JPH0160233B2

JPH0160233B2 -

Info

Publication number: JPH0160233B2
Application number: JP8939281A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hatanaka; Kunio Fujita; Seijiro Hatsutori; Satoo Motoi
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-06-09
Filing date: 1981-06-09
Publication date: 1989-12-21
Also published as: JPS57206390A

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は新規なアミノペプチダーゼに関する
ものであり、さらに詳細には遊離アミノ基を有す
るＬ−アミノ酸のカルボキシ側のアミド結合を分
解する新規なアミノペプチダーゼに関するもので
ある。遊離アミノ基を有するＬ−アミノ酸のカルボキ
シ側のアミド結合を分解するアミノペプチダーゼ
としては、従来豚の賢臓由来のロイシンアミノペ
プチダーゼが知られているが（例えば酵素ハンド
ブツク第496頁、昭和41年４月30日朝倉書店発行、
参照）、この発明者等はこのロイシンアミノペプ
チダーゼとは異なる新規なアミノペプチダーゼを
ストレプトマイセス属に属する微生物が生産する
という新知見を得、鋭意研究の結果、この発明を
完成した。この発明の新規なアミノペプチダーゼは次のよ
うな理化学的性質を有する。 (ア) 作用：遊離アミノ基を有するＬ−アミノ酸のカルボ
キシ側のアミド結合を加水分解する。 (イ) 至適PH：酵素溶液を下記各緩衝液で４倍希釈し、37℃
で10分間保ち、その残存活性を測定した。結果
は第１図の通りである。第１図のたて軸は酵素の相対活性（％）を、
よこ軸はPHである。第１図からも明らかなよう
に至適PHは7.0付近にあることが判る。使用緩衝液： ●0.1Mグリシン−0.1M塩化ナトリウム−水酸
化ナトリウム（PH8.0−10） ●0.2Mトリス−塩酸（PH6.9−8.8） ●0.01Mりん酸緩衝液（PH6.4−7.2） ●0.33M酢酸緩衝液（PH4.3−6.5） (ウ) 安定PH範囲：酵素溶液を下記各緩衝液で４倍希釈し、37℃
で10分間保ち、その残存活性を測定した。結果
は第２図に示す通りである。第２図のたて軸は
酵素の相対活性（％）を、よこ軸はPHである。
第２図からも明らかなように安定PHは5.5〜6.5
の範囲にあり、PH5.5以下およびPH6.5以上にお
いて失活することが判る。 ●0.1Mグリシン−0.1M塩化ナトリウム−水酸
化ナトリウム（PH8.0〜10） ●0.2Mトリス−塩酸（PH6.9〜8.8） ●0.1Mりん酸緩衝液（PH6.4〜7.2） ●0.1M酢酸緩衝液（PH4.3〜6.5） (エ) 力価の測定法：基質：10ｍML−ロイシン−Ｐ−ニトロアニリド
50％エチルアルコール緩衝液緩衝液：0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.0）反応温度：37℃ 反応PH：7.0 基質0.3mlと緩衝液2.4mlをキユベツトに入れ、
37℃に保ち、酵素溶液0.3mlを加え、すばやく混
合する。２−３分間反応させ、435nｍにおける
吸光度を測定し、１分間にＰ−ニトロアニリン
1μモルを生成する酵素を1uとする。 (オ) 作用適温の範囲： PH7.0で、25〜57℃の各温度で１分間反応の
酵素活性を測定した。結果は第３図に示す通り
である。第３図のたて軸は酵素活性を、よこ軸
は温度を示す。第３図からも明らかなように反
応の作用適温は46℃付近にあることが判る。 (カ) 温度による失活の条件： PH6.15およびPH7.0のそれぞれにおいて、30
