JPH01503640A - 生物学的液体中に含有されている物質の機能および抗原濃度を定量的に測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的液体中に含有されている物質の機能および抗原濃度を定量的に測定する 方法 血液、尿、髄液等のような種々の液体中の生物学的に重要な物質の濃度は、常法 で２つの互いに完全に異なる方法により測定されるニー面で多種多様の免疫学的 方法により前記物質の濃度は測定され（抗原濃度）：このような方法は、ラジオ イムノアッセイ（Ｔｒａｖｉｓ、　Ｊ、Ｃ，、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｒａｄｉｏｉ ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　５ｔａｔｅ　ｏｒ　ｔｈｅＡｒｔ、Ｌｉｇａｎｄ　ａ ｓｓａｙ　Ｐｕ１ｉｓｈｅｒ、Ａｎａｈｅｉｍ　ＣＡ　１９８０）、酵素結合イ ムノソルベントアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ−ｉ＋ｏｍｕｎｏｓｏｒ ｂｅｎｔ−ａｓｓａｙ）（Ｎａｋａｍｕｒａ　、　Ｒ、Ｍ　、　、　Ｄ　ｉ　ｔ ｏ　、　Ｗ、Ｒ、、Ｔｕｃｋｅｒｍ　、Ｅ、Ｓ、、Ｉｍ＋ｎｕｎｏａｓｓａｙｓ 　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３巻、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　 Ｉｎｃ、、ニューヨーク１９７９；Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ、、Ｂｉｄｖｅｌｌ、Ｄ、 Ｅ、、Ｂａｒｌｅｔｔ、Ａ、、Ｔｈｅ　ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ　Ｉ＋ｍ＋ｏ ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ−ＥＬＩＳＡ、Ｔｈｅ　Ａｕｔｈｅｒｓ、１ ９７９、ロンドン；　Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｊ、Ｊ、、Ｖａｎ　’Ｖｕｎａｋｉｓ、 ）１．、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ａｏｌｏｇｙ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｐａｒｔ　Ｅ、１９８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ；さらに５ｃｈｕｕｒｓ他、米国特許第２９１６９号明細書および 同第４０１６０４３号明細書）またはイムネフエロメトリー（１＋＋＋ｍｕｎｎ ｅｐｂｅｌｏｍｅＬｒｉｅ）、放射免疫拡散法または別の適当な免疫沈降法のよ うな重要な方法（Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｒ，Ｍ、、Ｄｉｔｏ、Ｗ、Ｒ，、Ｔｕｅｋ ｅｒＩＩＩ　、Ｅ、Ｓ、、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ１１ｎ ｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　）Ｊｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３巻、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ 　Ｉｎｃ、、ニューヨーク１９７９；Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｊ、Ｊ、、Ｖａｎ　Ｖｕ ｎａｋｉｓ、Ｈ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ、］ｍｍｕｎｏｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　丁ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｐａｒｔ 　Ｂ、１９８１．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）を包含する。５！際に物質の 濃度は、免疫学的測定により検出することができるが、しかしこうして検出され た物質の機能について結果から原因を推論することは不可能である。すなわち、 種々の場合に標準の免疫学的に測定可能な濃度で前記物質の分子の機能は免疫学 的に測定した場合の機能に相当せずかつ屡々標準値よりも遥かに低いことが判明 した。このような分子は、一定の酵素的機能またはキャリヤーまたはコファクタ ー等としての機能を体液中で生じさせかつ一定の分子部分を変えることによって 機能が損なわれ体液中での一定の物質の濃度を測定する第２の方法は、前記物質 の機能を検出することである（　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、Ｈ，Ｕ、、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、第５巻、ヒエミー社（Ｃｈ ｅ＋＋＋ｉｅ）刊、１９８４）。この場合には、多くの場合に酵素反応で構成さ れかつ試験される物質の酵素活性を定める種々の系が使用される（Ｌｏｒａｎｄ 、Ｌ、　、ＰｒｏｔｅｏｌｙＬｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第４５巻、１９７６年、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ：＝ｓ ）。この場合には、特に適当な基質（例えば、酵素、二；って変換される高分子 量の天然基質、例えば酵素−コンビンに対するフィブリノゲン、プラスミンに対 ″′己基質としてのフィブリン、プラスミノゲンアクチベーターに対する基質と してのプラスミノゲン、カリ、″／インに対する基質としてのキニノゲン（Ｋｉ ｎｉｎｏｇｅｎ〕、またはそれぞれの酵素に対して特異的なペプチドで合を含有 しかつ分解により例えば墨色反応を開始さで５低分子量基質）および適当な測定 判断基準（この場合、活性酵素を形成させる場合には第１工程でそれぞ１生成さ れｔ；酵素が測定されるか、ないしは低分子１基質の場合には呈色された生成物 が測定されるか、或１１は例えば一定の物質に結合する能力のような基質の新た に生じたかまたは失われた性質が測定され：こＣ基質の新たに生じたかまｌ；は 失われｔ；性質には、結合蛋白質での活性のプラスミノゲンアクチベーター阻害 剤の結合が当てはまり、この場合このプラスミノゲンアクチベーター阻害剤を不 活性化する際にこの結合番士は失われ：さらに、前記測定法の他の例は、特異上 阻害剤、輸送蛋白質または別の結合蛋白質の結合でｂつ、この結合は相応して標 識化することができかつ＝７プリング反応によって検出することができる。）？ １択することによって一定の物質に対して比較的にてい特異性を維持することが できるが；しかじ、絶対碍異性を用いて測定値を記載することは、不可能である 。それというのも、通常多数の酵素または別の物質は、この多数の酵素または別 の物質での同一かまたは類似の反応を勿論異なる速度で触媒するからである０例 としては、例えばプラスミノゲンアクチペーターによるプラスミンへのプラスミ ノゲンの活性化の際に使用され、この場合少なくとも２つの主要なプラスミノゲ ンアクチベーターは、体液中に存在し、このプラスミノゲンアクチペーターは、 それぞれプラスミノダン中での同一の結合を分解し、それによって同盟のプラス ミンが形成される。従って、機能的測定法を用いた場合には、正確に定義された 物質の定量化を行なうことは不可能であり：多くの場合には、全体系中での機能 的欠陥を検出することができるにすぎない。

