JPH0194261A - 酵素関与するアッセイのために、均一系でリポソームを利用してシグナルを増幅する方法 - Google Patents
酵素関与するアッセイのために、均一系でリポソームを利用してシグナルを増幅する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は酵素関与するアッセイのために、均−系でリポ
ソームを利用して信号を増幅する方法に関する。
ソームを利用して信号を増幅する方法に関する。
（従来の技術）
多くのホスホリビヮドは、水性媒体に分散させて、閉じ
た二層小胞（リポソーム）とすることができ、この小胞
は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造でありうる。し
かしながら、ミセルまたはへキサゴナル（Ｈ１＋）相の
ような非二層構造も、多くのホスホリピッドおよびグリ
コリピッドの系において存在できる。
た二層小胞（リポソーム）とすることができ、この小胞
は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造でありうる。し
かしながら、ミセルまたはへキサゴナル（Ｈ１＋）相の
ような非二層構造も、多くのホスホリピッドおよびグリ
コリピッドの系において存在できる。
生理的温度および」における不飽和ホスファチジル・エ
タノールアミン（ＰＥ）の平衡相が、へキサゴナル相（
Ｈ＋ ＋ ）であることは、確立されている（Ｃｕｌｌ
ｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ 。
タノールアミン（ＰＥ）の平衡相が、へキサゴナル相（
Ｈ＋ ＋ ）であることは、確立されている（Ｃｕｌｌ
ｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ 。
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、５５９．３９９ ４２０（１９７
９））。
９））。
さらに、ＰＥが次のような種々の安定化分子を用いるこ
とにより、二層型で安定化出来ることも、確立されてい
る：即ち、脂肪酸（Ｃｏｎｎｏｒら。
とにより、二層型で安定化出来ることも、確立されてい
る：即ち、脂肪酸（Ｃｏｎｎｏｒら。
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、４６．３４３１ ３４４３
（１９８６））、コレステリル・ヘミサクシネート
（Ｅｌｌｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５．
５５００ ５５０６ （１９８４））、ハプテン化すビ
フド（Ｈｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
（１９８６））、コレステリル・ヘミサクシネート
（Ｅｌｌｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５．
５５００ ５５０６ （１９８４））、ハプテン化すビ
フド（Ｈｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
１、．１３４．４０３５−４０４０ （１９８５））、
グリコホリン（Ｉ（ｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
グリコホリン（Ｉ（ｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
１、．１３４．４０３５−４０４０ （１９８５）；Ｔ
ａｒａｓｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１．
５７５６−５７６４．（１９８２）ｉＨｕら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１
４１．９７３ ９７８（１９８６））：ガングリオシド
類（Ｔｓａｏら。
ａｒａｓｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１．
５７５６−５７６４．（１９８２）ｉＨｕら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１
４１．９７３ ９７８（１９８６））：ガングリオシド
類（Ｔｓａｏら。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２４． １０９２−１
０９８ （１９８５））；およびアシル化抗体（ＨＯら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５．５５００−５５０
６ （１９８６））。標的感受性免疫リポソームと命名
された、抗体で安定化されたＰＥリポソーム（Ｈｏら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
０９８ （１９８５））；およびアシル化抗体（ＨＯら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５．５５００−５５０
６ （１９８６））。標的感受性免疫リポソームと命名
された、抗体で安定化されたＰＥリポソーム（Ｈｏら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
２５．５５００−５５０６ （１９８６）；Ｈｏら。
Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ。
ｍｍｕｎ、、１３８．９３１ ９３７ （１９８６）は
、特異的標的に結合してそのリポソームの内容物を放出
することが、示されている。
、特異的標的に結合してそのリポソームの内容物を放出
することが、示されている。
リポソームの溶解は、補体またはその他の溶解剤とは無
関係である。これは、ヘルペスシンプレックスウィルス
の均一アッセイを構成するために用いられている（Ｈａ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍｕｎ、、１３８゜９３１−９３７ （１９８６）。
関係である。これは、ヘルペスシンプレックスウィルス
の均一アッセイを構成するために用いられている（Ｈａ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍｕｎ、、１３８゜９３１−９３７ （１９８６）。
多量の酵素分子を各リポソーム小胞内に捕捉することが
できるので、リポソームに基づくアッセイは一般に、相
当する酵素免疫アッセイまたはラ−８＝ ジオイムノアッセイより高感度である（Ｄ、Ｍ。
できるので、リポソームに基づくアッセイは一般に、相
当する酵素免疫アッセイまたはラ−８＝ ジオイムノアッセイより高感度である（Ｄ、Ｍ。
ｎｒｏｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ１１ｎｉｃａｌＰｒ
ｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｖｉｅｗ、１２月号３４−４１頁
（１９８６）。しかしながら、ある種の分析物は、現存
のリポソームに基づくアッセイでさえも、検出するため
に充分とは言えぬほど低濃度で存在する。
ｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｖｉｅｗ、１２月号３４−４１頁
（１９８６）。しかしながら、ある種の分析物は、現存
のリポソームに基づくアッセイでさえも、検出するため
に充分とは言えぬほど低濃度で存在する。
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、酵素を用いる均一アッセイにおいて、信号を
増強するための、安定化Ｈ１，相を形成するリポソーム
の新規用途である。本発明は、感度増強を要求される多
くのアッセイに応用可能である。
増強するための、安定化Ｈ１，相を形成するリポソーム
の新規用途である。本発明は、感度増強を要求される多
くのアッセイに応用可能である。
（課題を解決するための手段）
安定化Ｈ１ｌ相リピッド含有リポソームの中に存在する
安定化剤を酵素で分解すると、この安定化リポソームの
急速な膜安定化または溶解を引き起こすことが知られて