〜70℃の各温度に10分間保つた後残存活性を測
定した。結果は第４図に示す通りである。第４
図中、実線はPH6.15における残存活性を、破線
はPH7.0における残存活性を示す。基質が存在
しない場合、PH6.15では50℃以上で、PH7.0で
は30℃以上で失活することが判る。 (キ) 阻害、活性化および安定化：酵素に下記金属塩をそれぞれ２ｍＭの濃度に
添加し、酵素活性（活性測定時の金属塩濃度：
1.8ｍＭ）を測定した。結果は下記表の通りで
ある。金属塩比活性（％）塩化カルシウム（２水加物） 113 硫酸マグネシウム（７水加物） 106 塩化マグネシウム（６水加物） 105 塩化バリウム（２水加物） 89.2 塩化第２鉄（６水加物） 73.4 塩化マンガン（４水加物） 53.5 塩化亜鉛 19.3 塩化コバルト（６水加物） 18.3 硫酸銅（５水加物）０エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム０上記表からも明らかなように、いずれの金属
塩も著しい賦活効果を示さなかつたが、カルシ
ウムイオン、マグネシウムイオンは、わずかに
賦活効果が認められる。亜鉛イオン、コバルト
イオン、銅イオンなどは強い阻害効果を示す。
また、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウムに
より完全に活性を失う。また、塩化カルシウム
（２水加物）を２ｍＭを加え、PH7.0で10分間各
温度で反応したあと、酵素活性（相対活性）を
測定した。結果は第５図に示す通りである。第
５図中、実線は塩化カルシウム（２水加物）存
在下における温度安定曲線を、破線は塩化カル
シウム（２水加物）の不存在下の温度安定曲線
を示す。第５図からも明らかなように、カルシ
ウムイオンの存在下で熱安定性が増加すること
が認められる。 (ク) 紫外部吸収スペクトル： 0.1M塩化ナトリウム含有0.1Mりん酸緩衝液
（PH6.0）中で測定した結果を第６図に示す。第
６図からも明らかなように280nｍ付近に吸収
極大を示し、294nｍに肩の吸収を示す。 (ケ) ミカエリス定数と最大反応速度：Ｌ−ロイシン−Ｐ−ニトロアニリドに対する
ミカエリ定数（Ｋｍ）と最大反応速度
（Vmax）とをラインウイーバーーバーク
（Lineweaver−Burk）方法で求めた結果、Ｋ
ｍ値は3.33ｍＫ、Vmaxは149u／mg酵素たんぱ
く−アミブミン相当であつた。 (コ) 溶解性： 0.1M塩化ナトリウム含有0.1Mりん酸緩衝液
（PH6.0）で10u／ml、2M塩化ナトリウム溶液で
１〜2u／ml程度である。 (サ) 基質特異性：試験方法： (1) 下記表に記載の各基質の10ｍＭ濃度の水溶
液を調製する（ただし、（Ｌ）−グルタミン−
Ｐ−ニトロアニリドの場合は５％エタノール
水溶液）。 (2) 各基質溶液を0.2Mトリス−塩酸緩衝液
（PH７）で10倍に希釈する。 (3) 酵素５mgを添加し、25℃で１時間撹拌す
る。 (4) 濃塩酸でPH＜２とし、常法により生成した
アミノ酸をアミノ酸分析機で分析・測定す
る。結果：結果は下記表の通りで、表中の相対活性の数
値は（Ｌ）−ワイシルグリシンに対する酵素活
性を100とした場合の相対活性（％）を示す。

【表】以上のような理化学的性質を有するこの発明の
アミノペプチダーゼとこの出願前公知の豚の賢臓
由来のものと比較すると、例えば至適PHについ
て、この発明の酵素がPH7.0付近であるのに対し、
公知のそれがPH8.5付近である点、またこの発明
の酵素がマンガンにより活性が阻害されるのに対
し、公知のそれは逆に活性化される点で両酵素は
明確に異なるものであることが判る。この発明の新規なアミノペプチダーゼの生産
は、例えばストレプトマイセス属に属する新規な
アミノペプチダーゼ生産菌を培地に培養すること
