JPH0158951B2

JPH0158951B2 -

Info

Publication number: JPH0158951B2
Application number: JP3810684A
Authority: JP
Inventors: Hikari Kimura; Toyofumi Mya; Hiroshi Gushima
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-02-29
Filing date: 1984-02-29
Publication date: 1989-12-14
Also published as: JPS60180592A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はグルタチオン生合成酵素の遺伝子をエ
シエリヒア．コリ（E.Coli）系ベクターに組込ん
だ組換えプラスミドに関する。グルタチオンはグルタミン酸、システイン、グ
リシンよりなるトリペプチドであり、広汎な肝疾
患の治療薬として、また試薬として頻用される重
要な化合物である。従来グルタチオンは有機合成
あるいは微生物（特に酵母）菌体から抽出する方
法で製造されているが、前者は反応工程の長さと
その複雑さにおいて、また後者は煩雑な操作と菌
体内低含量のために必ずしも有利な方法とは言え
ず、より効率の優れた生産方法の開発が望れてい
る。かかる現状に鑑み、本発明者らは、生化学的
手法と遺伝子組換え技術を組み合せることによ
り、大腸菌を形質転換してグルタチオン合成活性
を与え、この大腸菌を培養することによりグルタ
チオンを高い生産性で製造することに成功した。
グルタチオン（以下GSHと略称する）は、アデ
ノシン−5′−三リン酸（以下ATPと略称する）
を反応に要する２種の酵素γ−グルタミル−Ｌ−
システイン合成酵素（以下GSH−と略称する）
とグルタチオン合成酵素（GSH−と略称する）
によつて触媒されグルタチオン酸、システインお
よびグルタチオンより生合成される。すでに本発
明者らは遺伝子組換えによつて一つのベクタープ
ラスミド内にGSH−およびGSH−の両遺伝
子を組み込み、該組換えプラスミドを大腸菌に導
入することによつてGSH−、GSH−活性が
同時に増強された大腸菌を取得し、この菌株が
GSH生産菌株として優れていることを明らかに
した（特願昭57−170727）。本発明者らはさらに、
その技術の改良に鋭意研究の結果、GSH−の
遺伝子（以下gshと略称する。）を小型化し、
大腸菌内で安定に保持される組換えプラスミドを
作成した。すなわち本発明は、大腸菌の染色体
DNAを制限酵素Hindおよび制限酵素BamH
で処理することにより得られる２つのMlu切断
部位を有しグルタチオン合成酵素の遺伝子を担う
0.9MdのDNA断片を、エシエリヒア・コリ系ベ
クターに組込んだ、大腸菌内にて複製できる組換
えプラスミドにかかわる。また、律速因子となつ
ているGSH−の遺伝子（以下gshと略称す
る。）を複数個組込むことにも成功し、そしてこ
れらgshおよびgshを組み合わせた組換えプ
ラスミドを作成し、大腸菌に導入することによ
り、安定でGSH生成能の更に増強された大腸菌
を取得することができた。本発明はこの小型化に
より安定化されたgshおよび律速因子である
gshを単数または複数個組込んだ組換えプラス
ミドにもかかわる。以下本発明をGSH−遺伝子の制限酵素によ
る小型化による安定化、GSH−遺伝子の複数
個の組み込み、さらにそれら等によるグルタチオ
ンの製造の順に説明する。なお、本発明で使用す
るベクターはE.coli系のコピー数が比較的多いベ
クターブラスミドあるいはフアージ等であれば特
に限定されるものでないが、pBR325のプラスミ
ドを使用した場合について説明する。 GSH−遺伝子の小型化による安定化 GSH−遺伝子を含む組換えプラスミドとし
ては、特願昭57−170727に記載したエシエリヒ
ア．コリーＢ（E.coliB）株の変異株であるRC912
由来の染色体DNAを、制限酵素Hindで処理し
て取得される組換え体DNA：pBR322−gsh
〔分子量4.2Mdで1.6Mdに相当するRC912染色体
DNA断片をpBR322のHind部位に挿入した構
造を有する（第１図参照）〕が用いられる。この
pBR322−gshを適当な１種類又は２種類の制
限酵素で処理して、GSH−遺伝子を含むDNA
断片を常法、たとえばMethod in Enzymology
68176〜182（1979）に記載の方法に従つてアガロ
ース電気泳動によつて単離する。使用する制限酵素は、GSH−遺伝子を単離
できるものであれば何でも良いが、BamH又
はBamHとHindの組み合せが好適に用いら
れる。以下BamHを用いた場合について述べ
る。このBamHで断片化したGSH−遺伝子
を含むDNA断片（以下gshｂと略称する。）と
ベクタープラスミドpBR325のBamH処理物を
混合後、T₄フアージ由来のDNAリガーゼで連結
することによつて組換えDNAを調製することが
できる。組換えDNAの導入は、Molec.gen.
