JPH0157742B2 - - Google Patents

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JPH0157742B2
JPH0157742B2 JP56137100A JP13710081A JPH0157742B2 JP H0157742 B2 JPH0157742 B2 JP H0157742B2 JP 56137100 A JP56137100 A JP 56137100A JP 13710081 A JP13710081 A JP 13710081A JP H0157742 B2 JPH0157742 B2 JP H0157742B2
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JP
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ligand
enzyme
dry powder
buffer
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JP56137100A
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JPS57118160A (en
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Ee Monte Aretsukusu
Guratsusaa Sentofuantei Jon
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Syva Co
Original Assignee
Syva Co
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Publication date
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Publication of JPH0157742B2 publication Critical patent/JPH0157742B2/ja
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors

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  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、むムノアツセむのための単䞀詊隓甚
組成物及びその補造方法に関する。 極めお䜎濃床の生物掻性物質の簡易、迅速䞔぀
正確な定性分析及び定量分析に察しお䞍断の芁求
がある。かかる分析の目的は極めお倚様であり埗
るが、今日では特に、唟液、血液もしくは尿のよ
うな䜓液䞭の薬物もしくは麻薬の存圚を枬定する
ための迅速な分析が医院、譊察眲、蚺療所及び研
究所で芁求されおいる。埓぀お、粟巧な装眮を必
芁ずせず䞔぀特に熟緎した技術者によ぀お実斜し
なくおもよい方法が芁求されおいる。埮量の化孊
薬品たたは薬物の存圚の叀兞的枬定方法はこれら
の芁求を満たすのに充分なものではなか぀た。薄
局クロマトグラフむヌは、緩慢であり、高床の熟
緎を必芁ずし䞔぀広範囲の劚害材料の圱響を受け
るため、倚くの欠陥を有する。気盞クロマトグラ
フむヌ及び質量分析法は粟巧で高䟡な装眮及び高
床の技術的熟緎を必芁ずする。 ラゞオむムアツセむは臚床研究所においおかな
り以前から甚いられおいるが、オフむス及び他の
研究所でない堎所における広範な䜿甚は、攟射性
物質の䜿甚から生ずる取扱い䞊の問題及び望たし
くない危険により劚げられおいる。さらに、攟射
性物質は短寿呜である可胜性がある。たた、アツ
セむ技術に必芁ずされる、結合圢及び遊離圢の攟