により行われる。ストレプトマイセス属に属する新規なアミノペ
プチダーゼ生産菌のうち、最も好ましい生産菌の
１つとして、ストレプトマイセス・サツポロネン
シスATCC21532が挙げられるが、このストレプ
トマイセス・サツポロネンシスATCC21532はこ
の出願前公知（例えば特公昭48−29158号公報参
照）であり、アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（ATCC）の保存菌から自由に入手
できる菌株である。培養方法は原則的には、一般微生物の発酵法に
準じ、固体培養または液体培養により行われる。
培養に用いられる培地としては、ストレプトマイ
セス属に属する新規なアミノペプチダーゼ生産菌
が利用する栄養源を含有する培地であればよい。
すなわち、合成培地、半合成培地または天然培地
が用いられ、培地の組成としては、炭素源として
例えばでん粉、でん粉加水分解物、糖密、シユー
クロース、マルトース、フラクトース、グルコー
ス、グリセロース、大豆油、チキンオイル等が挙
げられ、窒素源として、例えばペプトン、麦芽エ
キス、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、脱脂大豆
粉、ピーナツツミール、グルテンミール、モラテ
イン等が挙げられる。このほか、無機塩類等が添
加されることがあり、無機塩類としては例えば、
りん酸第１カリウム、りん酸第２カリウム、りん
酸２ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネ
シウム、硫酸第１鉄、炭酸カルシウム等が挙げら
れる。培養温度は25℃〜37℃程度が好ましく、培養中
のPHは５〜８位が好適であり、また培養時間は１
〜９日間位が適当である。このようにして培養物中に蓄積された新規なア
ミノペプチダーゼを分離、採取するには従来から
行われている酵素の分離、採取方法をそのまま用
いればよい。その１例を挙げると次の通りであ
る。固体培養の場合は水または塩化ナトリウム、塩
酸、くえん酸、酢酸等水性溶剤の水溶液もしくは
種々の緩衝液で抽出して酵素液を得る。また液体
培養の場合は、過または遠心分離により菌体を
除去して酵素液を得る。このようにして得られた
酵素液にメタノール、エタノール、イソプロパノ
ール、アセトン等を用いて酵素を沈でんさせる
か、あるいは酵素液に硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム等を用いて塩析を行
う。次に得られた沈でんを乾燥粉末化した後透析
するか、あるいはりん酸カルシウム、アルミナ、
ベントナイト、イオン交換樹脂等による吸着およ
び脱着により精製する。さらには核酸、タンニン
酸、りんタングステン等の白沈でん剤による沈で
んあるいは重金属により不純物の分離法、等電点
における沈でん法、電気透析法等の精製手段を用
いて精製することができる。この発明の新規なアミノペプチダーゼは種々の
たんぱく質の一次構造の研究のための試薬として
有用であるだけでなく、たとえば立体特異性を有
するペプチドの合成のための試薬としても有用で
ある。この発明の新規なアミノペプチダーゼは前記の
ように、遊離アミノ基を有するＬ−アミノ酸のカ
ルボキシ側のペプチドを未端から分解する作用を
有するが、そのようなこの発明のアミノペプチダ
ーゼの作用を参考例として次に示す。参考例１メゾDAP−ジNHNEZ(1)（2.0ｇ）をアセトニ
トリル（７ml）に溶解し、水（28ml）で希釈す
る。溶液を５％塩酸でPH７に調整し、この発明の
アミノペプチダーゼ（20mg）を加える。混合液を
室温で1.5時間撹拌する。この間混合液のPHを５
％塩酸でPH７に保持する。反応終了後、反応混液
を酢酸エチル（30ml）で洗浄したあと、水層を10
mlまで濃縮する。濃縮液をHP−20のカラム（4.2
ml）に通し、水で溶出する。溶出液を減圧下に濃
