JPH0154668B2 - - Google Patents

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JPH0154668B2
JPH0154668B2 JP58193070A JP19307083A JPH0154668B2 JP H0154668 B2 JPH0154668 B2 JP H0154668B2 JP 58193070 A JP58193070 A JP 58193070A JP 19307083 A JP19307083 A JP 19307083A JP H0154668 B2 JPH0154668 B2 JP H0154668B2
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reaction section
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Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 産業上の利用分野 この発明は、アミノ酸分析方法及び装置に関す
る。さらに詳しくは種々のアミノ酸を簡単に定
性、定量でき、ことにプロリンのようなイミノ酸
をも高感度で定性、定量できる分析方法及び装置
に関する。
(ロ) 従来技術 従来から、アミノ酸分析に、オルトフタルアル
デヒド（以下OPA）とメルカプトエタノールを
用いた方法が行なわれている。この方法は、下記
に示すように、カラムで分離した各アミノ酸成分
をOPA及びメルカプトエタノールと反応させて
発蛍光性の化合物を生成させ、この化合物の蛍光
光度又は吸光光度に基づいて定性、定量を行なう
方法である。
そして、二級アミノ酸等を対象とする場合に
は、これらを次亜塩素酸と反応させて予め一級ア
ミノ酸に変換させた後、上記反応に供する方法が
行なわれている。
しかし、かような方法においてはプロリン等の
イミノ酸型の二級アミノ酸に対する分析感度は不
充分なものであつた。
この点に関し、本発明者らは変換された一級ア
ミノ酸に反応させるOPA濃度を上昇させ更に反
応時間や反応温度の最適化を計ることにより、プ
ロリン等のイミノ酸に対する感度を向上させる方
法について先に提案を行なつた（特開昭57−
135355号公報）。
一方、以上の方法に用いるメルカプトエタノー
ルは悪臭を有するという問題点があつた。
(ハ) 発明の目的 この発明は、上記種々の問題点に鑑みなされた
ものであり、OPA濃度をとくに上げる必要もな
く、プロリン等のイミノ酸をより高感度に分析で
き、しかも悪臭の問題も解消されたアミノ酸分析
方法及び装置を提供することを目的とする。
(ニ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、アミノ酸含有試料
を、Ｏ−フタルアルデヒド及びＮ−保護基置換−
システインと反応させて発蛍光性の化合物を生成
させ、その蛍光光度又は吸光光度を検出すること
を特徴とするアミノ酸分析法が提供される。さら
に上記分析方法の実施に好適なアミノ酸分析装置
が提供される。
アミノ酸含有試料と、上記OPA及びＮ−保護
基置換−システインとの反応は、通常、従来の
OPA及びメルカプトエタノールとの反応と同様
な反応条件下、ことにアルカリ性下行なわれる。
例えば、OPAとＮ−保護基置換−システインと
をPH10〜11程度のホウ酸塩緩衝液中に混合して弱
アルカリ性の反応試薬とし、これとアミノ酸含有
試料を混合し適宜加熱することにより簡単に（通
常、数十秒）行なうことができる。なお、この発
明における反応スキームをＮ−アセチル−Ｌ−シ
ステインで例示すれば以下の通りである。
この発明に用いるＮ−保護基置換−システイン
としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン又はＮ
−アセチル−Ｄ−システイン等のＮ−アセチルシ
ステインが好ましいが、これ以外にもシステイン