きた。
安定化剤を酵素で分解すると、この安定化リポソームの
急速な膜安定化または溶解を引き起こすことが知られて
きた。
例えば、標的感受性免疫リポソーム上の抗体のＦａｂ領
域をパパインによって除去すると、安定なリポソームの
脱安定化を生じる（Ｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、２５．５５００−５５０６（１９８６））。ＤＯＰＥ
−グリコホリンリポソームの二重層もまた、リポソーム
上の安定化用グリコホリンをトリプシンにより蛋白分解
すると、脱安定化される（Ｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、Ｉイ１゜９７
１−９７８ （１９８＆））。従って、安定化剤の親水
性部分を酵素で分解すると、それまで安定なリポソーム
の脱安定化を引き起こす。
域をパパインによって除去すると、安定なリポソームの
脱安定化を生じる（Ｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、２５．５５００−５５０６（１９８６））。ＤＯＰＥ
−グリコホリンリポソームの二重層もまた、リポソーム
上の安定化用グリコホリンをトリプシンにより蛋白分解
すると、脱安定化される（Ｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、Ｉイ１゜９７
１−９７８ （１９８＆））。従って、安定化剤の親水
性部分を酵素で分解すると、それまで安定なリポソーム
の脱安定化を引き起こす。
このような知識に基づいて、本発明者らは、リポソーム
が介在する信号増強法を発明した：この方法はＨ目相形
成すピッド（例えば、ホスファチジルエタノールアミン
またはＰＲ）は上記安定化用化合物または分子（例えば
、ガングリオシドＧＭ、）の−もしくはそれ以上によっ
て安定化することができるという事実を利用したもので
ある。
が介在する信号増強法を発明した：この方法はＨ目相形
成すピッド（例えば、ホスファチジルエタノールアミン
またはＰＲ）は上記安定化用化合物または分子（例えば
、ガングリオシドＧＭ、）の−もしくはそれ以上によっ
て安定化することができるという事実を利用したもので
ある。
本発明は安定化用化合物として、現在知られている酵素
アッセイで用られる酵素の基質である化合物を用いるこ
とを要求する（例えば、ＧＭ、は、ベータガラクトシダ
ーゼ酵素もしくはＢ−ｇａｌの基質である）。
アッセイで用られる酵素の基質である化合物を用いるこ
とを要求する（例えば、ＧＭ、は、ベータガラクトシダ
ーゼ酵素もしくはＢ−ｇａｌの基質である）。
さらに、本発明は安定化剤化合物とアッセイ酵素との酵
素反応の生成物が、リポソーム組成の安定化剤としても
はや機能しない（即ち、本発明が作用するためには、リ
ポソームは溶解すべきである）ことを要求する。
素反応の生成物が、リポソーム組成の安定化剤としても
はや機能しない（即ち、本発明が作用するためには、リ
ポソームは溶解すべきである）ことを要求する。
本発明はさらに、捕捉されたリポータ−酵素または他の
容易に検出可能なりボーグー成分を有するリポソームを
ｇｉすることを要求する（例えば、有用なリポータ−酵
素の一つは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（０６ＰＤＨ）である）。
容易に検出可能なりボーグー成分を有するリポソームを
ｇｉすることを要求する（例えば、有用なリポータ−酵
素の一つは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（０６ＰＤＨ）である）。
従って、例示的態様において、遊離の（活性な）Ｂ−ｔ
＜ａｌは、リポソームから分析物に依存する免疫溶解に
より遊離されてもよ＜ＣＨａら。
＜ａｌは、リポソームから分析物に依存する免疫溶解に
より遊離されてもよ＜ＣＨａら。
薬物担体としてのリポソーム；傾向と発達（Ｌｉｐｏｓ
ｏｍｅ ａｓ ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ；Ｔ
ｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）。
ｏｍｅ ａｓ ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ；Ｔ
ｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）。
＝１１−
Ｇ、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（１９８７））、またはＣ
ＥＤ ＩＡア７セイで使用されるように不活性成分から
再構成されてもよ＜ （Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、ＣＩ
ｉｎ、ｃｈｅｍ、、３２．１６３７−１６４１ （１
９８６））＝またはＥＬ Ｉ ＳＡまたは遺伝子−プロ
ーブアッセイにおけるように、酵素−抗体もしくは酵素
−アビジン複合物の一部であってもよく、このＢ−ｇａ
ｌがアッセイシステム中に添加される本発明のリポソー
ム上のＧＭｌを攻撃する。こうして脱安定化されたリポ
ソームは、捕捉されたリポータ−酵素を遊離し、判読信
号を増強する。
ＥＤ ＩＡア７セイで使用されるように不活性成分から
再構成されてもよ＜ （Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、ＣＩ
ｉｎ、ｃｈｅｍ、、３２．１６３７−１６４１ （１
９８６））＝またはＥＬ Ｉ ＳＡまたは遺伝子−プロ
ーブアッセイにおけるように、酵素−抗体もしくは酵素
−アビジン複合物の一部であってもよく、このＢ−ｇａ
ｌがアッセイシステム中に添加される本発明のリポソー
ム上のＧＭｌを攻撃する。こうして脱安定化されたリポ
ソームは、捕捉されたリポータ−酵素を遊離し、判読信
号を増強する。
図面の簡単な説明
第１図は、好ましい態様に基づいて本発明のリポソーム
を利用した信号増強法の原理を説明する図である。活性
酵素（例えばＢ−ｇａｌ）は再構成されたものでもよく
、分析物に依存して遊離されたものでも良いが、リポソ
ーム−安定化剤（例えばＣＭｌ）を分解して安定化リポ
ソームの溶解および捕捉酵素（例えばＧ６ＰＤＨ）の遊
離を生−１２〜 し、その結果、分析物に基づく誘発信号を増強する。
を利用した信号増強法の原理を説明する図である。活性
酵素（例えばＢ−ｇａｌ）は再構成されたものでもよく
、分析物に依存して遊離されたものでも良いが、リポソ
ーム−安定化剤（例えばＣＭｌ）を分解して安定化リポ
ソームの溶解および捕捉酵素（例えばＧ６ＰＤＨ）の遊
離を生−１２〜 し、その結果、分析物に基づく誘発信号を増強する。
第２図は、リポソームからのＧ６ＰＤｌ（酵素の遊離を
示すグラフである。リポソーム（１００マイクロモル）
をＢ−ｇａ Ｉ （２ｍｇ／ｍｆｆ１） （Ａ＞、
または０．１５％トリトン Ｘ−１００（Ｂ）、または
バッファー（Ｃ）と３７℃で１０分間予備加温した。得
られた反応混合物をリポソーム最終濃度が２０マイクロ
Ｍとなるように希釈して、０６ Ｐ Ｄ Ｈの基質を添
加し、そして酵素活性を３０分間にわたって測定した。
示すグラフである。リポソーム（１００マイクロモル）
をＢ−ｇａ Ｉ （２ｍｇ／ｍｆｆ１） （Ａ＞、
または０．１５％トリトン Ｘ−１００（Ｂ）、または
バッファー（Ｃ）と３７℃で１０分間予備加温した。得
られた反応混合物をリポソーム最終濃度が２０マイクロ
Ｍとなるように希釈して、０６ Ｐ Ｄ Ｈの基質を添
加し、そして酵素活性を３０分間にわたって測定した。
この測定は、３連で行い、その標準偏差は±６％であっ
た。
た。
第３（Ａ）図は、Ｂ−ｇａｌに誘発された、ＧＭ、−Ｐ
ＥリポソームからのＧ６ＰＤＨの遊離を示すグラフであ
る。リポソーム（５０マイクロモル） 、Ｇ６ Ｐ （
７ｍＭ）およびＮＡＤ” （２ｍＭ）を３７℃でＢ−
ｇａｌの存在下に（０−１，２ｑ／ｍＱ）インキュベー
トし、そして反応を３３４−０ｎの吸光文をモニターし
ながら、１０分間続けた。Ａ−Ｇは、Ｏｗ／ｍＲ（Ａ）
＝ ０．２ｍｇ７ｍ１ （Ｂ）、０、 ５ｍｙ：／ｍｌ
（Ｃ） ＋ ｏ、 Ｆ３ｗ／ｍｌ （Ｄ）
、］、。
ＥリポソームからのＧ６ＰＤＨの遊離を示すグラフであ
る。リポソーム（５０マイクロモル） 、Ｇ６ Ｐ （
