JPH01503673A - フェニルアラニンアンモニアリアーゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下、ＰＡＬと略称する ）をコードする遺伝物質、より詳細には天然〆状態のＰＡＬを］−ドする遺伝子 に通常認められる介在非コ植物、酵母菌、真菌およびストレプトマイシート内に 洪生ずるフェニルアラニンアンモニ・アリアーゼ（ＰＡＬ　：　ＥＣ４，３゜１ ．５）は、し−フェニルアラニンの非酸化的脱アミノ化反応を触媒してｔｒａｎ ｓ−ケイ皮酸にする（Ｑｉｌｂｅｒｔら。

１９８５参照）。この酵素はフェニルケトン尿症の治療および診断Ｓ−ケイ皮酸 からのＬ−フェニルアラニン合成に応用される（Ｙａｍａｄａら、　１９８１） 。植物の場合、この酵素は、フラボノイド生合成に関与し、光照射によって誘導 されるのに対し、ガーキンおよびカラシナの実生植物においては、不活性酵素の 構成プールの活性化の結果としてこの誘導が生じる（Ａｔｔｒｉｄｇｅら、　１ ９７４）　、他の植物種においてハ、光１９７９）。ガーキン、リンゴ、サツマ イモ及びビンワリのＰΔＬは特定の不活性化系によっても制御される（Ｔａｎ、 １９８０）。

ある種の担子酵母菌においては、フェニルアラニンが炭素、窒素およびエネルギ ーの唯一の供給源として作用し得る。ＰＡＬはアミノ酸の異化における初期反応 を触媒するため、該酵素はフェニルアラニン代謝の制御に重要な役割（Ｒｈｏｄ ｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）においては、Ｌ−フェニルアラ ニンまたはＬ−チロシンの存在によってＰＡＬが誘導される（Ｍａｒｕｓｉｃｈ ら、　１９８１）　、グルコース、およびグルコース存在下のアンモニアがＰＡ Ｌ合成を抑制する（Ｍａｒｕｓｉｃｈら、　１９８１）するのに対し、不活性な 前駆体の活性化やＰＡＬの分解速度の低下ではなく、むしろ酵素の生体内合成の 結果としてＰＡＬ活性が誘発される（ＱｉｌｂｅｒｔとＴｕ　ｌ　Ｉ　ｙ、　１ ９８２）　。グルコースはＰＡＬ合成を抑制するが、酵素の安定性には影響を及 ぼさないのに対し、アンモニアはフェニルアラニンの取込みを阻止するため、誘 発物質の排除により酵素合成が抑制される（Ｇｉｌｂｅｒｔら、　１９８２）。

異なる生理学的条件下で増殖したＲ、トルロイデスから単離したｍＲＮＡの試験 管内翻訳データから、フェニルアラニン、アンモニアおよびグルコースは機能化 ＰＡＬｍＲＮＡのレベルを調節することによってＰＡＬ合成を制御することが示 された（Ｑｉｌｂｅｒｔら、　１９８３）。

近年開発された遺伝子工学の手法により、一般的な微生物あるいは工業的規模で 容易に増殖させ得る微生物、特にある種の細菌または酵母菌は変形した遺伝物質 （ＤＮＡ配列）を有するため、蛋白質等の所要の化合物を生成できるようになっ た。概括的に８うど、化合物をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子から成 るプラスミドを、宿主の遺伝子装置に指令して化合物を合成させる他の遺伝物質 と共に宿主微生物に挿入することによって、この目的が達成される。

最近、ＰＡＬをコードする遺伝子が８．５ｋｂゲノムのｐｓｔｌ断片としてクロ ーン化された（Ｑｉｌｂｃｒｔら。

１９８５）。これらの研究から、ＰＡＬが２．５ｋｂのモノジストロニックｉ＋ ＲＮＡから合成されること、および遺伝子がＲ，トルロイデスゲノム内に単一コ ピーとして存在することが示された。クローン化したＰＡＬｉ伝子を大腸菌（Ｅ 、Ｃ：０１ｉ）（Ｇｉｌｂｅｒｔら、　１９８５）およびサツカロミセス・セレ ビサ工Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ　Ｃｃｒｅｖｉｓａｅ（Ｔｕｌ　ｌｙ、！： ａｉ　Ｉｂｅｒｔ、１９８５）　’に導入してもＰＡＬ蛋ら、　１９８５）およ び酵母菌サッカ・Ｏミセスーセ１し這ピサエ内（ＴｕｌｌｙとＧ１１ｂｅｒｔ、 １９８５）にＲ，トルロイデス１由来のクローン化ＰＡＬを］−ドする遺伝子を 導入する試みが成されて来たが、これらの非相同宿主ではＰＡＬ蛋白質が生成さ れなかった。

本発明の目的は、Ｒ，ｌ−ルロイデス以外の宿主生物体に導入し得、次いで該ホ ストがＰＡＬ蛋白質を産生する遺伝物質を提供することである。以下の説明から 、本発明のその他の目的と利点についても明らかとなろう。

本発明の第１の態様によって、真核微生物由来の対応するイントロン含有構造遺 伝子から誘導したイントロン欠失構造遺伝子を提供し、このときイントロン欠失 遺伝子が原核微生物または真核微生物の内部で産生物を発現し得る。という条件 で、どちらの遺伝子も同一の遺伝子産物をコードする。遺伝子産物は、生産させ ようとする化学的化合物、例えば蛋白質とすることができる。

本発明の第２の好適な態様によって、ＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチ ドをコードするイントロン欠失構造遺伝子を提供する。この遺伝子は、真核生物 体のＰ　Ａ　Ｌ産生株から誘導するのが好ましく、Ｒ，トルロイデス株から誘導 するのが最も好ましい。

Ｒ，トルロイデスの遺伝子ＤＮＡポリヌクレチド配列の一部を第３図に示す。こ の配列を決定するために発明者らが用いた方ン」の標識位置から「終止コドン」 の標識位置まで延びており、数にして６個のイントロンをＩＶ８１〜ＩＶＳ６で 標識している。これらのコドンによりコードしたアミノ酸を各種の制限部位と共 に示している。従って、本発明の第２の態様の遺伝子は、第３図の開始コドンか ら終止コドンまでのコドン配列と同じが、それに関連するか、それから誘導され るが、あるいはそれと相補的なりＮＡ配列から成るのが好ましく、この場合６個 のイントロンＩＶＳＩ〜ＩＶＳ６が欠失ており、次のようなポリヌクレオチ配列 を有する。

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ＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡｃ　ｃＴｃ　ｃＴｃ　ｃＡＧ　ＡＡｃ（ＴＧ　Ａ ＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣα工ＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣ；　ＣＡＧ　ＡＣＣＡＡ ＣＴＣＧ　ＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣ，ＣＣ ’ｒＴＣＴＣ（：　ＴＩ’Ｃα℃α：ＣＣＧＣＡＣＣＧＴＣαＣＣＡＣＣＴＣ（ ’ＴＣＴＣＣＴＣＧ　ＡｃＣＴＣＣ；　ＣＴＣＴＣＣＣＴＣｃｃｃ　ｃｃｃ　Ｃ ＴＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣ；　ＡＡＣｃｒｃ　ＧＣＣ（、ＣＣα℃αＣ’ＦＣＣ（ 、ＣＣＡ″：ｃ　ＴＣＧ　ＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡ　ＧＴＣＣＣＣＣ，、ＧＡ ＣＣＴｒＣＴＯＯＴＣＣＧＣＣ−１：、ＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧ　ＴＣＣ；　Ｃ ＣＣＣ，ＣＣＣ’ｒＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＧ　ＣＣＧ　ＣＣＣＡＣＴ■ＬＴ ＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＣ；ＣＣＡＴＣ）ＪＧ　ＴＣｔｌｌ；　Ｃ１−Ｃ ＡＣＧ　ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣｃＣＴ　Ｔ ＡＣ。

遺伝学の分野では周知のように、確定配列と関連するかあるいは確定配列から誘 導されるＤＮＡ配列は、同じ蛋白質または前記確定配列によって発現される類似 の活性を有するポリペプチドをコードすることができる。例えば、関連した配列 または誘導された配列は塩基をいくつか欠失したり、付加的な塩基をいくつか包 含したりすることができる。また、遺伝子コードを縮退し、複数のコドンで同一 のアミノ酸をコードすることも周知となっている。従って、関連した配列または 誘導された配列が第３図に挙げたものと異なるコドンを含むこともあるが、それ らが同一のアミノ酸をコードするのが好ましい。以上に挙げた方法の１つまたは それ以上の方法でこのようなコドン配列に関連するか、あるいはそれから誘導さ れた遺伝子が本発明に含まれる遺伝子である。

この配列に関連する遺伝子あるいはそれから誘導された遺伝子は、該配列に対す る類似度から定義する事もできる。類似度はできるだけ高い方が好ましい、理想 は１００　％であるが、−股木発明の第１または第２の態様による遺伝子を宿主 生物体に導入出来るようにするためには、遺伝子を組換えＤＮＡ分子の中に含ま せるのが一般的な方法である。従って、本発明の第３本発明の第３の態様による プラスミドは、遺伝子を宿主に導入するベクターとして使用し得るものであり、 従ってプラスミドを導入しようとする宿主に違当な遺伝物質を付加的に含ませる こともできる。好適には、この遺伝物質が前記濱伝子に作動的に結合している発 現制御配列、および／または該プラスミドを導入してＰＡＬ等の産物の発現が期 待される生物体に対する適当な他の遺伝子からの転写／翻訳信号を含んでも良い 。