Genet.vol.124pp1〜10（1973）に記載のカルシウ
ムイオン処理で行うことができる。組換えDNA
を含有する菌株の選択は、テトラサイクリン（以
下Tcと略称する。）に対する感受性を指標として
行うことができる。すなわち、目的とする
pBR325−gshｂを含有する株は、Tcを20μ
ｇ／ml含むＬ−培地〔酵母エキス0.5％、グルコ
ース0.1％、NaCl0.5％、ペプトン1.0％（PH7.2）〕
では生育できないが、Cmを20μｇ／ml含むＬ−
培地では生育する菌として選択できる。かくして
制限酵素BamHで小型化したGSH−遺伝子
を組み込んだ組換えDNAを含有する菌が取得で
きる。この菌株の組換えプラスミドの菌体内での保持
安定性およびGSH−活性について従来の
pBR322−gshを含有するC600_r-n-株を対照と
して調べた結果を第２図および第１表に各々示
す。本発明の組換えプラスミドは酵素活性を犠性に
することなく保持安定性が著しく改善されてい
る。【表】組換えプラスミドの菌体内での保持安定性は、
該菌株をＬ−寒天培地に24時間ごとに値継いで、
その一部について組換えプラスミドの保持をCm
耐性の有無を指標として調べた。具体的には各組
換えDNAを導入したC600^r-m-をクロラムフエニ
コールを含有しないＬ−寒天培地に24時間ごとに
値継いで、その一部を0.85％の生理的食塩水で希
釈後、Ｌ−寒天培地に塗布し、出現するコロニー
についてクロムフエニコール20μｇ／mlを含むＬ
−寒天培地にレプリカして生育するコロニー数の
比率を測定した。（なお培養は７℃で行つた。）この組換えプラスミドをPstで処理し、GSH
−の遺伝子（gsh）を含む組換えプラスミド
をPstで処理して単離したgshを組み込むこ
とによつて、GSH−とGSH−の両活性を同
時に増強せしめることができ、しかも菌体内での
保持安定性の良い組換えプラスミドを作成するこ
とができる。 GSH−遺伝子の複数個のクローニング GSH−遺伝子の複数個のクローニングの技
術は、GSH−遺伝子を含むDNA断片を制限酵
素処理されたベクタープラスミドに組入れるため
両者を混合するとき、前者の後者に対する量比を
大きくすることによつて可能であることを見出し
て完成したものである。ここで用いられるGSH−遺伝子を含む組換
えプラスミドは特願昭57−170727に記載したとお
りRC912由来の染色体DNAを制限酵素Pstで処
理して取得される組換体DNA：pBR322−gsh
が用いられる。pBR322−gshは分子量4.6Md
で、2.1Mdに相当するRC912染色体DNA断片を
pBR322のPst部位に挿入した構造を有する
（第３図参照）。このpBR322−gshをPstで処理してGSH−
遺伝子を含むDNA断片をアガロース電気泳動
によつて単離する。この単離されたDNA断片を
Pstで処理したベクタープラスミドpBR325と
混合する。この際、混合するgshを含むDNA
断片の量比をpBR325のPst処理物に対して多
くすることによつてgshを複数個含む組換えプ
ラスミド取得の確率が高くなる。この混合物を
T₄DNAリガーゼで処理後、カルシウム処理でコ
ンピテント化したＥ coli C600^r-m-に導入する。組換えDNAを含有する菌株はアンピシリン
（以下Apと略称する。）を20μｇ／ml含むＬ−培地
では生育でないが、Cmを20μｇ／ml含むＬ−培
地では生育する菌として選択する。この選択され
た組換えDNAを含有する菌株より組換えDNA
を、Nucleic Acids Reserch vol7pp1513−1523
に記載のアルカリ抽出法によつて単離して、アガ
ロース電気泳動で検出する。検出される組換え
DNAのうちgshが複数個組込れた組換えDNA
は、gshが１個組み込れた組換えDNAより大
きい組換えDNAとして検出される。すなわち、
アガロース電気泳動において泳動距離の短い組換
えDNAとして検出される。この大きい組換え
DNAを該菌体より密度勾配遠心により大量調製
し、DNAの制限構造を調べ、組み込まれたgsh
の個数および組み込みの方向を確認する。この様にして得られたGSH−の遺伝子を２
個組み込んだ組換え体DNA：pBR325−gsh．
を導入したＥ coliC600^r-m-のGSH−活性
