JPH0156051B2 - - Google Patents
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- JPH0156051B2 JPH0156051B2 JP55153947A JP15394780A JPH0156051B2 JP H0156051 B2 JPH0156051 B2 JP H0156051B2 JP 55153947 A JP55153947 A JP 55153947A JP 15394780 A JP15394780 A JP 15394780A JP H0156051 B2 JPH0156051 B2 JP H0156051B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbsag
- cells
- temperature
- occurs
- caffeine
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）は肝炎Ｂ疾病に対
するワクチンとして有効であることが知られてい
る。この抗原の通常の由来は例えば血漿搬出法に
よる供給者からの血漿である。その結果としてこ
の抗原を含有する血漿の供給はほとんどの血漿が
HBsAgがないので不確実でありそして不経済で
ある。 そのため試験管内でHBsAgを増殖する試みが
なされている。例えば試験管内でヒトの肝癌細胞
の組織培養が試験管内でHBsAgを痕跡量だけそ
して検出できない補体結合滴定量であるが産生す
ることが知られている。他方、肝炎Ｂ疾病に感染
したヒトは多量のHBsAg―約256の補体結合滴定
量で約1013粒子／mlを産生する。 従つて本発明の目的は高い滴定量および高純度
でHBsAgを調製する試験管内組織培養を提供す
るものである。他の目的はHBsAgを調製する改
良方法を提供するものである。さらにデーン粒子
のないHBsAgを提供することが目的である。本
発明のこれらのそして他の目的は次の説明から明
らかになる。 肝炎Ｂ表面抗原は高滴定量および高純度で試験
管内で二つの異なる上昇温度段階を有する増殖サ
イクルを用いてHBsAgを放つ細胞の組織培養か
ら産生される。 本発明は試験管内で肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）
を増殖する方法に関するものである。さらに詳細
にはHBsAgを放つ細胞を使用して高滴定量でそ
して高純度で試験管内でHBsAgを増殖する方法
に関するものである。 そこで細胞が二つの異なる温度範囲を有する増
殖サイクルを使用して試験管内の細胞培養中で増
殖する場合にHBsAgを放つ細胞からのHBsAgの
収量が著しく増加することを見出した。各温度範
囲は上記の室温であり、最初の温度範囲は第２の
温度範囲より高い。最初の温度範囲は35〜約38℃
であり、一方第２の温度範囲は約30〜34℃であ
る。最初温度は約37℃そして第２の温度は約32℃
が好ましい。 さらにカフエインがHBsAgの収量を改良する
ために有効な量で試験管内の細胞培養栄養素培地
中に存在する場合、または試験管内の細胞培養が
例えば空洞繊維毛細管単位束または透析膜のよう
な透過性膜で行なわれる場合にさらに高い収量が
得られることを見出した。カフエインは収量にお
いて検出できる改良を及ぼすレベルで毒性の影響
を及ぼす以下のレベルまで存在させることができ
る。典型的にはカフエインは約0.0001〜0.007M
で、好ましくは約0.001〜0.003Mで使用する。 本発明の方法においてHBsAgを放つあらゆる
細胞を使用することができる。かかる細胞の具体
例はヒトの肝癌からクロンを多く産生するいくつ
かのヒトの肝癌およびチンパンジーに感染した肝
炎Ｂの肝細胞である。 ヒトの肝癌組織は栄養素培地の存在下で試験管
内で増殖する。栄養素培地は、試験管における細
胞の増殖を可能にするものを意味する。いくつか
の特異的な栄養素培地は具体的には培地199、モ
ルガン等、Proc.Soc.Exp.Biol ＆ Med.73：１