７ｍＭ）およびＮＡＤ” （２ｍＭ）を３７℃でＢ−
ｇａｌの存在下に（０−１，２ｑ／ｍＱ）インキュベー
トし、そして反応を３３４−０ｎの吸光文をモニターし
ながら、１０分間続けた。Ａ−Ｇは、Ｏｗ／ｍＲ（Ａ）
＝ ０．２ｍｇ７ｍ１ （Ｂ）、０、 ５ｍｙ：／ｍｌ
（Ｃ） ＋ ｏ、 Ｆ３ｗ／ｍｌ （Ｄ）
、］、。
（１＋ｇ／ｍｌ’（Ｅ）または１ 、 ２ ｕ／ｍｌｌ
（Ｆ ）のベーターガラクトシダーゼの存在下、また
は０．１５％トリトン Ｘ−１００（Ｇ）の存在下にお
けるリポソームを示す。
（Ｆ ）のベーターガラクトシダーゼの存在下、また
は０．１５％トリトン Ｘ−１００（Ｇ）の存在下にお
けるリポソームを示す。
第３（Ｂ）図は、Ｇ６ＰＤＨに触媒された反応の速度を
Ｂ−ｇａｌ酵素濃度の関数として示すグラフである。
Ｂ−ｇａｌ酵素濃度の関数として示すグラフである。
第４図は、リポソームにより増強された、種々のジゴキ
シン濃度でのＣＥＤ ＩＡアッセイを説明するグラフで
ある。Ｇ６ＰＤの活性は３４０ｎｍの吸光度を追跡して
調べた。各プロットは、（Ａ）ＰＢＳ中のリポソーム：
（Ｂ）ジゴキシンＯｎｇ／ｍ１．の存在下でのリポソ
ーム： （Ｃ）ジゴキシン０゜０１ｎｇ／ｍｌの存在下
でのリポソーム； （Ｄ）ジゴキシン０．０２ｎｇ／ｍ
ｌの存在下でのリポソーム：″（Ｅ）ジゴキシン０ 、
０４ ｎｇ／ｍＲの存在下でのリポソーム： （Ｆ）
ジゴキシン０ 、 ０６ ｎｇ／ｍｌ！の存在下でのリ
ポソーム；を説明する。測定は４連で行った。
シン濃度でのＣＥＤ ＩＡアッセイを説明するグラフで
ある。Ｇ６ＰＤの活性は３４０ｎｍの吸光度を追跡して
調べた。各プロットは、（Ａ）ＰＢＳ中のリポソーム：
（Ｂ）ジゴキシンＯｎｇ／ｍ１．の存在下でのリポソ
ーム： （Ｃ）ジゴキシン０゜０１ｎｇ／ｍｌの存在下
でのリポソーム； （Ｄ）ジゴキシン０．０２ｎｇ／ｍ
ｌの存在下でのリポソーム：″（Ｅ）ジゴキシン０ 、
０４ ｎｇ／ｍＲの存在下でのリポソーム： （Ｆ）
ジゴキシン０ 、 ０６ ｎｇ／ｍｌ！の存在下でのリ
ポソーム；を説明する。測定は４連で行った。
第５（Ａ）図は、基質として０−ニトロフェニル−Ｄ−
ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用いた標準的ＣＥＤ
Ｉ Ａジゴキシンアッセイのグラフである。このアッ
セイは、製造販売者の推奨の方法で行った。測定は４連
で行った。
ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用いた標準的ＣＥＤ
Ｉ Ａジゴキシンアッセイのグラフである。このアッ
セイは、製造販売者の推奨の方法で行った。測定は４連
で行った。
第５（Ｂ）図は、リポソーム−増強ＣＥＤ Ｉ Ａアッ
セイにおける０６ＰＤＨ触媒反応の増加率を、血清中の
ジゴキシン濃度の関数として表示するグラフである。測
定は４回ずつ行った。このデータは第４図からのもので
ある。
セイにおける０６ＰＤＨ触媒反応の増加率を、血清中の
ジゴキシン濃度の関数として表示するグラフである。測
定は４回ずつ行った。このデータは第４図からのもので
ある。
ホスファチジルエタノールアミンのようなＨＩＩ−相形
酸リピッドから形成されたリポソームが、膜リピッドも
しくは蛋白質で安定化できるという事実、およびその安
定化剤の分解がリポソームの迅速な溶解をもたらすとい
う事実を利用して、本発明者らは、最終判読工程で酵素
を利用するアッセイのためのリポソーム利用信号増強法
を開発した。
酸リピッドから形成されたリポソームが、膜リピッドも
しくは蛋白質で安定化できるという事実、およびその安
定化剤の分解がリポソームの迅速な溶解をもたらすとい
う事実を利用して、本発明者らは、最終判読工程で酵素
を利用するアッセイのためのリポソーム利用信号増強法
を開発した。
説明のための態様において、安定なリポソームは、５モ
ルパーセントのガングリオシド ＧＭｌで安定化された
不飽和ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ Ｅ）を用
いてｔＭ製した。この単一ラメラリポソームの中にグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）（）
を高濃度で捕捉した。
ルパーセントのガングリオシド ＧＭｌで安定化された
不飽和ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ Ｅ）を用
いてｔＭ製した。この単一ラメラリポソームの中にグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）（）
を高濃度で捕捉した。
ベーターガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇａりの添加は、この
リポソームの迅速な（３−５分間）溶解を生じ、ＧＭｌ
での酵素的膜ガラクトシル化によりＧ６ＦＤＨの潜在能
力を顕在化した。
リポソームの迅速な（３−５分間）溶解を生じ、ＧＭｌ
での酵素的膜ガラクトシル化によりＧ６ＦＤＨの潜在能
力を顕在化した。
Ｂ−ｇａｌの各分子が多数のリポソームを分解すること
ができ、又、多量のリポータ−酵素（０６ＰＤＨ）が各
リポソームから遊離されることができるので、信号増幅
の強度は大である。
ができ、又、多量のリポータ−酵素（０６ＰＤＨ）が各
リポソームから遊離されることができるので、信号増幅
の強度は大である。
本発明者らはミクロジェニック（Ｍｉｃｒｏｇｅｎｉｃ
）社のジゴキシン用ＣＥＤＩＡアッセイを本発明の詳細
な説明のための例として用いた。
）社のジゴキシン用ＣＥＤＩＡアッセイを本発明の詳細
な説明のための例として用いた。
比較のため述べると、標準的ＣＥＤ ＩＡアッセイのア
ッセイ信号の強度は、２５ｍＡ／分／ ｎ ｇジゴキシ
ン／ｍ＋であり、一方、増幅（即ち、リポソーム強化）
アッセイでの信号強度は、１０００ｍＡＺ分／ ｎ ｇ
ジゴキシン濃度ｌ、即ち４０倍の増幅である。
ッセイ信号の強度は、２５ｍＡ／分／ ｎ ｇジゴキシ
ン／ｍ＋であり、一方、増幅（即ち、リポソーム強化）
アッセイでの信号強度は、１０００ｍＡＺ分／ ｎ ｇ
ジゴキシン濃度ｌ、即ち４０倍の増幅である。
信号強化に使用したリポソームはアッセイ期間を通して
、１０％ヒト血清の存在化で安定であった。この簡便、
迅速そして均一な信号増強法は、多くの酵素依存アッセ
イ、例えばＥＬＩＳＡ、、ＣＥＤＴＡＣ，遺伝子−プロ
ープアＶセイおよびイムノリポソームアッセイその他に
おいて有用である。
、１０％ヒト血清の存在化で安定であった。この簡便、
迅速そして均一な信号増強法は、多くの酵素依存アッセ
イ、例えばＥＬＩＳＡ、、ＣＥＤＴＡＣ，遺伝子−プロ
ープアＶセイおよびイムノリポソームアッセイその他に
おいて有用である。
ＣＥＤ ＴＡアッセイにおいては、酵素即ちＢ−ガラク
トシダーゼは、酵素活性の無い二つの成分Ｅ４およびＥ
、に分離されており、これらの成分は、自発的に再構成
されて活性酵素を生じる。−方の成分Ｅ６は、分析物に
共有結合し、その結合は抗体結合Ｅ４がもはや酵素の再
構成に使用され得ないようにする。試験試料中に遊離の
分析物が存在すると、Ｅ４は抗体に結合せず、活性酵素
分子が再構成される。
トシダーゼは、酵素活性の無い二つの成分Ｅ４およびＥ
、に分離されており、これらの成分は、自発的に再構成
されて活性酵素を生じる。−方の成分Ｅ６は、分析物に
共有結合し、その結合は抗体結合Ｅ４がもはや酵素の再
構成に使用され得ないようにする。試験試料中に遊離の
分析物が存在すると、Ｅ４は抗体に結合せず、活性酵素
分子が再構成される。
本発明の説明的態様によれば、分析物−抗体の反応が活
性酵素の形成をコントロールし、一方、この活性酵素が
、ＰＥ−リポソーム−にの安定化剤ＧＭ、の運命を決定
する。ＰＥリポソームの表面二重層の上のＧ Ｍ ＋
の脱ガラクトシル化は、リポソームの脱安定化をもたら
し、リポータ−酵素分子を遊離し、その結果、信号の増
幅がもたらされる（第１図参照）。
性酵素の形成をコントロールし、一方、この活性酵素が
、ＰＥ−リポソーム−にの安定化剤ＧＭ、の運命を決定
する。ＰＥリポソームの表面二重層の上のＧ Ｍ ＋
の脱ガラクトシル化は、リポソームの脱安定化をもたら
し、リポータ−酵素分子を遊離し、その結果、信号の増
幅がもたらされる（第１図参照）。
本発明のリポソームは、Ｒ，Ｊ、Ｈａの学位論文（１９