を、Ｅ coli C600^r-m-およびpBR322−gshを
導入したC600^r-m-を対照として測定し、その結果
を第２表に示す。【表】この様にして得られる組換えDNA：pBR325
−gsh（）ｎをBamHで処理し、前述のGSH
−の遺伝子（gsh）を含む組換えDNAの
BamHで単離したgshｂを組み込むことによ
つて、特願昭57−170727に記載のpBR325−gsh
・より、GSH活性が更に増強でき、その結
果、GSH生成能が更に強化できて、また菌体内
での保持安定性も良い組換えDNA pBR325−
gsh（）ｎｂを構築することができる。以下
本発明のプラスミドの効果を示すため、それを導
入した菌体によるグルタチオンの製造を説明す
る。グルタチオンの製造かくして得られるGSH−、GSH−の活性
が増強された大腸菌を用いるGSHの生産は、以
下のように行うことができる。組換えDNAを導
入してGSH−とGSH−の両活性が増強され
た菌株を、炭素源、窒素源、無機塩などを含む栄
養培地に接種して振盪培養する。炭素源としては
グルコース、フラクトース、グリセロール、シユ
ークロースなどが、窒素源としては塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素などの無機態窒素のほか、酵母エキスペプト
ン、肉エキスなどの有機態窒素も使用することが
できる。また微量金属元素として塩化マグネシウ
ム、塩化マンガンなどの添加も効果的である。用
いる炭素源の濃度は0.1〜５％、好適には0.5％で
あり窒素源の濃度は0.05〜５％、好適には0.5％
前後、また微量金属元素は0.005％程度添加する
のが好ましい。培養温度は20〜40℃、好適には約
35〜38℃であり、また培養PHは６〜８が好まし
い。かくして培養した培養終了液より菌体を集め
て、一度0.85％の生理的食塩水で洗浄後、水懸濁
液とし、これを沸騰水中で１〜10分、好適には１
〜２分程度処理することにより大腸菌内のGSH
を抽出できる。また、上記培養後の菌体を集菌し
た後、該菌体を以下に述べるような処理をし、こ
れをグルタミン酸、システイン、グリシン、マグ
ネシウムイオン、ATP、そして好ましくは適当
なATP再生系存在下に反応せしめることにより、
GSHを製造することができる。このような菌体
処理物として、菌体の有機溶媒処理物、界面活性
剤処理物、菌体の音波破砕物、音波処理後に遠心
で得られる無細胞抽出液、あるいは適当な担体に
固定化した菌体あるいは酵素が挙げられる。この
場合、利用できる有機溶媒としては、アセトン、
トルエンなどであり、界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸セチルトリメチルアンモニウムブロミド
などが利用される。また、菌体あるいは酵素の固
定化には、酵素活性を阻害せずかつリアクターと
して工業的に好適に作動できるものが採用でき
る。ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ゲル、カ
ラギーナンゲル、光硬化樹脂、ウレタン樹脂など
の他、DEAEセルロース、DEAEセフアデツクス
等も担体として用いることができる。またかかる
反応に利用されるATP再生系としては、大腸菌
のもつアセテートキナーゼ反応、カルバメートキ
ナーゼ反応、あるいは微生物の解糖系が好適であ
る。 GSH生成反応は、酵素含有物を10〜150ｍＭの
グルタミン酸、５〜40ｍＭのシステイン、５〜50
ｍＭのグリシン、１〜50ｍＭのマグネシウムイオ
ン、１〜40ｍＭのATPを含む反応液で20〜40℃、
また反応PHは６〜９（好適には7.5）で数時間接触
させることによつて行い得る。本反応系においてアセテートキナーゼ反応を
ATP再生系として用いる場合には、アセチルリ
ン酸５〜40ｍＭを添加すれば良い。また、アセチ
ルリン酸の添加量を増加させて、その分ATPの
添加量を減少させる方法も有効である。たとえば
ATP1ｍＭとアセチルリン酸39ｍＭを添加する方
法は、工業的には有利である。大腸菌は強いアセ
テートキナーゼ活性をもつているので、アセテー
トキナーゼ源を添加する必要はない。上記の様に
して、抽出あるいは反応液中に生成している
GSHは通常のイオン交換樹脂カラムで容易に単
離される。まず抽出液あるいは反応後のPHを硫酸
