JPH0191785A - Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 - Google Patents
Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞Info
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- JPH0191785A JPH0191785A JP62247896A JP24789687A JPH0191785A JP H0191785 A JPH0191785 A JP H0191785A JP 62247896 A JP62247896 A JP 62247896A JP 24789687 A JP24789687 A JP 24789687A JP H0191785 A JPH0191785 A JP H0191785A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はラットＬ−グロノラクトン酸化酵素を含むクロ
ーン化ＤＮＡ及びその断片、該クローン化ＤＮＡ又は断
片が組込まれた遺伝子組換えベクター、該ベクターによ
り形質転換された宿主細胞並びに該宿主細胞を用いてＬ
−グロノラクトン酸化酵素又はこれに類する物質を製造
する方法に係る。
ーン化ＤＮＡ及びその断片、該クローン化ＤＮＡ又は断
片が組込まれた遺伝子組換えベクター、該ベクターによ
り形質転換された宿主細胞並びに該宿主細胞を用いてＬ
−グロノラクトン酸化酵素又はこれに類する物質を製造
する方法に係る。
本発明方法により得られる し−グロノラクトン酸化酵
素様物質はＬ−アスコルビン酸、即ちビタミンＣの製造
に利用することができる。
素様物質はＬ−アスコルビン酸、即ちビタミンＣの製造
に利用することができる。
（従来の技術）
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素は、高等動物の肝臓及び腎
臓のミクロゾーム画分に局在している分子量５１０００
のフラビン酵素であって１、生体内におけるし一アスコ
ルビン酸（ビタミンＣ）合成経路の最終段階で触媒作用
を行う物質である。即ち、この酵素はＬ−グロノラクト
ンを基質として酸化反応を行ってＬ−キシロ−へキスロ
ラクトンを合成し、このＬ−キシロ−へキスロラクトン
が引続き異性化を受けてＬ−アスコルビン酸となるので
ある。尚、このし−グロノラクトン酸化酵素は膜に結合
した膜蛋白であり、その精製は容易でなく、又その蛋白
構造や遺伝子の性質は未だ明らかになされていない。
臓のミクロゾーム画分に局在している分子量５１０００
のフラビン酵素であって１、生体内におけるし一アスコ
ルビン酸（ビタミンＣ）合成経路の最終段階で触媒作用
を行う物質である。即ち、この酵素はＬ−グロノラクト
ンを基質として酸化反応を行ってＬ−キシロ−へキスロ
ラクトンを合成し、このＬ−キシロ−へキスロラクトン
が引続き異性化を受けてＬ−アスコルビン酸となるので
ある。尚、このし−グロノラクトン酸化酵素は膜に結合
した膜蛋白であり、その精製は容易でなく、又その蛋白
構造や遺伝子の性質は未だ明らかになされていない。
一方、アスコルビン酸は副作用を有しないビタミンであ
り、健康維持のためには、その摂取の重要なことが判明
している。従って、アスコルビン酸は食品や飲料等にお
ける添加物として大量の需要がある。更に、アスコルビ
ン酸は還元力が強く、従って抗酸化剤としての需要も高
い。
り、健康維持のためには、その摂取の重要なことが判明
している。従って、アスコルビン酸は食品や飲料等にお
ける添加物として大量の需要がある。更に、アスコルビ
ン酸は還元力が強く、従って抗酸化剤としての需要も高
い。
このアスコルビン酸を製造するために、従来では高圧水
素添加によりブドウ糖をｄ−ソルビトールに変じ、これ
を発酵させてｄ−ソルボースになし、アセトンと濃硫酸
とでヒドロキシ基を保護した後に過マンガン酸カリで酸
化し、次にアルコール性塩酸で処理してアセトンの除去
とエステル化を同時に行い、その後にナトリウムアルコ
ラードで処理することにより製造されてきた。尚、近年
では、所謂「バイオテクノロジー」を利用するアスコル
ビン酸の製法も提案されており（特開昭６０−７００７
３）、この方法によればコリネバクテリウムから２，５
−ジケト−〇−グルコナート還元酵素の遺伝子を取出し
、この遺伝子をプラスミドに組込み、この遺伝子組換え
プラスミドをＥｒｕｉｎｌａｈｅｒｂｉｃｏｌａに取込
ませ、得られた形質転換菌によりＤ−グルコースを直接
的に２．５−ジケトグルコン酸に変じ、酸又は塩基触媒
の存在下に該中間体を環化反応させてアスコルビン酸と
なしている。
素添加によりブドウ糖をｄ−ソルビトールに変じ、これ
を発酵させてｄ−ソルボースになし、アセトンと濃硫酸
とでヒドロキシ基を保護した後に過マンガン酸カリで酸
化し、次にアルコール性塩酸で処理してアセトンの除去
とエステル化を同時に行い、その後にナトリウムアルコ
ラードで処理することにより製造されてきた。尚、近年
では、所謂「バイオテクノロジー」を利用するアスコル
ビン酸の製法も提案されており（特開昭６０−７００７
３）、この方法によればコリネバクテリウムから２，５
−ジケト−〇−グルコナート還元酵素の遺伝子を取出し
、この遺伝子をプラスミドに組込み、この遺伝子組換え
プラスミドをＥｒｕｉｎｌａｈｅｒｂｉｃｏｌａに取込
ませ、得られた形質転換菌によりＤ−グルコースを直接
的に２．５−ジケトグルコン酸に変じ、酸又は塩基触媒
の存在下に該中間体を環化反応させてアスコルビン酸と
なしている。
（発明が解決しようとする問題点及び発明の目的）
アスコルビン酸は、その有用性を考慮する場合に、今後
需要が拡大することはあっても、減少するものとは考え
られず、従ってアスコルビン酸の有利な製法を開発する
ことは極めて重要である。
需要が拡大することはあっても、減少するものとは考え
られず、従ってアスコルビン酸の有利な製法を開発する
ことは極めて重要である。
ブドウ糖等・の糖類を原料とする汎用の方法は発酵法と
合成法を併用するものであり、合成工程数も比較的多く
、Ｉ！を適な方法とは必ずしも云えない、一方、特開昭
６０−７００７３公報に開示されている方法に従ってア
スコルビン酸を製造するには、形質転換菌による２、５
−ジケトグルコン酸の産生に際して菌を適切に管理する
必要性があり、又目的物質であるアスコルビン酸を得る
ためには産生じた２、５−ジケトグルコン酸を菌体がら
分離した後に環化反応に付さねばならない。
合成法を併用するものであり、合成工程数も比較的多く
、Ｉ！を適な方法とは必ずしも云えない、一方、特開昭
６０−７００７３公報に開示されている方法に従ってア
スコルビン酸を製造するには、形質転換菌による２、５
−ジケトグルコン酸の産生に際して菌を適切に管理する
必要性があり、又目的物質であるアスコルビン酸を得る
ためには産生じた２、５−ジケトグルコン酸を菌体がら
分離した後に環化反応に付さねばならない。
従って、本発明の背景となっている課題は、特開昭６０
−７００７３公報に開示されている方法と同様にバイオ
テクノロジーを利用するものであるが該公報に記載の方
法とは別の観点からアスコルビン酸の製法にアプローチ
することにある。
−７００７３公報に開示されている方法と同様にバイオ
テクノロジーを利用するものであるが該公報に記載の方
法とは別の観点からアスコルビン酸の製法にアプローチ