本発明の第３の態様によるプラスミドの構造は、ベクターとして使用する相手と なる宿主生物体に応じて変化するが、本発明の第１または第２の態様による遺伝 子を適当な調節信号の下流に配置することによって、現在使用している産生生物 体の何れにおいてもＲ，トルロイデスＰＡＬの発現をＩＨ！できることを利用し て、ベクターを作成することができる。産生生物体としシュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍａｎａｓ　ｐｕｔ＋ｄａ＞　、エルウイニア・クリサンテム（ Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍ）および哺乳類の細胞系がある。

同様に、ブラ、スミド内のＰＡＬのＣＤＮＡコード領域のすぐ上流にある調節用 ＤＮＡ配列の性質も適当な特徴的な転写／翻訳信号で構成されることになる。例 えば、Ｓ、セレビサエに使用する揚 合、リポソーム結合部位（ＣＣＡＣＣＴＴの配列に準じる）をＰＡＬ遺伝子の翻 訳開始点の上流の適当な位置に配置し、　Ｓ。

セレビサエ、ボスホグリセラートキナーゼおよび交配因子遺伝子から誘導される ような強力な転写信号をリボゾーム結合部位の５′側に配置することができる。

プラスミド自体が標準レプリコン（２ｐ等）と選択可能なマーカー（Ｌｅｕ２． 　Ｔｒｐ　等）を用いても良い。大腸菌に使用する場合も同様に、適当な細菌リ ポソーム結合部位を有するＰＬ、　ｔａｃ　ｔｒｐ　、　ｒａｃまたはｌａｃ　 プロモータ並びにＣｏ１Ｅ１（ＤＢＲ３２２およびｐＵｃプラスミド）　、Ｒ３ ＦＩＯＩＯおよび旧の脱走レプリコンで構成される。天然のＰＡＬｍ伝子に存在 するイントロンが、Ｒ，トルロイデス以外の生物体内で、ＰＡＬ発現に対する障 壁として作用するため、本発明を用いると、６＠のイントロンの存在により天然 ＰＡＬｍ伝子ｍ発子できない広範囲の原核宿主および真核宿主において、ＰＡＬ を産生ずることができる。

本発明の第４の態様によって、本発明の第３の態様による少なくとも１つの組換 えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主生物体、特に大腸菌、エルウィニア（ Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クロストリテアロテルモフイラス（Ｂ、　Ｓｔｅａｒｏｔ ｈｅｒｍｏｐｈｉ　Ｉｕｓ）、シュードモナス属の各菌株、桿菌、酔ａ菌等のそ の他の微生物、その他の真菌、動物または植物の宿主を提供し、好適には原核宿 主を提供する。

本発明はまた、イントロンを欠失した遺伝子の製造方法も提（Ｉ）　Ｒ，ｔ−ル ロイデス株からＰＡＬのｍ　Ｒ六±を単離する段階と、 Ｎ　、Ａ （Ｕ）前記ｍＲ大士から、それぞれがＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチ ドをコードする遺伝子の一部を含む２つのイントロン欠失相補ＤＮＡ　（ｃＤＮ Ａ）配列を合成し、２つの遺伝子部分で遺伝子の３′末端と５′末端を含むよう にする段階と、 （ＩＩＩ）　（Ｉｔ）項に記載の２つのｃＤＮＡ配列を結合してＰＡＬまたはＰ ＡＬ活性を示すポリペプチドをコードするイントロン欠失構成遺伝子を形成する 段階とを含んでいる。

（Ｉ［＞の段階で使用する方法として、プラスミドに含まれるｃＤＮＡ配列を形 成するクローン化方法を使用することができる。その場合、適当な制限部位でプ ラスミドを切断することによりプラスミドからｃＤＮＡ配列を分離した後、２つ の配列を結合して遺伝子を形成する。次に遺伝子を他の遺伝物質と組合せて該遺 伝子を含むプラスミドを形成する。その、後、例えばＤＵＣ９のような適当な周 知のプラスミドを適当な部位で切断する。所望により、今度はこのプラスミドか ら遺伝子を順次切除し、さらに他の遺伝物質と組合せてベクターとして使用し得 る他のプラスミドを形成することもできる。当業者に周知の標準的な組換えＤＮ Ａ技術を本発明の方法に用いても良い。

上記の方法の（Ｉ［ｌ）の段階で産生する遺伝子および／またはプラスミドは、 本発明の第２および／または第３の態様によって包含される遺伝子またはプラス ミドのうち何れか１つとするのが好ましく、従って（ＩＩ）の段階で産生ずるＣ ＤＮＡ配列は、その遺伝子またはプラスミドの一部とするのが好ましい。（ｎ） の段階で産生プするＣＤＮＡ配列および該ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドも本発 明の別の態様を成すものである。

従って本発明は、本発明の方法によって産生ずるプラスミド等のＤＮＡポリヌク レチド配列と同じか実質的に同じである、あるいは該ＤＮＡ配列から誘導される かそれに関連するＤＮＡポリヌクレチド配列も含む。

次に、添付図面を参照しながら本発明について例示的に説明する。

第１図は、ＰＡＬ遺伝子を載せた遺伝子ＤＮＡの配列決定方法を示す略図である 。

第２図は、天然の遺伝子のイントロン配列を欠失したＰＡＬ選伝遺伝子せた２つ のプラスミドの製法を示す。

第３図は、ゲノムクローンの完全なヌクレオチド配列、ＩＶＳ１〜ＩＶＳ６の標 識を付けた本発明において除去されるイントロン配列・およびＰＡＬの対応する アミノ酸配列を示す。

第４図は２つのＣＤＮＡプラスミドである１）ＰＡＬｌとｐＰＡＬ２を結合して 、イントロン欠失遺伝子を含む組換えプラスミドＤＰＡＬ３を形成する方法を示 す。

第５図および第６図は、重複するｃＤＮＡクローンであるｐＰＡＬｌおよびｐＰ ＡＬ２のＤＮＡヌクレオチド配列をそれぞれ示す。

第７図はプラスミドｐＰＡＬ４からのＰＡＬ蛋白質の発現を示す。

以下の説明および図面において使用する略称は下記の通りでアラニン　Ａｌａ　 ウラシル　Ｕ アルギニン　Ａｒｇ　チミン　Ｔ アスパラギン　Ａｓｎ　シトシン　Ｃ アスパラギン酸Ａｓｐ　アデニン　△ Ａｓｎ　＋ＡＳｐ　Ａｓｘ　グアニン　Ｇグルタミン酸　Ｇｌｕ Ｇｌｎ　十Ｇｌｕ　Ｇｌｘ グリシン　ｃｒｙ ヒスチジン　旧Ｓ イソロイシン　Ｉｌｅ ロイシン　Ｌｅｕ リジン　Ｌｙｓ メチオニン　Ｎｅｔ フェニルアラン　Ｐｈｅ 第１〜６図を参照しながらより詳細に説明する。

第１図において、適当なりローン（Ｃ）ＨＧ３）から領域２を単離し、Ｔ４ＤＮ Ａ合成酵素による処理で環状化した後、富波処理によって断片化し、５００〜１ ｏｏｏｂ　ｐの断片をＭ　１３ｍ　ｐ　８に挿入した。制限部位ＢａｍＨ１，Ｂ ｃ　Ｉ　Ｉおよび５ａｌｌを用いて、領域（１）を各種の特定断片としてＭ　１ ３ｍ　ｐ　８およびＭ１３ｍ　ｐ　９に挿入した。指示した断片（３）をＭ　１ ３ｍ　ｐ８にクローン化することによって、ＢａｍＨＴ部位に及ぶＤＮＡ配列を 得た。

第２図では、旧ｄｅｃｋｅｒｌ！：Ｈｅｓｓｉｎｇ（１９８３）の方法によりク ローン１　（ｐＰＡＬ　１）を得た。匪により誘導したＲ、トルロイデス細胞か ら得たｍＲＮＡ全体をアニールしてオリゴ（ｄＴ）を尾部に結合したｐＵｃ９に した後、４つの全ｄＮＴＰの存在下で逆転写酵素を用いて第１鎖のｃＤＮＡコピ ーを合成した。

新たに合成した鎖の末尾にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー ゼを用いてオリゴ（ｄＣ）をつけた。アルカリ性スク［］−ス勾配による分画後 、ｃＤＮＡ配列を載せた一本鎖ブラスミドＤＮＡをアニールして変性オリゴ（ｄ Ｇ）を尾部に結合したｐＵｃ９とし、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ　Ｉ　ｅｎｏｗ） を使用すると共に４つの全ｄＮＴＰを添加して第２鎖を合成した。

ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ　（１９８２）の方法を用いてクローン２（ｐＰ ＡＬ２＞を構築した。逆転写酵素とｐａｌ　ｍＲＮＡに対してした。ＲＮ　Ａ　 −Ｄ　Ｎ　Ａ　ハイブリッド内のＲＮＡをＲＮａｓｅＨでニックし、大臆菌のＤ ＮＡポリメラーゼによってＲＮＡｔｉをＤＮＡで置換した。このとき、プライマ ーとしてニックされた一重してオリゴ（ｄＧ）を尾部に結合したｐＢ　Ｒ３２２ とした。

