JPH01503565A - 中和／免疫阻害アッセイ方法および試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■■ １、□ 相対濃度が異常な生理学的状態を示し得る診断に適切なイソ酵素の活性の比較的 に不完全な免疫阻害に基づく、優れた中和アッセイ；および、この優れたアッセ イを行うための試験キットに関するものである。このアッセイはゑ、性心筋梗塞 症をわずらう患者の正確な確認を助けるために生物流体におけるＣＭ−ＭＢの測 定に特別の用途を有する。

２、又皿二ど亙 種々の生理学的プロセスにおける酵素およびその役割の研究により、これ等の複 雑な蛋白質と外傷および／または病状に関連する異状な身体の機能との間の相互 関係が一層完全に理解されるようになった０例えば、生物流体試料に見出される 主たるタレアチンキナーゼは骨格筋（ＣＫ−？ＬＭ）　。

平滑筋（ＣＭ−？ＩＢ）　、および脳（ＣＭ−ＢＢ）に見出される特定の組織に 関連していることが知られている。障害がこれらの組織の一つ以上に起きる場合 には、血液のタレアチンキナーゼ（ＣＫ）のレベルは外傷を受けた組織に最も優 勢であるイソ酵素あため高められる０人が心臓発作（ｉｔ］ちゑ、性心筋梗塞症 ）をわずらう場合には、血液レベルは発作の開始に伴ってＣＫ−ＭＢイソ酵素の 増加をもたらし；　ＣＫ−１１Ｂ量の最大の増加は一般に苦しみを最初に受けた 後１０〜１２時闇であるようである。

特許および技術文献がＣＫイソ酵素活性の種々の測定法に向けられる文献ととも に十分にある。これ等の文献を顧みる前に用語の簡単な解説が適当であり同時に 一層完全な理解とこの分野に適切な文献の論議の助けになる。

ここで「中和」なる用語は、以下口ｎ床アッセイに関連して、２つの別個の部分 ：抗血清と標的酵素が急速に相互に作用し、これにより酵素活性をほぼ欠いた免 疫複合体を形成する第１部分および、凝集後酵素の残存する活性が漸次減する第 ２部分を有する免疫アッセイを特徴づけるために使用される。〔シナダー（Ｃｉ ｎａｄｅｒ）　＋　アン、シブ。ミクロパイオル、　（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　１１＋　３７１〜３９０　（１９５７）。〕ここで「凝 集反応」なる用語は、以下臨床アッセイに関連して、抗原粒子が１．０００〜２ ，０００　ｒｐｔａでの遠心作用により沈澱させられるに十分大であり（５００ 〜１，０００　ｇ）　、従って、この抗原に対し特定の抗血清と接触させた場合 、この結果凝集物の形態である免疫複合体が生成される免疫阻害アッセイを特徴 づけるために使用される。〔カバット（Ｋａｂａｔ）およびメイヤーズ（Ｍａｙ ｅｒｓ）　＋　エクスペリメンタル・イミュノケミスト、リー、チャス、トマス 　バブル、　（Ｃｈａｓ。

Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌ、）＋スプリングフィールド、４９２４．９０５頁（１ ９６７）　、　） ここで「免疫滴定」なる用語は、以下ｎ床アッセイに関連して、免疫阻害アッセ イを特徴づけるために用いられるもので、抗血清の標的酵素との相互作用が酵素 に不活性の沈澱を形成する。〔シンク（Ｓｅｈｉｎｋｅ）　＋　メソッズ・イン ・エンチモロジイ、第４０巻、第２４１〜２５１頁（１９７５）。〕ここで「免 疫沈澱」なる用語は、臨床アッセイに関連して、免疫阻害アッセイを特徴づける ために使用するもので、抗血清の標的酵素との相互作用が沈澱を形成し次いでこ の沈澱を遠心作用により分離しその蛋白質含量を分析する。

〔シンク、メソソズ・インチモロシイ、第４０巻、第２４１〜２５１頁（１９７ ５）。〕 抗血清と酵素との相互作用に関する技術文献は殆んど４０年さかのぼるもので； 比較的早い文献の一つはセバッグ（Ｓｅｖａｇ）による免疫触媒作用および抗酵 素抗体に対する講評、イミュノキャタリシス、第２版、シー、トマス・コンパニ ー、スプリングフィールド、Ｉし、第５４７頁である。酵素の免疫阻害における 関心は、１９５０年代初年代上び中期に促進され、若干の文献および講評が現わ れた。１９５５年のシナグーによる講評には種々の酵素／抗酵素抗体の性質が記 載されている、プル、ツク、ヒム、パイオル、（Ｂｕｌｌ、　Ｓｏｃ。