することにある。
そこで、本発明者等はＬ−グロノラクトン酸化酵素に着
目した。蓋しＬ−グロノラクトン酸化酵素を用いれば、
その基質であるＬ−グロノラクトンと適当な条件下で混
和するだけでアスコルビン酸が生成するからである。し
かしながら、ここで留意すべきことは、Ｌ−グロノラク
トン酸化酵素が、既述のように、高等動物の肝臓や腎臓
に局在するのみであり、大量入手が困難であり且つ膜蛋
白であるために精製が困難なことである。
目した。蓋しＬ−グロノラクトン酸化酵素を用いれば、
その基質であるＬ−グロノラクトンと適当な条件下で混
和するだけでアスコルビン酸が生成するからである。し
かしながら、ここで留意すべきことは、Ｌ−グロノラク
トン酸化酵素が、既述のように、高等動物の肝臓や腎臓
に局在するのみであり、大量入手が困難であり且つ膜蛋
白であるために精製が困難なことである。
従って、本発明の本質的目的は高純度のＬ−グロノラク
トン酸化酵素乃至これと同様の作用を有する物質を大量
生産する方法を提供することにある。
トン酸化酵素乃至これと同様の作用を有する物質を大量
生産する方法を提供することにある。
この本質的目的を達成するための、本発明の第１の基礎
的目的は、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のクローン化Ｄ
ＮＡ又はその断片を提供することにある。
的目的は、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のクローン化Ｄ
ＮＡ又はその断片を提供することにある。
第２の基礎的目的は、し−グロノラクトン酸化酵素のク
ローン化ＤＮＡ又はその断片が組込まれた遺伝子組換え
ベクターを提供することにある。
ローン化ＤＮＡ又はその断片が組込まれた遺伝子組換え
ベクターを提供することにある。
第３の基礎的目的は、し−グロノラクトン酸化酵素のク
ローン化ＤＮＡ又はその断片が組込まれた遺伝子組換え
ベクターを取込むことにより形質転換がなされた宿主細
胞を提供することにある。
ローン化ＤＮＡ又はその断片が組込まれた遺伝子組換え
ベクターを取込むことにより形質転換がなされた宿主細
胞を提供することにある。
（問題点を解決し、目的を達成する手段及び作用）
本発明によれば、上記の第１基礎的目的は、ラットＬ−
グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配列をコードしてい
る塩基配列を含み約２１００個のヌクレオチドからなる
クローン化ＤＮＡ又はその断片により達成される。
グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配列をコードしてい
る塩基配列を含み約２１００個のヌクレオチドからなる
クローン化ＤＮＡ又はその断片により達成される。
上記の第２基礎的目的は、上記のクローン化ＤＮＡ又は
その断片が組込まれた遺伝子組換えベクターにより達成
される。
その断片が組込まれた遺伝子組換えベクターにより達成
される。
上記の第３基礎的目的は、上記の遺伝子組換えベクター
により形質転換されている宿主細胞により達成される。
により形質転換されている宿主細胞により達成される。
更に、上記の本質的目的は、
ａ）ラット肝臓由来のし−グロノラクトン酸化酵素を自
体公知の方法により精製して高純度なものとなし、この
精製酵素をウサギに免疫させて抗血清を得る工程と、 ｂ）ラット肝臓のｍＲＮＡから調製された市販のλｇｔ
１１ファージのｃＤＮＡ発現ライブラリを用い、このフ
ァージをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ Ｙ１０９
０（ｒ−）に感染させ培養し、イソプロピｌレーβ−Ｄ
−チオガラクトピラノシドにより融合蛋白を誘導させ、
上記の抗血清を用いてこの融合蛋白を酵素免疫法により
検出してスクリーニングすること番こより し−グロノ
ラクトン酸化酵素のクローンを（尋る工程と、 Ｃ）このポジティブクローンを培養してλファージのク
ローン化ＤＮＡを調製する工程と、ｄ）この人ファージ
のクローン化ＤＮＡを！１１限酵素で切断してインサー
トＤＮＡとなす工程と、ｅ）プラスミドベクタ−を制限
酵素で切断し、その断点に上記のインサー） ＯＮ入を
接合して遺伝子組換えベクターとなす工程と、 ｆ）この遺伝子組換えベクターを宿主細胞番こ取込ませ
てその形質転換を行う工程と、 ｇ）得られた形質転換細胞を培養して Ｌ−グロノラク
トン酸化酵素又はこれに類する物質を産生させる工程と
、 ｈ）産生されたＬ−グロノラクトン酸化酵素又はこれに
類する物質を分１１１ｉ精製する工程とを具備している
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素又はこれに類する物質の製
法により達成され、これによって上記の問題点が解決さ
れるのである。
体公知の方法により精製して高純度なものとなし、この
精製酵素をウサギに免疫させて抗血清を得る工程と、 ｂ）ラット肝臓のｍＲＮＡから調製された市販のλｇｔ
１１ファージのｃＤＮＡ発現ライブラリを用い、このフ
ァージをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ Ｙ１０９
０（ｒ−）に感染させ培養し、イソプロピｌレーβ−Ｄ
−チオガラクトピラノシドにより融合蛋白を誘導させ、
上記の抗血清を用いてこの融合蛋白を酵素免疫法により
検出してスクリーニングすること番こより し−グロノ
ラクトン酸化酵素のクローンを（尋る工程と、 Ｃ）このポジティブクローンを培養してλファージのク
ローン化ＤＮＡを調製する工程と、ｄ）この人ファージ
のクローン化ＤＮＡを！１１限酵素で切断してインサー
トＤＮＡとなす工程と、ｅ）プラスミドベクタ−を制限
酵素で切断し、その断点に上記のインサー） ＯＮ入を
接合して遺伝子組換えベクターとなす工程と、 ｆ）この遺伝子組換えベクターを宿主細胞番こ取込ませ
てその形質転換を行う工程と、 ｇ）得られた形質転換細胞を培養して Ｌ−グロノラク
トン酸化酵素又はこれに類する物質を産生させる工程と
、 ｈ）産生されたＬ−グロノラクトン酸化酵素又はこれに
類する物質を分１１１ｉ精製する工程とを具備している
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素又はこれに類する物質の製
法により達成され、これによって上記の問題点が解決さ
れるのである。
本発明において、ラット Ｌ−グロノラクトン酸化酵素
のアミノ酸配列をコードしている塩基配列とは式 ％式％ （式中においてＡ、 Ｃ，Ｇ及びＴはそれぞれアデニン
、シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシ
リボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応
するコドン毎の配列として示されている） にて示される１３１７個のヌクレオチドを含むヌクレオ
チド配列又はそれと生物学的に同等のヌクレオチド配列
を意味する。ここにおいて、生物学的に同等のヌクレオ
チド配列とは、二つのコドンｒＴＴＡ」と ｒＣＴＧＪ
におけるように、ヌクレオチドの種類や配置が異なるに
も拘らず、同一のアミノ酸（この場合は「ロイシン」）
を指定するようなヌクレオチド配列を意味しており、従
って上記のヌクレオチド配列により指定されるアミノ酸