両方の方法を用いて産生したｃＤＮＡクローンを大腸菌ＪＭ８３に形質転換し、 〔α−３２ｐ）ｄＡＴＰを標識したｐＨＧ３制限第３図では、５つのランダムに 誘導したペプチド断片につき決定したアミノ酸配列を対応する残塁上に線を引い て示している。イントロンをＩＶ８１〜６で標示し、６個Ｉ全部に共通の配列は 対応する領域に下線を引いて示している。５′の非コード領域の上に引いた破線 はその配列の中でＴＣに富む領域を示すのに対し、そのすぐ下流側の下線と上線 は反復領域を標示でいる。この配列は第１図の最も左側のＢＣ１１部位からＣＤ ＮＡクローンｐＰＡＬ１の３′末端（第２図）まで延びている。

第４図では、ｐＰＡＬｌとｐＰＡＬ３の環状マツプの一重線がそれぞれｐＵＣ９ 誘５ＤＮＡとｐＬＪｃ８誘導ＤＮＡを表しねしているのに対し、ｐＰＡＬ２の一 重線はｐＢ　Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　Ａを表している（ｐＰＡＬｌとｐＰＡＬ２の構築 については第２図参照）。ｐＰＡＬ２の二重線がＰＡＬＩ伝子の転子ントロン欠 失」の５′末端を表すのに対し、ｐＰＡＬｌの太い線は遺伝子の３′末端を表し ている。Ｉ）　Ａ　Ｌ　ｉ転子の５′末端をｐＰＡＬ２から１．Ｏｋｂ　Ｐｓｔ ｌ−Ｆｓｐｌ断片として！！＠シた後、遺伝子の３′末端を有するｐＰＡＬｌか ら単離した１、２５ｋ　ｂのン（ＴＡＧ）コドンの位置（第３図参照）を矢印で 示している。

ＰＡＬ遺伝子の挿入方向は、ｌａｃプロモータ（ｌａｃｐｏ）を有するベクター からの翻訳読み通しが起こらないようにする。

第５図および第６図では、２つのクローンを結合してｐＰＡＬを形成するために 使用したＬ呈上１部位を、対応するヌクレオチドに下線を引いて示している。

第７図では、隣接する／ａＣプロモータからの翻訳読み通しが起こるように、Ｅ Ｃ０ＲＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片としてｐＵＣ９にクローン化したｐｒ’ＡＬ３ 　（第４図）からの完全なＰＡＬ遺伝子を含むプラスミドｐＰＡＬ４を示してい る。

Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐ　Ｌ　Ｃから入手したプラ スミド依存１、、ＤＮＡ無添加、２．プラスミドｐＵｃ９．３．プラスミド１） ＰＡＬ４゜蛋白質マーカーの分子量をＭｒとする。

以下の記述においては、下記の一般的手続きを参照するもの本発明により使用す る微生物株とプラスミドは表１に列挙した通りである。

敷基 Ｌ−ブロス（トリプトン１％、酵母菌抽出物０．５％、ＮａＣ１ｏ、５％）にお いて［、ｃｏｌｉ株を培養した。２％（Ｗ／Ｖ）のバクト寒天（Ｄｉｆｃｏ）を 添加して培地を固化した。アンピシリン１００μＱｄ”を用いてトランスフォー マントの選択、成長を行なった。５−ブロモ−４−クロＯ−インドイルーβ−Ｄ −ガラクトシド（ｘ−Ｇａｌ）を添加して最終濃度２μｄ−１にすることによっ て、機能化β−ガラクトシターゼを検出した。

化学物質 〔α３２ｐ）ｄＴＡＰとＣＤＮＡ合成キットをＡｍｅｒＳｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌから入手した。アガロース、制限Ｎ″＃、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ 、ターミナルデオキシヌクレオデジル転移酵素および１７メル一般配列プライマ ーを３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓがら購入 した。タレノウＤＮ酵素合醇素をＢｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから 、ｄＴテールドｐＵＣ９をＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍ　ｉ　ｃａ　ｌ　ｓから購入し た。逆転移酵素はＡｎｏｌｉｃｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄから 購入した。

その他の試薬は全て、Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉＣａｊ２　Ｃｏ。

または、ＢＤＨから購入した。

表１　使用した微生物株とベクター ｒｐｓＬ、　ｔｈｉ−１ｏ８ｏｄ　Ｉａｃｌ　ｚＨ１５Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８ ２）Ｅ、Ｃ０１ｉ　ＪＭＩＯＩ　（ｌａｃ−ｐｏす、５ｕｐＥ、ｔｈｉ　Ｍｅｓ ｓｉｎｇ　ａｎｄＦｌａｃｌ　２ｍ１５　ｔｒａロ　且り立Ｖ　ｉ　ｅ　ｒ　ｉ 　ａ　（１９８２）プラスミド ＤｕＣ９Ａｍｐ’　Ｖｉｅｒｉａ　ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２） ｐＢＲ３２２＾ａｍｐ　ＴｅｔＲＢｏｌｉｖａｒ　ｃｔ　ａｌ。

ＥＩＧＨ３、Ａｌ１１ｌ）Ｒ（ＰＡＬ遺伝子クローン）　Ｇ１１ｂｅｒｔ　ｅｔ 　ａｔ。

ｐＰＡＬＩ　ＡｍｐＲ（３’末端ＰＡＬ　ｃＤＮＡ　新規プラスミドｐＰＡＬ３ 　ＡｌｌＩＤ　（ＰＡＬｃＤＮＡ　遺伝子全体）新規プラスミドｐＰＡＬ４　Ａ ｍＤ　（ＰＡＬ　ｃＤＮＡ　遺伝子全体）新規フラスミトバクテリオア？−ジ Ｈ１３ｍｐ８　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄＶｉｅｒｉａ（１９８２） ＩＩｌ１３ｕ＋ｐ９　Ｈｅ５ｓｉｒ＋ｇ　ａｎｄＶｉｅｒｉａ（１９８２） ＤＮＡ操作 全ての制限Ｗ＃素とＤＮＡ／ＲＮＡ変性酵素は供給者の推奨する条件下で緩衝液 に入れて使用した。プラスミドの形質転換技術およびＤＮＡのあらゆる操作につ いてはこれまでに記載されている。（Ｍｉｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、１９８４） 。

シラスミド　ＤＮＡ分離 ［ブリジ溶解（Ｂｒｉｊ　Ｉｙｓｉｓ）Ｊそれに続＜ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離 により、アンピシリンを含むＬ−ブロス培養の１９から（：、ｃｏｌｉプラスミ ドを精製した（Ｃ１ｅｗｃｌｌ＆１−１ｅ　ｌ　ｉ　ｎｓｋ　ｉ　、　１９６９ 年）。小形プラスミド分離選抜のためには１−（ｏ　１ｍｅｓ＆Ｑｕ　ｉ　ｇ　 ｌ　ｅｙ（１９８１）の高速沸騰法を使用した。

゛処理による　Ｊの 配列を決定しようとするＤＮＡをＤｅ　ｉ　ｎ　ｉ　ｎｇｒ　（１９８３）の方 法によりランダムプラント末端断片に断片化した。こうして獲得した断片をＭ　 １３ｍ　ｐ　８の３ｍａ　１部位にクローン化し、３ａｎｇｅｒ等＜１９８０＞ に記載のように鋳型ＤＮＡを作製した。

ヌクレオチドの配列決定 ５ａｎａｅｒ　ｅｔ　ａ　ｌ　（１９８０）のジデオキシ法によってヌクレオチ ドの配列決定を行なった。Ｓ　ｔ　ａｄ　ｅ　ｎ　（＋９８０）のコンピュータ プログラムを用いて、獲得したデータをコンパイル・して完全な配列とした。

ＰＡＬｍＲＮＡの分離 容易に入手可能なＲ，ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ株ＩＦＯＯ５５９（１９８６年９月 ８日付きでブタベスト条約の規定によりノーウィッチ（英国）のＮＣＹＣに寄託 されたＮ　ＣＹ　０１５８９）を用いて、先に記載されたように（Ｇｉ　Ｉｂｅ ｒｔ　ｅｔ　ａｌ、１９８５）ＰＡＬ　ｍＲＮＡを分離シタ。

ｃＤＮＡのクローニック（合成） ■）ハイデツカ−・メツシング法 使用方法は本質的にＨｅ１ｄｅｃｋｅｒ＆Ｍｅｓｓｉｎ。

（１９８３年）に記載の方法とした。

ＰＡＬＸＷＲ，ｔｏｒｕ　ｔｏ　ｉ　ｄｅｓ細胞から得たｍＲＮＡ全部をアニー ルしてオリゴｄ　ＴテールドｐＵｃ９とし、４つの全部のｄＮＴＰの存在下で逆 転写酸素を用いて第１鎖のｃＤＮＡコピーを合成した。新たに合成した鎖の末尾 に、ターミナルオキシヌクレオチジル転移酵素を用いてオリゴｄＣを付けた。ア ルカリ性スクロース勾配を用いて分画を行なった後に、ｃＤＮＡ配列を載せた一 本鎖ブラスミドＤＮＡをアニールして変性オリゴｄＧテールドｐｕｃｃ＋とし、 タレノウＤＮＡ重合酵素を使用すると共に４つ全部のｄＮＴＰを添加して第２鎖 を合成した。