Ｂ？）、テネシー大学（Ｕｎｉｖ、ｏｆＴｅｎｎ、、Ｋ
ｎｏｘｖｉ Ｉ Ｉｅ）に記載されている、迅速押しだ
し法（ｆａｓｔ ｅｘｔｒｕｓ ｉ ｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ）でｍ製された。リポソームの組成は、ジオレイ
ルホスファチジルエタノールアミン：トランスホスホリ
ル化ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ：ＴＰ
Ｅ）＜２：Ｉ Ｍ／Ｍ＞および５モル％のＣＭ、が好
ましい。
Ｂ？）、テネシー大学（Ｕｎｉｖ、ｏｆＴｅｎｎ、、Ｋ
ｎｏｘｖｉ Ｉ Ｉｅ）に記載されている、迅速押しだ
し法（ｆａｓｔ ｅｘｔｒｕｓ ｉ ｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ）でｍ製された。リポソームの組成は、ジオレイ
ルホスファチジルエタノールアミン：トランスホスホリ
ル化ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ：ＴＰ
Ｅ）＜２：Ｉ Ｍ／Ｍ＞および５モル％のＣＭ、が好
ましい。
リポソームの！ＩＮ製の後、捕捉されなかったＧ６ＰＤ
Ｈをセファロース４Ｂカラムクロマトグラフイーで除去
した。微量のトリチウム化ヘキサデシルコレスタニルエ
ーテル（（”Ｈ）−ＣＥ）で標識したリポソームは、ボ
イド量中に溶出された。
Ｈをセファロース４Ｂカラムクロマトグラフイーで除去
した。微量のトリチウム化ヘキサデシルコレスタニルエ
ーテル（（”Ｈ）−ＣＥ）で標識したリポソームは、ボ
イド量中に溶出された。
この精製工程の後でさえも、通常、遊離の（非−潜在）
酵素活性がある程度検出され（全活性の８−１２％）、
これは、酵素が二重膜の外表面に弱く結合しているため
と考えられた。
酵素活性がある程度検出され（全活性の８−１２％）、
これは、酵素が二重膜の外表面に弱く結合しているため
と考えられた。
０６ＰＤｌ（酵素活性は、３４０ｎｍの吸光度を連続的
に追跡して測定した。第２図に示すとおり、正常なリポ
ソーム調製物中に全酵素活性の約１０％が存在した。し
かしながら、０６ Ｐ Ｄ Ｈの大部分は潜在しており
、膜を０．１５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１０’
Ｏで破壊すると、放出させることが出来た。
に追跡して測定した。第２図に示すとおり、正常なリポ
ソーム調製物中に全酵素活性の約１０％が存在した。し
かしながら、０６ Ｐ Ｄ Ｈの大部分は潜在しており
、膜を０．１５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１０’
Ｏで破壊すると、放出させることが出来た。
Ｂ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇａｌ）で予め処理したリ
ポソームは、トリトンで予め処理したリポソームに比べ
て約８０％のカプセル内０６ＰＤＨ−ｔ−遊離した。こ
れらのデータは、リポソームのＧＭ、にたいするＢ−ガ
ラクトシダーゼの酵素作用が、それまで安定だったリポ
ソームからその内容物を放出させるＭ１７Ｊとなったこ
とを示す。
ポソームは、トリトンで予め処理したリポソームに比べ
て約８０％のカプセル内０６ＰＤＨ−ｔ−遊離した。こ
れらのデータは、リポソームのＧＭ、にたいするＢ−ガ
ラクトシダーゼの酵素作用が、それまで安定だったリポ
ソームからその内容物を放出させるＭ１７Ｊとなったこ
とを示す。
しかしながら、ＧＭ、−ＰＥリポソームのＢ−ｇａｌ処
理は、最大でカプセル内の酵素の約８５％を遊離し、１
００％のａｍには達しなかった。
理は、最大でカプセル内の酵素の約８５％を遊離し、１
００％のａｍには達しなかった。
脱ガラクトシル化ＧＭＩ （ＣＭ２）が、依然として
ＰＥの二重層を多少番よ安定化できるためとも考えられ
る。
ＰＥの二重層を多少番よ安定化できるためとも考えられ
る。
この結果は、グリコホリン−ＰＥリポソームのトリプシ
ン処理が、約７０％のカプセル内マーカーしか遊離しな
かったという以前の観察に一致する（Ｈｕら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
ン処理が、約７０％のカプセル内マーカーしか遊離しな
かったという以前の観察に一致する（Ｈｕら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１４１，９７３−９７８（１
９８６））。
９８６））。
卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）の中の５モル％のＧＭ
、からなる対照リポソームはＢ−ｇａｌでの処理後も安
定であった。これはＰＥと異なり、ＰＣ二重層がＧＭｌ
の酵素的分解の後でも安定なためである。
、からなる対照リポソームはＢ−ｇａｌでの処理後も安
定であった。これはＰＥと異なり、ＰＣ二重層がＧＭｌ
の酵素的分解の後でも安定なためである。
第３（Ａ）図および３（Ｂ）図において、ＧＭｌ−ＰＥ
リポソームのＢ−ｇａｌ濃度に依存する溶解が３７′ｃ
で１０分間まで検討されている。この実験は、リポソー
ム、Ｇ６ＰＤＨ基質、および同時に添加された（即ち、
第２図の実験でのようにリポソームの予備加温なしに）
Ｂ−ｇａｌで行った。
リポソームのＢ−ｇａｌ濃度に依存する溶解が３７′ｃ
で１０分間まで検討されている。この実験は、リポソー
ム、Ｇ６ＰＤＨ基質、および同時に添加された（即ち、
第２図の実験でのようにリポソームの予備加温なしに）
Ｂ−ｇａｌで行った。
第３（Ａ）図に示されているように、低酵素濃度では、
最初のラグタイムがあり、その後３４０ｎｍの吸光度が
急速に増加した。このラグ期間は、溶液中のＢ−ｇａｌ
の濃度増加により短縮できた。
最初のラグタイムがあり、その後３４０ｎｍの吸光度が
急速に増加した。このラグ期間は、溶液中のＢ−ｇａｌ
の濃度増加により短縮できた。
リポソームの脱安定化を引き起こすには、実質的量のＧ
Ｍｌを開裂することが必要であろう。酵素濃度には限度
があるから、リポソーム上の充分な数の０Ｍ１分子を開
裂させてリポソームを不安定にするためには、ある程度
の時間を必要とすると思われ、このためラグタイムが生
じる。他方、安定な酵素反応速度は、Ｂ−ｇａｌの濃度
が高いほど増大する。
Ｍｌを開裂することが必要であろう。酵素濃度には限度
があるから、リポソーム上の充分な数の０Ｍ１分子を開
裂させてリポソームを不安定にするためには、ある程度
の時間を必要とすると思われ、このためラグタイムが生
じる。他方、安定な酵素反応速度は、Ｂ−ｇａｌの濃度
が高いほど増大する。
第３（Ｂ）図は、リポソームからのＧ６ＰＤ）（の放出
速度は、Ｂ−ｇａｌ濃度の増加とともに直線的に増大す
ることを示す。カーブの直線部分の勾配は８４ｍＡ／分
／ｗＢ−ｇａｌ／−である。
速度は、Ｂ−ｇａｌ濃度の増加とともに直線的に増大す
ることを示す。カーブの直線部分の勾配は８４ｍＡ／分
／ｗＢ−ｇａｌ／−である。
ＧＭ、−ＰＥリポソームの安定性を、種々濃度のヒト血
清の存在下で検討した（第工表）。
清の存在下で検討した（第工表）。
物中の％潜在Ｇ６ＰＤＨ活性を、リポソームの安で使用
した。
した。
リポソームは純粋な血清中では安定では無かったが、５
０％までの血清溶液中では相当に安定であった。２ＩＩ
ＩＭまたはそれより多いＥＧＴＡの存在が血清中でのリ
ポソームの安定性を非常に高めることが認められ、この
ことは、Ｃａ＋′＋のような２価のカチオンの除去によ
り、リポソームの安定性が増強されることを示唆した。
０％までの血清溶液中では相当に安定であった。２ＩＩ
ＩＭまたはそれより多いＥＧＴＡの存在が血清中でのリ
ポソームの安定性を非常に高めることが認められ、この
ことは、Ｃａ＋′＋のような２価のカチオンの除去によ
り、リポソームの安定性が増強されることを示唆した。
以前に、ＰＥでできたリポソームはＰＣでできたリポソ
ームよりも血清中でより安定であることが認められてい
る。血清中でのリポソームの安定性は、コレステロール
の添加により（Ｋｉｒｂｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、
１８６．５９１−５９８ （１９８０）およびＤａｍｅ
ｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、
６６５゜５３８−５４５ （１９８１））および／また
はガングリオシドの添加により（ＡＩｌｅｎら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、、
８１８．２０５−２１０ （１９８５））、非常に向上
させることができる。明らかに、これらのリポソームを
血清中で比較的安定にするものは、ＰＥ中の５モル％Ｇ
Ｍ、の存在である。
ームよりも血清中でより安定であることが認められてい
る。血清中でのリポソームの安定性は、コレステロール
の添加により（Ｋｉｒｂｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、
１８６．５９１−５９８ （１９８０）およびＤａｍｅ
ｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、
６６５゜５３８−５４５ （１９８１））および／また
はガングリオシドの添加により（ＡＩｌｅｎら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、、
８１８．２０５−２１０ （１９８５））、非常に向上
させることができる。明らかに、これらのリポソームを
血清中で比較的安定にするものは、ＰＥ中の５モル％Ｇ
Ｍ、の存在である。
均一酵素再構成イムノアッセイの感度向上のための、Ｇ
６ＰＤＨを含む０Ｍ１安定化ＰＥリポソームの使用につ
いて、以下に説明する。
６ＰＤＨを含む０Ｍ１安定化ＰＥリポソームの使用につ
いて、以下に説明する。
ＣＥＤ Ｉ Ａジゴキシンアッセイをモデルアッセイと
して選んだ、その理由は、このアッセイがＢ−ガラクト
シダーゼ酵素（Ｂ−ｇａ＋）の分析物に依存する再構成
を、結果の判読に使用しているからである。形成される
活性Ｂ−ｇａ＋の量は、従って患者の血清中に存在する
ジゴキシンの量に比例する。
して選んだ、その理由は、このアッセイがＢ−ガラクト
シダーゼ酵素（Ｂ−ｇａ＋）の分析物に依存する再構成
を、結果の判読に使用しているからである。形成される
活性Ｂ−ｇａ＋の量は、従って患者の血清中に存在する
ジゴキシンの量に比例する。
先ず始め、種々のリポソームの濃度を聞いて検討し、次
の実験に用いるべきリポソームの飽和濃度を決定した。
の実験に用いるべきリポソームの飽和濃度を決定した。
リポソーム濃度の増加は、４０マイクロモルのリピッド
まで０６ＰＤＨの活性の増加をもたらした。その後、５
０マイクロモルのリポソームを引き続くアッセイで用い
た。
まで０６ＰＤＨの活性の増加をもたらした。その後、５
０マイクロモルのリポソームを引き続くアッセイで用い
た。
第４図に示すとおり、ジゴキシン濃度に依存したリポソ
ーム溶解の増加が認められ、これは３４０ｎ１１の吸光
度の増加として現れた。
ーム溶解の増加が認められ、これは３４０ｎ１１の吸光
度の増加として現れた。
前記のとおり、最大の酵素反応速度が確立される前に２
〜３分間のラグ期間が存在した。酵素反応速度は少なく
とも８ないし１０分間は安定であり、異なるバッチのリ
ポソーム調製物を用いて行ったとき、３４［１ｎｍの吸
光度読み取り値として０゜３５−０．９０を与えた。ア
ッセイ内およびアッセイ間の精度は８％Ｚ内であった。
〜３分間のラグ期間が存在した。酵素反応速度は少なく
とも８ないし１０分間は安定であり、異なるバッチのリ
ポソーム調製物を用いて行ったとき、３４［１ｎｍの吸
光度読み取り値として０゜３５−０．９０を与えた。ア
ッセイ内およびアッセイ間の精度は８％Ｚ内であった。
リポソーム−増強ＣＥＤ Ｉ Ａアッセイの結果を未増
強の原アッセイの結果と比較した（第５（Ａ）図および
第５（Ｂ）図参照）。原アッセイは製造販売者の指示ど
おりに実施した。これらの図から明らかなように、ジゴ
キシンの＠ＣＦ、ＤＴＡアッセイは、Ｏ−０，４ｎｇ／
ｍｆのジゴキシン濃度範囲で直線的反応を与え、これは
製造者の説明書に一致した。
強の原アッセイの結果と比較した（第５（Ａ）図および
第５（Ｂ）図参照）。原アッセイは製造販売者の指示ど
おりに実施した。これらの図から明らかなように、ジゴ
キシンの＠ＣＦ、ＤＴＡアッセイは、Ｏ−０，４ｎｇ／
ｍｆのジゴキシン濃度範囲で直線的反応を与え、これは
製造者の説明書に一致した。
アッセイの感度（スタンダードカーブの傾斜）は、２５
ｍＡ／分／ｎｇ ジゴキシン／ ｒｒｄｌであった（
第５（Ａ）図参照）。同様に、リポソーム増強アッセイ
も０ 、 ０４ ｎｇ／ｍｌまで直線的反応を与え、０
．０６ｎｇ／ｍＲで飽和が生じた。増強アッセイの感度
（カーブの傾斜）は、１．ＯＯＯｍＡ／分／ｎｇ ジ
ゴキシン／ ｍｌであった（第５（Ｂ）図参照）。従っ
て、信号強度に４０倍の増強が認められた。統計的に０
濃度のジゴキシンと有意な差（ｐ＜ ０． ０５スチユ
ーデントのｔ−検定）を与えるジゴキシンの最低濃度は
、それぞれ、原アッセイでは０．４ｎｇ／ｍｌ （０，
５２ピコモル／ｍり、そしてリポソーム増強アッセイで
は６．Ｑ２ｎｇ／ｍｌＯ，０２６ピコモル／ ｍｌ ）
であった。
ｍＡ／分／ｎｇ ジゴキシン／ ｒｒｄｌであった（
第５（Ａ）図参照）。同様に、リポソーム増強アッセイ
も０ 、 ０４ ｎｇ／ｍｌまで直線的反応を与え、０
．０６ｎｇ／ｍＲで飽和が生じた。増強アッセイの感度
（カーブの傾斜）は、１．ＯＯＯｍＡ／分／ｎｇ ジ
ゴキシン／ ｍｌであった（第５（Ｂ）図参照）。従っ
て、信号強度に４０倍の増強が認められた。統計的に０
濃度のジゴキシンと有意な差（ｐ＜ ０． ０５スチユ
ーデントのｔ−検定）を与えるジゴキシンの最低濃度は
、それぞれ、原アッセイでは０．４ｎｇ／ｍｌ （０，
５２ピコモル／ｍり、そしてリポソーム増強アッセイで
は６．Ｑ２ｎｇ／ｍｌＯ，０２６ピコモル／ ｍｌ ）
であった。
血清中の０．０９ないし２．Ｏｎｇ／ｍｌのジゴキシン
濃度は、通常治療を要すると考えられている（Ｂｅｌｌ
ｅｒら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、２ｇ４，
９２９−９９７ （１９７］）およびＬｉｎｄｅｎｂａ
ｕｍら、Ｌａｎｃｅｔ、１゜１２１５−１２１７ （１
９７３））。一般に、毒性の症状は、２ｎｇ／ｍｆ以上
の濃度でようやく出現する（Ｂｅｌｌｅｒら、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌ、Ｊ。
濃度は、通常治療を要すると考えられている（Ｂｅｌｌ
ｅｒら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、２ｇ４，
９２９−９９７ （１９７］）およびＬｉｎｄｅｎｂａ
ｕｍら、Ｌａｎｃｅｔ、１゜１２１５−１２１７ （１
９７３））。一般に、毒性の症状は、２ｎｇ／ｍｆ以上
の濃度でようやく出現する（Ｂｅｌｌｅｒら、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌ、Ｊ。
Ｍａｄ、、 ２８４． ９２９ ９９７ （１９
７１＞およびＢｕｔｌｅｒら、Ａｍ、Ｊ、）。
７１＞およびＢｕｔｌｅｒら、Ａｍ、Ｊ、）。
ジゴキシンのＣＥＤ Ｉ Ａアッセイの感度を増加させ
る必要はないとはいえ、本発明のリポソームを利用した
増強法は、本発明に記載したのと同じ原理の多くの免疫
化学的アッセイの感度の向上に有用である。例えば、Ａ
ｍ５ｈｅｙの［酵素イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）Ｊ、Ａｎｎ、Ｒｐｔｓ、Ｍｅ
ｄ、Ｃｈｅｍ。
る必要はないとはいえ、本発明のリポソームを利用した
増強法は、本発明に記載したのと同じ原理の多くの免疫
化学的アッセイの感度の向上に有用である。例えば、Ａ
ｍ５ｈｅｙの［酵素イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）Ｊ、Ａｎｎ、Ｒｐｔｓ、Ｍｅ
ｄ、Ｃｈｅｍ。
、１８．２８５−２９２ （１９８３）を参照。
例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のアッセイは、
０．０２ピコモル／ ｍＲの低濃度を検出する感度を必
要とする（Ｒ，Ｊ、Ｋｉ ｔ ｓｋｙ。
０．０２ピコモル／ ｍＲの低濃度を検出する感度を必
要とする（Ｒ，Ｊ、Ｋｉ ｔ ｓｋｙ。
Ｃビタミン、ミネラルおよびホルモンのハンドブック（