配列、即ち Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ｐｈｅ ＧｌｎＡｓｎ Ｔｒｐ Ａ
ｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃ
ｙｓ Ｓｃｒ ［’ｒ。
のアミノ酸配列をコードしている塩基配列とは式 ％式％ （式中においてＡ、 Ｃ，Ｇ及びＴはそれぞれアデニン
、シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシ
リボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応
するコドン毎の配列として示されている） にて示される１３１７個のヌクレオチドを含むヌクレオ
チド配列又はそれと生物学的に同等のヌクレオチド配列
を意味する。ここにおいて、生物学的に同等のヌクレオ
チド配列とは、二つのコドンｒＴＴＡ」と ｒＣＴＧＪ
におけるように、ヌクレオチドの種類や配置が異なるに
も拘らず、同一のアミノ酸（この場合は「ロイシン」）
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ｂｒ １ｉｅｒ Ｖａｌ ＧｌｕＧｌｕ Ｖａｔ Ａｒ
ｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ
ＡｒｇＧｌａ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖ
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ｐ Ｌｙｓ ＧｌａＬｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ ＩＩｓ
Ｔｈｒ Ｖａｔ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｙ ＩＩｅＬｅ
ａ ＬｅｕＡｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＡｓｐＧｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｓｎ
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ｌｙ Ｖａ１１ｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
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ｌ１ｅＬｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ ＬｅｕＡ
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Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｈ
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ｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ＾ｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｔｒｐ
Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ ｌ１ｅＧｌｙ ！
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Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＴｒｐＴｂｒ Ｓｅ
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ｒｏ Ｔｙｒ ＧｌｙＬｙｓ Ａｓｐ Ｖａｔ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＬｅｕＡ
ｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＧｌｙＧｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎＣｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ ＴｙｒＰｒｏ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｒ４Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｅ
ａ入ｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｖａｔ Ｐｈｅ Ｔｙｒと同一のアミ
ノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を意味して
いる。
ｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ ＶａｔｋＢ Ｐｈｅ Ｔｈｒ＾
ｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅａ Ｌｅ
ａＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ 、Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ＴｙｒＭｅｔ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｔｙｒ ＧｌｙＬｙｓ Ａｓｐ Ｖａｔ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＬｅｕＡ
ｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＧｌｙＧｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎＣｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ ＴｙｒＰｒｏ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ａｒ４Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｅ
ａ入ｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｖａｔ Ｐｈｅ Ｔｙｒと同一のアミ
ノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を意味して
いる。
この１３１７個のヌクレオチドを含むクローン化ＤＮＡ
は約２１００個のヌクレオチドを含む前記のクローン化
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより得る
ことができ、又更に小さなりＮＡ断片は上記の約２１０
０又は１３１７個のヌクレオチドを含むＤＮＡ領域を適
当な制限酵素により切断することにより得ることができ
る。勿論、制限酵素による切断のみで所望の断片が得ら
れない場合にはＤＮＡ合成装置を用い且つ自体公知の方
法でＤＮＡを一部合成し、この合成りＮＡを上記の切断