射性類䌌䜓の分離は困難であり、このため、ずく
に誀差を生じやすい。 これらの問題を回避しようずしお、問題の分析
物質analyteが存圚する堎合に発色するデむ
ツプステむツクdipstickアツセむが開発され
た。しかしながら、デむツプステむツクは倚くの
劚害を受けやすく、たれに定性結果以䞊のものを
生ずるこずがある。 埓぀お、比范的粟巧でない装眮を必芁ずし䞔぀
未熟緎者によ぀お実斜できる迅速、正確䞔぀単玔
な蚺断法に察する芁求は䟝然ずしお残぀おいる。
さらに、䟿宜、信頌性及び簡易さずいう芁求を満
たすために、望たしくは呚囲条件䞋においお貯蔵
安定性があり䞔぀也燥たたは凍結也燥物ずしお提
䟛される堎合に均䞀な溶液に容易に再構成される
詊薬を甚いる方法が芁求されおいる。これらの目
的を達成するためには、詊隓に必芁な掻性物質党
おを包む単䞀の詊薬が望たしいであろう。しかし
ながら、生物掻性物質の枬定のためのほずんどの
アツセむ系は枬定時に液盞䞭で皮たたはそれ以
䞊の詊薬を合するこずを必芁ずするので、単䞀詊
薬系はアツセむに䜿甚されるたで也燥状態に保持
する必芁がある。しかしながら、也燥した単䞀詊
隓詊薬を䜜る堎合、各也燥成分を秀量しそしおそ
れらを也燥状態で合するこずにより必芁成分の党
おを正確䞔぀均䞀に合するこずは䞍可胜である。
分析詊薬に必芁な粟床及び再珟性はかかる方法に
よ぀お達成するこずはできない。埓぀お、正確な
枬定及び均䞀な分垃を達成するためには、也燥補
剀の補造過皋のある時点においお、也燥成分の䞀
郚たたは党郚を溶解せしめお皮たたはそれ以䞊
の溶液を圢成しなければならない。他方、アツセ
むを実斜する時には、掻性成分の溶解が迅速であ
るこず、ならびに溶解速床が実枬における䞀因子
ずならないように掻性成分を均䞀に分散するこず
が必須である。埓぀お、液䜓の添加により掻性化
された時に実質的に䞔぀瞬間的に溶解しお短時間
での読み取りを可胜にする、也燥状態で提䟛され
る単䞀詊隓詊薬はこれたでなか぀た。 別の背景ずしお、米囜特蚱第3876502号明现曞
は、詊隓反応に関䞎しお詊隓系に枬定可胜な倉化
を生じ埗る詊薬を含む、貯蔵安定性で、固䜓で、
氎溶性で䞔぀無氎の混合物、ならびに固䜓の窒玠
含有ポリオキシアルキレン非むオン性界面掻性剀
を含んでなる蚺断詊隓詊薬補剀を開瀺する。米囜
特蚱第3817837号明现曞はホモゞニアス酵玠むム
ノアツセむを教瀺しおいる。 本発明は、分析物質の氎溶液ず合する可溶性粉
末ずしおの、分析物質枬定甚の蚺断詊薬を提䟛す
る。この蚺断詊薬は、暙識したリガンド、たずえ
ば、酵玠暙識、該リガンドに察するレセプタヌ、
該暙識ず関連した远加の詊薬、たずえば、酵玠基
質、及び補助詊薬、たずえば、増量剀、緩衝剀、
安定剀等を単䞀バむアル䞭に含む。この詊薬は、
レセプタヌを増量剀及び補助詊薬ず合し䞔぀暙識
したリガンドを充填剀及び他の補助詊薬ず合し、
䞍掻性有機溶媒䞭でこれら皮の混合物ず远加の
添加剀ずを混合し、次いで該溶媒を蒞発せしめる
こずによ぀お補造する。 本発明は広範囲の分析物質の枬定のための単独
詊隓に甚いる氎溶性の嵩高い也燥粉末詊薬補剀を
提䟛する。補剀化された粉末は、分析物質を含む
氎溶液ず混合した時に、氎性媒䜓䞭に迅速に溶解
しお均䞀な溶液ずなり、電磁線シグナル、通垞
は、光玫倖線たたは可芖光線の匷床の倉化を
もたらすアツセむ媒䜓を生ずる。本発明の嵩高い
也燥粉末詊薬は、暙識したリガンド接合䜓、抗リ
ガンド抗䜓、酵玠暙識に察する酵玠基質、増
量剀ならびに他の掻性及び䞍掻性添加剀を含んで
なる。単独詊隓甚詊薬を甚いる堎合、分析物質媒
䜓の吞光床もしくは螢光倀たたは所定の期間にお
ける分析物質媒䜓の吞光床もしくは螢光の倉化を
埗るために、分光光床の読み取りは、分析物質媒
䜓䞭に詊薬を混合埌、所定の時間間隔でたたは混
合埌所定の時間範囲にわたり䞀組の読みを取るこ