Ｃｈｉｎａ、　Ｂｉｏｌ、）、　３７　（７〜８）、　７６１〜７８１　（１９ ５５）。シナグーはこの分野における先んじた研究を十分に講評し詳細に述べ、 抗体／酵素中和相互作用に対するモデルを提案した。

シナグーによる第２の講評には抗体／酵素相互作用における更に最近の進歩につ いて記載され議論されている、アン、シブ。ミクロパイオル、（Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ８Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．）　１１＋３７１〜３９０　（１９５７）。このシナ グーの文献は、生物学および免疫学の調査における道具として抗体／酵素相互作 用を含む研究、およびかかる酵素レベルの損失または変化および／または活性と 特定の病状との相互関係を詳細に講評している。

１９６０年代の初期において、２つの論文が現われこれ等はクレアチンキナーゼ の免疫阻害に関するものである、サミュＸル：）、、バイオフィズ（Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、）ジエ−，１，４３７（１９６１）。

およびアーチ、バイオケ、・アンド・バイオフィズ（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｂ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　９２．４９７　（１９６１）　、 サミュエルスは基質をクレアチンキナーゼ酵素を含有する試料に添加することが 、他の酵素／抗体系と異なり、抗体による酵素の免疫阻害を妨げないという観察 を報告した。またサミュエルスは免疫は害がキナーゼ酵素における構造の変化を 起すことおよびかかる構造の変化は基質および酵素が相互作用する結果生ずるも のと異なることを報告した。［アン、エヌワイ、アカド・サイ（Ａｎｎ、　ＮＹ 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、）第１０３巻、８８９〜９６３頁（１９６３）。〕 ワッツ等は１９６２年にクレアチンキナーゼが異なるが、関連した、酵素の一連 のものまたは補体として存在することを最初に認、知したと思われること（即ち イソ酵素）を報告した、ワッツ等、バイオケミ（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋１．）、ジエ イ、　８２．４１２（１９６２）。ワッツ等による発見は、３つの異なるＬＤＨ イソ酵素（心臓、肝臓および筋肉の組織内におこるものとして）の免疫化学的区 別を含む、ＬＤＨの研究に関する進展と平行した、カーノ（Ｃａｈｎ）　＋　サ イエンス１３６．９６２〜９６９　（１９６２）。

カーノによる研究は種々のＬＤ）ｌイソ酵素の遠心処理後の免疫阻害を含んだ。

第３の講評はシナグーが１９６３年に発表したものでこれは専ら抗酵素抗体に向 けられた、シナダー、イントロダクション・フォアＡｎｎ、　ＮＹ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、、第１０３巻、　４９５〜５４８頁（１９６３）。シナグーはこの 論題に関する１００種以上の文献につき論議している。シナグーの講評文献は特 に一つの酵素の多分子形態の論題および現在入手し得る免疫阻害技術はこれ等の 酵素の分化および定量のいずれにも有意な役割をどのようにして可能的に演じ得 るかを扱った。シナダー講評文献はクレアチンキナーゼが免疫阻害に関する一般 的シーンに対する例外であることを記載しその免疫化学挙動を提案された４次分 モデル系に対し比較した。シナグーはまた中和評価が混合物中のイソ酵素の測定 に対して慣例の沈澱を基とする方法より一層正確であることを記載した。

１９６４年に、３つの異なる形のクレアチンキナーゼ酵素成分、ＣＭ−問、　Ｃ Ｋ−ＭＢおよびＣＭ−ＢＢが同定された、デュエルおよびパンブリーマン、アブ スト、フェト、オブ・ヨーロブ。

バイオケ、ソック、　（Ａｂｓｔ、　Ｆｅｄ、　ｏｆ　Ｅｕｒｏｐ、　Ｂｉｏｃ ｈ、　Ｓｏｃ、）＋第５２頁（１９６４）　；　クリン、ケム、アクタ（ＣＩｉ ｎ、　Ｃｈｉ＋ｎ、　Ａｃｔａ）１９、２７６　（１９６４）　；および、バー ガー、エイ等、バイオケム。