〜８ 1950年、基礎培地イーグル、イーグル科学
第122巻、第501〜504頁、1955年、インヴイト
ロ第６巻No.２ 1970年、ドウルベコの修飾された
イーグルの培地、ドウルベコ等、ウイルス学第８
巻、第396頁、1959年 スミス等、J.Virol.第12
巻、第185〜196頁、1960年、インヴイトロ 第６
巻 No.２ 1970年、最小特発性培地（イーグル）、
サイエンス第130巻、第432頁（1959年）および
RPMI培地、モーア等、第199巻、第519〜524頁、
1967年、インヴイトロ第６巻、No.２ 1970年であ
る。 HBsAgを放つ細胞は具体的には組織培養フラ
スコ、空洞繊維毛細管単位、または透析膜のよう
な技術的に公知のあらゆる適当な手段で増殖する
ことができる。 空洞繊維毛細管単位は細胞および臓器組織培養
のための基質を提供する多数の異方性空洞繊維膜
で形成される。これらの毛細管束は養分を有する
細胞集合の制御された還流を並びに排出した物質
の交換を可能にする３次元脈管系を形成する。毛
細管は非常に薄い（0.5〜1μｍ）スポンジ様の本
体、管腔側で細孔サイズを制御された（およその
範囲：0.001〜0.01μｍ）、極めて細い平滑層から
なる。表面から外に向つて細孔が周囲５〜10μｍ
にますます大きくなる。この構造は非常に低いか
あるいはゼロ圧でさえも液体に対して選択的なそ
して非常に高い透過性を有する独特の組合わせを
提供する。希望する膜の“切断”レベルの選択は
巨大分子の運搬の選択的制御を提供する。毛細管
の外側は細胞付着のための大きな表面が存在し、
そして細胞を管腔における障壁に透過させる。異
方性繊維膜は米国特許第3615024号に記載した通
り製造することができる。空洞繊維毛細管単位束
は米国特許第3821087号に記載した通り製造する
ことができる。 細胞の多くの型が空洞繊維毛細管単位、例えば
マウスの線維芽細胞、ヒトの胸および絨毛膜癌、
ラツトの膵臓、ラツトの下垂体腫、ラツト絨毛陰
窩、ヒトの肝細胞、ラツトの肝癌、サルの腎臓、
子供のハムスターの卵巣、およびラツトの肺で生
物学的な物質、調製および操作パラメータでいろ
いろに変えられて、増殖している一方、細胞の他
の型を有する特異的な行為は予側することができ
ない。 透析膜はガンブロR・ルンデイアR プレートの
ような平行流動透析器であることができる。 次の実施例は本発明を具体的に説明するもので
あるがそれらに限定されるものではない。 実施例１ （比較例） 毛細管束（ヴイタフアイバー 、アミコン空
洞、毛細管単位3S100）、250ml貯蔵ビン、フイン
ガーポンプおよびシラスチツク管（約２メート
ル）からなる一単位をオートクレーブしそして次
の方法で無菌条件下で組み立てる。 毛細管外隙（２ml）を新たに取入れた肝癌細胞
列（PLC／PRF／５、マクナブ等、Br.J.癌
（1976年）、第34巻、第509〜515頁）３×106細胞
の懸濁液で充填する。細胞を２時間静置し、次い
で全部の組立てた単位を湿つた37℃ CO2細菌培
養器中に入れる。10％胎児牛の血清を含有するイ
ーグルの最小特発性培地（MEM）、レーグルタ
ミン2mMおよびネオマイシン50μｇ／mlを２ml／
分の速度で毛細管単位を通して循環する。細胞の
増殖をグルコース利用によつて監視する。抗原試
料を毛細管外隙から採り、補体結合によつて定量
する。先行技術の通常の単一層の組織培養の結果
と共に結果を次の表に要約する。
するワクチンとして有効であることが知られてい
る。この抗原の通常の由来は例えば血漿搬出法に
よる供給者からの血漿である。その結果としてこ
の抗原を含有する血漿の供給はほとんどの血漿が
HBsAgがないので不確実でありそして不経済で
ある。 そのため試験管内でHBsAgを増殖する試みが
なされている。例えば試験管内でヒトの肝癌細胞
の組織培養が試験管内でHBsAgを痕跡量だけそ
して検出できない補体結合滴定量であるが産生す
ることが知られている。他方、肝炎Ｂ疾病に感染
したヒトは多量のHBsAg―約256の補体結合滴定