■）ガブラー・ホフマン法 ＣＤＮＡの第２合成法としてＧｕｂ　ｌ　ｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８３年） の方法を使用した。逆転写酵素とＰＡＬｍＲＮＡに１棟 対してキキ的な１９マーのプライマー（Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　 Ｇ　ＴＴＧＴＣＧＧＴＣ）を用いて第１鎖のｃＤＮＡコピーを合成した。ＲＮΔ −ＤＮ複合体の中のＲＮＡをＲＮａＳｅＨを用いて「ニック」し、ニックしたＲ ＮＡをプライマーとして用いてＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡ重合酵素によりＲＮＡ鎖をＤＮＡで置換した。次に二本鎖ＤＮ Ａを７４　ＤＮＡ重合酵素の作用によりプラントエンドにし、オリゴｄＣを末尾 に付けた後アニールしてオリゴｄＧテールドｐＢ　Ｒ３２２とした。

ＰＡＬ　ｃＤＮ△ＤＮＡンの検出 ＣＤＮＡ挿入断片を載せたプラスミドＤＮＡを、Ｆ、ｃｏｌｉＪ　Ｎ８３に形質 転換し、Ａｍｐ　ｌ−ランスフォーマントをＰＡＬ特異的ＤＮＡについてスクリ ーンした。ＰＡＬｍ伝子の転子を叙せた放射標１ｐＨＧ３ＤＮＡ小断片を用いた コロニーハイブリッド形成（Ｑｒｕｎｓｔｅ　ｉ　ｎ＆Ｈｏｇｎｅｓｓ、１９７ ５）によりこれを実施した。

アミノ酸の配列決定 精製した（Ｇｉｌｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）の方法による）ＰＡＬ蛋 白質のペプチド断片を、先行技術に記載の方法（Ｍ　ｉ　ｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ 　１９８４）により分離した。＾ｐｐｌｉｅｄＢｉＯＳｌ／ＳｔｅｍＳ％Ｊ気相 シークエンサー４１〇八を用いた自動気相シークエン性−４１〇八ノ酸の配列決 定を行なった。

インビトロ翻訳 イオン非存在下の細菌転写翻訳システムとして、ｏｅ　ＶｒｉｅＳ＆　２ｕｂａ ｙ（１９６７）　によって最初に記載されたシステムを変更したのを使用した。

細菌プラスミドに含まれる遺伝子のインビトロ発現に必要な補助溶液とＥ、ｃｏ ｌｉ　５−３０抽出物をキットとしてＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌＰＬＧから購入した。生成した蛋白質を３５８−メチオニン（Ａｍｅ　ｒ 　ｓ　ｈ　ａｍ）で標識し、１２％のアクリルアミドゲル（Ｌ　ａ　ｅｍｍ　Ｉ 　ｉ　、　１９７０年）上１”５ＤＳ−ＰＡＧＥｌ、：よッテ分析した。ゲルを １６時間乾燥させた後にオートラジオグラフィーを行なった。

１、ＰＡＬ遺伝子クローンのヌクレオチド配列決定ＰＡＬ遺伝子はこれまでに証 明されている通り（Ｇｉｌｂｅｒｔ　ｅｔａｌ、、１９８５）、組換えプラスミ ドｐＨＧ３を生成するべくｐｕｃ８にクローン化された６、７ｋｂ　ＢＣＩＩ断 片の内部でＤＮＡの２．５ｋｂの領域を占める（第１図参照）。遺伝子の大部分 が３ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片の上に存在するのに対し、遺伝子の残りの５′末端ハ ０．７ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｂｃ　Ｉ　Ｉ断片の上に位置する。従って、３ｋｂ断 片を適当なりローン（第１図の断片２）から分離し、ランダムな小断片を音波処 理によって生成（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ、１９８３）してＭ　１３ｍ　ｐ　８にク ローニングした。Ｓ　ｔ　ａｄ　ｅ　ｎ　（１９８０）　のコンピュータプログ ラムをするＢｃ　ｌ　］−ＢａｍＨＩＩ！Ｆｉ片、Ｂｃｌｌ−３ａｌｌ断片およ びＢａｍＨｌ−８ａ　Ｉ　ＩＱ断片（第１図の領域１）ヲＭ１３ｍｐ８およびＭ 　１３ｍｐ９の適当な部位に部位特異的にクローニングすることによって獲得し た。１３ａｍＨ１部位を走査するＤＮＡの配列決定は、第１図のＳａ　ｌ　Ｉ− ＸｈＯＩ断片（３）をクローニングすることによって達成した。

配列領域の適当なりＮＡ鎖を翻訳した結果、ＰＡＬをコードし得るオーブンリー ディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しないこ゛とが分かった。しかしこの領域が 確かにＰＡＬをコードすることが、翻訳したアミノ酸配列とランダムに誘導した ５つのペプチド断片とを比較することによって確認された。５つのペプチド配列 の全部が翻訳配列の内部に存在していたが、それはいろいろな翻訳リーディング フレームにおいてであった（第２図）。連続したＯＲＦが存在しないという事実 は、他の真菌遺伝子と同様に、ＰＡＬｍ伝子も転子トロンを含むことを示唆して いるものである。

２、ＰＡＬ遺伝子を載せたｃＤＮＡクローンの分離ＰΔＬ介在配列の識別を可能 にするために発明者らはｃＤＮＡから遺伝子を再クローニングする方法をとった 。初期実験においてハ、ベクターｐＵＣ９と精’！ＪＰＡＬｍＲＮＡをもちいて ハイデツカ−・メツシング法（１９８３）を採用した。ｐＨＧ３の用してＰＡＬ 　ＤＮＡ配列を載せたクローンを識別した。こうして獲得した最大クローンであ るＤ　ＰＡ　Ｌ　１は、ＰＡ　Ｉｌｌ仏子の３′末端から約１．３　ｋｂを含有 していたく第３図）。遺伝子の５′末端は、ガブラー・ホフマン法（１９８３） 　により作成したＣ−チルドｃＤＮＡをクローニングしてＧ−テールドｐＢ　Ｒ ３２２とし、ｐＰＡＬ２を形成することによって１１４された。この場合。第１ 鎖の合成に使用するプライマーを、先に獲得したＣ対してイ考的な合成１９マー オリゴヌクレオチドとしたく第３図参照）。適当な制限断片をＭ１３ｍｐ８とＭ 　１３ｍ　Ｄ　９に部位特異的クローニングすることによって、２つのＣＤＮＡ クローンのヌクレオチド配列を決定した。

３、ＰＡＬイントロンの識別 ２つのクローンの配列決定により、ＰＡＬコード配列の中に６つのイントロンが 存在することがｖ＆Ｈされた。従ってＩＶＳ１〜ＩＶＳ６で標識された６つのＤ ＮＡ領域が完全にｐＰΔ［１およびＣＩＰＡＬ２の特定領域から無くなっている ことが分かった。６つの欠損領域を調べた結果、全てが３′末端にヌクレオチド ＣＡＧを含んでおり、真核遺伝子に普通具られるコンに一致することが判明した 。これらのイントロンのいくつかの５′末端における多数の配列は真核コンセン サス供与体配列（ＧＴＡ／ＧＡＧＴ）に余り一致しないことが分かった。すなわ ちｌＶＳ２．４．５の供与体配列はそれぞれＧＴＧＣＧＴ。

ＧＴＧＣＧＣ，ＧＴＧＣ：ＧＣであった。真核遺伝子のイントロンは一般に、介 在非コード領域を精密にスプライシングするのに必要な配列を含むことが証明さ れている。その他の真核インｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓイントロンの中に存在しない 。その代りに、コンセンサスＧ／ＡＮＧ／ＣＴＧＡＣに一致する配列が存在する （各イントロン内部の関連配列を第３図にＦ線で示した）。このような配列はＲ ，ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓに特異的なものであり、生物体と密接に関連している。

ｖｉｓａｅ（Ｔｕｌｌｙ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｅｒｔ、１９８５）の何れにおい ても発現しないことが証明されている。Ｅ、ｃｏｌｉにおいて発現しない理由は 、ＰＡＬｉ伝子に転子トロンが存在することによるものである事は間違いない。

また、Ｓ、ＣｅｒｅＶｉＳａｅ　はイントロンをスプライスできるのであるが、 ＰＡＩ−イントロンのヌクレオチド配列とＳ。

ｃｅｒｅｖ　ｉ　ｓａｅイントロンに見られるヌクレオチド配列との間に相違が あるためこの酵母菌はＲ，ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓＰＡＬ遺伝子を発現できない。

４、連続ｃＤＮＡ　Ｐ’ＡＬ遺伝子の誘導ＣＤＮＡからＰＡＩ伝子転子ローニン グする際に用いた方法により、結果的に遺伝子の３′末端を載せたｐＰＡＬｌと 遺伝子の５′末端を載せたｐＰＡＬ２の２つのクローンが形成された。上記２つ のプラスミドの挿入断片を融合することによって、ＰＡ１１造遺伝子の全体を載 せた第３プラスミドを構築した。これを達成するために、ＰＡＬの５′末端を載 せたｐＰＡＬ２から１．０ｋｂ　Ｆｓｐｒ−Ｐｓｔ［を断片を分離し、それをＤ ＰＡＬｌから分離した遺伝子の３′末端を載ぜた１、２５ｋｂ従ってプラスミド ｐＰＡＬ３はＰＡＬＩＩｌｉ造遺伝子全体を載せているが、 天然のＲｏｔｏｒｕ　ｌｏ　１ｃｌｅｓ染色体遺伝子に見られる６つのイントロ ンはすべて欠落している。