で3.0に合わせた後、これをカチオン交換樹脂、
例えば登録商標ダイヤイオンpK.228H⁺に導通
し、0.5Mの水酸化アンモニウムで溶出する。溶
出液のPHを硫酸で4.5に合わせた後、アニオン交
換樹脂、例えば登録商標デユオライトＡ−２
（CH₃COO−型）に導通する。吸着したGSHを、
0.5M硫酸で溶出後、エタノールを50％になるよ
うに添加することによつて結晶GSHを単離取得
できる。以下実施例をあげて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれによつて限定されるものではな
い。なお、本発明で使用するpBR325−gsh・
ｂ及びpBR325−gsh・・ｂの各々をＥ
coli−C600^r-m-に移入した株は工業技術院微生物
工業技術研究所に各々受託番号微工研菌寄第7421
号（FERM Ｒ−7421）および同第7420号
（FERM Ｐ−7420）として寄託された。またpBR325−gshｂをＥ・coli−C600^r-m-に
移入した株も微工研菌寄第7471号（FERM Ｐ−
7471）として寄託されている。実施例１（制限酵素で小型化したGSH−遺伝子と
GSH−遺伝子を含む組換えDNA pBR325−
gsh・ｂの調製およびそれを保持する菌
株） GSH−遺伝子を組み込んだ組換えDNA：
pBR322−gshを保持するエシエリヒアコリー
Ｂ（Ｅ coli Ｂ）の変異誘導体RC912（微工研菌
寄第336号）より組換えDNA pBR322−gshを
精製単離する。そのpBR322−gsh50μｇをBamHで処理し
た後、アガロース電気泳動によつて生じたDNA
断片を分離する。この小断片を含むゲルを切り出
し、これを透析チユーブに入れて再び電気泳動に
かけ、ゲル中に存在するDNA断片をゲル外に出
す。かくして3μｇのGSH−遺伝子を含むDNA
断片gshｂを得た。次にベクタープラスミド
pBR325 1μｇをBamHで処理した後、上記調
製したgshｂを含むDNA断片1μｇを加え、
T₄DNAリガーゼで処理する。かくしてpBR325
上にBamHで小型化したGSH−の遺伝子を
含む組換え体DNA：pBR325−gshｂが得られ
る。一方特願昭57−170727記載のGSH−の遺
伝子を含む組換えDNA pBR322−gsh50μｇを
Pstで処理後、同様の手法で4μｇのgshを含
むDNA断片を得た。次に先に取得したpBR325
−gshb1μｇをPstで処理した後、上記調製し
たgshを含むDNA断片1μｇを加えT₄DNAリガ
ーゼで処理する。かくしてpBR325上にGSH−の遺伝子gsh
とBamHで小型化したGSH−の遺伝子gsh
ｂを合わせ持つ組換え体DNA：pBR325−gsh
．ｂが得られる（第４図）。このpBR325−
gsh．ｂをEcoli C600^r-m-にカルシウム処理
法で導入する。形質転換株は20μｇ／mlのCmを
含むＬ−培地上で生育するが、TcおよびApを
20μｇ／ml含むＬ−培地上では生育出来ない株と
して容易に選択出来る。かくして得られる形質転
換株のもつGSH−およびGSH−活性を第３
表に示した。【表】なお、各酵素活性は、DM最少培地（リン酸第
一カリウム0.3％、リン酸第二カリウム0.7％、硫
酸マグネシウム・７水和物0.01％、硫酸アンモニ
ウム0.1％グルコース0.5％）で対数増殖期の菌体
より調製した菌体抽出液を用いて行つた。また酵
素活性は、ジヤーナルオブジエネラルマイクロバ
イオロジー（J.Gen.Microbiol）1281047〜1052
（1982）の記載の方法で行つた。また該菌株およ
び特願昭57−170727記載のpBR325−gsh・
をC600^r-m-に導入した菌株を、選択圧としてのク
ロラムフエニコール（Cm）無添加のＬ−培地に
24時間ごとに値継いだ場合の組換えDNAの保持
率をCm耐性を指標として第２図の場合と同様に
して調べ、その結果を第５図に示す。実施例２（GSH−の遺伝子を２個と制限酵素で小型
化したGSH−の遺伝子を含む組換え
DNApBR325−gsh・・ｂの調製および
それを保持する菌株）実施例１と同様の手法で、pBR322−gsh
200μｇよりgshを含むDNA断片を15μｇ取得し
た。次にベクタープラスミドpBR325 1μｇをPst
で処理した後、上記調製したgshを含む