量で約1013粒子／mlを産生する。 従つて本発明の目的は高い滴定量および高純度
でHBsAgを調製する試験管内組織培養を提供す
るものである。他の目的はHBsAgを調製する改
良方法を提供するものである。さらにデーン粒子
のないHBsAgを提供することが目的である。本
発明のこれらのそして他の目的は次の説明から明
らかになる。 肝炎Ｂ表面抗原は高滴定量および高純度で試験
管内で二つの異なる上昇温度段階を有する増殖サ
イクルを用いてHBsAgを放つ細胞の組織培養か
ら産生される。 本発明は試験管内で肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）
を増殖する方法に関するものである。さらに詳細
にはHBsAgを放つ細胞を使用して高滴定量でそ
して高純度で試験管内でHBsAgを増殖する方法
に関するものである。 そこで細胞が二つの異なる温度範囲を有する増
殖サイクルを使用して試験管内の細胞培養中で増
殖する場合にHBsAgを放つ細胞からのHBsAgの
収量が著しく増加することを見出した。各温度範
囲は上記の室温であり、最初の温度範囲は第２の
温度範囲より高い。最初の温度範囲は35〜約38℃
であり、一方第２の温度範囲は約30〜34℃であ
る。最初温度は約37℃そして第２の温度は約32℃
が好ましい。 さらにカフエインがHBsAgの収量を改良する
ために有効な量で試験管内の細胞培養栄養素培地
中に存在する場合、または試験管内の細胞培養が
例えば空洞繊維毛細管単位束または透析膜のよう
な透過性膜で行なわれる場合にさらに高い収量が
得られることを見出した。カフエインは収量にお
いて検出できる改良を及ぼすレベルで毒性の影響
を及ぼす以下のレベルまで存在させることができ
る。典型的にはカフエインは約0.0001〜0.007M
で、好ましくは約0.001〜0.003Mで使用する。 本発明の方法においてHBsAgを放つあらゆる
細胞を使用することができる。かかる細胞の具体
例はヒトの肝癌からクロンを多く産生するいくつ
かのヒトの肝癌およびチンパンジーに感染した肝
炎Ｂの肝細胞である。 ヒトの肝癌組織は栄養素培地の存在下で試験管
内で増殖する。栄養素培地は、試験管における細
胞の増殖を可能にするものを意味する。いくつか
の特異的な栄養素培地は具体的には培地199、モ
ルガン等、Proc.Soc.Exp.Biol ＆ Med.73：１
〜８ 1950年、基礎培地イーグル、イーグル科学
第122巻、第501〜504頁、1955年、インヴイト
ロ第６巻No.２ 1970年、ドウルベコの修飾された
イーグルの培地、ドウルベコ等、ウイルス学第８
巻、第396頁、1959年 スミス等、J.Virol.第12
巻、第185〜196頁、1960年、インヴイトロ 第６
巻 No.２ 1970年、最小特発性培地（イーグル）、
サイエンス第130巻、第432頁（1959年）および
RPMI培地、モーア等、第199巻、第519〜524頁、
1967年、インヴイトロ第６巻、No.２ 1970年であ
る。 HBsAgを放つ細胞は具体的には組織培養フラ
スコ、空洞繊維毛細管単位、または透析膜のよう
な技術的に公知のあらゆる適当な手段で増殖する
ことができる。 空洞繊維毛細管単位は細胞および臓器組織培養
のための基質を提供する多数の異方性空洞繊維膜
で形成される。これらの毛細管束は養分を有する
細胞集合の制御された還流を並びに排出した物質
の交換を可能にする３次元脈管系を形成する。毛
細管は非常に薄い（0.5〜1μｍ）スポンジ様の本
体、管腔側で細孔サイズを制御された（およその
範囲：0.001〜0.01μｍ）、極めて細い平滑層から
なる。表面から外に向つて細孔が周囲５〜10μｍ
にますます大きくなる。この構造は非常に低いか
あるいはゼロ圧でさえも液体に対して選択的なそ
して非常に高い透過性を有する独特の組合わせを
提供する。希望する膜の“切断”レベルの選択は
巨大分子の運搬の選択的制御を提供する。毛細管
の外側は細胞付着のための大きな表面が存在し、