５、ＰＡＬ蛋白質の合成 ｐＰＡＬ３からの完全にイントロンをもたないＰＡＬｍ伝子ｍ金子断片を、Ｉａ ｃプロモータに対して両方向にｐＵＣプラスミドを挿入してクローニングし−Ｕ 、　ｐＰＡＬ３　（ｐＵｃ８）と・ｐＰＡＬ４　（ｐＵｃ９）を得た。ｐＰＡＬ ４では、ＰＡＬ遺伝子がｐＵｃ９からのｌ　ａｃＺプロモータと同疎相にあり、 プラスミド特異的インビトロ翻訳系統においてＰＡＩ−蛋白質が合成されること が証明されたこれを示したのが第７図である。反対の向きにあるＰＡＬＪ伝子（ 転子ＡＬ３）を用いても、ＰＡＬ蛋白質は生成されない。現在発明者らは３ａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＰＡＬｉ伝子を転子する ことを可能にするベクター系統を開発中である。

入ｒａｂｃｕｓｒ　Ｃ，Ｍ、＋　Ｊ、Ｌ、＾ｍｂｒｕｉ、ｃ、ＨＯ１ｃＶ＆ｔｈ ｔ　Ｈ，Ｐ＃ｄｅ【Ｓｅｎ＋　５．　５ｈａｒｍａ、ｃ、Ｋ■獅メB Ｍａｒｕｓｉｃｈ、ｗ、ｃ、、Ｒ，＾、ｊｅｎｓｅｎ＋　ａｎｄ　Ｌ、Ｏ，Ｚａ ｍＬｔ、１９８１．　！ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏＥＴｕｌｌｖ；　Ｍ、＋　ａｎｄ 　ｌ’１．Ｊ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、１９１１５．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ＲｈＱｄ０Ｓ　０ｒ奄р撃kＩＩＩｌ ｔｏｒｕＬｏｔｄｅｓ、　Ｇｅｎｅ　コロ：　２コ５−２４０゜ぽＵ　−−切り 　コ＜　１＋リ　ψす ＝ｕＩ＆Ｉｕ−（−＜Ｉ＋１１＋−（ ←く　頓−Ｊ＜　ｕｌＪ　τ＜　＝Ｕ ＋ｕ　ｌ＋υ　ｚｕ　ｚｕ　ｘｕ　＜ｕ　コク％Ｐ＋＜　−１３−＜　＆Ｔ１４ 　−＜　ＪＬＩ　Ｊ＜（＜　リｕ　ｇｕ　＜＜　＝ｕ　＜ｕ　ｕｕシー　−一　 ＝と　Ｉ＋じ　コリ　イロ　χロ　コリー（Ｊ　、Ｊ←　給＜　−ｕ　１ｊｌ− −ｕ　Ｊ＜　−←ＬＪｕ　−＜　＜＜　ＩｊＣＪ　ＪＬＪ　４ｕ　Ｌｌｕ　−リ ｅ＋ＸＪ　＊Ｕ　６−ＣＪ　＊ｌｐ−ズｕ　＜ｕ　＋−ｃ　区１−い＜　−０１ （コリ　リ＜　ＪＬＩ　ｕ＝　ｖｕくＱ　給＜　＜ＣＪ　ｌ−＜　＜＜　＜υ　 工く　ψヒいロ　−ｕ＋ＪＣＪ　ＶＡＪ　ｈＵ　ωＵ　コロ　＝←とくり＋＝← 　と＜　Ｗｌ−−１−、Ｊ＜　−←−＜　＞（Ｊ　−＜　Ｊ＜　’ｒ、＜　、− ＜　コロ　−Ｖ−ロ　コｕ　ｚｕ　：ｌ口　−Ｕ　へＵ　く←　−０＜１−ＩＪ ！−ＩＪＩ−−１＜　ＪＣｊ　い（−〇　（ヒ＞ｕ　−ｕ　ｚｕ　ｕｐ　ｕｕ　 ＜ｕ　＜ｕ　＞ｕ１／ｌＬ３　ｏｐ　ロ←　←ロ　＋ｔｕ　：）ＩＪ　ｏｐ　＝ ａ＞＜　ｗｕ　ｕｕ　ｗ←−ｕｗ＋−・ピＬＪＩ／、＜−＜　ｃ＋ｑ　ｃ＋ｕ　 ｘ＜　＜ｕ　＋Ｉｕ　ｃ−ｕ　＜ｕＪＩＪ　＞Ｌｌ　ｍｕ　Ｗｕ　Ｚω　＞ｕ　 ｚｕ　ｚｕ＜＋−−！ａ　い＜　＝Ｕ　い（−〇　−く　い（〉ロ　ｕｕ　＜＜ 　ト＜　＜＜　ｕｕ　コリ　くベコ口　コロ　−Ｕ　−ロ　＝Ｕ　い口　＝ρ　 コロ−く　−←　Ｘ＜　Ｘ＜　−←　＞＜　＜ｒ−ＷＬＩｕＬ）　−ｕ　＜ＩＪ 　＜＜　−１ｕ　−１＜　＞ｕ　Ｉ／１？コロ　らロ　：ｔｕ　＜υ　←Ｑ　ψ Ｑ　切←　コロ−（工ω　工ω　コリ　−←　＞ｏ　−＜　４４０ロ　トド　← 鴫　くＱ　工く　υト　エＵ　ａＵ＝Ｕ　＊Ｕ　＞Ｕ　コＱ　コ＜　ＣＣＵ　コ υ−く　ズＬｌ　−１ｕ　ＷＩ＋−＜　ｍ＜　−ヒ１−１ｍ　ｌ−＜　（ｊＬｌ 　＝Ｌ）　ｕｕ　：Ｌｌ　−ＩＪＵＵ　コＱ　＞ロ　クロ　（Ｑ　とく　くυば ＋ｊ　−←　−Ｑ　洲（−リ　コロ　−Ｑ＜Ｕ　＝Ｕ　Ｕロ　−＜　＜ｕ　Ｌ） Ｕ　＜ａＬＬＩ　−ＩＪ　ｌ／＋Ｌｌ　シＵ　＜Ｕ　コロ　コ←妥ご　ミし　＝ ご　巳８　＝８５口　＝むｕ％Ｊ　−Ｌ）　Ｌ）ＩＪ　（ｕ　ＷＪ　−υ　＞Ｖ 　＜−←＝＝　べべ　呵Ｒゴ尺　モロ　層上　ｄｇ　；尺　尺ｅｔＱ４υ　Ｖ口 　Ｃυ　−υ　−υ　コリ　トυｔＪＬＪ　＋ＩＪ　）−＜　αリ　−１く　工 ←　い＜　−Ｊｖ、ｓ　＜ｕ　−１＜　＜ｕ　＜ｔＪ　：＋ト＜＜　ＵＵＯ＜　 ）ｕ　＜Ｊ　ＩｊＣＪ　工Ｑ　−ｖ　０口　２０＝８　二じ　―どｔ仁　＝實　 でご　て８　で＝０（←ｇ＜ＣＪ　コＩＪ　Ｌ）Ｌｊ　ＷＩＪ　Ｗｕ　：ｕ二（ ，１ｗｌ−−ｕ　−＜　ｃｔロ　＝←　−←　−←＜ｕ　！：４　＜ｔＪ　ｕｌ Ｊ　＜ＩＪ　１１．ｌ−−＜　ＪＬＪｇｕ　り０　＝ロ　コＵ　いυ　ロＱ　ロ Ｕ　−υζ（Ｗｉ−Ｗ−−←　−（区ＩＪ　ＩｔＬ＋　−←ト←−Ｑ−ｕ　−リ 　：Ｕ　＜Ｕ　シＵ　−＜ｆＬｌ　＆ＪＬｌ　＞←　りＱ　コヒ　ｅ：ｕ　ｅｌ Ｊ　ａｃＬＩ−ｕ　−ト　−リ　−←　−一　−〇　とり＝−クト　−＜　Ｕロ 　−υ　−Ｕ　いく　トド　トベ：＋ｌＪ　ｌ／ＩＬ）　：）ＬＪ　ｅｌＪ　１ ４９　＞＜　１ｊＬＩ　：＝Ｌｌ−一　と＜　ｗＩ−ｗｇ　＋４”　−ｕ　ピυ 　−トーｕ　、：＜　−ｕ　！Ａｉ−ｅ−１−ＣＪＩＪ　（ＩＪ　−ＬＪロー　 ＝Ｑ　＞←　コＣＣｕ　コＱ　ムυ　−Ｕ仁Ｕ　＝＜　−ロ　−ｈ　：’Ｊ　− ＜　リく　ベト−Ｕ　υＣＪｔＪロ　＝υ　−υ　ＵＵ　＜ω　〉Ｃぽ←　ｔｎ ｕ　コく　←ロ　Ｖω　コＵ　ＺＣ，＋　イυＷｕ　＞＜　−＜　ＷＨ−＜　ｇ 、−＜　−一■ト　−ペ　ロリ　エく　ニー　−Ｕ　ＵＵ　＜じ＝＋ｕ　＞ｕ　 ｔ／＋ｕ　ｘｕ　ｗｕ　：ｌＬＩ　ＣＪＬＩ　ｘｕ＝ｉＳ　己８−〉　；ご　二 に　七じ　霜８　＝ご＞ｕ　筐ｕ　：）ＩＪ　＜ｕ　＜ｕ　り＜　＝Ｕ　コυ　 コＱ−Ｑ　−υ　−Ｈ−ＩＪ　−ＩＬＩ　−Ｊ＜　＜Ｈ−←　−トｕｕ　ｖｒ＜ 　ｗｕ　＜ｕ　＜ＩＪ　ｕｕ　＞ｕ　ＪＩＪ　−ｕｕｕ　ａ＋ｕ　ｚｕ　ｈｕ　 ：ｌ＜　ｕｕ　ｔｎｕ　ｏｐ　ｏｔ−ｃｔＣＩ／Ｉ＜　いく　−←　−べ　−← 　トく　αＱ　区Ｑ＜ｕ　＜ｕ　＜＜　ｒ：＜　＊ロ　＋−＜　４＜　ＬＬＩ　 ＬＬＪ＝ｕ　ｏｐ　１ＩＪｕ　ｃｔａ　−リ　ＺＵ　＝Ｕ　＞υ　２υ−←　区 Ｑ　−ヒ　−Ｕ　（←　−＜　＜＋　ＪＬ）　Ｉ／ｌ＜−ＩＪ　Ｉ−ｕ　Ｌｌ− １／ｌ←　〉リ　リυ　〉ロ　ＵＵ　＜＜０１Ｊ　ｌ／ＩＬＩ　＝ｐｕ　＜＜　 ｇｏ　ｅ：ｕ　コＣＪ　：ｌＬｌ　ａ−ｕ工Ｌｌ　ｗ＜　ＬＪｉ−−１ｕ　：リ 　工Ｌｌ　＝（＋、Ｊｉ−ＬＡ＜１−ＬＪ　：ｕ　−υ　＜Ｑ　←（←＜ＵＵ　 −Ｕ　＜Ｕ垢？　−し　二８　＝５　Ｈｇ　旨８３足　主８　手８＞Ｌ）　ｕｕ 　＜Ｕ　Ｌ／１１−　工＜１−、ＪＩＪロ　←←　トくｕｕ　ｇｕ　ｈａ　、Ｊ （Ｊ　＜ｕ　ＬＩＳＬＩ　コｕ　ｚｕ　ａ４Ｌ）−一　−ロ　ωヒ　＜ｉ−−＋ ｕ　−（＝＜　＝＜　＝す、−＜　−ｘ＜　！：＜　＞ａ　＜ｕ　ｗｕ　ｕｕ　 ｇｕ　＋＜０１Ｊ　ｌｊｕ　＜ｕ　＜ＩＪ　ｅｌＪ　Ｑｌ−１／ｌ）−ｅｌ−ｅ ：（ｊｌｌｅｕ　−←　”　”’　＝Ｌ＋ａｕ＋（ｅｌＪ　７１ＪＬＩＪ　−＜ 　＜ロ　４ｕ　ｌ−＜　ｃ−リ　＝’Ｊ　：Ｕ　＋ｘｉ−ｇｕ　＜ＩＪ　：ｌ口 　−Ｑ　コｕ　ｕｕ　ｘｕ　：＋ｓ−ｚａｕｕｕ　、、ｊｕ　Ｊ＜　二Ｕ　Ｗｔ −ピＵ　−＜　ｕｕ　、Ｊ＜ｈ＜　＜ＩＪ　ＩＪｃｊ　ｌ−＜　：リ　くｕ　工 ｕ　ｘｓ　ｕｕ！？　５８　首と　ｚ８　乙８　臣８　ゴ？　臣８　ｚ８＋＜　 ＜ａ　＜ｕ　ｐｕ　ｌ／ｌヒ　＋＜　＞Ｕ　←＜１　ｕｕｑ園１１１％ 、、ＰＡＬ 補正書の写しく翻訳文）提出内（特許法第１８４条の８）平成元年３月８日 特許庁長官　古　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１００６２８２、発明の名称　フェニ ルアラニンアンモニアリアーゼの製法３、特許出願人 住　所　イギリス国、ロンドン・Ｊヌ・ダブリュ・　９・　５・イー・キュー、 コリンディル・アヴ工ニュ・６１ 名　称　ザ・パブリック・ヘルス・ラボラタリイ・サーヴイス・ボード４、代　 理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提出年月日 　１９８８年８月１０日６、添附肉類の目録 請求の範囲 １）　具眼微生物由来の対応するイントロン含有構造遺伝子から誘導したイント ロン欠失構造遺伝子であって、前記イントロン欠失遺伝子が原核または具眼微生 物内でフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）またはＰＡＬ活性を示す ポリペプチドを発現できることを条件として、どちらの這ｄ（龜−の産生物をコ ードしていることを特徴とする遺伝子。