DNA断片10μｇを加えT₄DNAリガーゼで処理
し、組換えDNAを調製する。目的とするGSH−
の遺伝子を複数個含む組換えDNAを選択する
ために、まず全組換え体をカルシウム処理法で
C600^r-m-に導入した。組換えDNAを含有する菌株を、Ap20μｇ／ml
含むＬ−培地上では生育出来ず、Cm20μｇ／ml
含むＬ−培地では生育出来る株として50株取得し
た。それらの菌株が保持する組換えDNAを
Nucleic Acid Research、vol.7pp1513〜1523
（1979）に記載のアルカリ抽出法で単離してアガ
ロース電気泳動で検出したところ、明らかに他の
組換えDNAより大きい組換えDNAが１個認めら
れた。この組換えDNAを含む菌株より、該組換え
DNAを密度勾配遠心により大量に調製して、そ
の制限構造を調べたところ、gshを含むPst
によるDNA断片が２個組み込れた組換えDNAで
あつた。（第６図参照。以下この組換えDNAを
pBR325−gsh・と略称する。）このpBR325
−gsh・1μｇをBamHで処理後、実施例１
と同様の手法で、pBR322−gshよりBamH
で処理して単離したgshb1μｇを加えT₄DNAリ
ガーゼで処理する。かくして、pBR325上の２個のGSH−の遺伝
子gshとBamHで小型化したGSH−の遺伝
子gshｂ合わせ持つ組換えDNA：pBR325−
gsh・・ｂが得られる（第６図）。この
pBR325−gsh・・ｂをＥ coli C600^r-m-
にカルシウム処理で導入する。形質転換株は20μ
ｇ／mlのCmを含むＬ−培地上では生育するがTc
あるいはApを20μｇ／ml含むＬ−培地上では生育
出来ない株として容易に選択できる。かくして得
られるpBR325−gsh・・ｂを導入した形
質転換株および特願昭57−170727記載のpBR325
−gsh・をC600^r-m-株に導入した菌株の、
GSH−・GSH−活性を測定した結果を宿主
のC600^r-m-株を対照として第４表に示す。【表】実施例３実施例１記載のpBR325−gsh・ｂを保持
するC600^r-m-、実施例２記載のpBR325−gsh
・・ｂを保持するC600^r-m-、特願昭57−
170727記載のpBR325−gsh・を保持する
C600^r-m-および組換えDNAを保持しない
C600^r-m-を500mlのDM最少培地に接種し、37℃
で３時間振盪培養する。かくして得られる対数増
殖期菌体を集め、0.85％の生理的食塩水で１回洗
浄する。この菌体を再度水に懸濁し、50μｇ／ml
の溶液とする。この懸濁液0.5mlを100℃で11分間
加熱し、菌体中のグルタチオンを抽出する。かく
して得られたグルタチオンの量は第５表に示す通
りであつた。【表】定量法：アナリテイカルバイオケミストリー
(Anal.Biochem.)27 502〓522(1969)による。
実施例４実施例３の第５表記載の菌株を、500mlのＬ−
培地およびクロラムフエニコール20μｇ／mlを含
有するＬ−培地に接種し、37℃で20時間、振盪培
養する。かくして得られる菌体を集め0.85％の生
理的食塩水で１回洗浄する。この菌体１ｇを２ml
の0.5ｍＭのＬ−システインを含む５ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し、さらに、0.5
mlのトルエンを加え25℃で１時間振盪する。この
トルエン処理菌体を遠心分離で集菌し、80ｍＭ
Ｌ−グルタミン酸、20ｍML−システイン、20ｍ
Ｍグリシン、25ｍＭ塩化マグネシウム、20ｍＭ
ATP、20ｍＭアセチルリン酸、25ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（PH7.2）を含む反応液80mlを加え
37℃で２時間振盪する。かくして反応液中に生成
したグルタチオン量より算出したグルタチオン生
成活性は第６表に示した通りであつた。【表】【表】＊菌が生育せず
( )相対値を示す。
実施例５実施例２記載のpRB325−gsh・・ｂを
保持するC600^r-m-を500mlのＬ−培地に接種し、
37℃で20時間振盪培養する。かくして得られる菌
体を集め、0.85％の生理的食塩水に懸濁して40℃
に加温し、これに40℃に加温溶解した3.1％のK.