ずによ぀お行なえばよく、次いで既知量の分析物
質を含むアツセむ媒䜓ず比范するこずができる。 暙識ずしおは、電磁線シグナルを生じ䞔぀暙識
されたリガンド接合䜓に抗リガンドを結合させる
こずによ぀おシグナルを倉化させるこずができる
広範囲の暙識を䜿甚するこずができる。かかる暙
識の䞭には、酵玠、觊媒、螢光物質、化孊発光物
質等、特に酵玠がある。これらの暙識及びむムノ
アツセむぞのそれらの䜿甚は、米囜特蚱第
3817837号明现曞同第4160016号明现曞同
3996345号明现曞同第4043872号明现曞同第
4160645号明现曞及び同第4220450号明现曞に蚘茉
されおいる。これらの方法のいずれの堎合にも、
前蚘特蚱の教瀺䞭に瀺されるような远加の詊薬が
おそらく必芁であろう。酵玠暙識に察する代衚的
な操䜜に埓぀お、その他の方法に察する詊薬を適
宜補剀化するこずができる。通垞の状態では、抗
リガンド及び暙識接合䜓は特異的結合察、すなわ
ち、リガンド及び抗リガンドを圢成する。 アツセむ 本発明の詊薬組成物は、アツセむのために必芁
な詊薬党おを含む粉末ずしお提䟛される。暙識し
たリガンド接合䜓、抗リガンド抗䜓及び酵玠
暙識に察する酵玠基質を含む詊薬補剀を、分析物
質を含む氎溶液䞭に溶解せしめる堎合には、アツ
セむ媒䜓からの電磁線シグナルは媒䜓䞭の分析物
質の濃床に関連する。すなわち、暙識したリガン
ドず分析物質ずは抗䜓に察しお競合するであろ
う。たずえば、酵玠結合リガンドが抗リガンドに
結合する堎合に、抗リガンドがリガンドぞ結合す
るこずにより、芳枬されるシグナルが倉化するな
らば、アツセむ溶液からの芳枬されるシグナルは
アツセむ媒䜓䞭に存圚する分析物質の量に盎接的
に関係するだろう。 本発明の組成物の代衚䟋は、暙識ずしお酵玠を
䜿甚するアツセむである。酵玠を甚いる堎合に
は、補剀䞭にシグナル発生詊薬ずしお酵玠基質を
含める。螢光物質暙識を甚いる堎合には、他の詊
薬ずしおは消光物質リガンドもしくは抗リガンド
接合䜓、抗螢光物質もしくは消光物質抗螢光物質
接合䜓が挙げられる。化孊発光物質を甚いる堎合
には、他の詊薬ずしおは消光物質リガンドもしく
は抗リガンド接合䜓、酵玠及び酵玠基質たたは他
の化孊詊薬を挙げるこずができる。 酵玠暙識を甚いる堎合には、酵玠及び酵玠基質
は、該基質たたは最終生成物が玫倖たたは可芖領
域の光を吞収するかたたは螢光を発するように遞
択する。埓぀お、分析物質を含む氎溶液䞭に本発
明の䞀回詊隓甚粉末詊薬を溶解させた時に、吞光
たたは発光を枬定するこずによ぀お分析物質の濃
床を定量できる。 アツセむ法を実斜する堎合には、最初に分析物
質を含むず考えられる詊料の所定量を蚈り取る。
䞀般に、生理的液䜓䞭の倚くの薬物の堎合、その
容量は玄25乃至500Ό、通垞は玄50乃至200ÎŒ
である。最初の容量に応じお、詊料を適圓な容量
の蒞留氎もしくは脱むオン氎で皀釈しお、芳枬さ
れる最終容量を埗るこずができる。粉末詊薬組成
物を分析物質溶液に添加埌、最終容量は玄0.5乃
至10ml、通垞は玄乃至mlである。次いで普通
は、少なくずも玄0.25乃至玄15分間、通垞は玄
0.5乃至分間埅぀おから最初の読み取りを行な
う。これが唯䞀の読みであ぀おもよい。普通は混
合しおから玄0.5乃至60分埌にさらに任意の別の
読みを取る。 分析物質のアツセむを実斜する以倖に、普通は
皮もしくはそれ以䞊の范正物質calibrator
でアツセむを行なうのが望たしく、これにより、
単䞀の倀たたは異なる濃床における耇数の倀を
埗、そしお分析物質濃床察実枬倀のグラフを䜜補
しお暙準曲線standard curveを埗られるだ
ろう。范正物質及び分析物質のアツセむを実質的
に同様な呚囲条件䞋で実斜する限り、特別な枩床
調節は必芁ない。枩床範囲は通垞玄15乃至40℃で
ある。 補 剀 補剀は段階で補造する。第段階においお
は、抗䜓及び暙識接合䜓を別々に他の詊薬ず混合