２）　具眼微生物のＰＡＬ産生株のイントロン含有遺伝子から誘導することを特 徴とする請求項１に記載の遺伝子。

３）　前記微生物がＲｏｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓであることを特徴とする請求項２ に記載の遺伝子。

４）　前記遺伝子がＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチドを発現する条件 で、下記に列挙したポリヌクレオチド配列：ＡＴＧ　Ｏｌ：Ｇ　ＣＣＴ　ＣＣＡ 　ｃＣＡ’　ＡＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　Ｃ（、ＣＡＣＣＴＩ ｌ＆　ＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＣＡＣにＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴ ＣＣＡＧ　ＡＡＧ　人ＴＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＣＧ 　ＣＴＣＱ’ｔＡ　ＣＴｃＣＡＣＣ；（：４　ＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＡＣＣｒＣ ＣＣＡ　ＣＡＣｉｃ　ｌ：Ｔｃ　ＴＣＧ　ＣＣＣＣＣＧ　ＡＣＧ　ＡＡＧ　０ｃ ｃＡＣＣＣＣＴ　（ＴＣＣＣＣＧＴＣＡＡＩＩＩ；　（、ＡＣＡｉｌ；ＣＣＡＣ ＣＡＧ　八ＴＣＣＧＣＴＣＡ　ＡＡＣＡＴｒ　ＣＡＣＡ人Ａ　ＴＣに　（：ＴＣ ＣＡＣＴｒＣＴＴＧ　ＣＣＣＴＣｔｌｌ；ＣＡＡ　ＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣ ；ＴＣＴＡＣＣｃｃ（ＴＣＡＣＣＡＣＴ　Ｃ（ＩＡ　ＴｒＴ　ＣＣＣＣＣＡ　Ｔ ＣＸ：：ＣＣＡ　ＣＡＣＡＣＣｃｃｃ　八ＣＣＣＡＧ　ＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣ Ｃ，ＣｒＣＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＣＡ（１；　ＣＡＣＣＡＧ　 Ｃ’ｒＣＴ（１５Ｇｆ：Ｔ　ＣｒＴ　ＣＴＣＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＴＴＣＣ ＡＣＴＣ’ＣＴＴＣＣＧＣＣＣ；ＣＣＴＣ（ＴＣ（ＴＣＣＴＣＣＡＧ　ＣＣＧ　 ＣＴＣ’　ＡＣＣＡＡＣＴｒＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＣＣＯＡＴＯＡＣＣＣＣＣＡ ＴＣＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧＣ（、（Ａ　ＡＣＣ！　ＡＴＣＴＣＴ　ｃｃｃ　〒 ｃｃ　ｃｃｃ　ａｈｃ　ＣＴＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＴ　Ｇ ＣＡ　ＣＣＧ、’ＣＣＣ八ＴＣＡＣＣＣ（７ＣＡＣＣＣＣＣＡＣＡＧＣ：ＡＡＧ 　ＣＴＣＣＡＣ（ＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡ；　ＧＣＣ−ＡＡＣ（、ＡＣ；　ＡＡＣ ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＧＣＧ　ＣＴＣＴｒＣＡ ＡＣＣｒＣ（：ＡＣＣＣＣ（７Ｃ（ＩＴｃ　ＣＴＣ（Ｃ：ＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡ 　ＣＣＴ　ＣＴＣＣＣＴ　ＣＴＣＣ，ＴＣＡＡＣＣＤＮＡ配列：　ＣＣＣＧＴＣ ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＣＡＴＣＩｌ＄ＣＴＣＡＣＧ　ＣＣＣＡＴＣＡＣＧ　ＧＴ ＣＣＡＡ　（１；ＣＣ；　ＡＴＣＧ’ｒＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＣＴＣＧ　Ｔ ｒＣＣＡＣＣＣＣＴｒｙ！　ＣＴＴ　ＣＡＣＣＡＣＧ’ｒＣＡＣＧ　ＣＧＣＣＣ Ｔ　ＣＡＣＣＣＧ　ＡＣに　ＣＡＧ　ＡＴＣＣＡＡにＴＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡ ＣＡＴＣＣＣ；ＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＣＣＣＣＣＴｒＴ　Ｇ ＣＴ　（ＩＴｃＣＡＣＣＡＴ　ＣＡＣＣＡＧｃＡＧ　（ＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＧ 、　ＧＡＣＣＡＣ０Ｇに（１４ＡＴＴ、ＣＴＣＣＣＣＣＡＧ　ＣＡＣＣＧＣ’Ｔ ＡＣＣＣＣＴＴＣＣＧＣｋＣＧ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＣＴ（Ｃ；　ＣＴＣＣ， （、ＣＣＣＧ　ＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴｒ　ＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣ ＣＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣ八ＴＣＣＡＣｃｃｃ　ｃｃｃＣＡＣＴＣＣＡＣＧ　ＡＣ ＣＣ／ＶＣＡＡＣＣＣＴ　ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ　八人ＣＡＡＣＡＣ Ｔ　、ＴＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ（、ＧＣＡＡＴ　ＴｒＣＣＡに　ＣＣＴ　ＣＣ ＣＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡ八Ｇ　へＡＣＴ　ＣＧＣ ＣＴＣＧＣＧ　ＣＴＣＧＣＣＣＡＧ　ＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡ ｃＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣ（ＴＴＣＡＡＣ！　ＣＣＣＣ（Ａ　ＡＴＣ ＡＡＣＣＧＣ（、ＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣτＣＣＣＴＣＧＣＣ：　ＧＣＣＣＡＡ 　ＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＣＴ（１；ＣＡへｃ　ｃｃｃ　ｃ ｒｃ　ｃへＣへＴＣ（１；ＣＣＧＯＴ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＴＡＣＡＣＣＴＣＣ； 　（、ＡＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＣＡＣＣＴＣＣＣＣ八ＡＣＣＣＴＧＴＧ　ＡＣ（ ：　ＡＣＧ　ＣＡＴ　ＣＴＣＣＡＣＣＣＣＧＣｒ　ＣＡＧ　ＡＴＣ；　ＣＣＧ　 ＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＧ　、ＣｒＣ八人ＣＴＣＣＣＴＴ　Ｃ；ＣＧ　ＣＴＣＡＴＣ ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＣＡＣＧ　ＡＣＣＧＡＧ　ＴＣＣＡＡＣＣＡＣＱ ＴＣＣＴＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＡＣＩＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＴ ＣＣＧＴＴ　ＣＴＣＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＣ（１；ＡＣＴｒＣＣＣＣＣ，ＣＧ　Ａ ＴＣＣＡＣＴＴＣ（１；ＡＧ　ＴｒＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＴＴＣＧＧＣＣＣＡ 　ＣＣＣＡＴＣＣｒｃ！　ＴＣＣＣＴＣＡＴＣ（ｌａｃ　ＣＡＣＣＡＣ！　Ｔｒ Ｔ　ＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＧΔ八ＣへＣＴＣＣ（、ＣＣＡ ＣＣＡＣＣＴＣＣｒＣ（１；ＡＣＡＡＧ　ＣｒＣ；　ＡＡＣＡＡＧ　ＡｃＣＣＴ Ｃ（、ＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧ　ＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＣ：　ＴＡＣＧ ＡＣ（ＩＴｃ　にＴＣＣＣＣＣＣ；ＣＴＣＧ　ＣＡＣＣＡＣｃｃＣＴＴＣＴＣＣ ＴｒＣにＣＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣ（ＩＴｃ！　（ＴＣＧｋＧ　ＣＴＣＣＴＣＴＣ Ｇ　ＴＣＧ　ＡＣＧＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＣＣＣＣ ＴＯＯＡＡＣＧＴＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣへＣＴＣ（”、ＧＣＣＡＴＣＴＣＧ　 ＣＴＣＡＣＣＣ（、ＣＣＡＡ　（ＩＴｃ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＣＣＴｒＣＴＣＧ　 ＴＣＣＣＣＣＧＣＧ　ＴＣＣ；　八ＣＣＴＣＣＴＣＧ　ＣＣＣＧＣＧ　ＣＴＣＴ Ｃｆｌｌ；　ＴＡＣ、ＣＴＣＴＣＧ　ＣＣＧ　ＣＣＣＡＣＴ　ＣへＧＡＴＣＣＴ ＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣ（、ＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＣにＣＧＴＣＡ ＡＣＧＣＣＣＧＣＣＣ；ＣＣＴＣＡＡＧ　ＡＴＣＣＴＣＧＣＴ　ＴＡＧと同一の 構造または該配列と７０％もしくはそれ以上の相同性を有する構造であることを 特徴とする遺伝子。