断片に接合することにより得ることができる。
は約２１００個のヌクレオチドを含む前記のクローン化
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより得る
ことができ、又更に小さなりＮＡ断片は上記の約２１０
０又は１３１７個のヌクレオチドを含むＤＮＡ領域を適
当な制限酵素により切断することにより得ることができ
る。勿論、制限酵素による切断のみで所望の断片が得ら
れない場合にはＤＮＡ合成装置を用い且つ自体公知の方
法でＤＮＡを一部合成し、この合成りＮＡを上記の切断
断片に接合することにより得ることができる。
尚、遺伝子組換えベクターを取込ませる宿主細胞として
は酵母、枯草菌、放線菌等の微生物、マウス、ヒト等の
動物の培養細胞、タバコ、トウモロコシ等の植物の培養
細胞であることができる。
は酵母、枯草菌、放線菌等の微生物、マウス、ヒト等の
動物の培養細胞、タバコ、トウモロコシ等の植物の培養
細胞であることができる。
（実施例等）
次に、参考例、製造例、試験例等により本発明を更に詳
細に説明する。
細に説明する。
１１涯
（Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のＮ−末端アミノ酸配列
の決定） ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自体公
知の方法［ＮｉＮ１５ｈｔｋｉ、 Ｍ、等”Ａｒｃｈ。
の決定） ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自体公
知の方法［ＮｉＮ１５ｈｔｋｉ、 Ｍ、等”Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、”」第１７５巻第
４２７−４３５頁（１９７６年）１により精製して高純
度なものとなした。この精製Ｌ−グロノラクトン酸化酵
素１００μｇをエドマン分解し、気相プロテインシーク
エンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製
のモデル４７０Ａ）によりＮ末端部分のアミノ酸配列を
分析した結果は下記の通りであった。
４２７−４３５頁（１９７６年）１により精製して高純
度なものとなした。この精製Ｌ−グロノラクトン酸化酵
素１００μｇをエドマン分解し、気相プロテインシーク
エンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製
のモデル４７０Ａ）によりＮ末端部分のアミノ酸配列を
分析した結果は下記の通りであった。
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｂｅ−Ｇｌｎ−入５ｎ−Ｔｒｐ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−３ｅｒ
−１’ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−Ａｒｇ １１漣ユ （し−グロノラクトン酸化酵素を含むクローン化ＤＮＡ
の調製） ａ）抗Ｌ−グロノラクトン酸化酵素抗血清の調製 参考例に記載の方法で得た、ラット由来の高純度Ｌ−グ
ロノラクトン酸化酵素をウサギに対して免疫させること
により抗血清を得た。
ａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｂｅ−Ｇｌｎ−入５ｎ−Ｔｒｐ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−３ｅｒ
−１’ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−Ａｒｇ １１漣ユ （し−グロノラクトン酸化酵素を含むクローン化ＤＮＡ
の調製） ａ）抗Ｌ−グロノラクトン酸化酵素抗血清の調製 参考例に記載の方法で得た、ラット由来の高純度Ｌ−グ
ロノラクトン酸化酵素をウサギに対して免疫させること
により抗血清を得た。
ｂ） ｃＤＮＡライブラリによるスクリーニングラット
肝臓のｍＲＮＡから調製された、市販のλｇｔ１１ファ
ージのｃＤＮＡ発現ライブラリ（Ｃ１ｏｎｔｅｃ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、上記の抗血清を利
用する酵素免疫法によりＬ−グロノラクトン酸化酵素の
クローンをスクリーニングした。
肝臓のｍＲＮＡから調製された、市販のλｇｔ１１ファ
ージのｃＤＮＡ発現ライブラリ（Ｃ１ｏｎｔｅｃ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、上記の抗血清を利
用する酵素免疫法によりＬ−グロノラクトン酸化酵素の
クローンをスクリーニングした。
即ち、λｇｔ１１ファージをＥｓｃｂ ｒｉ ｈ’ａ
ｃｏｌｔＹ１０９０ （ｒ−）に感染させ、これを軟寒
天培地と混合した後にＬＢ寒天培地（アンピシリン１０
０μｇを含有）上に広げ固化させた。これを４２℃で３
時間培養してプラークを形成させた後に、ｌｏｍＭのイ
ソプロピル−β−０−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）溶液を染み込ませたニトロセルロースフィルターを
プラークの上に載置して３７℃で２時間培養し、ＩＰＴ
［ｉにより誘導された融合蛋白をフィルターに吸着させ
た。このフィルターをＴＢＳＴ （５θｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、 ｐＨ７，９，１５０ｍＭ ＮａＣ１゜０．
０５％Ｔｗｅｅｏ−２０）で軽く洗浄し、２０％牛脂児
血清含有ＴＢＳＴを３０分間作用させた。
ｃｏｌｔＹ１０９０ （ｒ−）に感染させ、これを軟寒
天培地と混合した後にＬＢ寒天培地（アンピシリン１０
０μｇを含有）上に広げ固化させた。これを４２℃で３
時間培養してプラークを形成させた後に、ｌｏｍＭのイ
ソプロピル−β−０−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）溶液を染み込ませたニトロセルロースフィルターを
プラークの上に載置して３７℃で２時間培養し、ＩＰＴ
［ｉにより誘導された融合蛋白をフィルターに吸着させ
た。このフィルターをＴＢＳＴ （５θｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、 ｐＨ７，９，１５０ｍＭ ＮａＣ１゜０．
０５％Ｔｗｅｅｏ−２０）で軽く洗浄し、２０％牛脂児
血清含有ＴＢＳＴを３０分間作用させた。
これに、前記のａ）項に記載の抗Ｌ−グロノラクトン酸
化酵素抗血清を １０００倍に稀釈させたＴＢ ＳＴを
１６時間作用させた０次いで、フィルターをＴＢＳＴ
で充分に洗浄した後に、ホースラデイシュ由来のペルオ
キシダーゼで標識を施したヤギ抗ウサギＩｇＧ （［１
ｉｏ−Ｒａｄ社製）を３０００倍に稀釈したＴＢＳＴを
２時間作用させた。 ＴＢＳＴからＴｗｅｅｎ−２０を
除去した溶液でフィルターを充分に洗浄した後に、過酸
化水素と４−り四ローｌ−ナフトールを基質として発色
させることによりポジティブクローンを検出した。ポジ
ティブクローンについて同様のスクリーニングを繰り返
して単一のクローンに純化させた。ファージはＬＢ培地
で液体培養した後にポリエチレングリコールによる沈殿