そして細胞を管腔における障壁に透過させる。異
方性繊維膜は米国特許第3615024号に記載した通
り製造することができる。空洞繊維毛細管単位束
は米国特許第3821087号に記載した通り製造する
ことができる。 細胞の多くの型が空洞繊維毛細管単位、例えば
マウスの線維芽細胞、ヒトの胸および絨毛膜癌、
ラツトの膵臓、ラツトの下垂体腫、ラツト絨毛陰
窩、ヒトの肝細胞、ラツトの肝癌、サルの腎臓、
子供のハムスターの卵巣、およびラツトの肺で生
物学的な物質、調製および操作パラメータでいろ
いろに変えられて、増殖している一方、細胞の他
の型を有する特異的な行為は予側することができ
ない。 透析膜はガンブロR・ルンデイアR プレートの
ような平行流動透析器であることができる。 次の実施例は本発明を具体的に説明するもので
あるがそれらに限定されるものではない。 実施例１ （比較例） 毛細管束（ヴイタフアイバー 、アミコン空
洞、毛細管単位3S100）、250ml貯蔵ビン、フイン
ガーポンプおよびシラスチツク管（約２メート
ル）からなる一単位をオートクレーブしそして次
の方法で無菌条件下で組み立てる。 毛細管外隙（２ml）を新たに取入れた肝癌細胞
列（PLC／PRF／５、マクナブ等、Br.J.癌
（1976年）、第34巻、第509〜515頁）３×106細胞
の懸濁液で充填する。細胞を２時間静置し、次い
で全部の組立てた単位を湿つた37℃ CO2細菌培
養器中に入れる。10％胎児牛の血清を含有するイ
ーグルの最小特発性培地（MEM）、レーグルタ
ミン2mMおよびネオマイシン50μｇ／mlを２ml／
分の速度で毛細管単位を通して循環する。細胞の
増殖をグルコース利用によつて監視する。抗原試
料を毛細管外隙から採り、補体結合によつて定量
する。先行技術の通常の単一層の組織培養の結果
と共に結果を次の表に要約する。
【表】
子牛の血清の除去は滴定量に少しも重要な効果
を有しないそしてさらにHBsAgの精製を容易に
する。 実施例 ２ 実施例１に使用したような空洞繊維毛細管単位
を３−４×106PLC／PRF／５細胞で充填する。
細胞を２週間実施例１に記載した通り処理する。
次いで単位の温度を32℃に低下し、その後この温
度に維持する。１日の試料をHBsAg用にそして
グルコース消費用に採りそして試験する。補体結
合滴定量１：32が得られるが、37℃では通常１：
８より高い滴定量は見出されない。さらにグルコ
ース消費が減少することは意味があり従つて因子
20によつて消費されるグルコース100mg当りイン
ミユノジエンの収量を増大させる。細胞培養の培養日数 補体結合滴定量 （日）７ １ 14 ２ 21 16 26 32 実施例 ３ 空洞繊維毛細管単位ヴイタフアイバー 3S100
をPLC／PRF／５細胞のクロンを産生する高
HBsAgから誘導される４×106細胞で充填する。
30分毎に空洞繊維単位を180゜回転する。２時間後
10％子牛の血清を含有するMEM、レーグルタミ
ン2mMおよびネオマイシン50μｇ／mlを５ml／分
の流動速度で毛細管を通して循環させる。２週間
後、５％CO2細胞培養器中37℃で単位の温度に低
下させそして実験の停止の間この温度を維持す
る。毛細管外隙の抗原試料を採りそして補体結合
によつて定量する。結果を次表に要約する。細胞培養の熟成 補体結合滴定量 （日）８ １ 12 ２ 16 ４ 18 ８ 実施例 ４ 空洞繊維毛細管単位（ヴイタフアイバー
3S1000）をPLC／PRF／５細胞のクロンを産生
する高HBsAgから誘導された６−７×106細胞で
充填する。30分毎に空洞繊維単位を180゜回転す
る。２時間後、10％子牛の血清を含有する
MEM、レーグルタミン2mMおよびネオマイシ
ン50μｇ／mlを流動速度５ml／分で毛細管を通し
て循環する。２週間後、37℃で５％CO2細胞培養
器中、最終濃度103Mでカフエイル溶液を循環培
地に添加する。単位の温度を32℃に下げ、実験停
止の間この温度に維持する。毛細管外隙の抗原試
料を採り、補体結合によつて定量する。結果を次