ゼット（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　Ｚ、）　３３９．３０５　（１９６４）　、　１ ９６５年に、タウリンはこれ等の３種のイソ酵素の関係および差異を夫々のおよ び夫々の結合体の単量体単位を用いて始めて説明した。

タウリンは他の２つの文献；第１のものは１９６７年に出版し〕タウリンおよび ファイン、アーク、二二一ロル、　（Ａｒｃｈ。

Ｎｅｕｒｏｌ、）　１６：　１７５〜１８０　（１９６７））　；第２のものは １９６８年に出版した〔タウリン等Ａｎｎ、　ＮＹ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋’ 　１５５＋　６１６〜６２６　（１９６８））文献によりこの主題の彼の解説を 続けた。同じ年に、バークオフはＣＫ−ＭＢ　ｙＦ：急性心筋梗塞症と関係させ た、パークオフ、アン、インターン、メト、　（Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｍｅｄ、）　１２２．３２６　（１９６８）。

増大したＣＭ−ＭＢ活性の評価の臨床的有効性はゑ、性心筋梗塞症の表示として 十分に認められるようになった、ウィルキンソン、ジェ′−、タリン、ケム、　 Ｕ、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、）　１６（９）、　７７３〜７３９　（１９７０ ）、ゑ、性心筋梗塞症の表示として、ＣＪ−ＭＢアッセイの予報値は２人の個々 の研究者により１９７３年に確かめられた、ワグナ−等、サーキュレーシヨン４ ７．２６３（１９７３）　；および、コンチノー、プル、メト、ジェー、　（Ｂ ｒ。

Ｍｅｄ、　Ｊ、）　１．３８６　（１９７３）。

（Ｊ−ＭＢを決定するための診断アッセイの特許出願が１９７０年の初期および 中期に出願され始め、最終的に米国特許第３、９３２．２２１号（外国優先権、 　１９７１年６月９日）；および、第４．０６７、７７５号（外国優先権＋　１ ９７５年１１月３日）として特許された。

米　奔；　７３，９３２，２２１　［プライダーラー（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ） 　：１には診断に通切なイソ酵素の残存活性の決定の診断方法が記載されている 。プライダーラーによると、特定の基質に対して、診断に適切なイソ酵素の全酵 素活性を最初に診断に適切なイソ酵素を含有する試料で決定し、然る後試料をイ ソ酵素に対し特定の抗血清と接触させる。抗血清と診断に適切なイソ酵素の免疫 化学相互作用は沈澱を形成しこの沈澱を次いで試料から分離し廃棄する０次いで 試料の残存する酵素活性を同じ基質に対して測定しこの残存活性を最初に測定し たような試料に対する全酵素活性と比較する。

最初の全酵素活性と残存活性との間の差は診断に適切なイソ酵素に貢献すると考 えられる。試料から沈澱する免疫複合体の分離はプライプーラ−法に必要であり 、これは抗血清と診断に適切なイソ酵素との間に形成される免疫複合体、がその 最初の酵素活性の少くとも若干を保持するという彼の関心による。また使用され る抗血清は、極めて有効で、即ち診断に適切な酵素の少くとも９０％、好ましく は９５〜１００％を沈澱することがプライダーラーの方法の必要条件である。恐 らく、彼の抗血清と診断ムこ、適切なイソ酵素との間で形成された免疫複合体が 酵素に不活性である場合には、分離は必要でない。

゛　奔−４，０６７７７５”　（ウルッパーグ等）にはＩＪ−聞とＣＫ−ＭＢイ ソ酵素のＭサブユニットの免疫阻害に独特の抗血清を使用することを含むＣＭ− ＭＢの測定に対する優れた方法が記載されている。プライダーラーのものと同様 に、抗血清は比較的高い結合活性を有し、従って、診断に適切なイソ酵素のほぼ 完全な阻害が可能で（かかる免疫阻害後５Ｕ／Ｌ以下の残存活性が維持される） ；シかじ、プライダーラーの場合と異なり、抗血清とイソ酵素との相互作用は酵 素のこの中和に効果的であり沈澱する免疫複合体の形成を伴うことがない。従っ て、診断に適切なイソ酵素（この場合ＣＭ−？ｌＢのＢサブユニット）の残存す る活性を免疫複合体の分離を行うことなく一回の測定で決定することができる。