法［Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、 等”Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８
２）］に従って調製された。
化酵素抗血清を １０００倍に稀釈させたＴＢ ＳＴを
１６時間作用させた０次いで、フィルターをＴＢＳＴ
で充分に洗浄した後に、ホースラデイシュ由来のペルオ
キシダーゼで標識を施したヤギ抗ウサギＩｇＧ （［１
ｉｏ−Ｒａｄ社製）を３０００倍に稀釈したＴＢＳＴを
２時間作用させた。 ＴＢＳＴからＴｗｅｅｎ−２０を
除去した溶液でフィルターを充分に洗浄した後に、過酸
化水素と４−り四ローｌ−ナフトールを基質として発色
させることによりポジティブクローンを検出した。ポジ
ティブクローンについて同様のスクリーニングを繰り返
して単一のクローンに純化させた。ファージはＬＢ培地
で液体培養した後にポリエチレングリコールによる沈殿
法［Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、 等”Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８
２）］に従って調製された。
Ｃ）クローン化［ＩＮＡ及びその断片の調製上記のｂ）
項で得られた＾ファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断すれば、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配
列をコードしている塩基配列を含む所望のクローン化Ｄ
ＮＡが得られる。
項で得られた＾ファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断すれば、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配
列をコードしている塩基配列を含む所望のクローン化Ｄ
ＮＡが得られる。
尚、このクローン化ＤＮＡに自体公知の適宜の制限酵素
を作用させて切断すれば、種々の長さを有するクローン
化ＤＮＡ断片が得られる。
を作用させて切断すれば、種々の長さを有するクローン
化ＤＮＡ断片が得られる。
製ＩＬｆＬｉ
（遺伝子組換えベクターの調製）
上記製造例１のＣ）項で得たＬ−グロノラクトンをコー
ドしているクローン化ＤＮＡの組込まれたλｇ、ｔ１１
ファージに、蛋白をコードする領域を切断しない制限酵
素であるＢｃｌＩ及び５ｐｈｌを作用させて切断した後
に、このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により回
収した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ フラグ
メント）と各５０μＭのｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ、 ｄｃ
ＴＩ’、 ｄＧＴＩ’、 ｄＴＴｌ’）を含有する６７
ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７，４）、６．７ｍＭＭｇＣ１
２，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液を上記のＤ
ＮＡ断片に作用させることにより断片の末端を平滑にな
した。
ドしているクローン化ＤＮＡの組込まれたλｇ、ｔ１１
ファージに、蛋白をコードする領域を切断しない制限酵
素であるＢｃｌＩ及び５ｐｈｌを作用させて切断した後
に、このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により回
収した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ フラグ
メント）と各５０μＭのｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ、 ｄｃ
ＴＩ’、 ｄＧＴＩ’、 ｄＴＴｌ’）を含有する６７
ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７，４）、６．７ｍＭＭｇＣ１
２，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液を上記のＤ
ＮＡ断片に作用させることにより断片の末端を平滑にな
した。
次いで、このＤＮＡ断片の両端に、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造株式会社製）を用いて、８ｇ１１ｌリ
ンカ−を付加した後に、アガロースゲル電気泳動により
ＢｇｌＩＩ リンカ−付加ＤＮＡを回収した。
ンキット（宝酒造株式会社製）を用いて、８ｇ１１ｌリ
ンカ−を付加した後に、アガロースゲル電気泳動により
ＢｇｌＩＩ リンカ−付加ＤＮＡを回収した。
一方、プラスミドｐＫｓＶ−１０（ファルマシア・ジャ
パン株式会社製）をＢｇ１１ｌで切断し、その断点に上
記の８ｇ１１ｌリンカ−付加１１ＮＡを結合させた。
パン株式会社製）をＢｇ１１ｌで切断し、その断点に上
記の８ｇ１１ｌリンカ−付加１１ＮＡを結合させた。
得られたベクターを大腸菌に取込ませて大腸菌の形質転
換を行い、その形質転換体からアンピシリン耐性菌を選
択し、この菌からプラスミドを取出すことにより所望の
遺伝子組換えベクターを得た。
換を行い、その形質転換体からアンピシリン耐性菌を選
択し、この菌からプラスミドを取出すことにより所望の
遺伝子組換えベクターを得た。
この遺伝子組換えベクターにおいてはｐＫＳＶ−１０の
ＳＶ４０プロモータ下流にＬ−グロノラクトン酸化酵素
をコードするＤＮＡが正しい方向で配置されており、従
ってこのベクターはＬ−グロノラクトン酸化酵素を発現
し得るベクターである。
ＳＶ４０プロモータ下流にＬ−グロノラクトン酸化酵素
をコードするＤＮＡが正しい方向で配置されており、従
ってこのベクターはＬ−グロノラクトン酸化酵素を発現
し得るベクターである。
製ｍ
（形質転換宿主細胞の調製）
マウスＬＩＴ−細胞をダルベツコ改良イーグル培地で培
養させた後に、６０ｍｍ径のベトリ皿当り１．５ ｘ
１０’個の細胞を入れた。
養させた後に、６０ｍｍ径のベトリ皿当り１．５ ｘ
１０’個の細胞を入れた。
一方、５０ｄ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，１）、２８０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４からなる溶
液１．２５ｍ１に５μｇのプラスミドｐＫｓＶＧｏ （
前記の製造例２により得られた遺伝子組換えベクター）
、２．５μｇのチミジンキナーゼ遺伝子及び５μｇのサ
ケ精子ＤＮＡ溶液１．１ｍｌと ２Ｍ ＣａＣｌ２溶液
０．１５ｍ１とを混合し、室温で３０分間放置して処理
液を調製しておいた。
Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４からなる溶
液１．２５ｍ１に５μｇのプラスミドｐＫｓＶＧｏ （
前記の製造例２により得られた遺伝子組換えベクター）
、２．５μｇのチミジンキナーゼ遺伝子及び５μｇのサ
ケ精子ＤＮＡ溶液１．１ｍｌと ２Ｍ ＣａＣｌ２溶液
０．１５ｍ１とを混合し、室温で３０分間放置して処理
液を調製しておいた。
この処理液０．５１を上記の細胞収容へトリ皿に添加し
、室温で３０分間放置した後にダルベツコ改良イーグル
培地５１＋を添加し、５Ｘ ＣＯ２，３７℃の条件下に