表に要約する。細胞培養の培養日数（日） 補体結合滴定量 32 64 39 128 50 128 68 156 実施例 ５ 肝癌細胞をプラスチツクの処分できる75cm2組織
培養フラスコ中で37℃において融合するまで増殖
せしめる。培地は実施例２で使用した培地と同じ
である。次いで組織培養フラスコを32℃に移し、
毎日新らたに培養液を加える（refed）。コントロ
ールとしてフラスコ２個を用い、上述した培地を
加える。他の２個のフラスコをさらに２×10-3M
カフエインを含有する同様の培地を加える。各グ
ループの上澄液をプールしそして試料を放射線免
疫分析によつて抗原に対して試験する。滴定量
（１：16希釈においてＰ／Ｎ比）を評価する。結
果を次表に要約する。培養日 コントロール細胞 カフエイン処理細胞 32℃ ４ ２ ６ ９ ４ ８
を有しないそしてさらにHBsAgの精製を容易に
する。 実施例 ２ 実施例１に使用したような空洞繊維毛細管単位
を３−４×106PLC／PRF／５細胞で充填する。
細胞を２週間実施例１に記載した通り処理する。
次いで単位の温度を32℃に低下し、その後この温
度に維持する。１日の試料をHBsAg用にそして
グルコース消費用に採りそして試験する。補体結
合滴定量１：32が得られるが、37℃では通常１：
８より高い滴定量は見出されない。さらにグルコ
ース消費が減少することは意味があり従つて因子
20によつて消費されるグルコース100mg当りイン
ミユノジエンの収量を増大させる。細胞培養の培養日数 補体結合滴定量 （日）７ １ 14 ２ 21 16 26 32 実施例 ３ 空洞繊維毛細管単位ヴイタフアイバー 3S100
をPLC／PRF／５細胞のクロンを産生する高
HBsAgから誘導される４×106細胞で充填する。
30分毎に空洞繊維単位を180゜回転する。２時間後
10％子牛の血清を含有するMEM、レーグルタミ
ン2mMおよびネオマイシン50μｇ／mlを５ml／分
の流動速度で毛細管を通して循環させる。２週間
後、５％CO2細胞培養器中37℃で単位の温度に低
下させそして実験の停止の間この温度を維持す
る。毛細管外隙の抗原試料を採りそして補体結合
によつて定量する。結果を次表に要約する。細胞培養の熟成 補体結合滴定量 （日）８ １ 12 ２ 16 ４ 18 ８ 実施例 ４ 空洞繊維毛細管単位（ヴイタフアイバー
3S1000）をPLC／PRF／５細胞のクロンを産生
する高HBsAgから誘導された６−７×106細胞で
充填する。30分毎に空洞繊維単位を180゜回転す
る。２時間後、10％子牛の血清を含有する
MEM、レーグルタミン2mMおよびネオマイシ
ン50μｇ／mlを流動速度５ml／分で毛細管を通し
て循環する。２週間後、37℃で５％CO2細胞培養
器中、最終濃度103Mでカフエイル溶液を循環培
地に添加する。単位の温度を32℃に下げ、実験停
止の間この温度に維持する。毛細管外隙の抗原試
料を採り、補体結合によつて定量する。結果を次
表に要約する。細胞培養の培養日数（日） 補体結合滴定量 32 64 39 128 50 128 68 156 実施例 ５ 肝癌細胞をプラスチツクの処分できる75cm2組織
培養フラスコ中で37℃において融合するまで増殖
せしめる。培地は実施例２で使用した培地と同じ
である。次いで組織培養フラスコを32℃に移し、
毎日新らたに培養液を加える（refed）。コントロ
ールとしてフラスコ２個を用い、上述した培地を
加える。他の２個のフラスコをさらに２×10-3M
カフエインを含有する同様の培地を加える。各グ
ループの上澄液をプールしそして試料を放射線免
疫分析によつて抗原に対して試験する。滴定量
（１：16希釈においてＰ／Ｎ比）を評価する。結
果を次表に要約する。培養日 コントロール細胞 カフエイン処理細胞 32℃ ４ ２ ６ ９ ４ ８
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 栄養素培地の存在下、上昇温度における第１
増殖段階およびより低い温度であるがなお室温以
上である上昇温度における第２増殖段階において
肝炎Ｂ表面抗原を放つ細胞を増殖させることを特