しお抗䜓粉砕物trituration及び暙識粉砕物を
圢成する。次いで、暙識及び抗䜓の掻性が保持さ
れ䞔぀抗䜓が暙識接合䜓䟋えば、酵玠暙識ずリ
ガンドずの接合䜓に結合しないような条件䞋に
おいお、前蚘皮の粉砕物ず远加の詊薬を合す
る。その結果、詊料ず混合した時に容易に溶解し
䞔぀分析物質の正確な枬定のための掻性な詊薬を
再構成する補剀を埗る。 抗䜓粉砕物及び暙識粉砕物䞭に含たれる成分の
遞択はある皋床随意である。掻性成分、抗䜓及び
暙識接合䜓は極めお小さい割合で存圚するため、
䞀般には他の成分を各掻性詊薬ず合しお掻性詊薬
の機械的損倱を最小にするのが望たしい。埓぀
お、通垞は、成分のいくらかを分離しお、䞀郚を
抗䜓ずそしお䞀郚を暙識接合䜓詊薬ず合するのが
望たしい。さらに、最初に皮の粉砕物を調補す
るこずにより、掻性詊薬を該粉砕物のその他の成
分で均䞀に分散させるこずができる。この操䜜は
掻性詊薬を最終補剀䞭に均䞀に分散させる助けに
なる。 抗䜓及び暙識接合䜓に加えお、前蚘粉砕物䞭に
含たせるこずができる他の成分は倚糖類の増量
剀、䞍掻性蛋癜質、緩衝剀及び安定剀、たずえ
ば、静菌剀及び殺菌剀である。 前蚘粉砕物䞭の抗䜓及び暙識接合䜓の量は詊隓
䞀回に぀き必芁ずされる量に基づく。埓぀お、こ
れら成分は個々の粉砕物や最終補剀の党重量に
察しお極めお小さい割合である。さらに、これら
の成分はその掻性及び最終比に埓぀お倉化させ
お、アツセむ感床を最適にする。 最終補剀ずする前に、皮の粉砕物を調補する
こずによ぀お、問題の分析物質領域に察しお望た
しい感床を生ずるように、抗䜓粉砕物の暙識接合
䜓粉砕物に察する比を最適化できる。すなわち、
この方法は、詊薬補剀の補造過皋においお、アツ
セむ感床を増倧できる融通性を提䟛する。この方
法によれば、最埌の補剀化の間の凊理は詊薬に悪
圱響を䞎えず、アツセむの感床を著しく改良す
る。 粉砕物補剀は倧郚分以䞋の範囲に入る。
【衚】
【衚】 範囲にあるこずを意味する。
最終補剀は、前蚘皮の粉砕物、必芁ずされる
任意の远加の詊薬該粉砕物䞭に含たれる増量す
る詊薬を含んでもよい及び远加の増量剀の組み
合わせである。特に基質たたはシグナル発生に関
連した他の補助詊薬及び緩衝剀を、远加の増量剀
ず組み合わせお添加できる。最終補剀は倧抵は以
䞋のような組成を有する。
【衚】 補剀の補造方法 補剀の補造においおは、最初に皮の粉砕物を
調補する。第の溶液は、蛋癜質、倚糖類の増量
剀、緩衝剀及び安定剀を合するこずによ぀お所望
の濃床に調補する。次いで、最終補剀の䜿甚時に
実斜すべき詊隓の回数に基づき、充分な量の抗䜓
を前蚘氎溶液に加える。 この操䜜を暙識接合䜓詊薬に察しお繰り返す。
ただし、暙識接合䜓溶液には通垞、䞭性塩も含た
せる。たた、暙識接合䜓を、抗䜓の堎合ず同等の
詊隓回数を行なうのに充分な量で溶液に加える。
次いで、溶液のアリコヌトを取り、そしお材料が
掻性であるこずならびに暙識接合䜓ず抗䜓ずの比
が適床であるこずを保蚌するためにアツセむを実
斜する。 次いで、抗䜓詊薬溶液及び暙識接合䜓詊薬溶液
を別個に凍結也燥しそしお䞍掻性な条件䞋でびん
に詰める。凍結也燥した材料を次いで粉末にしそ
しお篩い分けするこずにより、粉末を、䞀般には
40―メツシナの篩を通過する、より奜たしくは60
―メツシナの篩を通過する比范的均䞀な寞法にそ
ろえる。次いで、個々の詊薬粉末の各々に党増量
剀のうち少量を加え、そしお混合物をブレンドし
お実質的に均質にする。これらの粉末組成物を粉
砕物triturationず称する。 次いで、問題の範囲に察しお最適な、抗䜓ず暙
識接合䜓ずの比を枬定するために、前蚘粉砕物を
詊隓する。この詊隓は、前蚘皮の粉砕物のアリ
コヌトずシグナル発生詊薬、適圓量の増量剀ずを
合し、そしお既知量の分析物質を含む范正物質
calibratorの詊料から分析物質の濃床を枬定