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｉ ｔａｍｉｎｓ、
Ｍｉｎｅｒａｌｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
）」、第２版、Ｖ Ｎ ＲＣｏ ｍ ｐ ａ ｎ ３’
、ニューヨーク（１９８１）およびＲｏｓｅｎｆｉｅ
ｌｄら、ＣＩ ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３２．２３２−２
３３ （１９８６））。このアッセイで要求される水準
の高感度の達成のために、リポソームを利用した本発明
の信号増幅方法は、非常に通ずる。
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｉ ｔａｍｉｎｓ、
Ｍｉｎｅｒａｌｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ
）」、第２版、Ｖ Ｎ ＲＣｏ ｍ ｐ ａ ｎ ３’
、ニューヨーク（１９８１）およびＲｏｓｅｎｆｉｅ
ｌｄら、ＣＩ ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３２．２３２−２
３３ （１９８６））。このアッセイで要求される水準
の高感度の達成のために、リポソームを利用した本発明
の信号増幅方法は、非常に通ずる。
さらに、増強工程は均一であり、洗浄または分離工程が
一切不要である。基質およびリポソームは一緒に添加で
き、全加温時間の増加はほんの僅かにすぎない。
一切不要である。基質およびリポソームは一緒に添加で
き、全加温時間の増加はほんの僅かにすぎない。
最後に、この増幅方法は、ＥＬ Ｉ ＳＡ、イムノリポ
ソームアッセイおよび遺伝子−プローブアッセイ、その
他のような最終判読工程に酵素が関与する他の多くの非
−アイソトープ使用アッセイの感度増加に有用である。
ソームアッセイおよび遺伝子−プローブアッセイ、その
他のような最終判読工程に酵素が関与する他の多くの非
−アイソトープ使用アッセイの感度増加に有用である。
実施例
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、
これらの実施例は説明のためのものであって、本発明を
限定するものと解釈すべきものではない。実施例中、特
に記載のないときはパーセントは重量％である。温度は
全て摂氏で示す。
これらの実施例は説明のためのものであって、本発明を
限定するものと解釈すべきものではない。実施例中、特
に記載のないときはパーセントは重量％である。温度は
全て摂氏で示す。
材料
ＴＰＥ （卵ホスファチジルコリン（Ｐ Ｃ）からトラ
ンスホスフ１チジル化したホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＲ））、ジオレオイルＰＥ（ＤＯＰＥ） 、お
よび卵ＰＥは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ
ｓ社（バーミンガム、アレキサンドリア）から購入した
。ガングリオシド（ＧＭ 、 ）は、３ｕｐｅｌｃｏ社
（ヒユーストン。
ンスホスフ１チジル化したホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＲ））、ジオレオイルＰＥ（ＤＯＰＥ） 、お
よび卵ＰＥは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ
ｓ社（バーミンガム、アレキサンドリア）から購入した
。ガングリオシド（ＧＭ 、 ）は、３ｕｐｅｌｃｏ社
（ヒユーストン。
テキサス）またはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（サンディエ
ゴ、カリホルニア）から入手した。ＧＭ。
ゴ、カリホルニア）から入手した。ＧＭ。
の純度は、ＴＬＣによりクロロホルム／メタノール／２
．５Ｎ水酸化アンモニウム（６０：４０＝９）を襞間系
として用いて確認した（Ｓｋ ＋ ｐ ｓｋｉ、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ。
．５Ｎ水酸化アンモニウム（６０：４０＝９）を襞間系
として用いて確認した（Ｓｋ ＋ ｐ ｓｋｉ、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ。
ｇｙ、３５．３９６−４２５ （１９７５）およびＫｕ
ｎｄｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、７２，１９８−２０４ （１９８１））。トリチ
ウム〔３Ｈ〕標識ヘキサデシルコレスタニルエーテルは
、Ｐｏｏｌら、Ｌｉｐｉｄｓ。
ｎｄｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、７２，１９８−２０４ （１９８１））。トリチ
ウム〔３Ｈ〕標識ヘキサデシルコレスタニルエーテルは
、Ｐｏｏｌら、Ｌｉｐｉｄｓ。
１７．４４８−／１５２ （１９８２）に記載されてい
るようにして合成及び精製した。
るようにして合成及び精製した。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ
）、グルコ−ｙ、−６−！ＪンｒＲ（Ｇ６Ｐ）およびニ
コチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（インデイアナポ
リス、インディア）から購入した。Ｂ−ガラクトシダー
ゼおよびその基質の０−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａ１社（セントルイス、ミズーリ）から人手した。ＣＥ
ＤＩＡジゴキシンアッセイキットは、マイクロジヱニッ
ク社（コンコルド、カリホルニア）から人手した。他の
成分は全て分析規格のものを用いた。
）、グルコ−ｙ、−６−！ＪンｒＲ（Ｇ６Ｐ）およびニ
コチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（インデイアナポ
リス、インディア）から購入した。Ｂ−ガラクトシダー
ゼおよびその基質の０−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａ１社（セントルイス、ミズーリ）から人手した。ＣＥ
ＤＩＡジゴキシンアッセイキットは、マイクロジヱニッ
ク社（コンコルド、カリホルニア）から人手した。他の
成分は全て分析規格のものを用いた。
実施例１ リポソームの調製
リポソームは、Ｒ，Ｊ、Ｈｏの学位論文（１９８７）テ
ネシー大学５ノックスビル（Ｋｎｏｘｖｉ Ｉ Ｉ ｅ
）の迅速押出法で１１製した。５モル％のＧＭ、を含む
ＤＯＰＥ ： ＴＰＥ （２： Ｉ Ｍ／Ｍ〉のリポ
ソーム組成を用いた。ルーチンには、３モルＤＯＰＥお
よび１．５セルＴＰＥおよび微量の（３Ｈ） ＣＢ
（Ｉ Ｘ １０９ｃ ｐｍ／１Ｉｏｌ リピッド）と
混合した０、２３モルＧＭ、をＮ２気流下で乾燥し、さ
らに１時間以上減圧下で乾燥した。
ネシー大学５ノックスビル（Ｋｎｏｘｖｉ Ｉ Ｉ ｅ
）の迅速押出法で１１製した。５モル％のＧＭ、を含む
ＤＯＰＥ ： ＴＰＥ （２： Ｉ Ｍ／Ｍ〉のリポ
ソーム組成を用いた。ルーチンには、３モルＤＯＰＥお
よび１．５セルＴＰＥおよび微量の（３Ｈ） ＣＢ
（Ｉ Ｘ １０９ｃ ｐｍ／１Ｉｏｌ リピッド）と
混合した０、２３モルＧＭ、をＮ２気流下で乾燥し、さ
らに１時間以上減圧下で乾燥した。
次いで、リピッド混合物を１１０ｆｆ１のＧ６Ｐ （１
５） （Ｃａｎｏｖａ−Ｄａｖｒｓら、Ｃｌ１ｎ。
５） （Ｃａｎｏｖａ−Ｄａｖｒｓら、Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｅｍ、、３２．１６８７ １６９１ （１９８６）
）：］ｄのＥＧＴＡおよび０．０２％ＮａＮ３を含むＰ
ＢＳ （全量５００．１． ｐｉ（７，６）中の酵素（
Ｇ６ ＰＤＨ）２０００単位で水和させた。
）：］ｄのＥＧＴＡおよび０．０２％ＮａＮ３を含むＰ
ＢＳ （全量５００．１． ｐｉ（７，６）中の酵素（
Ｇ６ ＰＤＨ）２０００単位で水和させた。
この混合物を室温で時々攪拌しながら２〜３時間放置し
た。このリピッド混合物を、次に渦を式に攪拌し、室温
でさらに１時間放置した。
た。このリピッド混合物を、次に渦を式に攪拌し、室温