急性心筋梗塞症（ＡＭＴ）の診断または排除の助けとして僅か一つの患者試料に ついて行った一回の測定に基づいて（Ｊ−？’ｌＢの診断調書の精度および価値 が最近問題にされた、ガーハード、ダブり二一９等、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ、 　２８／２＋　２７７〜２８３（１９８２）　ｉおよび、ウー、エイ、エッチ、 ビー、（Ｗｕ、’Ａ、　Ｈ。

Ｂ）等、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｎ、　２８／１０．２０１７〜２０２１　（１９ ’８２）　、これ等の各文献において、これ等の患者はＡＭＩの発生または非発 生の傾向として単−ＣＭ−ＭＢアンセイの信頼性を探究する。

各文献はゑ、性心筋梗塞により生したと考えられる患者の苦しみが始まった後多 数のアッセイが行われることを推挙した。代表的には、ＣＭ−？ｌＢのレベルを 決定するだめのアッセイを患者が病院へ入院した際行い、次いで第２（および恐 らく第３）のアッセイをその後１０〜１２時間間隔で行った。

一連のアッセイを推挙された時間に亘って行うことが、ＡＭＩの早期排除に対す る一層信頼し得る方法を与えると考えられる。

米国特許第４．０６７．７７５号の方法および抗体を利用する診断試験キットを 含む、現在の市販されている各診断試験キットにおいて、推挙した診断調書は各 試料の多酵素レベルの測定を意図し；第１の全酵素（キナーゼ）活性の測定およ び第２の、免疫阻害後の、残存酵素活性の測定を意図する。

先行技術の上記記載から明らかな如＜、ＣＫイソ酵素の選択的免疫阻害に含まれ る複雑性、およびかかるイソ酵素を含む試料の残存する活性の正確な測定は愚者 の苦しみが起ったｉＡＭＩ　Ｏ臨界的排除に絶対必要である。この仕事はＣＫ− ＭＢの検出に使用される試験キットの抗血清を生成するのに普通使用されている 形の非霊長類の蛋白質に対する抗体（抗山羊、抗うさぎ、抗マウス抗体）を含み 得る個々の患者の試料により更に複雑である。更に、かかる試薬に用いられる抗 血清の交差反応性（イソ酵素のＢサブユニットの免疫阻害）、はｂｎ界的に重要 な結果をゆがめる。

上記および関連する複雑性のため、ＣＭ−ＭＢレベルの測定に対するかかる試験 操作の信頼性が妥協され試薬の調製および方法は、不当に負担になる。これ等の 問題に関心をもつ人々により取られた従来の方向は、最良で、恐らく、唯一の利 用し得る道であったと認めたものによりかかるアッセイの信頼性を増大する（即 ちかかる試験キットに使用される抗血清の特異性、結合活性および／または感度 を増す）ことであった。抗血清の質の改善は若干のプラスの増進を提供したが、 著しい費用を伴うものであった。一般にこれ等の抗血清は高度に精製されアッセ イの操作窓はますます狭くなった。この結果比較的高価な試験を高度に熟練した オペレータおよび／または極めて高価な装置を用いて著しく制御した条件下で行 わなければならないことである。

！約一 本発明は、第１の目的として、レート　データ（ｒａｔｅ　ｄａｔａ）処理技術 と組合せて比較的不純な低品位抗血清を用いることにより診断に適切なイソ酵素 の免疫阻害アッセイの実施の複雑さおよび費用を低減することにある。従って、 本発明におけるレート　データ処理技術は、診断に適切なイソ酵素のレベルの正 確な測定の妨害をし得る、酵素の活性の比較的高いバックグラウンド　レベルの 補償をするだめの手段を提供する。

更に特に、本発明は複雑な生物流体において多数分子配置に生ずる酵素の診断に 適切なイソ酵素の測定方法を提供する。この方法は診断に適切なイソ酵素に対し 特定の比較的不純な、低結合活性の抗血清、多数測定技術および多数試料採取技 術並びにレート　データの計算の修正を、組合せて、利用するが、これ等のデー タは共通の基質に対して、診断に適切なイソ酵素および他の酵素に活性な試料成 分の残存する活性の測定から誘導される。本発明の好運例においては、この方法 に用いる抗血清は患者の試料の診断に適切なイソ酵素の最初の酵素活性の少くと も５０％で且つ約８５％までを免疫阻害することができる。この種の試験が有効 であるために、個々の試料の多数の評価が必要であり、同時に異なる試料につい て、患者の苦しみが開始してから１以上の定時間隔（即ち１０〜１２時間間隔） で、一定の時間に亘ってアッセイを繰返す如くして、行うことが必要である。