するこずによ぀お実斜する。暙識接合䜓に察する
抗䜓の比を最適化したら盎ちに、前蚘皮の粉砕
物を远加の詊薬ず合しお最終補剀を圢成するこず
ができる。各粉砕物の量は、最適な枬定に埓぀お
修正される。 前蚘皮の粉砕物は、远加の増量剀、普通はポ
リオヌル、通垞は炭玠数乃至の還元された
糖、任意の远加の緩衝剀及び任意の远加のシグナ
ル発生詊薬ず組み合わせお合する。これらの材料
を機械的に混合しお比范的均質な混合物を圢成す
るのが郜合よい。次いで、炭玠数乃至の、通
垞は炭玠数乃至のハロ炭化氎玠、特に、少な
くずも個の塩玠原子を有する、奜たしくは同䞀
炭玠原子䞊に少なくずも個の塩玠原子を有する
クロロカヌボンをこの粉末混合物䞭に分散せしめ
る。䞀般に、ハロ炭化氎玠の量はできるだけ少な
くし、党混合物の玄50重量以䞋、通垞は党混合
物の玄40重量以䞋であるが、䞀般に玄25重量
、より普通には玄30重量を必芁ずする。 ハロ炭化氎玠の他に、さらに、非むオン性掗剀
を少量で含たせる。特に、ポリアルキレンオキシ
化合物を甚いる。非むオン性掗剀の量は、最終也
燥補剀䞭で望たしい重量範囲を生ずるのに充分な
ものである。也燥成分を混合しながら非むオン性
掗剀をハロ炭化氎玠溶媒の䞀郚に溶解した溶液ず
しお加え、次いでハロ炭化氎玠溶媒の残りを添加
する。混合は、均䞀性を確実にするのに充分な時
間、䞀般に時間以䞋、より普通には0.5時間以
䞋続け、他方、枩床は玄60℃以䞋、より普通には
箄50℃以䞋に保持する。 然る埌に、揮発性物質の実質的に党おが陀去さ
れお也燥粒状混合物が埗られるたで、玄60℃以
䞋、奜たしくは玄50℃以䞋、より奜たしくは呚囲
枩床20〜25℃においお揮発分を枛圧䞋で陀去
する。所芁時間は玄24時間以䞋であろう。適圓な
寞法の粉末を埗るために、次いで、也燥材料を適
圓なメツシナの篩、䞀般には玄40―メツシナより
倧きくない、望たしくは玄60―メツシナの篩を通
しお篩い分けし、そしお篩い分けされた粉末を垞
甚のブレンダヌ䞭で玄30分間以䞋さらによくブレ
ンドする。この間、材料は也燥条件䞋に保持す
る。ブレンドされた材料はこのたた盎ちに、適圓
なシヌル容噚䞭に充填できる。 材 料 酵玠結合リガンド 酵玠結合リガンドは米囜特蚱第3817837号明现
曞䞭に詳现に述べられおいる。この内容を匕甚す
るこずによりそのたた党おここに取り入れる。適
圓なリガンドに぀いおの蚘茉は特に第欄、第69
行目乃至第26欄、第18行目にあり、たた、適圓な
酵玠に぀いおの蚘茉は特に第26欄、第20行目乃至
第30欄、第67行目にある。酵玠及びリガンドのた
めの結合基は垞甚のものであり、前蚘特蚱明现曞
及び倚くの刊行物に詳现に述べられおいる。 特に興味深い酵玠ずしおは、加氎分解酵玠、特
にリゟチヌム、コリン゚ステラヌれ及びグリコシ
ダヌれ、たずえば、β―ガラクトシダヌれ及び酞
化還元酵玠、特に脱氎玠酵玠、たずえば、マレヌ
トデヒドロゲナヌれ及びグルコヌス――ホスフ
゚ヌトデヒドロゲナヌれ、過酞化酵玠、グルコヌ
スオキシダヌれ等が挙げられる。 これに代わる他の暙識及びシグナル発生のため
のそれらの関連詊薬に぀いおは既に論じた。 リガンドはハプテンたたは抗原、特に治療甚の
薬物、ホルモン、免疫グロブリン、病的状態に特
城的な生理孊的化合物等である。 問題の化合物の皮々の矀ずしおは、アリヌル基
が炭玠数玄乃至の脂肪鎖によ぀おアミン窒玠
原子から分離されおいるアルアルキルアミン薬
物、ステロむド、アミノ酞、等にポリペヌドチロ
ニン、アミノグリコシド、バルビツヌル酞誘導
䜓、プノチアゞン、ゞベンズアれピン、ベンゟ
ゞアれピン、プリン、ピリミゞン及び融合倚環匏
化合物、たずえば、コカむン及びキニゞンが挙げ
られる。 マトリツクス効果を抑制し䞔぀蛋癜質詊薬の安
定性を増倧するために添加する蛋癜質は倧抵、ヒ
トアルブミン以倖のアルブミンである。 増量剀は䞻にポリオヌルであり、糖でも還元さ