５時間培養を行った。ダルベツコ改良イーグル培地を交
換後更に２４時間培養し、次いでヒボキサンチン（１５
μｓ／ｍｌ）、アミノプテリン（ｌμｇ／ｌ）及びチミ
ジン（５μｇ／ｍｌ）を含有するＨＡＴ培地に培地を交
換して培養を継続する。２−４週間後に形成された細胞
集落を分離して形質転換宿主細胞を得た。
、室温で３０分間放置した後にダルベツコ改良イーグル
培地５１＋を添加し、５Ｘ ＣＯ２，３７℃の条件下に
５時間培養を行った。ダルベツコ改良イーグル培地を交
換後更に２４時間培養し、次いでヒボキサンチン（１５
μｓ／ｍｌ）、アミノプテリン（ｌμｇ／ｌ）及びチミ
ジン（５μｇ／ｍｌ）を含有するＨＡＴ培地に培地を交
換して培養を継続する。２−４週間後に形成された細胞
集落を分離して形質転換宿主細胞を得た。
置１」Ｌま
（Ｌ−グロノラクトン酸化酵素の製造）製造例３により
得られた形質転換宿主細胞をダルベツコ改良イーグル培
地で培養することにより増殖させ、その培養上清及び培
養細胞を回収した。この培養上清については、これを直
接にカラムクロマトグラフィーにかけ、又培養細胞につ
いてはＩＮ Ｔｒｉｔｏｏ Ｘ−１００溶液に懸濁させ
た後にカラムクロマトグラフィーにかけることにより
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を分離精製した。
得られた形質転換宿主細胞をダルベツコ改良イーグル培
地で培養することにより増殖させ、その培養上清及び培
養細胞を回収した。この培養上清については、これを直
接にカラムクロマトグラフィーにかけ、又培養細胞につ
いてはＩＮ Ｔｒｉｔｏｏ Ｘ−１００溶液に懸濁させ
た後にカラムクロマトグラフィーにかけることにより
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を分離精製した。
尚、本製造例では、参考例で言及したように生物起源の
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を原料として調製され且つ
製造例１のＣ）項で言及した、λフアージＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより調製されなＬ−グ
ロノラクトン酸化酵素のクローン化遺伝子ＤＮＡが宿主
細胞のプラスミドに組込まれているために、この宿主細
胞がＬ−グロノラクトン酸化酵素を産生じているが、生
物起源の配列とアミノ酸配列は等しいが塩基配列が異な
る、少なくとも一部が合成されたＬ−グロノラクトン酸
化酵素のクローン化ＤＮＡが宿主細胞のプラスミドに組
込まれていたり、或は又Ｌ−グロノラクトン酸化酵素の
ＤＮＡよりも遺伝子領域の短いＤＮＡ断片が組込まれて
いれば、荷重細胞はＬ−グロノラクトン酸化酵素ではな
く、この酵素に類する物質を産生ずることになる。
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を原料として調製され且つ
製造例１のＣ）項で言及した、λフアージＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより調製されなＬ−グ
ロノラクトン酸化酵素のクローン化遺伝子ＤＮＡが宿主
細胞のプラスミドに組込まれているために、この宿主細
胞がＬ−グロノラクトン酸化酵素を産生じているが、生
物起源の配列とアミノ酸配列は等しいが塩基配列が異な
る、少なくとも一部が合成されたＬ−グロノラクトン酸
化酵素のクローン化ＤＮＡが宿主細胞のプラスミドに組
込まれていたり、或は又Ｌ−グロノラクトン酸化酵素の
ＤＮＡよりも遺伝子領域の短いＤＮＡ断片が組込まれて
いれば、荷重細胞はＬ−グロノラクトン酸化酵素ではな
く、この酵素に類する物質を産生ずることになる。
１１匠」
（制限酵素地図の作成）
製造例１のＣ）項で言及の、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
したλファージ（λｇｔ１１）のｃＤＮＡ挿入部（イン
サート）断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、
相当する部分のゲルを切出し、これよりＤＮＡ断片を抽
出した。このＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＩで切断したプラ
スミドｐｕｃ １９とをＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造株式会社製〉によりライゲーションした。得ら
れた組換えプラスミドを用い、製造例３と同様にして、
但し宿主細胞としてのＥｓｃｂｅｒｔｃｂｉａ ｃｏｌ
ｔ ＪＭ１０９の形質転換を行い、形質転換宿主細胞を
得た。この宿主細胞を培養し、アルカリ−５ＯＳライセ
ード法（前出のＭａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、等の方法）に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミド
ＤＮＡ （インサートＤＮＡを含む）を各種の制限酵素
で切断し、ＤＮＡ断片の長さをアガロースゲル電気泳動
により調べて制限酵素地図を作成した結果、プラスミド
ＤＮＡは第１図に示される通りの制限酵素認識部位を有
していることが判明した。
したλファージ（λｇｔ１１）のｃＤＮＡ挿入部（イン
サート）断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、
相当する部分のゲルを切出し、これよりＤＮＡ断片を抽
出した。このＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＩで切断したプラ
スミドｐｕｃ １９とをＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造株式会社製〉によりライゲーションした。得ら
れた組換えプラスミドを用い、製造例３と同様にして、
但し宿主細胞としてのＥｓｃｂｅｒｔｃｂｉａ ｃｏｌ
ｔ ＪＭ１０９の形質転換を行い、形質転換宿主細胞を
得た。この宿主細胞を培養し、アルカリ−５ＯＳライセ
ード法（前出のＭａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、等の方法）に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミド
ＤＮＡ （インサートＤＮＡを含む）を各種の制限酵素
で切断し、ＤＮＡ断片の長さをアガロースゲル電気泳動
により調べて制限酵素地図を作成した結果、プラスミド
ＤＮＡは第１図に示される通りの制限酵素認識部位を有
していることが判明した。
隨１匠ユ
（プラスミドＤＮＡの塩基配列の決定とＬ−グロノラク
トン酸化酵素部分のアミノ酸配列の決定） 試験例１で言及したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩにより切断して得た断片をファージＭ１３ ｍｐｌ
ｇにサブクローニングし、得られた組換えベクターによ
り Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ ＪＭ１０９を
形質転換させた。得られた形質転換体のプラスミドを制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、その内で約１．３ｋｂのイ