本発明によれば、２つの前記方法群とは異なり、−面で正確に定義された物質の 機能的活性を測定することができ、ならびにそれに続いて同じ試料から同一物質 の免疫学的濃度を測定することができる。ところで、本発明よる方法は、差当た り第１工程で試験物質を特異的に結合蛋白質（例えば、アイプリン、コアアクタ −１また脂質、レクチン）との相応する相互作用または特異的抗体、有利にはモ ノクロナール抗体との相応する相互作用により表面で固定し、ひいては１つの試 料から除去し、次いでこの場合に結合された物質を（例えば、低分子量プラスミ ン基質、低分子量基質自体、阻害剤に対して１制すべきアクチベーターを用いて の形成されたプラスミンのプラスミノゲン活性化および測定のように）−３Ｆす る適当な基質により機能について試験し、この−百合された物質を定量的に測定 し、その後に第２の特異的過程、例えば抗体まｔ；は結合蛋白質によって結合− ｌ；物質の全部の抗原濃度を測定する。

前記方法の利点は、２つの分野に存在するニー面で同一試料中で抗原濃！および 機能を試験することができ、他面機能的試験２こ際に特異的に結合した酵素まｔ ；は物質の機能のみをデ査し、全部の試料の機能的活性は検査しない。

更に、本発明は、三物学的液体中に含有されている物質が平板表面での信金によ ってポリクロナールまたはモノクロナールで、′）媒介下に固定されることにあ る発し、プラスミノゲンアクチベーターを固定し、第１工程でプラスミン形ズを 添加したプラスミノゲンによって測定し、第２二哩で結合したプラスミノゲンア クチベーターの免疫学面濃度をモノクロナール抗体によりペルオキシダーゼＪ識 化し、検出系として測定する最後に、本発明は、特異的結合蛋白質または別の物 質（この物質は、固定された試験抗原に特異的に結合している）を検出系として 使用することにある。これは、例えば天然もしくは合成阻害剤、天然もしくは合 成結合蛋白質、コファクターまたは脂質である。