のアミノ基を反応から保護しうる基を置換してな
るシステインを用いることができる。
なお、アミノ酸含有試料としては複数のアミノ
酸を含有する試料であつてもよく、単独のアミノ
酸を含有する試料であつてもよい。通常、複数の
アミノ酸を含有する試料を、所謂アミノ酸分析計
に準じて、まず液体クロマトグラフイーカラムで
分離し、これを連続的に前記反応に供し検出部に
送液するのが適当である。
アミノ酸含有試料中に二級アミノ酸が存在する
場合、予めアミノ酸含有試料に次亜塩素酸（通
常、塩の形で添加）を混合して一級アミノ酸に変
換することにより、同様にして分析を行なうこと
ができる。ことにプロリンのごときイミノ酸型二
級アミノ酸が存在する場合、次亜塩素酸処理の
後、OPA及びＮ−保護基置換−システインと反
応させることにより、従来法に比して極めて高感
度の分析を行なうことができる。すなわち、従来
法に比して10倍以上の高感度でプロリンのごとき
イミノ酸型二級アミノ酸を検出することができ
る。
OPA及びＮ−保護基置換−システインとの反
応によつて生成した発蛍光性化合物は、その蛍光
光度や吸光光度に基づいてそのまま簡単に検出す
ることができる。通常、より高感度な検出が行な
える点、蛍光光度に基づいて検出を行なうのが好
ましい。これらの検出は当該分野で公知の種々の
検出器によつて行なうことができる。
(ホ) 実施例 第１図は、この発明のアミノ酸分析方法を実施
する装置を例示する構成説明図である。図におい
て、アミノ酸分析装置は、アミノ酸含有試料の導
入部２を介してアミノ酸分離用カラム３に接続さ
れるバツフアー流路１と、該カラム３から延設さ
れ蛍光光度計を備えた検出部５に接続されるアミ
ノ酸成分溶離液流路４から基本構成されてなる。
そして溶離液流路４には、Ｏ−フタルアルデヒド
及びＮ−アセチルシステインの混入反応部７が設
けられており、さらにその前段に次亜塩素酸塩の
予備反応部６が設けられている。混入反応部７
は、ｏ−フタルアルデヒド及びＮ−アセチルシス
テインを含有するPH約10のホウ酸塩緩衝液７２を
ンプで供給しうる混入流路７１と、らせん管状の
液混合管とから構成され、ヒーターで所定の反応
温度（通常50〜70℃）となるよう設定されてい
る。一方、予備反応部６は、次亜塩素酸ナトリウ
ムを含有するPH約10のホウ酸塩緩衝液６２をポン
プで供給しうる注入流路６１とらせん管状の液混
合管とから構成され、同様に所定温度に設定され
ている。なお、図中１１はPH3.2のクエン酸緩衝
液、８はレコーダーをそれぞれ示す。なお、本図
は酸性アミノ酸群のみの分析に供せられる例で、
全アミノ酸を分析する場合は通常のアミノ酸分析
計のごとく、PH、塩濃度の異なる移動相をステツ
プ的に、又は連続的に変えるためのクラジエント
装置が用いられる。
上記装置において、まず、緩衝液１１が流路
１、カラム３、流路４を通じて検出部５に供給さ
れる。次いでアミノ酸含有試料が導入部２からシ
リンジで流路１内に注入される。注入されたアミ
ノ酸含有試料は、次いでカラム３内に導入され、
各アミノ酸成分に分離されつつ溶離液流路に導か
れる。次いで、各アミノ酸成分の分離相が順次、
注入反応管６内に入る。この際、注入反応管６に
は次亜塩素酸塩が注入される。これにより、プロ
リン等のイミノ酸型二級アミノ酸や他の二級アミ
ノ酸は、予備反応部において一級アミノ酸に変換
される。次いで各分離相は混入反応部７に入る。
この際、混入反応管７には、Ｏ−フタルアルデヒ
ド及びＮ−アセチルシステインが注入される。そ
れにより各分離相中の一級アミノ酸成分は、前述
したスキームに従つて対応する蛍光光性の縮合ヘ
テロ環式誘導体に変換され、検出部５に移送され
る。検出部５において各分離アミノ酸成分に対応
する発蛍光性化合物の蛍光光度が測定され、レコ
ーダー８に記録される。
このようにして、プロリン等のイミノ酸を含む
アミノ酸含有試料を簡単に分離分析することがで
きる。なお、二級アミノ酸の分析を意図しない場