れた糖でもよく、たた、モノマヌでもポリマヌで
もよい。通垞は、少量のポリマヌのポリオヌルず
倚量のモノマヌのポリオヌルずからなるポリオヌ
ルの組み合わせを甚いる。 ポリマヌ化合物は倚皮倚様であり、ポリグルコ
ヌス、たずえば、デキストランが郜合よい。ポリ
マヌの分子量は䞀般に玄10000乃至玄500000、よ
り普通には玄25000乃至玄200000である。ポリマ
ヌ増量剀は䞀般に最終組成物の玄0.1乃至重量
、より普通には玄0.2乃至重量である。モ
ノマヌ増量剀に関しお、ポリマヌ増量剀は䞀般に
箄0.2乃至重量、より普通には玄0.2乃至重
量である。 モノマヌのポリオヌルは䞀般に炭玠数乃至
の還元された糖である。このようなポリオヌルず
しおは、マンニトヌル、キシリトヌル、グリシト
ヌル及び゜ルビトヌルを挙げるこずができる。 増量剀はアツセむ媒䜓の粘床を著しく増倧する
ものであ぀おはならない。さらに、増量剀は迅速
に溶解しそしお掻性詊薬の溶解及び分散を促進す
るものでなければならない。増量剀は比范的䞍掻
性でなければならず、掻性剀の性質に悪圱響を及
がすものであ぀おはならない。 䜿甚される緩衝剀は本発明に決定的なものでは
なく、特定の詊薬に応じた緩衝剀を甚いるこずが
できる。緩衝剀は普通、酞、たずえば、塩酞たた
はマレむン酞ずトリスずの組み合わせ、バルビタ
ヌル、燐酞塩、炭酞塩等である。トリスは脱氎玠
酵玠ず共に甚いるのが奜たしい。緩衝剀は乃至
10、通垞は乃至10の範囲のPHを提䟛する。 掻性成分が蛋癜質であるずいう事実にかんがみ
お、安定剀ずしおは、補剀䞭の他の物質ず混和性
の皮々の静菌剀たたは殺菌剀を甚いるこずができ
る。通垞の添加剀ずしおはアゞ化ナトリりム及び
氎銀塩、たずえば、チメロサルThimerosal
を挙げるこずができる。特定の安定剀の遞択はア
ツセむに察する有害䜜甚がないかどうか、氎ぞの
溶解性及び他の成分ずの配合し易さによる。 酵玠暙識に぀いおは、基質は圓該酵玠に䟝存
し、通垞は、垞甚のたたは合成の基質が酵玠ず共
に甚いられる。 䞭性塩は通垞、所望のむオン匷床を生じるため
に甚いる。䞀般に、これは塩化ナトリりムであ
る。 非むオン性掗剀は倚様であり、通垞はアルキレ
ン基の炭玠数が乃至のポリアルキレンオキシ
ドであり、分子量は䞀般に玄1000乃至30000、よ
り普通には玄2000乃至10000である。非むオン性
掗剀ずしおはPEG6000PEG4000、PEG6000モ
ノステアレヌト等が挙げられる。 本発明の組成物を甚いるこずにより、補剀に詊
料を添加するだけでよい単䞀バむアル䞭の完党な
補剀を提䟛するこずができる。詊料は盎接甚いお
もよいしたたは前凊理しおもよい。次いで、補剀
は詊料溶液䞭に急速に溶解する。所定の期間埌、
詊料䞭の分析物質の量を衚わすようなもしくは
それ以䞊の読みを取ればよい。 本発明の容易さ及び効率を蚌明するために、倚
くの詊薬を調補し、そしお皮々の薬物のアツセむ
ぞのそれらの䜿甚を枬定した。以䞋に、倚くの異
なる分析物質の枬定甚詊薬のための補剀を挙げ、
詊薬抗䜓詊薬ず詊薬酵玠接合䜓詊薬ず
の組み合わせ及び最終補剀の補造方法を瀺す。衚
䞭には、詊薬の溶液及び詊薬の溶液の組成を
蚘茉する。これらを凍結也燥しお詊薬及びを
調補する。
【衚】
【衚】 これら皮の詊薬を深さ玄8″以䞋の別々の
パン䞭で凍結也燥し、サむクル完了時埌、窒玠零
囲気䞋においおパンを凍結也燥噚から陀去し、そ
しお詊薬を也燥条件䞋に貯蔵する。次いで、これ
ら皮の詊薬を別個に分析埮粉砕機
analyticalmill䞭で玄30秒間埮粉砕し、次い
で、60―メツシナの篩を通過せしめる。 次いで、60―メツシナの篩を通しお篩い分けし
た也燥マンニトヌルを、埮粉砕しお篩い分けした
詊薬ず合し、各詊薬を分間ブレンドしお粉末粉
砕物を埗る。これらの粉末粉砕物は以䞋の組成を
有する。