制限されているものと理解すべきではない次の実施例により本発明方法の可能な 構成を詳説する。

実施例１：生物学的液体中での組織プラスミノゲンアクチベーターの機能および 抗原を測定するｔ；めの系。マイクロ−エリザ平板（Ｍｉｋｒｏ−Ｅｌｉｓａ− Ｐｌａｔｔｅｎ）を組織プラスミノゲンアクチベーターに対する精製モノクロナ ール抗体４０　ｐｇ／ｍＱ、　２０　ｉｔｇ／ｍＱ、１０．ｕｇ／ｍａまたは５ μｇ／ｍＱを含有する０、０３５モルの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６， １カツプあたり１００　、ｕ　Ｑ　（Ｍ　Ｐ　Ｗ　Ｉ　Ｖ　Ｐ　Ａ　）で４℃で １２時間処理する。その後に、この平板を３回トゥイーン（Ｔｖｅｅｎ）　２０ ０．５％を含有するＰＢＳ　ｌカップあｔ；す３００μｇで洗浄する。ポリスチ レン平板上の残存する結合個所を１％〜２５％の牛血清アルブミン、ＰＢＳ中の 溶液、１カツプあたり１００μＱを添加することによって室温で４時間飽和させ 、その上平板を前記の記載と同様にして新たに洗浄する。その上、この平板は、 空気乾燥するか、親液性化するか、または適当な方法で貯蔵することができる。

測定を実施するためには、１回の洗浄後に前記のようにｔＰＡを含有する、必要 に応じてＰＢＳで希釈した、牛血清アルブミン０．５％およびトウイーン（Ｔｉ ｅｓｎ）８０　０．１％を含有する溶液１００μ０が添加される。この平板を４ °Ｃで２時間貯蔵し、この場合時間および温度は、変動可能である。更に、この 平板を再び洗浄し、次いで適当なプラスミン基質、例えばＨ−Ｄ−Ｖａ　Ｉ−Ｌ ｅ　ｕ−Ｌｙ　５−ｐＮＡを天然基質（、ｌｕ−プラスミノゲンの０．６ミリモ ルの３つの異なる濃度（ｆｉ終的濃度７５０ナノモル、３７５ナノモルおよび１ ８７ナノモル）で含有する溶液１カツプあたり１００μａを添加し、フィブリノ ゲンのシアノプロミド断片を７５μｇ７ｍＱの濃度で添加する。その上、この平 板を３７℃で２時間、３時間または５時間暗中で恒温保持し、さらに吸光度を４ ０５％ｍで４９５％ｍの参照波長に対して測定し、この場合には、二波長分光光 度計、例えばダイナチック・マイクロエリザ・リーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍ ｙｃｒｏｅｌｉｓａ　Ｒｅａｄｅｒ）、が使用される。これにより、結合した組 織プラスミノゲンアクチベーターの機能は検査され、かつ定量化される。

更に、抗原を測定するためには、平板を前記の記載と同様にして洗浄し、かつペ ルオキシダーゼ標識化されたかまたは適当な別の酵素により標識化されＩ；、組 織プラスミノゲンアクチベーターの方向に向いｔ；別のモノクロナール抗体１０ ０ｐ１２、例えばＭＰＷ３ＶＰＡ１最終的濃度０．５　μｇ！ｍＱ、１　μｙ　 ／ｍｎ、２ｐｙ／ｍＱおよび４μ９／ｍＱ、を添加する。更に、この平板を４℃ で２時間恒温保持し、洗浄し、その後に０．１１モルの燐酸ナトリウム中のオル トフェニレンジアミン１　ｙＩＱの溶液、０．５モルのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ ５，８５、を添加し、この場合にはＨ２Ｏ２０，０３％を付加する。この溶液を １カツプあたり１００μＱを添加する。更に、この平板を室温で３０分間暗中で 恒温保持し、その後にこの反応を１．５モルの［８１カツプあたり１００μｇを 添加することによって終結させる。吸光度を４９５％ｍおよび６３０％ｍで参照 波長として測定し、この場合には、上記の光度計を使用する。

ｌＯμｇ／ｍＱを有する第１の抗体の濃度、７５０ナノモルのＧｌｕ−プラスミ ノゲンの濃度、３時間のプラスミン形成のための恒温保持時間および１μ９／ｍ （１のペルオキシダーゼ標識化された第２の抗体の濃度は、常法手段として選択 された。