ンサー） ＤＮＡを有するものについては、上記ファー
ジのＲＦ ＤＮＡを調製し、キロシーフェンス用デレー
ジョンキット（宝酒造株式会社製）を用い且つエクソヌ
クレアーゼＩＩＩとマングビーンヌクレアーゼを用いる
方法［Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ、 Ｓ。
トン酸化酵素部分のアミノ酸配列の決定） 試験例１で言及したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩにより切断して得た断片をファージＭ１３ ｍｐｌ
ｇにサブクローニングし、得られた組換えベクターによ
り Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ ＪＭ１０９を
形質転換させた。得られた形質転換体のプラスミドを制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、その内で約１．３ｋｂのイ
ンサー） ＤＮＡを有するものについては、上記ファー
ジのＲＦ ＤＮＡを調製し、キロシーフェンス用デレー
ジョンキット（宝酒造株式会社製）を用い且つエクソヌ
クレアーゼＩＩＩとマングビーンヌクレアーゼを用いる
方法［Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ、 Ｓ。
”Ｇｅｎｅ”第２８巻第３５１−３５９頁（１９８４年
）及びＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｏ、 Ｃ，等“Ｇｅ
ｎｅ″第３３巻第１０３−１１９頁（１９１１５年）］
によりデブレーションミュータンを作成した。
）及びＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｏ、 Ｃ，等“Ｇｅ
ｎｅ″第３３巻第１０３−１１９頁（１９１１５年）］
によりデブレーションミュータンを作成した。
一方、各種の制限酵素を用いて、ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切
断断片を更に切断して種々の領域長さを有するものとな
し、この各フラグメントをそれぞれファージＭ１３ ｍ
ｐｌｇにサブクローニングした。
断断片を更に切断して種々の領域長さを有するものとな
し、この各フラグメントをそれぞれファージＭ１３ ｍ
ｐｌｇにサブクローニングした。
上記のデレーションミュータント及びサブクローンのＤ
ＮＡ断片について、それぞれジデオキシ−チエインター
ミネータ法［Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ。
ＮＡ断片について、それぞれジデオキシ−チエインター
ミネータ法［Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ。
“５ｃｉｅｎｃｅ″第２１４巻第１２０５−１２１０頁
（１９８１年）１の改良法［Ｍｉｚｕｓａｖａ、 Ｓ、
等“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、”第１４巻
第１３１９−１３２４頁（１９８６年）１に従って塩基
配列の決定を行った。第１図において、点線矢印はデレ
ーションミュータントのＤＮＡ断片に関する塩基配列の
決定方向と領域とを示し、実線矢印はサブクローンのＤ
ＮＡ断片に関する塩基配列の決定方向と領域とを示して
いる。
（１９８１年）１の改良法［Ｍｉｚｕｓａｖａ、 Ｓ、
等“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、”第１４巻
第１３１９−１３２４頁（１９８６年）１に従って塩基
配列の決定を行った。第１図において、点線矢印はデレ
ーションミュータントのＤＮＡ断片に関する塩基配列の
決定方向と領域とを示し、実線矢印はサブクローンのＤ
ＮＡ断片に関する塩基配列の決定方向と領域とを示して
いる。
各断片について決定された塩基配列を繋ぎ合わせること
により最終的に決定された塩基配列は第２図に示される
通りであり、２１２０ｂｐの領域長さを有していた。こ
の塩基配列において、塩基番号１番から１３２３番迄の
領域がＬ−グロノラクトン酸化酵素をコードする領域で
あって、開始コドンである ＡＴＧから始まり、終止コ
ドンである ＴＡＡにより終了するオープンリーディン
グフレームとして存在し、アミノ酸数は４３９個であワ
た。このクローン化ＤＮＡのＮ末端における塩基配列が
指定するアミノ酸配列（第２図においてアンダーライン
の付されているアミノ酸配列部分）が、ラットＬ−グロ
ノラクトン酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列（参考例にお
ける分析結果）と−致するので、このクローン化ＤＮＡ
塩基配列はラット Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のもの
と同定された。
により最終的に決定された塩基配列は第２図に示される
通りであり、２１２０ｂｐの領域長さを有していた。こ
の塩基配列において、塩基番号１番から１３２３番迄の
領域がＬ−グロノラクトン酸化酵素をコードする領域で
あって、開始コドンである ＡＴＧから始まり、終止コ
ドンである ＴＡＡにより終了するオープンリーディン
グフレームとして存在し、アミノ酸数は４３９個であワ
た。このクローン化ＤＮＡのＮ末端における塩基配列が
指定するアミノ酸配列（第２図においてアンダーライン
の付されているアミノ酸配列部分）が、ラットＬ−グロ
ノラクトン酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列（参考例にお
ける分析結果）と−致するので、このクローン化ＤＮＡ
塩基配列はラット Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のもの
と同定された。
（発明の効果）
ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配列をコ
ードしている塩基配列を含む、本発明によるクローン化
ＤＮＡ及びその断片、該クローン化ＤＮＡ又は断片の組
込まれた遺伝子組換えベクター並びに該ベクターにより
形質転換された宿主細胞はＬ−グロノラクトン酸化酵素
及びこれに類する物質の大量生産を可能になす。
ードしている塩基配列を含む、本発明によるクローン化
ＤＮＡ及びその断片、該クローン化ＤＮＡ又は断片の組
込まれた遺伝子組換えベクター並びに該ベクターにより
形質転換された宿主細胞はＬ−グロノラクトン酸化酵素
及びこれに類する物質の大量生産を可能になす。
一方、本発明方法により製造されるＬ−グロノラクトン
酸化酵素又はこれに類する物質によりＬ−グロノラクト
ンを処理すれば、自体周知のように、アスコルビン酸く
ビタミンＣ）又はその類縁体を極めて容易に製造するこ
とができる。
酸化酵素又はこれに類する物質によりＬ−グロノラクト
ンを処理すれば、自体周知のように、アスコルビン酸く
ビタミンＣ）又はその類縁体を極めて容易に製造するこ
とができる。
第１図はラット Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ
酸配列をコードしている塩基配列を含む、本発明による
クローン化ＤＮＡ領域並びに該領域の塩基配列決定のた