°゛　を１む本　の曾 本発明の方法および試験キットを更に論する前に、次の用語および成句を簡単に 定義することは本発明を理解するのに役立つであろう。

ここで「診断に適切なイソ酵素」とは代表的に臨床試料または試供品に見出され 、また異状な生理状態または存在する場合には異状なレベルの病状を表わすこと ができる酵素活性検体について記載せんとするものである。

ここで「多数分子配置」とは酵素活性化合物の物理的の、構造のおよび／または 化学的の特徴の一つ以上が異なる場合があるが、共通の基質と接触する場合はぼ 同様の方法で挙動する酵素活性化合物について記載せんとするものである。

ここで「残存酵素活性」とは診断に通切なイソ酵素の中和／免疫阻害に対して特 定の抗血清と試料の接触後に残存する試料中の酵素活性の程度を表わす。

本発明の一つの好週例においては、本発明の方法および試験キットを使用して患 者に苦しみが起った際工、性心筋梗塞（Ａ？ＩＩ）の発生を除くため臨床医師に 信頼される診断具を提供することができる。

本発明の方法の使用は、 （ａ）　中和／免疫阻害前に、診断に適切なイソ酵素の多数分子配置の全酵素活 性を最初に測定するだめの個々の試料の多数評価； （ｂ）　中和／免疫回置に続いて、イソ酵素の多数分子配置の残存酵素活性の測 定；および （ｃ）　苦しみの開始に続いて一定時間に亘り　（即ち１２時間および２４時間 間隔で）患者から採取した多数の試料の診断に適切なイソ酵素のレベルの測定 を行なう。

更に特に、患者を病院に入院させた際、患者の診断に適切なイソ酵素のレベルを 測定し、然る後第２のおよび恐らく第３の生物流体試料を患者から定時間隔で得 、これについて試験方法を繰返す。このようにして得た診断に適切なイソ酵素の 値を各試料につき比較し、臨床的に有意な差を記載する。

実際には、診断に適切なイソ酵素の測定は診断に適切なイソ酵素の多数分子配置 の全活性を最初に測定することを含む。然る後患者の試料をイソ酵素に対し抗血 清と一緒に最初のレベルの少くとも５０％の中和／免疫阻害を行なうに十分な時 間温間する。この温ｒｊＬ期間中生ずる免疫阻害反応により、所要に応じて、遠 心処理により試料から分離することができる免疫複合体が形成される。免疫複合 体はそれ自体酵素に不活性であるが、試料中にそれが存在することは診断に適切 なイソ酵素の多数分子配置の残存活性の決定を妨害しない。従ってかかるイソ酵 素の残存活性に対する試料の分析はこの免疫複合体の存在下で進めることができ る。診断に適切なイソ酵素の中和は、一般に試料中のその相対濃度およびイソ酵 素に対する抗血清の相対的結合活性により左右されるが、いずれにしても約３０ 秒乃至５分を必要とする。

中和に続いて、診断に適切なイソ酵素の多数分子配置に対し基質を、患者の試料 に添加し試料中に存在する酵素による基質の消耗のレートを動力学的に監視する 。レートデータを残存酵素活性の正確な反映を与えるのに十分な時間集める。一 般に診断に通切なイソ酵素の中和は試料と基質のこの接触期間中継続することは 注目すべきであるが；試料の残存酵素活性が著しくおそい速度で漸減し続けるこ とは注目すべきことである。試料の残存酵素活性を監視するこの期間中、試料の 最初の全酵素活性の少くとも約１５％が保持される。

本発明の方法で使用する抗血清は、メソッズ・イン・エンチモロジイ（デビッズ 等第１０巻第６９６〜６９９頁；リッチモンド、第４３巻、第８６〜１００頁、 　１９７３）に記載されているような、従来の方法により製造されるか、または ケンブリッジ・メディカル・ダイアグノスティックス、ビレリカ。