５）　請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え ＤＮＡ分子。

６）　請求項４に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。

７）　前記組換えＤＮＡ分子がプラスミドであることを特徴とする請求項６に記 載の分子。

８）　前記プラスミドがベクターであり、遺伝子に作動的に結合した発現制御ｌ 配列、および／またはＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２゜の細胞系由来のＰＡＬまたはＰ ＡＬ活性を示すポリペプチドに対する適当な転写／翻訳信号を含むことを特徴と する請求項７に記載のプラスミド。

９）　前記プラスミドが遺伝子の翻訳開始点の上流側のリポソーム結合部位を含 み、並びにＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓａｅホスホグリセラードキナーゼ遺伝子および 交配因子遺伝子から誘導した転写信号をリポソーム結合部位の５°に配置するこ とを特徴とする請求項８に記載のプラスミド。

１０）　請求項４に記載の遺伝子を、ｐＵｃ９のＩａｃ　Ｚプロモータを有する 相内の遺伝子と共にプラスミドＰＵｃ９に挿入して成ることを特徴とする組換え ＤＮＡ分子。

１１）　請求項４に記載の組換えり、　Ｎ　Ａ分子を用いて形質転換したＥ、ｃ ｏｌｉであることを特徴とする宿主微生物。

１２）　イントロンを欠失した遺伝子の製造方法であって、（Ｉ　）　Ｒ、ｔｏ ｒｕｌｏｉｄｅｓ株からＰＡＬのｍＲＮＡを単離する段階と、 （Ｉ［）前記ｍＲＮＡから、それぞれがＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプ チドをコードする遺伝子の一部を含む２つのイントロン欠失ＣＤＮＡ配列を合成 し、２つの遺伝子部分が遺伝子の３゛末端と５°末端とを含むようにする段階と 、（■）２つの前記ＣＤＮＡ配列を結合して、ＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポ リペプチドをコードするイントロン欠失構造遺伝子を形成する段階とを含んで成 ることを特徴とする方法。

１３）’ＰＡＬまたはＩ）ＡＬ活性を示すポリベブブードをコードするイントロ ン欠失遺伝子の一部であり、前記遺伝子の３°末端まとするポリヌクレオチド配 列。

１４）　下記の配列： ＾ＴＧＣＸ２Ｇα：Ｔ　ＣＣＡＯＣＡ　ＡＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧα：Ｔ 　ＣＣＣＡ（Ｘ：　Ｔ■ＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧ　（ＴＣＡＣ（：　ＣＡＧ　 ＣｒＣ（、ｋＣＡＴＣＣｒＣＱｌｋＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣ＋５　ＣＡＧ　ＣＣＧ ＾ＣＣ（ＡＣＴＣ（：、　ＡＣ（：　ＣＴＣＣＡＡ　Ｃ’ｒＣＣＡＣ（、（Ａ　 ＴＡＣＴＣｃ　ＣＴＣＡＡＣＣＴ’ＣＧ（Ａ　ｆｆｃ（ＴＣ（ＴＣＴＣ（：　Ｇ ＣＣＣＣＧ　ＡＣＧＡＡＣＧ（Ａ　ＡＣＧ　ＣＣＴ　（ＩＴｃ　ＣＧＣ（ＴＣＡ ＡＧ　ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＣＡ（：　ＡＴＯＣＣＣＴＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴｒ　Ｃ ＡＣＡＡＡ　ＴＣＧ　（ＴＣＱＡＧ　ＴｒＣＴｒＧ　Ｃ圓ＴＣＣＣＡＡ　ＣＴＣ ＴＣＣＡＴＧ　ＡＣ；ＣＣＴＣＴＡＣＧＧＣ（ＴＣＡＣＧ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　Ｔ ｒＴ　ＧＣＣＧＣＡ　ＴＣＣＣＣＡ　ＣＡＣＡＣＣＣ（Ｘ：　Ａ（ＩＣＧＡＣＣ ＡＣ！　ＡＴＣＴＣＧ　ＣＴＣＣＡＣ）ＪＧ　α７　（’ｒＣＣＴＣＣＡＧ　Ｃ ＡＣＣＡＧ　ＣＴＣＴＧＣＣに’ｒ　（Ｔｒ　ＣＴＣＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　 ＴｒＣＣＡＣＴＣＧ　ＴｒＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＯＣＧ（Ｔ　ＣＴＣＣＡＧ　 ＡＡＣＴＣＣＣＴｒ　ＣＣＣＣＴＣＣＡＣ（ＴＴ　（ＴＴ　Ｃ（４Ｃ℃ＣＣＣＡ ＴＣＡＣＡ　ＡＴＣＣｃｃ（ＴＣＡＡＣＡＣｃＴＴＧ　ＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＡ ＣＴＣＧ　ＣＣｒ　ＧｒＣＣＴＸ：　ＣＴＣ（ＴＯＣ：’ｒＣＣＴＣ（ＩＡｃ　 （ＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＣＴｒＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＣ（ＣＡＴＣ＾ＣＣＣＣＣ ＡＴＣ（ＴＣＣｔＡ　ＣＴｃＣＧｃＧ（Ａ　Ａｃｅ　ＡＴＣＴＣｒ　ＱＣ（１； 　ＴＣＧ　（５ＣＡＣＣＴＣＴＣＴ　ＣＣＴ　Ｃ’ｒＣＴＣＣＴＡＣＡＴｒ　（ ：ＣＡ　ＧＣＣ，ＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＴ　ＣＡＣＣＣＣＣＡｃ　ＡＣＧＡＡ Ｃ（ＴＧ　ＣＡＣＧＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧ　（５ＡＡＣＧＡＧ　ＡＡＣＡＴＣ Ｃｒ’ＣＴＡＣＣＣＩＣＣ（Ｘ：ＣＡｃｃｃｃ＾ＴＯｃｃＧ　ＣＴＣＴｒＣＡＡ ＣＣＴＣｃＡＣσ：Ｃ（ＴＣ（ＴＣＣＴＣＣ（Ａ　ＣＣＧ　ＡＡＧｃＡＡ　ｃＧ ｒＣＴＣｃＧｒＣＴＣＧＴＯＡＡＯＧ（Ａ　ＡＣＣＧＣＩ：、　ｇ　ＴＣＡ　Ｃ ＣＡ　ＴＣＧ　ＡＴＣ（５＾ＣＣＣＴＣＣ（Ｔ　ＣｒＧ　ＣＡＣＣＡＣ（ＡＡ　 ＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＧ　ＣＥ　αＴＣ（：　（Ｊｌ；　ＴＣＩＩＩ；（２） ＡＣＣ（、ＣＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣｃＡＡ　ＣＣＣＡＴに　ｃ′ｒＣＣＣＶ　Ｃ ＡＣＣＣＣＧ（Ａ　ＴＣＧ　ＴＴＣＣＡＣＣＣＣＴｒＣＣＴＴ　ＣＡＣＣＡＣ（ ７ＣＡＣＧ　ＣＣＣＣＣＴ　ＣＡＣＣＣＣＡＣに　ＣＡＣＡＴＣＣＡＡ（ＴＣｃ ｃＧ　Ｃ，Ｇｋ　ＡＡＣＡＴＣＣｃｃＡＡＣ；　ＣＴＣＣＴＣＣＡＧ　（、（Ａ 　ＡＣＡ　Ｃ（Ａ　ＴＴＴ　ＧＣｒ　（ＴＣＣＡＣＣＡＴ　ＣＡＧ　ＧＡに　Ｃ ＡＧ　（ＸＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧ　ＣＡＣＣＡＣＣＡＧ　Ｇ（Ａ　ＡＴＴ　ＣＴ ＣＣにＣＣＧＣＡ　１１．Ａｃ　Ｃ（、ＣＴＡＧ　ＣＣＣＴｒＣｉ　ＣＣＣＡＣ Ｇ　＋と同一のポリヌクレオチド配列、または該配列と７０％もしくはそれ以上 の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１３に記 載の配列。