ｔ−ＰＡ活性およびｔＰＡのための標準曲線：精製ｔＰＡ調製物をＰＢＳ緩衝液 中の１０ｎｇ／ｍ１２．５％ｇ／ｍＱ、　２．５　ｎｇ／ｍＱ％１．２５　ｎｓ ＋／ｍ（＋、　０．６２５　ｎｇ／ｍＱ、０．３１２５　ｎｇ／ｍ（ｌおよび０ ．１５　ｎｙ／ｍ（ｔの濃度でトウ４−７　（Ｔｖｅｅｎ）８０　０　、１％お よびＢＳＡ　００５％の添加下に得、この場合にも１ｍＱあたり０．０７５〜５ 単位の濃度の国際標準が使用される。エステル分解活性がプラスミノゲンとは無 関係に平板中に存在している程度を検出する目的のために、第１の試験系に対し てＧｌｕ−プラスミノゲンも牛血清アルブミン０．５％によって代えられた。第 ２の抗体の非特異的結合がアッセイ系に影響を及ぼす程度を測定するために、ｔ −ＰＡ含有試料の代わりにＢＳＡ　０．５％、ウィーン（Ｔｖｅｅｎ）　０．０ １％を含有するＰＢＳが使用される。ＥＤＴＡ８よびクエン酸ナトリウムは、標 準曲線に対する精製ｔＰＡの予想される影響を検査するために精製ｔＰＡの希釈 液に添加された。

アッセイ系に対する添加されたプラスミノゲンアクチベーター阻害剤の影響につ いて検査：精製プラスミノゲンアクチベーター阻害剤を′１ｍ１２あたりのｔ− ＰＡ阻害単位の濃度で精製ｔ−ＰＡの相応する希釈液に添加した。また、他面プ ラスミノゲンアクチベーター阻害剤を同じ濃度でｔ−ＦＡＡ希釈液添加し、この 場合このｔ　−Ｆ　Ａ希釈液は、既に第１の抗体と平板上で反応していた。２つ の場合、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤とｔ−ＰＡとの反応を３７℃で３ ０分間実施した。対照として同じ方法を実施し、この場合には、ＰＢＳ含有ＢＳ Ａ　Ｏ，５％をプラスミノゲンアクチベーター阻害剤の代わりに使用しｔ；。次 に、ｔ−ＦＡ活性およびｔ−ＰＡ抗原を相応して測定した。

回収試験： 種々の抗凝結物質を用いて得られたプールされた希釈されてない血漿中で標準曲 線を実施することにより、回収試験を実施した。血漿は、１０人の健康な志願者 から得られた個別的な血漿試料のプールであった。

抗凝結物質としては、０．０１モルのクエン酸ナトリウム、０．０２モルのナト リウムＥＤＴＡおよび０．０５モルのナトリウムＥＤＴＡを使用した。ｔ−ＰＡ を添加した血漿試料を種々に抗凝結化した場合、ｔ−ＦＡ活性およびｔ−ＦＡ抗 原を測定した。得られた結果の中、０．２モルのナトリウムＥＤＴＡを抗凝結物 質として選択的に試験した。血漿試料を健康の志願者から入手し、この血漿試料 中で同様に組織プラスミノゲンアクチベーター抗原の濃度および活性を１５分間 の静脈の営血前および菅血後に測定した。双方の測定を２回実施し、かつ試料を 上記の記載と同様に０．２モルのＥＤＴＡで抗凝結化した。

第１図：ｔ−ＰＡ活性（破線）およびｔ−ＰＡ抗原（実線）を測定するためのア ッセイ系の較正曲線。この測定を緩衝液、７５０ナノモル（開いた丸印）、３７ ５ナノモル（開いた三角形中）および１８７ナノモルおよびＢＳＡ　Ｏ，５％を 用いて３時間の恒温保持後に実施した０機能的活性を４０５ｎｍで測定し、かつ 抗原を４９５ｎｍで測定した。これらは、それぞれ国際単位または添加されたｔ −ＰＡ　ｎｍに対してプロットされたものである。

第２図：ｔ−ＰＡ活性に対する用量−作用曲線、破線＝ｔ−ＰＡｔｌ’（原、実 線＝ｔ−ＰＡおよび１つの単位を用いて３７℃で３０分間予備恒温保持した後の ｔ−ＰＡの固定前（開いた三角形中）および固定後（開いた四角形印）のプラス ミノゲンアクチベーター阻害剤。対照としてプラスミノゲンアクチベーター阻害 剤をＢＳＡｏ、０５％によって代えた。抗原４０５に対するｎｍおよび４９５ｎ ｍでの機能的活性は、相応して横座標上の国際単位またはｔ−ＰＡ　ｎｇ／ｍＱ に対して縦座標上にプロットされている。