？す）ユセッツ；ディニスエル、ハウストン、テキサス；または、ビイ−エルフ リーズ、ロガース、アーカンサスの如き商業的供給源を介して得られる。

本発明の方法および試験キットは、次の診断に適切なイソ酵素の測定に使用する のに適する： 乳酸デヒドロゲナーゼ β−グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼキサンチンオキシダーゼ １−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ α−グルカンホスホリラーゼ ヘキソキナーゼ クレアチン−ＡＴＰホスホトランスフェラーゼＲＮＡポリメラーゼ ＲＮＡポリメラーゼ型■ 逆転写酵素（ＲＮＡ−依存性、　ＤＮＡポリメラーゼ）リパーゼ レシチナーゼ（ホスホリパーゼＡ） アルカリホスファターゼ ゛α−グリセロールホスファターゼ（グリセロール−１−ホスファターゼ） レシチナーゼ（ホスホリパーゼＣ） デオキシリボヌクレアーゼ ヌクレアーゼ 酸性α−グルコシダーゼ（ａ−ｂ−グルコシドグルコカルボキシ　ペプチダーゼ トロボミオシナーゼ ゲラチナーゼ ストレプトコカス　ペプチダーゼＡ ５′−アデニル酸デアミグーゼ アデノシントリホスファターゼ グルタミン酸デオキシラーゼ トリプトファンシンセターゼ ホスホグルコースイソメラーゼ ピルビン酸カルボキシラーゼ 本発明の方法に使用することができる基質は一般に種々の市場の供給源から入手 することができるかまたは従来の合成技術により容品に入手し得る物質から製造 することができる。上記各酵素に対する基質は標準の参考文献、例えば、メソッ ズ・イン・イミュノロジイ・アンド・イミュノケミストリイ、第■巻、アカデミ ツク・プレス（１９７７）第３１６〜３２０頁で確認される。

試料の残存酵素活性を監視する方法は自動臨床化学分析器で優先的に行われ、レ ート　データは分析器内で自動的に集められ処理される。最初試料は従来法で得 られ分析のために準備される。かかる準備は代表的に血清画分から全血試料の細 胞成分を分離し然る後血清画分を分析することを含む。若干の条件下でかかる分 析を行う前に試料を稀釈することが適当である場合がある。本発明の方法に従っ て診断に適切なイソ酵素に対し試料を分析する代表的方法においては、試料の全 酵素活性を診断に適切なイソ酵素の多数分子配置に対して測定する。診断に適切 なイソ酵素に対する比較的不純な低結合活性抗血清を次いで試料に添加し、抗血 清およびイソ酵素を診断に適切なイソ酵素の少くとも約５０％の活性が中和され るまで相互作用させる（温間する）。

この中和処理中、酵素に不活性の沈澱免疫複合体が形成される。この沈澱の存在 は本発明の方法を行う間試料中に許容される。この方法の最初のこの中和相に続 いて、診断に適切なイソ酵素に対する基質を試料に添加し試料の残存酵素活性を 記録する。

酵素活性の評価は基質の指示体への転換に基づき、この指示体の相対的濃度を動 力学的に監視する。本発明の方法に使用される基質はまた診断に適切なイソ酵素 の多数分子配置により攻撃されることは勿論理解される。従って基質の指示体へ の酵素転換に対するレート　データは有用な評価ではなく、更に改善することな くしては、診断に対する基礎として使用することができない。

本発明の詳細な説明を簡単にするために、この議論の残りはこの方法が著しく十 分に展開された模範システムとしてクレアチンキナーゼを取扱う。この方法を展 開するため選定した模範システムはＣＫ−ＭＢイソ酵素のレベルを測定すること に基づく。この測定に使用される分析調書は既に記載した通りである。試料中の 残存タレアチンキナーゼ活性の測定によりレート　データが得られるがこのデー タは更に改善することなくしては殆んど意味がなかった。このデータを改良する 若干の合理的再現性のある調和した方法で到達した過程において、中和／免疫阻 害環境下で、単一の修正因子は適当でないことを見出した。更に特に、方法に使 用される特定の抗血清に対する個々に取扱われた修正を実験的に決定することが 必要であり；動物により抗血清の変化および同じ動物の異なる血液からの抗血清 の異なることが個々に取扱われた修正因子の必要とされた実験的測定に十分に変 化を与えた。模範的系（ＯＫ−？ｌＢ）において、レート　データの処理はＣＭ −ＭＢ、　ＣＬＭ？ｌ、抗血清とＢサブユニットおよび他の妨害体との交差反応 性から残存酵素活性を算術的に除去することを含む。