縮して、メゾDAP−(D)−NHNEZ(2)（1.14ｇ）を
得る。 mP205〜209℃（分解） IR（ヌジヨール）cm^-1：3600〜2200、1720、
1640、1580 NMR（CD₃OD）、δ：1.4〜2.1（ｍ、6H）、3.50
（ｍ、2H）、5.17（ｓ、2H）、7.40（ｓ、5H）〔α〕_D−21.3゜（Ｃ＝1.0、酢酸）参考例２メゾDAP−ジNHNHBoc(1)（4.0ｇ）をPH7.5
のトリス緩衝液（200ml）に溶解し、この溶液に
アミノペプチダーゼ（2.0ｇ）を加え、室温で1.5
時間撹拌する。反応終了後反応液を酢酸エチル
（100ml）で洗浄し、水層を減圧下で濃縮する。残
渣をメタノール（50ml）で抽出し、抽出液を濃縮
し、水（30ml）に溶解する。溶液を５％塩酸でPH
7.8に調整し、HP−20（30ml）のカラムに通す。
水で溶出し溶出液を濃縮し、残渣を粉末化すると
メゾDAP−(D)−NHNHBoc(2)（1.80ｇ）を得る。 IR（ヌジヨール）cm^-1：3500〜2700、3270、
1730、1690、1610、1580 NMR（CD₃OD）、δ：1.47（ｓ、9H）、1.4〜2.1〜
（ｍ、6H）、3.3〜3.7（ｍ、2H）〔α〕_D−19.8゜（Ｃ＝1.0、水） (注)：上記参考例１および２において、Ｚはベンジ
ルオキシカルボニル、DAPはα、ε−ジアミ
ノピメリルを、Bocはｔ−ブトキシカルボニル
をそれぞれ意味するものとする。次にこの発明の実施例を示す。実施例１でん粉４ｇ／dl、大豆粉２ｇ／dl、フアーマメ
デイア１ｇ／dlの組成培地（PH6.5）100mlを500
ml容三角フラスコに入れ、常法により滅菌したあ
と、ストレプトマイセス・サツポロネンシス
ATCC21532を一白金耳植菌し、30℃で３日間培
養する。上記と同じ組成の培地20を30発酵槽
に入れ常法により滅菌したあと、上記培養物を５
％接種し、30℃で24時間培養する。別に、でん粉８ｇ／dl、モラテイン１ｇ／dl、
フアーマメデイア１ｇ／dl、グルテンミール２
ｇ／dl、りん酸２水素カリウム0.5ｇ／dlの組成
の培地（PH6.5）350を500容発酵槽に入れ、
常法により滅菌したあと、上記第２回目の培養物
を５％接種し、30℃で６日間培養する。この間撹
拌速度220r、ｐ、ｍ、通気量350／分の培養条
件で培養を行う。培養終了後、培養物にりん酸２
水素カリウムを３％添加し、加圧過して菌体を
除く。培養液330を冷却下限外過機（分画
分子量：60000）で脱塩濃縮する。濃縮液（40）
を１夜４℃に放置し、得られた沈殿を遠心分離に
より集め、冷アセトンで洗浄したあと乾燥すると
粗粉末（74ｇ）が得られる。この粉末のうち10ｇを2M塩化ナトリウム溶液
２に溶解し、活性炭10ｇを添加したあと、４℃
で２時間撹拌し過する。液（21）に硫酸ア
ンモニウムを30％飽和になるまで加えた後、炭酸
水素ナトリウム溶液でPH6.0に調整し、４℃で一
夜放置する。析出する固形物を2M塩化ナトリウ
ム溶液3.5に溶解し過後、４℃で１夜透析す
る。この操作を２回くり返す。固形物を遠心分離
して集め部分精製粉末（280mg）（比活性：23u／
mgたんぱく−アルブミン相当）を得る。実施例２実施例１と同様の条件でストレプトマイセス・
サツポロネンシスATCC21532を培養する。培養
終了後、培養物にりん酸２水素カリウムを３％添
加し、加圧過して菌体を除く。培養液330
を冷却下限外過機（分画分子量：60000）で脱
塩濃縮する。濃縮液（40）を１夜４℃に放置
し、得られた沈殿を遠心分離により集め、冷アセ
トンで洗浄したあと乾燥すると、粗粉末（74ｇ）
が得られる。この粉末（8.0ｇ）を0.1塩化ナトリ
ウム含有0.1Mりん酸緩衝液（PH6.0）４を溶解
する。活性炭２ｇを添加し、４℃で２時間撹拌し
たあと過する。液（4.6）に硫酸アンモニ
ウムを30％飽和になるまで加え、一夜４℃で放置