第３図二標準の対照（開いた三角形中）および減少した菅血活性を有する患者（ 開いた円形印）のそれぞれ１ｍＱあＩ；りの横座標上の静脈管直後に測定された ｔ　−Ｐ　Ａ抗ＩＸｎｇ／ｍＱと、縦座標上の静脈響血後に測定されたｔ−ＰＡ 活性との間の補正。

表には、ｌＯの標準対照の場合、しかも静脈管車前および静脈蕾血後のｔ−ＰＡ 活性およびｔ−ＰＡ抗原に対する平均値および標準偏差が記載されている。

静脈管車前　静脈管直後 ｔ−ＰＡ抗！　２．７±０．５　１２．６±４．４ｔ−ＰＡ活性　＞０．２　３ ．７ 対照群ｎ＝１ｏ、平均年齢２９．６±８．１年実施例２：生物学的液体中でのウ ロキナーゼープラスミノゲンアクチベーターおよびプロウロキナーゼの機能およ び抗原を測定するための系。ミクロ−エリザ（ＥＬ−ＩＳＡ）平板をポリクロナ ール山羊状ウロキナーゼ抗体２０μ９を含有する０、０３５モルの重炭酸ナトリ ウム緩衝液、ｐ）１９−６．１カツプあたり１００μａで４℃で２時間児理する 。その後に、この平板を３回トゥイーン２０　０．０５％を含有するＰＢＳＩカ ップあたり３μａで洗浄する。その後に、ポリスチレン板上での残存する結合個 所をＰＢＳ中の１％の牛血清アルブミン溶液１カツプあたり１００μａを室温で ４時間飽和し、さらにこの平板を再び洗浄する。更に、この平板は、空気乾燥す るか、親液性化するか、または適当な方法で貯蔵することができる。

測定を実施するためには、１回の洗浄後に板を必要に応じてＰＢＳ中で希釈して 、ＢＳ、Ａｏ、５％、トウイーン８００．０１％を含有するｕ　−Ｐ　Ａ含有試 料１００ｐＱで３７℃で２時間恒温保持し、この場合時間および温度は、変える ことができる０次に、この板を再び洗浄する。その後に、適当なプラスミン基質 、例えばＨＤＮＬＥ−ＨＨＤ−Ｌｙ　５−ｐＮＡ　１カツプあたり１００ｐａを Ｈｌあたり０．０４ミリモルの濃度で添加し、ならびに天然基質Ｇｌｕ−プラス ミノゲンをＭｌあたり５００ナノモルの濃度で添加する。この平板を３７℃で１ 時間暗中で恒温保持する。その後１；、吸光度を４０５ナノモルで４９５ｎｍの 参照波長を用いて特に２波長の分光光度計中で測定する。試料の場合にプロウロ キナーゼの活性を測定しなければならない場合には、試料は、まずセファロース に結合したヒトプラスミン溶液ＩＱあたり０．５ｔＭで３７℃４１時間１００μ ｇ／ｍＱの量で処理しなければならない１次に、プラスミン−セファロースの除 去後、プロウロキナーゼの活性は、同様にして測定することができ、この場合に は、結合の間にアブロティニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）　ｌ　ｍ　Ｑあたり１０ 単位が存在するはずである６機能の測定後に、平板を再び洗浄し、ペルオキシダ ーゼ標識化されたモノクロナール抗体、例えばＭＰＷ５ＵＫ１匙あたり１００μ ａを１ｍｆｆあたり１／Ｊこの濃度で添加し、板を３７℃で２時間恒温保持する 。その後に、この平板を洗浄し、かつＨ２ｏ２ｏ、ｏ３％を含有する、燐酸ナト リウム０．１１モルｌａ中のオルトフェニレンジアミンｌ　ｍｇ／Ｑ、クエン酸 緩衝液０．０５ｐｆｆ％ｐＨ５，８５、の溶液を１００μａの量で添加する。こ の板を室温で１５分間暗中で恒温保持し、反応を硫酸１．５モル／ａｌ匙あたり １００μ９の添加によって終結させる。吸光度を４９５ｎｍで５４０ｎｍの参照 波長で、最善の場合に２波長の分光光度計で測定する。また、オルトフェニレン ジアミンの代わりに適当な別のペルオキシダーゼ基質を使用することもできるか ないしは別の酵素中での第２の抗体の標識化は、相応する方法で行なうこともで きる。