国際的単位でＣＫ値を計算するための標準の式は興味あるＣに−ＭＢイソ酵素は 二量体であるので、標準の式はこの事実を反映するために修正する。分子の値に 単に適当な因子（ＩＣ＝　２　）を乗じてＣＫイソ酵素の特異な性質を反映させ る。従って、標準の式は次の如く書き直せる：各バッチの抗血清に対する結果の 断定できない変化のために、これ等の変化を更に補償し且つ分析データの信頬し 得る一貫した表示を発現させるために更なる修正が必要とされる０次式は異種の 系からのレート　データを解釈する能力を与えるもので抗血清はバッチ毎に結合 活性が変化し、更に、診断に適切なイソ酵素だけでなく、また他の若干の妨害体 からの有意なレベルの残存する酵素活性を許容し得る。

スー」Ｌ−皿 次め実施例は本発明の方法を更に明らかにし且つ説明する。この方法を実施する のに用いる装置および技術は標準的のもので前述の通りである。これ等の例にお ける部およびパーセントは、特記しない限り、重量によるものである。

ｆｉＪＬｌ 最初全血試料を角、性心筋梗塞症をわずらうと考えられた患者から得た。この試 料を自動臨床化学分析器、好ましくはアメリカ合衆国フロリダ州ハイアリアのク ールター・エレクトロニクス・コーポレーションから入手し得るＤＡＣＯＳ　＠ 化学分析器で分析するために調整した。かかる試料調整には代表的に細胞部分か ら血清を分離することが含まれる。

拭旦生二五 血清を直ちに分析しない場合には、蓋をした容器に入れ凍結する必要がある。明 るい光に瑠露することを回避する。

溶血試料は使用すべきでないが、僅かな溶血は許容し得る。

鎧に里ユ ＣＭ−？ｌＢイソ酵素に対するＤＡＣＯ５試験方法において、山羊の抗体を用い て？ＩＢイソ酵素のＭサブユニットおよび聞イソ酵素とにより助成される患者の 血清試料における活性を抑制する。残存する活性をＤＡＲＴ　ＣＫ試薬（修正し たオリバーーロサルキ法）（クールター・エレクトロニクス・コーポレーション から入手し得る）を用いて測定する。監視した活量がＣＭ−ＭＢのＢサブユニッ トにより助成されたのでＣＭ−ＭＢ活性を得ることが倍加する。血清試料中にＣ Ｍ−ＢＢが存在する場合には、高分子型のＣＫおよびミトコンドリアＣＫはこの 残存活性に貢献するが、これらの干渉体の任意のものの影響の頻度および大きさ は１％より小である。アデニル酸キナーゼからの干渉はＤＡＲＴ　ＣＭ（ＣＰＫ ）試薬中のアデノシン五リン酸およびＡ？ＩＰにより押さえられる。

ＤＡＲＴ＠　ｊ−バー　−ジ　六 抗ＣＫ−財山羊抗体　Ｉ　Ｘｏ、２４　ｖａｎトリスＨＣ４緩衝液　Ｉ　Ｘ１２ 　ｔａｎダート（Ｄａｒｔ）　ＣＭ試薬　２　ＸＩＯｐｉ詰３μ呂１袈 ５０μＥの抗体を取り２．４５　ｔｈｌのトリスＨＣ！緩衝液を添加することに より抗ＣＫＭＭの１：５０稀釈液をつくった。穏やかに混合した。この稀釈液は ５°Ｃで１０日間安定であった。

ＤＡＲＴ　（Ｈ（ＣＰＭ）試薬のガラス瓶を数回穏やかに軽くたたき容器の側部 から内容物をほぐした。ガラス瓶にＮＣＣＬＳ型■水の型棒水満足するかまたは これ以上である１０．Ｏｖｎｌｌの水を添加した。内容物が完全に溶解するまで 、泡立ちを回避するため穏やかに一方向にまた逆方向に渦巻き状に直ちに混合し た。試薬は７２時間安定であった。

ヱ…豆五亙■ 正常ＣＭ−ＭＢ活量：　０〜１６　ｔｌ／Ｌ　（正常範囲セクション参照）立梶 国国 １２００　Ｌｌルを越す全ＣＫ活量を有する血清試料を稀釈し再分析する必要が ある。