カラギーナン水溶液５mlを加え撹拌後、0.3Mの
塩化カリウム溶液に滴下して固める。この固定化
菌体の物理的強度を強化するために、得られた固
定化菌体10ｇを２％塩化カリウム、および0.08M
ヘキサメチレンジアミンを含む0.33Mのリン酸カ
リウム緩衝液（PH7.0）中で０℃で10分間撹拌後、
25％グルタルアルデヒド水溶液を2.5ml添加して
０℃で更に１時間撹拌する。このようにして得ら
れた硬化処理をほどこした固定化菌体を、0.85％
の生理的食塩水で充分洗浄後、0.5mM Ｌ−シス
テインおよび８％のトルエンを含む５ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.0）中で25℃で１時間振盪
する。処理後の固定化菌体10ｇを0.85％の生理的
食塩水で充分に洗浄後、直径１cmのカラムに充填
し、37℃で80ｍＭＬ−グルタミン酸、20M Ｌ
−システイン、20ｍＭグリシン、25ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１ｍＭ ATP、59ｍＭアセチルリン
酸、25ｍＭリン酸カリウム緩衝液（PH7.3）を含
む反応液を空間速度Ｓ・Ｖ・＝0.5／時間で連続
的に通塔したところ５mg／mlのグルタチオンの生
産が20日間にわたつて維持出来た。（一方、特願
昭57−170727記載のpBR325−gsh・を保持
するC600^r-m-で同様の実験を行つたところ５mg／
mlのグルタチオンの生産は10日目までであつた。）

【図面の簡単な説明】

第１図−組換え体DNA pBR322−gshの環
状制限地図（図中の数値はメガダルトン）〓〓：RC912の染色体DNA断片：pBR322 Ｐ：Pst Ｅ：EcoR Ｂ：BanH Ｓ：Sal Ｍ：Mlu Ｈ：Hind Pv：Pvu 第２図−組換え体DNA：pBR322−gshおよび
pBR325−gshｂのC600^r-m-菌体内での保持
安定性を示すグラフ横軸は種継回数、縦軸はクロラムフエニコー
ル耐性コロニーの比率を％で示す。 −Γ− C600^r-m-／pBR325−gsh −●− C600^r-m-／pBR325−gshｂ第３図−組換え体DNA pBR322−gshの環状
制限地図〓〓：RC912の染色体DNA断片：pBR322 （記号は第１図に同じ）第４図−組換え体DNApBR325−gsh・ｂの
調製と環状制限地図〓〓：RC912の染色体DNA断片（gsh）〓〓：同上（gsh）〓〓：pBR322 ：pBR325 （記号は第１図に同じ）第５図−組換え体DNA：pBR325−gsh・お
よびpBR325−gsh・ｂのC600^r-m-菌体内
での保持安定性を示すグラフ横軸は種継回数、縦軸はクロラムフエニコー
ル耐性コロニーの比率を％で示す。 −Γ− C600^r-m-／pBR325−gsh・ −●− C600^r-m-／pBR325−gsh・ｂ第６図−組換え体DNA pBR325−gsh・・
ｂの調製と環状制限地図〓〓：RC912の染色体DNA断片（gsh）〓〓：同上（gsh）〓〓：pBR322 ：pBR325 （記号は第１図に同じ）をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌の染色体DNAを制限酵素Hindおよ
び制限酵素BamHで処理することにより得ら
れる２つのM1u切断部位を有しグルタチオン
合成酵素の遺伝子を担う0.9MdのDNA断片を、
エシエリヒア・コリ系ベクターに組込んだ、大腸
菌内にて複製できる組換えプラスミド。２ γ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素の
遺伝子を担うDNA断片を同時に組込んだ特許請
求の範囲第１項記載の組換えプラスミド。３ γ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素の
遺伝子を担うDNA断片を複数個同時に組込んだ
特許請求の範囲第１項記載の組換えプラスミド。