ウロキナーゼの標準曲線は、ウロキナーゼ１ｍｆｉあたり国際単位５．２．５． １．２５．０．６２５，０．３１２および０．１５５および０．０６７７の濃度 を加え、かつ相応する試験系中で測定する。緩衝液中および血漿中のウロキナー ゼの結果は、第４表に記載されている：緩衝液（三角形中）中および血漿（円形 印）中のｕ　−Ｐ　Ａの活性アッセイの場合の吸光度の値（開いた符号、４０５ ｎｍで測定）。緩衝液中の添加されたウロキナーゼの抗原濃度と、血漿中の添加 されたウロキナーゼの抗原濃度とは一致し、血漿中で添加されｔ；ウロキナーゼ の活性の明らかな減少を生じ、この減少は、ウロキナーゼでの特異的プラスミノ ゲンアクチベーター阻害剤の結合に帰因する。前記データから、ナトリウムＥＤ ＴＡ　１５ミリモル／Ｑの濃度、ベンズアミジン塩酸塩２０モリモル／Ｑの濃度 およびアプロチニン１０Ｕ／ｍ（ｌの濃度が試料中で少なくとも達成される場合 には、添加されたウロキナーゼの血漿回収率８８％を抗原アッセイに対して計算 することができる。

１０の標準血漿試料を検査する場合１：は、遊１ｍ　ｕ　−ＰＡ活性は全く検出 されず、ウロキナーゼ抗原の平均含量は、１．８８±０．６１　ｎ　ｙ／ｍＱで あり、活性アッセイおよび抗原アッセイのインテレアッセイ偏差は、１．９％お よび６．８％であり、かつイントラアッセイ偏差は、９．６％および４．８％で ある。

トロンポースを溶解する目的のためにウロンキナーゼ処置した患者でウロキナー ゼ濃度を検査した場合には、ウロンキナーゼ抗原の上昇は、初期のウロンキナー ゼ添加の終了直後に測定することができる。４人の典型的な例は、＄５図に記載 されている。

第５図：ウロキナーゼでの血栓崩壊の治療中の４人の患者の場合のウロキナーゼ 抗原（閉鎖された円形印）および活性（開いた円形印）。ウロキナーゼを体重１ ｋｇあたり７５００±１６００単位の用量で２５分間体重１ｋｇあたり毎時１９ ００±４００の国際単位の注入量に応じて注入する。

Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、２ １０　２０　３０　ｎＱ／ｍｌ Ｑ　１０　２０　３０　４０　５０　６０　ｍｉｎＦｉｇ、　Ｓ 国際調査報告 １−一一−ａｍ−−Ｉｌ＆ＰＣＴ／ＡＴ　８８１０００２７国際調査報告

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的液体中に含有されている物質の機能および抗原濃度を定量的に測定 する方法において、生物学的液体中に含有されている物質を固定し、次に生物学 的機能を特異的基質または別の物質の添加によって測定し、この特異的物質を引 続き洗浄によって除去し、次いで１つの後続過程で結合物質の免疫学的濃度を適 当な特殊の検出糸を用いて抗体を用いるかまたは用いることなしに測定すること を特徴とする、生物学的液体中に含有されている物質の機能および抗原濃度を定 量的に測定する方法。
2. ２．生物学的液体中に含有されている物質を平板表面に結合させることによって ポリロナールまたはモノクロナール抗体の媒介下に固定する、請求項１記載の方 法。
3. ３．血漿または尿から出発し、プラスミノゲンアクチベーターを固定し、第１の 工程で添加したプラスミノゲンによるプラスミン形成を測定し、第２の工程で結 合したプラスミノゲンアクチベーターの免疫学的濃度を検出系としてのペルオキ シダーゼ標識化されたモノクリナール抗体を用いて測定する、請求項１または２ に記載の方法。
4. ４．特異的結合蛋白質または固定された検出抗原に特異的に結合している別の物 質を検出系として使用する、請求項１記載の方法。