１５）　下記の配列： ＴＣＴ　ＯＣＴ　ＣＡＣＴ（１；Ｇ　ＣＴＣＣｃｃα℃口℃（ＴＣＡ（：ＣＧＡ ＣＣＴＣＡＴｒ　ＣＡＣにｃｃＣＡＣｎ　（Ｔ（！　ＣＴｃＡＣＣ＾’ｒｃｃ八 ＧαＥへ１；ｃｃＭｃ　ＡＣＴ　ｃｃｃ　ｃＴｃ　ｃｃｃ　ａｒｃ　ｃｃｃ　Ｃ ＡＣＡＴＣｃｃｃ　ＡＡＧ　ｃｒｃ　ＡＡＣ’ｒｒｃ　ＡＣＧ　ＣＡＣＣＴＣＡ ＣＣにＡＣＡＴＣＣｒＣ人ＡＣＧＯＣＧＧＣＡＴＧ　ＡＡ（！　ＣＣＯ（：ＧＣ ＣＴ（！　ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧ　ＣＣＣＣＡＡ　ＣＡＣＣＣＣＴ（ Ｉ：　ＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＣＴｌ：４　ＡＡＣＧＧＣＣＴＣ（：、ｋＣＡＴ ＣＧＣＣ（１；（Ｔ　Ｇｌ：ＣｃｃＧ　ＴＡＣＡ閃ＴＣＧ　ＣＡＧ　ｍ　（：Ｃ Ａ　ＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣｒＴＣに　ｃｃｃＡＴＣＴＣＧ　ＣＴＣＡＣ ＣＣＧｃＣＡＡ　ＧｒＣＣＯＯＣＡＣＡＣＣＴｒＣＥに　ＴＣＣｌ双ＣＣＣＴＣ に　ＡＣＣＴＣＧ　ＴＣＧ　ＣＣＣＧＣＧ　ＣＴＣＴＣＣ，ＴＡＣＣＴＣＴＣＧ 　ＣＣＧ　ＣＧＣＡＣＴ　ＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＡＣにＣＣＴｒＣ！　ＣＴＣＣ ＧｃＧＡＧ　ＧＡＧ　（ＴＴ　ＣにＣ（ＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣ（：、Ｇ ｋ　ＣＡＣ（ＴＣＴｒＣＣＴＣＧＣＣＡＡ（：　ＣＡＡ　にＡＧ　（：ＴＣＡｃ ＧＡＴＣＣＣ；Ｃ’ＴＣＣＡＡＣ（ＴＣと同一のポリヌクレオチド配列、または 該配列と７０％もしくはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む ことを特徴とする請求項１４に記載の配列。

１６）請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換え ＤＮＡ分子。

１７）　請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴 とする組換えＤＮＡ分子。

１８）　ポリヌクレオチド配列がｐＢ　Ｒ３２２またはｐＵｃ９と結合している ことを特徴とする請求項１１に記載の組換えＤＮＡ分子。

国際調査報告 １Ｍ１ｅ”ｊ１１６”ａｌ　Ａｌ−１１−１１＠、　ＰＣＴ／　Ｇ−１，８７／ 　０Ｏｏ２８　−国際調青報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）真核微生物由来の対応するイントロン含有構造遺伝子から誘導したイントロ ン欠失構造遺伝子であって、前記イントロン欠失遺伝子が原核または真核微生物 内で産生物を発現できることを条件として、どちらの遺伝子も同一の産生物をコ ードしていることを特徴とする遺伝子。 ２）前記遺伝子がフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）またはＰＡＬ 活性を示すポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。 ３）前記遺伝子が真核微生物のＰＡＬ産生株のイントロン含有遺伝子であること を特徴とする請求項２に記載の遺伝子４）微生物がＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓで あることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子。 ５）前記遺伝子がＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチドをコードする下記 のポリヌクレオチド配列：【配列があります】 と同一の構造、または該配列と関連する構造、または該配列から誘導した構造、 または該配列と相補的な構造を有することを特徴とする遺伝子。 ６）前記遺伝子がＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチドをコードすること を条件として、前記遺伝子がいくつかの塩基を欠くか、またはいくつかの塩基を 余分に含むか、または列挙したコドンのいくつかを他のコドンと置換することを 特徴とする請求項５に記載の遺伝子。 ７）請求項１〜４の何れかに記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ 分子。 ８）請求項５または６に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子 。 ９）前記組換えＤＮＡ分子がプラスミドであることを特徴とする請求項８に記載 の分子。 １０）前記プラスミドがペクターであり、遺伝子に作働的に結合した発現制御配 列、および／またはＥ．ｃｏｌｉ　ｋ１２．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｐｒｅｕｄｏｍｏｎａ ｓＰｕｔｉｄａ、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉまたは哺乳類の細 胞系由来のＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチドに対する適当な転写／翻 訳信号を含むことを特徴とする請求項９に記載のプラスミド。 １１）前記分子が遺伝子の翻訳開始点の上流側のリポソーム結合部位を含み、並 びにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅホスホグリセラートキナーゼ遺伝子および交配因子 遺伝子から誘導した転写信号をリポソーム結合部位の５′に配置することを特徴 とする請求項１０に記載の分子。 １２）請求項５に記載の遺伝子を、ｐＵＣ９のＩａｃＺプロモータを有する相内 の遺伝子と共にプラスミドｐＵＣ９に挿入して成ることを特徴とする組換えＤＮ Ａ分子。 １３）請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて形質変換することを特徴とす る宿主微生物。 １４）イントロンを欠失した遺伝子の製造方法であって、（Ｉ）Ｒ．ｔｏｒｕｌ ｏｉｄｅｓ株からＰＡＬのｍＲＮＡを単離する段階と、 （ＩＩ）前記ｍＲＮＡから、それぞれがＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプ チドをコードする遺伝子の一部を含む２つのイントロン欠失ｃＤＮＡ配列を合成 し、２つの遺伝子部分が遺伝子の３′末端と５′末端とを含むようにする段階と 、（ＩＩＩ）２つの前記ｃＤＮＡ配列を結合して、ＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示 すポリペプチドをコードするイントロン欠失構造遺伝子を形成する段階とを含ん で成ることを特徴とする方法。 １５）ＰＡＬまたはＰＡＬ活性を示すポリペプチドをコードするイントロン欠失 遺伝子の一部であり、前記遺伝子の３′末端または５′末端を含むことを特徴と するポリヌクレオチド配列。 １６）下記のポリヌクレオチド配列： 【配列があります】 と同じ、または該配列と関連する、または該配列から誘導したポリヌクレオチド 配列を含むことを特徴とする請求項１５に記載の配列。 １７）下記のポリヌクレオチド配列： 【配列があります】 と同じ、または該配列に関連する、又は該配列から誘導したポリヌクレオチド配 列を含むことを特徴とする請求項１５にに記載の配列。 １８）いくつかの塩基を欠くか、または他の塩基を含むかまたは列挙したコドン のいくつかを他のコドンと置換することを特徴とする請求項１６又は１７に記載 のポリヌクレオチド配列。 １９）請求項１５に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換え ＤＮＡ分子。 ２０）請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴と する組換えＤＮＡ分子。 ２１）ポリヌクレオチド配列がｐＢＲ３２２またはｐＵＣ９と結合していること を特徴とする請求項２０に記載の組換えＤＮＡ分子。