徴とする肝炎Ｂ表面抗原の製造方法。 ２ 第１段階が35〜約38℃で起る特許請求の範囲
第１項の方法。 ３ 第２段階が約30〜34℃で起る特許請求の範囲
第１項の方法。 ４ 第１段階が約37℃で起り、第２段階が約32℃
で起る特許請求の範囲第１項の方法。 ５ 増殖が透過性膜で起る特許請求の範囲第１項
の方法。 ６ 透過性膜が空洞繊維毛細管単位または平行流
動透析器である特許請求の範囲第５項の方法。 ７ 栄養素培地がHBsAgの収量を改良するため
に有効な量のカフエインを含有する特許請求の範
囲第１項の方法。 ８ カフエインを約0.0001〜0.007M量存在させ
る特許請求の範囲第７項の方法。 ９ カフエインを約0.001M量存在させる特許請
求の範囲第７項の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/090,169 US4301250A (en) | 1979-11-02 | 1979-11-02 | Method of producing hepatitis B surface antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5679625A JPS5679625A (en) | 1981-06-30 |
| JPH0156051B2 true JPH0156051B2 (ja) | 1989-11-28 |
Family
ID=22221612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15394780A Granted JPS5679625A (en) | 1979-11-02 | 1980-11-04 | Virus proliferation |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4301250A (ja) |
| EP (1) | EP0028567B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5679625A (ja) |
| AT (1) | ATE10806T1 (ja) |
| DE (1) | DE3069846D1 (ja) |
| DK (1) | DK462280A (ja) |
| ES (1) | ES8202059A1 (ja) |
| GR (1) | GR70783B (ja) |
| IE (1) | IE50695B1 (ja) |
| PT (1) | PT71977B (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1177753A (en) * | 1980-03-27 | 1984-11-13 | Paul M. Keller | Method of growing hepatitis b surface antigen background of the invention |
| US4393133A (en) * | 1980-06-12 | 1983-07-12 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Human hepatoma derived cell line, process for preparation thereof, and uses therefor |
| US4301249A (en) * | 1980-07-23 | 1981-11-17 | Merck & Co., Inc. | High titer production of hepatitis A virus |
| US4416986A (en) * | 1981-01-16 | 1983-11-22 | Merck & Co., Inc. | Methods of producing HBsAg |
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