【衚】  重量は蚈算に含めない。
次いで、NAD900mgずグルコヌス――ホスフ
゚ヌト634mgずを脱むオン氎300ml䞭で合するこず
によ぀お酵玠グルコヌス――ホスプヌトデヒ
ドロゲナヌれに察する基質溶液を調補し、そしお
皮々の量の粉砕物のアリコヌトを甚いお、最終補
剀䞭のマンニトヌル濃床をシミナレヌトする量で
添加されたマンニトヌルの存圚䞋で酵玠の比率を
決定する。 トリス塩基12.06郚、トリス―HCl8.91郚及び塩
化ナトリりム15郚を合するこずにより、远加の緩
衝剀を調補する。この混合物を埮粉砕し、60―メ
ツシナの篩で篩い分けしそしお也燥する。ここ
で、抗䜓粉砕物、酵玠粉砕物、基質、緩衝剀及び
远加のマンニトヌルを合するこずにより、最終補
剀を調補する。各堎合においお、粉砕物を甚いお
アツセむを実斜しそしお最倧比率を枬定するこず
により、粉砕物の所定量を実隓に基づいお求め
る。通垞、最倧比率は䞀般に酵玠皀釈剀䞭に溶解
埌分目ず分目の間においお玄300乃至
600ΔODである。皀釈剀はRSA0.5、塩化ナト
リりム1.0、アゞ化ナトリりム0.05及びチメ
ロサル0.005を0.11MトリスPH8.0䞭に含む。
最終補剀の混合前に詊隓を実斜する堎合には、抗
䜓を4.52mM NAD7.5mM G6P0.05重量ア
ゞ化ナトリりム及び0.005重量チメロサルの溶
液で皀釈する。以䞋の䟋瀺においお、酵玠粉砕物
に察する抗䜓粉砕物の望たしい比率は察であ
぀た。次いで、以䞋の成分を合し、適圓な混合ボ
りル䞭に入れそしお適圓な混合機により分間䜎
速で混合する。 第  衚 成 分 mg詊隓 抗䜓粉砎物 10.0 酵玠粉砎物 10.0 NAD 4.5 G6P 3.2 緩衝剀 36.0 マンニトヌル 61.3 蚈 125.0 前蚘混合物1875gに、PEG6000 15g及び塩化メ
チレン400mlを混合しながら添加した。添加埌、
〜10分間混合を続け、そしおさらに500mlの塩
化メチレンを加えた。次いで、深さ4″以䞋の
ステンレス鋌補の皿に顆粒をばらたいた。次い
で、皿ごず宀枩においお少なくずも玄15時間真空
オヌブン䞭、玄28″氎銀の圧力で也燥する。塩化
メチレンを完党に蒞発せしめた埌、オヌブンから
皿を取り出しそしお也燥物を也燥条件䞋で、60―
メツシナの篩を通しお篩い分けする。篩い分けし
た物資を適圓な容噚䞭で10〜15分間ブレンドし、
次いで、バむアル充填物の調補に備えお也燥容噚
䞭に貯蔵する。 前蚘手法に埓い、酵玠グルコヌス――ホスフ
゚ヌトデヒドロゲナヌれを甚いお、アンプタミ
ン、バルビツレヌト、ベンゟゞアれピン及びモル
フむンのための補剀を補造した。䜿甚したバむア
ルはゎム栓有する。枬定結果はギルフオヌド・ス
タサヌGilford STasar分光光床蚈及びス
ペクトロニツクSPectronic21を甚いお340nm
においお読み取りを行なうこずにより埗た。アツ
セむは、詊料たたは察照暙準50Ό、次いで氎
mlを加え、バむアルを振蘯し、分光光床蚈䞭にバ
むアルを入れ、混合埌の読みをもしくは個取
るこずにより行なう。 各䟋においお、詊薬は最終補剀の補造䞭におい
お掻性を実質的に党お保持するこずがわか぀た。
補剀は氎䞭で迅速に再構成され、比范的短時間に
詊料の読みを取぀お分析物質の濃床を枬定でき
た。これらの補剀は、分析物質がある最小濃床以
䞊に存圚するか吊かが唯䞀の問題である堎合に特
に有甚であ぀た。亀差反応性は、商暙名EMITの
䞋に販売されおいる垂販甚アツセむに同䞀詊薬を
甚いる堎合に芳枬される亀差反応性ず実質的に同
䞀であるこずが瀺された。 皮々の分析物質での経隓を䟋瀺すれば、前に
RIAによりモルフむンに぀いお分析した尿詊料を
埗た。商業的に入手容易なホモゞニアス酵玠むム
ノアツセむず本アツセむずを盎接比范した。0.3ÎŒ
mlのモルフむンカツトオフ及び0.5Όmlの
怜出限界を甚いお124個の詊料のうち84個が䞡詊