合には、前記装置における予備反応部を設ける必
要はない。
なお、上記装置を用い以下の条件でアミノ酸分
析を行なつた結果を第２図に示した。
〔測定条件〕
Γ緩衝液１１：クエン酸緩衝液（PH3.2） Γカラム流量：0.4ml／分 Γカラム：ISC−07／S1504 （島津製作所(株)製） Γ液混合管径：混入反応部 0.5φ×６cm 予備反応部 0.5φ×12cm Γ緩衝液７２：500mlの緩衝液中に0.08％のOPA
と１ｇのＮ−アセチル−Ｌ−システインを
含有する溶液 （流量：0.2ml／分） Γ緩衝液６２：500mlの緩衝液中に0.4mlの次亜塩
素酸ナトリウムを含有する溶液 （流量：0.2ml／分） ＊ なお、６２及び７２に用いた緩衝液は、PH10
のNa2CO3−H3BO3−K2SO4緩衝液である。
Γ蛍光光度測定：励起波長 350nm 蛍光波長 430nm Γ混入反応部及び予備反応部での反応温度：60℃ Γ混入反応部での反応時間（通過時間）：20秒 図に示すように、種々のアミノ酸に対応するピ
ークが検出され、ことにプロリン（Pro）及びヒ
ドロキシプロリン（Hy−Pro）について極めて
高いピークが得られている。なお、図中、Aspは
アスパラギン酸、Thrはトレオニン、Serはセリ
ン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、Alaは
アラニンをそれぞれ示す。
これに対し、緩衝液７２中のＮ−アセチル−Ｌ
−システインの代わりに２−メルカプトエタノー
ルを用いた従来の反応試薬を用いる以外、上記と
同様にしてアミノ酸の分析を行なつた。その結果
は第３図に示すごとくであり、Pro及びHy−Pro
を除いては良好なピークが得られたが、Pro及び
Hy−Proについて極めて低いピークしか認めら
れず感度がこの発明の方法に比して１／10以下と
低いことが判る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、この発明のアミノ酸分析装置を例示
する構成説明図、第２図はこの発明の方法により
得られたアミノ酸分析チヤートを示すグラフ、第
３図は従来法により得られたアミノ酸分析チヤー
トを示すグラフである。 １……バツフアー流路、２……導入部、３……
アミノ酸分離用カラム、４……溶離液流路、５…
…検出部、６……予備反応部、７……混入反応
部、８……レコーダー、１１……緩衝液、６１…
…注入流路、６２……次亜塩素酸ナトリウムを含
有するPH10のホウ酸塩緩衝液、７１……混入流
路、７２……Ｏ−フタルアルデヒド及びＮ−アセ
チルシステインを含有するPH約10のホウ酸塩緩衝
液。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ アミノ酸含有試料を、Ｏ−フタルアルデヒド
    及びＮ−保護基置換−システインとアルカリ性下
    で反応させて発蛍光性の化合物を生成させ、その
    蛍光光度又は吸光光度を検出することを特徴とす
    るアミノ酸分析法。 ２ アミノ酸含有試料の導入部を介してアミノ酸
    分離カラムに接続されるバツフアー流路と、該ア
    ミノ酸分離カラムから延設され蛍光光度又は吸光
    光度測定手段を備えた検出部に接続される溶離液
    流路を有し、該溶離液流路にＯ−フタルアルデヒ
    ド及びＮ−保護基置換−システインの混入反応部
    を備えてなるアミノ酸分析計。 ３ バツフアー流路に、アルカリ性緩衝液が導入
    される特許請求の範囲第２項記載の分析計。 ４ アミノ酸分離カラムと混入反応部との間に、
    さらに次亜塩素酸の予備反応部が設けられてなる
    特許請求の範囲第２項又は第３項記載の分析計。
JP58193070A 1983-10-14 1983-10-14 アミノ酸分析方法及び装置 Granted JPS6082967A (ja)

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