ＤＡＣＯ５分析器に関連するデータ管理ターミナルのレートデータ処理能力は試 料データをそのデータ　ベースの標準曲線と効果的に比較することができる。試 料の高残存酵素活性に対する補償は患者の試料における分析結果から最後のプリ ントに自動的に因子が加算される。Ｄ　Ａ、ＣＯＳ分析計においては、これは修 正因子（ＦＶＣＦ）をレート　データに適用することにより達成される。ＤＡＲ Ｔ　ＣＭ−１’ｌＢイソ酵素試験キツト（カタロ゛グ；＃７５４６８６２　）に 対する修正因子は抗血清ロッ）　９７２０００Ｍニ対しＴ１．３３ｔ’ある。

上記分析を１２時間および２４時間の間隔をとって他の患者試料について繰返し 、結果をＣＭ−ＭＢ活性の最初の測定値と比較する。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）異状レベルの適切なイソ酵素を含むと考えられる生物流体試料を上記 生物流体試料中の上記適切なイソ酵素の中和／免疫阻害に対し特有の抗血清と一 緒に温置し；（ｉｉ）上記血清と上記適切なイソ酵素との相互作用を上記イソ酵 素が酵素に不活性の免疫複合体を形成するまで行わせ；（ｉｉｉ）イソ酵素に特 有の基質を上記試料に上記基質を試料の残存する酵素活性を示す指示体に酵素転 化させるのを助成する条件下で添加し；（ｉｖ）指示体の存在に対して試料を監 視する工程を含む、生物流体試料中の、多数分子配置を有し且つ濃度が変化し得 る適切なイソ酵素の相対的濃度を測定する方法において、（ａ）中和／免疫阻害 条件下で温置する上記工程が適切なイソ酵素に対し特有の比較的不純な低結合活 性の抗血清を用いるもので； （ｂ）抗血清とイソ酵素の上記相互作用を生成した免疫複合体の形成速度がイソ 酵素特有の基質の添加前に平衡に近づくまで進め； （ｃ）上記監視が指示体を生成するためレートデータを誘導するに十分な期間に 亘って指示体の存在に対し試料の測定を多数画行なうこと含み： （ｄ）レートデータを処理してイソ酵素およびまた基質に対して特定される試料 の他の酵素に活性な成分に貢献する試料の残存酵素活性を修正し、上記レートデ ータ処理が上記レートデータに工程（ａ）で用いた抗血清に対して特に発現され た所定の修正因子を適用することを含み； （ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）を同じ試料源から得られた次の生物流体試料に対し、 規定した間隔で、繰返し、最初の試料の相対的酵素活性を次の試料のものと比較 することを特徴とする生物流体試料中の適切なイソ酵素の相対的濃度の測定方法 。
2. ２．イソ酵素の中和／免疫阻害が試料の内在する酵素活性を少くとも５０％乃至 約８５％低減することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．イソ酵素特有の基質を生成した免疫複合体の形成速度が平衡に近づいた後試 料に添加することを特徴とする請求項１記載の方法。
4. ４．基質を酵素により分割し、従来の監視技術により検出することができる発色 団若しくは発蛍光団を遊離することを特徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．最初の生物流体試料および次の生物流体試料のアッセイに使用する抗血清が 異なる動物からのものであるかまたは同じ動物からの異なる血液からのものであ ることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. ６．適切なイソ酵素がＣＫ−ＭＢであることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. ７．最初の試料のＣＸ−ＭＢの活性と次の試料のＣＫ−ＭＭ活性のレベルの測定 間の規定した間隔が約１２時間であることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. ８．抗血清による酵素の中和／免疫阻害が沈澱する免疫複合体を形成することを 特徴とする請求項６記載の方法。
9. ９．抗血清が非霊長類の給源から得られ生物流体試料が抗血清に対する抗体を含 むことを特徴とする請求項６記載の方法。
10. １０．抗血清がＣＫ−ＭＢのＢサブユニットの少くとも若干のものと交差反応す ることを特徴とする請求項６記載の方法。
11. １１．指示体のレベルの監視を自動臨床分析器で行い所定の修正因子を分析器の レートデータ処理論理によりレートデータに適用することを特徴とする請求項６ 記載の方法。
12. １２．多数分子配置を有する適切なイソ酵素を測定するための、上記適切なイソ 酵素とイソ酵素特有の基質のほぼすべての中和／免疫阻害に特有の高結合活性を 有する抗血清を含む試験キットにおいて、 （ａ）上記抗血清が適切なイソ酵素の少くとも５０％で約８５％までの中和／免 疫阻害を可能とする比較的不純な低結合活性の抗血清から成り； （ｂ）抗血清に対して特有のレートデータ修正因子を特徴とする試験キット。