求項２２に記載のキット。
２４．請求項１の少なくとも２種以上のペプチドを有効成分として含有する組成物。
２５．免疫原的に有効量の請求項６に記載の組成物を投与することを特徴とするＴ４レセプターに結合するウイルスから生ずる病気の予防方法。
２６．免疫原的に有効量の請求項２４の組成物を１〜４週間隔てて与えられる一連の２〜４回の投与量で投与することを特徴とするＴ４レセプターに結合するウイルスから生ずる病気の予防方法。