でさらに１時間放置した。
続いて、この懸濁液を０．５ｍＲＢ−Ｄインシュリン注
射筒を用いて、２８ゲージの注射針から迅速に且つ強制
的に２０回押し出した。この押し出し工程を４−１２時
間の静止期間をおいてさらに２回繰り返した。
射筒を用いて、２８ゲージの注射針から迅速に且つ強制
的に２０回押し出した。この押し出し工程を４−１２時
間の静止期間をおいてさらに２回繰り返した。
ネガティブ染色電子！ＩＩＩｗＩ鏡によれば、得られた
リポソームは主に平均直径１５００人の単一ラメラ構造
であった。
リポソームは主に平均直径１５００人の単一ラメラ構造
であった。
捕捉されなかった酵素はセファロース４Ｂカラムのクロ
マトグラフィーで、流速０．４ｍ１７分で除去した。各
フラクシヲンを３ Ｈ〜ｃｐｍで測定し、トリトンＸ−
１００の存在下または不在下でＧ６ＰＤＨ活性を測定し
た。ピーク部分をプールし、５００マイクロモルのリピ
ッド濃度７４℃に貯蔵した。このリポソームは生理食塩
水中で４℃で少なくとも３週間安定であった。約５％の
Ｇ６Ｐ Ｄ Ｈがリポソームの中に捕捉された。
マトグラフィーで、流速０．４ｍ１７分で除去した。各
フラクシヲンを３ Ｈ〜ｃｐｍで測定し、トリトンＸ−
１００の存在下または不在下でＧ６ＰＤＨ活性を測定し
た。ピーク部分をプールし、５００マイクロモルのリピ
ッド濃度７４℃に貯蔵した。このリポソームは生理食塩
水中で４℃で少なくとも３週間安定であった。約５％の
Ｇ６Ｐ Ｄ Ｈがリポソームの中に捕捉された。
ストックリポソーム（以下、ＧＭ、−ＰＥリポソームと
よぶ）は、各アッセイの直前に適当なリピッド濃度に希
釈した。
よぶ）は、各アッセイの直前に適当なリピッド濃度に希
釈した。
実施例２ Ｇ６ＰＤＨのアッセイ
酵素活性の測定は、７ＩＩＩＭのＧ６Ｐおよび２ｍＭの
ＮａＤ＋を含むバッフｙ −（３ｍＭ Ｍｇ＋′＋）
、 ｐ１７．６またはＰＢＳ、ｐＨ７，６を室温また
は３７℃で加温して行った（Ｃａｎｏｖａ−Ｄａｖｉｓ
ら、ＣＩ ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３２．１６８７ １６９
１ （１９８６））。
ＮａＤ＋を含むバッフｙ −（３ｍＭ Ｍｇ＋′＋）
、 ｐ１７．６またはＰＢＳ、ｐＨ７，６を室温また
は３７℃で加温して行った（Ｃａｎｏｖａ−Ｄａｖｉｓ
ら、ＣＩ ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３２．１６８７ １６９
１ （１９８６））。
リポソーム調製物中の全酵素活性は、リボソームを０，
１５％トリトンＸ−１００で破壊した後アッセイした。
１５％トリトンＸ−１００で破壊した後アッセイした。
反応は、ウォータージャケット付きの測定セル保持装置
を有するパーキンエルマーのモデル３Ａ分光光度計を用
いて、３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、追跡
した。
を有するパーキンエルマーのモデル３Ａ分光光度計を用
いて、３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、追跡
した。
捕捉されたＧ６ＰＤ）Ｔを有するリポソーム（８０−１
００マイクロモル・リピッド）を、基質であるＧ６Ｐお
よびＮＡＤ＋を加える前にＢ−ｇａｌ （２■／ｍりま
たは０．１５％トリトンとともに、３７℃で１０分間予
備加温した。セル保持装置の温度は、循環式温浴で変動
が±０．３℃以下となるようにＷＭした。Ｇ６ＰＤＨの
遊離は、３４０ｎｍの吸光度の変化によって監視した。
００マイクロモル・リピッド）を、基質であるＧ６Ｐお
よびＮＡＤ＋を加える前にＢ−ｇａｌ （２■／ｍりま
たは０．１５％トリトンとともに、３７℃で１０分間予
備加温した。セル保持装置の温度は、循環式温浴で変動
が±０．３℃以下となるようにＷＭした。Ｇ６ＰＤＨの
遊離は、３４０ｎｍの吸光度の変化によって監視した。
ＣＥＤ Ｉ Ａジゴキシンアッセイキットは、販売者の
指示に従って用いたが、但し、３７℃での反応を４２０
ｎｒｍの吸光度で連続的に追跡した。
指示に従って用いたが、但し、３７℃での反応を４２０
ｎｒｍの吸光度で連続的に追跡した。
実施例５ 基４’／−止１」□解ｊ１再」１或アツセイ
ＣＥＤ Ｔ Ａジゴキシンアッセイ試薬を販売者の推奨
する方法で再構成して用いたが、但し、Ｅｄ試薬は４℃
で１ｍＭ Ｍｇ Ｃ１２を含むＰ）１７． ２の０．
１Ｍリン酸ナトリウムバッファーで一夜透析して、引き
続＜Ｇ６ＰＤＨのアッセイを阻害する基質物質を除去し
た。
ＣＥＤ Ｔ Ａジゴキシンアッセイ試薬を販売者の推奨
する方法で再構成して用いたが、但し、Ｅｄ試薬は４℃
で１ｍＭ Ｍｇ Ｃ１２を含むＰ）１７． ２の０．
１Ｍリン酸ナトリウムバッファーで一夜透析して、引き
続＜Ｇ６ＰＤＨのアッセイを阻害する基質物質を除去し
た。
リポソーム−増強酵素アッセイは、次のようにして行っ
た。Ｅａ（６０ｐＪりおよびサンプル（ヒト血清中の２
５ｐｌ）を３７℃で、ときどき攪拌しながら４分間イン
キエベートした。透析したＥｄ試薬（３７，５１！りを
次いで添加し、さらに４分間インキュベーションを継続
した。最後に、リポソームを基質０６Ｐ（７ｍＭ）およ
びＮＡＤ＋ （２１）とともに添加し、１０−１５分
間３４００蒙の吸光度を追跡した。全反応量は、２５０
ｐｊ！であった。
た。Ｅａ（６０ｐＪりおよびサンプル（ヒト血清中の２
５ｐｌ）を３７℃で、ときどき攪拌しながら４分間イン
キエベートした。透析したＥｄ試薬（３７，５１！りを
次いで添加し、さらに４分間インキュベーションを継続
した。最後に、リポソームを基質０６Ｐ（７ｍＭ）およ
びＮＡＤ＋ （２１）とともに添加し、１０−１５分
間３４００蒙の吸光度を追跡した。全反応量は、２５０
ｐｊ！であった。
以上において、好ましい態様を含めて、本発明の詳細な
説明した。しかしながら、上記記載に基づいて当業者が
行う変法および／または改良であっても、発明の本質が
同じであって特許請求の範囲に含まれるものは、本発明
の範囲である。
説明した。しかしながら、上記記載に基づいて当業者が
行う変法および／または改良であっても、発明の本質が
同じであって特許請求の範囲に含まれるものは、本発明
の範囲である。
第１図は、好ましい態様に基づいて本発明のりボソーム
ー利用信号増強法の原理を説明する図である。 第２図は、リポソームからのＧ６ＰＤＨ酵素の遊離を示
すグラフである。 第３（Ａ）図は、Ｂ−ｇａ＋に誘発された、ＧＭ、−Ｐ
ＲリポソームからのＧ６ＰＤＨの遊離を示すグラフであ
る。 第３（Ｂ）図は、０６ＰＤＨに触媒されノー反応の速度
をＢ−ｇａｌ酵素濃度の関数として不すグラフである。 第４図は、リポソームにより増強された、種々のジゴキ
シン濃度でのＣＥＤＩＡアッセイを説明するグラフであ
る。 第５（Ａ）図は、基質としてＯ−ニトロフェニル−Ｄ−
ガラクトピラノシド ０ＮＰＧを用いた標準的ＣＥＤ
ＩＡジゴキシンアッセイのグラフである。 第５（Ｂ）図は、リポソーム−増強ＣＥＤＩＡアッセイ
における０ ６ Ｐ Ｄ Ｈ触媒反応の増加率を、血清
中のジゴキシン濃度の関数として表示するグラフである
。 （外４名） ＦＩＧ、３（Ａ） インＡ：しく−シｊン畔げツ（玲０ ＦＩＧ、３（Ｂ） ［／？ −Ｇ Ａｌ１ ｍｇ ／ ｍ ＩＦＩＧ、５（
ハ） ０ ０，２ ０．４ＦＩＧ、５（Ｂ
） ０ α０２ ０．０４ ０．０６ｎｇ／
ｍ１
ー利用信号増強法の原理を説明する図である。 第２図は、リポソームからのＧ６ＰＤＨ酵素の遊離を示
すグラフである。 第３（Ａ）図は、Ｂ−ｇａ＋に誘発された、ＧＭ、−Ｐ
ＲリポソームからのＧ６ＰＤＨの遊離を示すグラフであ
る。 第３（Ｂ）図は、０６ＰＤＨに触媒されノー反応の速度
をＢ−ｇａｌ酵素濃度の関数として不すグラフである。 第４図は、リポソームにより増強された、種々のジゴキ
シン濃度でのＣＥＤＩＡアッセイを説明するグラフであ
る。 第５（Ａ）図は、基質としてＯ−ニトロフェニル−Ｄ−
ガラクトピラノシド ０ＮＰＧを用いた標準的ＣＥＤ
ＩＡジゴキシンアッセイのグラフである。 第５（Ｂ）図は、リポソーム−増強ＣＥＤＩＡアッセイ
における０ ６ Ｐ Ｄ Ｈ触媒反応の増加率を、血清
中のジゴキシン濃度の関数として表示するグラフである
。 （外４名） ＦＩＧ、３（Ａ） インＡ：しく−シｊン畔げツ（玲０ ＦＩＧ、３（Ｂ） ［／？ −Ｇ Ａｌ１ ｍｇ ／ ｍ ＩＦＩＧ、５（