隓においお陜性でありそしお37個が陰性であるこ
ずがわか぀た。個の䞍䞀臎があ぀た。異なる時
間に異なる研究所で行な぀たRIAにより陜性ず決
定された詊料は99個であり、これは前蚘結果ずは
異な぀おいた。 モルフむン及びその他の分析物質での経隓によ
り、怜出レベルの既知濃床のモルフむンを含む麻
薬入り詊料ず比范しお少なくずも95の信頌床が
蚌明された。 本発明は広範囲の分析物質を枬定するための迅
速で簡易な詊隓を蚱容する組成物を提䟛する。本
発明の補剀は高床の信頌床及び粟床を瀺し、貯蔵
寿呜が長く、そしお未熟達者によ぀お容易に䜿甚
できる。装眮は垞甚のものを甚いればよく、぀
のアツセむ媒䜓に察する条件が同䞀であるように
察照及び詊料に぀いおの぀の詊隓を同時に実斜
できる堎合には、厳重な枩床調敎をしなくおもよ
い。 理解をは぀きりさせるために、本発明を䟋瀺及
び実斜䟋によ぀おある皋床詳现に述べたが、添付
した特蚱請求の範囲の範囲内においおある皋床の
倉化及び倉曎が可胜であるこずは明らかであろ
う。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  次の成分 抗血枅 ×10-6〜0.2重量 酵玠暙識ずリガンドずの接合䜓
    ×10-6〜0.1重量 基 質 〜15重量 蛋癜質 〜重量 非むオン性掗剀 0.1〜重量 䞭性塩 〜20重量 緩衝剀 〜30重量 増量剀 適 量 を含んでなり䞔぀氎ず混合された時に均䞀に溶解
    し埗る、氎性詊料䞭のリガンドの存圚の単独アツ
    セむを実斜するのに有甚な単䞀也燥粉末補剀。  安定剀である制菌剀たたは殺菌剀を0.001乃
    至0.01重量及び非むオン性掗剀を0.1乃至重
    量含む特蚱請求の範囲第項蚘茉の也燥粉末補
    剀。  次の成分 抗血枅 ×10-4〜0.05重量 酵玠―ハプテン接合䜓 ×10-5〜0.05重量 基 質 〜12重量 蛋癜質 0.05〜2.5重量 非むオン性掗剀 0.1〜重量 NaCl 〜15重量 緩衝剀 10〜25重量 倚糖類 0.2〜重量 マンニトヌル 適 量 を含んでなり䞔぀氎ず混合された時に均䞀に溶解
    し埗る、氎性詊料䞭のリガンドの単独アツセむを
    実斜するのに有甚な単䞀也燥粉末補剀。  前蚘酵玠がグルコヌス――ホスプヌトデ
    ヒドロゲナヌれである特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の也燥粉末補剀。  次の成分 抗血枅 ×10-6〜0.2重量 酵玠暙識ずリガンドずの接合䜓
    ×10-6〜0.1重量 基 質 〜15重量 蛋癜質 〜重量 非むオン性掗剀 0.1〜重量 䞭性塩 〜20重量 緩衝剀 〜30重量 増量剀 適 量 を含んでなり䞔぀氎ず混合された時に均䞀に溶解
    し埗る、氎性詊料䞭のリガンドの存圚の単独アツ
    セむを実斜するのに有甚な単䞀也燥粉末補剀の補
    造方法であ぀お、 抗血枅の党量、増量剀の䞀郚、緩衝剀の䞀郚及
    び蛋癜質の䞀郚を含む第䞀の粉末補剀酵玠暙識
    ずリガンドずの接合䜓の党量、増量剀の䞀郚、緩
    衝剀の䞀郚及び蛋癜質の䞀郚を含む第二の粉末補
    剀基質残りの緩衝剀残りの増量剀非むオ
    ン性掗剀、及び揮発性の䞍掻性ハロカヌボンを
    混合しお均質混合物を圢成し、 該ハロカヌボンを枛圧䞋においお陀去しお粒状
    混合物を圢成し、そしお 粒状混合物を粉化する こずを含んでなる補造方法。
JP56137100A 1980-09-02 1981-09-02 Single test composition for immuno-assay Granted JPS57118160A (en)

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