めに用いられた制限酵素と、゛塩基配列決定のためのス
トラテジーとを示す図面、第２図は本発明によるクロー
ン化ＤＮＡ領域における塩基配列及び該配列内において
オープンリーディングフレームを構成するアミノ酸配列
を示す図面である。
酸配列をコードしている塩基配列を含む、本発明による
クローン化ＤＮＡ領域並びに該領域の塩基配列決定のた
めに用いられた制限酵素と、゛塩基配列決定のためのス
トラテジーとを示す図面、第２図は本発明によるクロー
ン化ＤＮＡ領域における塩基配列及び該配列内において
オープンリーディングフレームを構成するアミノ酸配列
を示す図面である。
Claims (9)
- （１）ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配
列をコードしている塩基配列を含み約２１００個のヌク
レオチドからなるクローン化ＤＮＡ又はその断片。 - （２）ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配
列をコードしている塩基配列が、式 【遺伝子配列があります。】 （式中においてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている） にて示される１３１７個のヌクレオチドを有するヌクレ
オチド配列又はそれと生物学的に同等のヌクレオチド配
列を含んでいることを特徴とする、特許請求の範囲第１
項に記載のクローン化ＤＮＡ又はその断片。 - （３）アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります。】 である領域を含んでいることを特徴とする、特許請求の
範囲第１又は２項に記載のクローン化ＤＮＡ又はその断
片。 - （４）ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配
列をコードしている塩基配列を含み約２１００個のヌク
レオチドからなるクローン化ＤＮＡ又はその断片が組込
まれていることを特徴とする、遺伝子組換えベクター。 - （５）ベクターが宿主細胞内で該ベクターに組込まれた
ＤＮＡのコードしている蛋白質を発現する発現ベクター
であることを特徴とする、特許請求の範囲第４項に記載
の遺伝子組換えベクター。 - （６）ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配
列をコードしている塩基配列を含み約２１００個のヌク
レオチドからなるクローン化ＤＮＡ又はその断片が組込
まれた遺伝子組換えベクターにより形質転換されている
ことを特徴とする、宿主細胞。 - （７）宿主細胞が微生物、動物及び植物の培養細胞から
選択されたものであることを特徴とする、特許請求の範
囲第６項に記載の宿主細胞。 - （８）微生物の培養細胞が酵母、枯草菌及び放線菌の培
養細胞から選ばれたものであることを特徴とする、特許
請求の範囲第７項に記載の宿主細胞。 - （９）Ｌ−グロノラクトン酸化酵素又はこれに類する物
質を製造する方法において、 ａ）ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自
体公知の方法で精製して高純度なものとなし、この精製
酵素をウサギに免疫させて抗血清を得る工程と、 ｂ）ラット肝臓のｍＲＮＡから調製された市販のλｇｔ
１１ファージのｃＤＮＡ発現ライブラリを用い、このフ
ァージをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９
０（ｒ−）に感染させ培養し、イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシドにより融合蛋白を誘導させ、上
記の抗血清を用いてこの融合蛋白を酵素免疫法により検
出してスクリーニングすることによりＬ−グロノラクト
ン酸化酵素のクローンを得る工程と、 ｃ）このポジティブクローンを培養してλファージのク
ローン化ＤＮＡを調製する工程と、 ｄ）このλファージのクローン化ＤＮＡを制限酵素で切
断してインサートＤＮＡとなす工程と、 ｅ）プラスミドベクタ−を制限酵素で切断し、その断点
に上記のインサートＤＮＡを接合して遺伝子組換えベク
ターとなす工程と、 ｆ）この遺伝子組換えベクターを宿主細胞に取込ませて
その形質転換を行う工程と、 ｇ）得られた形質転換細胞を培養してＬ−グロノラクト
ン酸化酵素又はこれに類する物質を産生させる工程と、 ｈ）産生されたＬ−グロノラクトン酸化酵素又はこれに
類する物質を分離精製する工程 とを具備していることを特徴とする、Ｌ−グロノラクト
ン酸化酵素又はこれに類する物質の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62247896A JP2602435B2 (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62247896A JP2602435B2 (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0191785A true JPH0191785A (ja) | 1989-04-11 |
| JP2602435B2 JP2602435B2 (ja) | 1997-04-23 |
Family
ID=17170178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62247896A Expired - Lifetime JP2602435B2 (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2602435B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997029194A3 (de) * | 1996-02-09 | 1997-10-02 | Herbstreith & Fox Kg Pektin Fa | Herstellung von l-ascorbinsäure |
| WO1998050558A3 (en) * | 1997-05-07 | 1999-02-04 | Vlaams Interuniv Inst Biotech | Production of ascorbic acid in plants |
-
1987
- 1987-10-02 JP JP62247896A patent/JP2602435B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997029194A3 (de) * | 1996-02-09 | 1997-10-02 | Herbstreith & Fox Kg Pektin Fa | Herstellung von l-ascorbinsäure |
| WO1998050558A3 (en) * | 1997-05-07 | 1999-02-04 | Vlaams Interuniv Inst Biotech | Production of ascorbic acid in plants |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2602435B2 (ja) | 1997-04-23 |
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