する。上澄液をさらに硫酸アンモニウム60％飽和
とし、一夜４℃に放置する。析出した固形物を
0.1M塩化ナトリウム含有0.1Mりん酸緩衝液（PH
6.0）1.7に溶解し過したあと一夜４℃で透析
する。固形物を塩心分離して回収し、酵素粉末
（220mg）を得る。この粉末（５mg）を0.1M塩化
ナトリウム含有0.1Mりん酸緩衝液（PH6.0）7.5ml
に溶解し、精密過膜で過する。液をあらか
じめ上記の緩衝液で平衡化したセフアロース4B
（フアルマシア製）200mlで分画し、精製されたア
ミノペプチダーゼ（たん白量として2.2mg）（比活
性31u／mgたんぱく−アルブミン相当）を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の新規なアミノペプチダーゼ
の活性曲線を、第２図はそのPH安定曲線を、第３
図は温度活性曲線を、第４図は温度安定曲線を、
第５図は熱安定曲線を、および第６図は紫外部吸
収スペクトをそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】１次の理化学的性質を有する新規なアミノペプ
チダーゼ (ア) 作用：遊離アミノ基を有するＬ−アミノ酸のカルボ
キシ側のアミド結合を加水分解する。 (イ) 至適PH： 7.0 (ウ) 安定PH範囲： 5.5〜6.5 (エ) 作用適温の範囲： PH7.0、25〜57℃の各温度で１分間反応の酵
素活性を測定した結果、反応適温は46℃付近に
認められた。 (オ) PH、温度などによる失活の条件： PH5.5以下およびPH6.5以上において失活す
る。基質が存在しない場合、PH6.15の場合50℃以
上で失活する。 (カ) 阻害、活性化および安定化：酵素溶液に金属塩を２ｍＭ添加し、37℃で10
分間保持したあと、酵素溶液2.7mlに基質0.3ml
を加え酵素活性（活性測定時の金属濃度：1.8
ｍＭ）を測定した結果、マグネシウム、ウルシ
ウムによりわずかに活性化され、亜鉛、コバル
ト、銅により阻害効果が認められた。エチレンジアミン四酢酸のジナトリウム塩に
より完全に失活する。カルシウムイオンの存在下で熱安定性が増加
する。 (キ) 紫外部吸収スペクトル： 0.1M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH6.0）中で測定した結果、280nｍ付近に吸収
極大を示し、294nｍ付近に肩の吸収を示す。２ストレプトマイセス属に属する下記の理化学
性質を有する新規なアミノペプチダーゼ生産菌を
培地に培養し、得られた培養物から該アミノペプ
チダーゼを分離、採取することを特徴とする新規
なアミノペプチダーゼの製造法。 (ア) 作用：遊離アミノ基を有するＬ−アミノ酸のカルボ
キシ側のアミド結合を加水分解する。 (イ) 至適PH： 7.0 (ウ) 安定PH範囲： 5.5〜6.5 (エ) 作用適温の範囲： PH7.0、25〜57℃の各温度で１分間反応の酵
素活性を測定した結果、反応適温は46℃付近に
認められた。 (オ) PH、温度などによる失活の条件： PH5.5以下およびPH6.5以上において失活す
る。基質が存在しない場合、PH6.15の場合50℃以
上で失活する。 (カ) 阻害、活性化および安定化：酵素溶液に金属塩を２ｍＭ添加し、37℃で10
分間保持したあと、酵素溶液2.7mlに基質0.3ml
を加え酵素活性（活性測定時金属塩濃度：1.8
ｍＭ）を測定した結果、マグネシウム、カルシ
ウムによりわずかに活性化され、亜鉛、コバル
ト、銅により阻害効果が認められた。エチレンジアミン四酢酸のジナトリウム塩に
より完全に失活する。カルシウムイオンの存在下で熱安定性が増加
する。 (キ) 紫外部吸収スペクトル： 0.1M塩化ナトリウム含有0.1Mりん酸緩衝液
（PH6.0）中で測定した結果、280nｍ付近に吸収
極大を示し、294nｍ付近に肩の吸収を示す。