ハ） ０ ０，２ ０．４ＦＩＧ、５（Ｂ
） ０ α０２ ０．０４ ０．０６ｎｇ／
ｍ１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）試験液体中でアナライトに依存して保持され
、放出され、再構成され又は活性化される酵素を使用す
る、酵素を用いる診断システムを選択し； （ｂ）安定化剤の不存在下では不安定なＨ＿１＿１相を
形成する分子と前記（ａ）の酵素の基質である両親媒性
化合物から選ばれるリポソーム安定化剤化合物の有効量
とから形成されたリポソームであって、その中に一種ま
たは一種以上のリポーター酵素を捕捉して含んだリポソ
ームを用意し； （ｃ）（ａ）の酵素を（ｂ）のリポソームと混合するこ
とにより、該酵素と前記安定化剤化合物を反応せしめて
、リポソームを溶解し、これにより捕捉されているリポ
ーター酵素を放出し；そして （ｄ）正常なリポソーム膜を透過しない基質から選ばれ
る、リポーター酵素に対する適当量の基質を添加して、
前記放出されたリポーター酵素とその基質の組合せによ
り、アッセイ系の判読信号を増強させる； ことよりなる、判読工程に酵素が関与する診断用アッセ
イ系でリポソームを介して信号を増強する方法。 ２、工程（ｃ）および（ｄ）が実質的に同時に行われる
、請求項１記載の方法。 ３、酵素を利用した診断アッセイ系が、ＥＩＡ、ＥＬＩ
ＳＡ、ＥＭＩＴ、ＳＬＦＩＡ、ＣＥＬＩＡ、ＣＥＤＩＡ
、ＥＬＡ、ＴＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＡ、ＩＥＩＡ、イムノ
ケミカルアッセイ、イムノリポソームアッセイ、および
遺伝子−プローブアッセイからなる群から選択される、
請求項１記載の方法。 ４、安定化剤化合物が、脂肪酸類、コレステリル・ヘミ
サクシネート、ハプテン化リピッド類、ガングリオシド
類、グリコプロテイン類、プロテイン類、アシル化抗体
類および核酸類よりなる群から選ばれる、請求項１記載
の方法。 ５、ガングリオシド類から選ばれる安定化剤化合物がＧ
Ｍ＿１である、請求項４記載の方法。 ６、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性分子がリピッドである、請求項
１記載の方法。 ７、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性リピッドが、モノグリコシル・
ジグリセリドである、請求項６記載の方法。 ８、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性リピッドが、ホスファチジルエ
タノールアミン類の一種もしくは二種以上のものである
、請求項６記載の方法。 ９、ホスファチジルエタノールアミンが、ＤＯＰＥおよ
びＴＰＥのモル比２：１の混合物である、請求項８記載
の方法。 １０、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性リピッドが、不飽和である請
求項８記載の方法。 １１、リポソームがさらに約５モルパーセントまでの両
親媒性安定化剤化合物を含む、請求項１記載の方法。 １２、診断酵素アッセイに有用な酵素が、β−ガラクト
シダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
およびグルコースオキシダーゼよりなる群から選択され
る、請求項１記載の方法。 １３、酵素を利用した診断アッセイが、甲状腺刺激ホル
モンのアッセイである、請求項１記載の方法。 １４、酵素を利用した診断アッセイが、ジゴキシンのＣ
ＥＤＩＡアッセイである、請求項１記載の方法。 １５、リポソームがＤＯＰＥ：ＴＰＥからなる、請求項
１４記載の方法。 １６、安定化剤化合物がガングリオシドのＧＭ＿１であ
る、請求項１４記載の方法。 １７、リポーター酵素がグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼである、請求項１４記載の方法。 １８、不安定なＨ＿Ｉ＿Ｉ相形成性の、それ自体ではリ
ポソームを形成しない一種またはそれ以上のリピッドお
よび充分量の両親媒性の安定化剤化合物よりなり、その
中に一種またはそれ以上のリポーター酵素を捕捉して含
んでなるリポソームであって、該安定化剤化合物は診断
用酵素アッセイ系に有用な酵素の基質であるリポソーム
。 １９、安定化剤化合物が、脂肪酸類、コレステリル・ヘ
ミサクシネート、ハプテン化リピッド類、ガングリオシ
ド類、グリコプロテイン類、プロテイン類、アシル化抗
体類および核酸類よりなる群から選ばれる、請求項１８
記載のリポソーム。 ２０、リポソーム安定化剤化合物が、ガングリオシドの
ＧＭ＿１である、請求項１９記載のリポソーム。 ２１、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性リピッドが、モルグリコシル
・ジグリセリドである請求項１８記載のリポソーム。 ２２、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性リピッドが、ホスファチジル
エタノールアミンである、請求項１８記載のリポソーム
。 ２３、ホスファチジルエタノールアミンが、ＤＯＰＥお
よびＴＰＥのモル比２：１の混合物である、請求項２２
記載のリポソーム。 ２４、Ｈ＿Ｉ＿Ｉ相形成性リピッドが不飽和である、請
求項１８記載のリポソーム。 ２５、リポソームが、さらに約５モルパーセントまでの
両親媒性の安定化剤化合物を含む、請求項１８記載のリ
ポソーム。 ２６、酵素利用診断アッセイが甲状腺刺激ホルモンのア
ッセイである、請求項１８記載のリポソーム。 ２７、酵素利用診断アッセイがジゴキシンのＣＥＤＩＡ
アッセイである、請求項１８記載のリポソーム。 ２８、リポソームが、ＤＯＰＥ：ＴＰＥからなる、請求
項２７記載のリポソーム。 ２９、安定化剤化合物が、ガングリオシドのＧＭ＿１で
ある、請求項２７記載のリポソーム。 ３０、リポーター酵素が、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼである、請求項２７記載のリポソーム。 ３１、診断酵素アッセイに有用な酵素が、β−ガラクト
シダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
およびグルコースオキシダーゼよりなる群から選択され
る、請求項１８項記載のリポソーム。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7246387A | 1987-07-13 | 1987-07-13 | |
| US72463 | 1987-07-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0194261A true JPH0194261A (ja) | 1989-04-12 |
Family
ID=22107754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17485588A Pending JPH0194261A (ja) | 1987-07-13 | 1988-07-13 | 酵素関与するアッセイのために、均一系でリポソームを利用してシグナルを増幅する方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0300682A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0194261A (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6362003B1 (en) | 1992-02-24 | 2002-03-26 | Coulter Corporation | Hematological reference control composition containing leukocyte analogs, methods of making, and uses thereof |
| GB9617631D0 (en) * | 1996-08-22 | 1996-10-02 | Biovation Ltd | Signal amplification method |
| US7531594B2 (en) | 2002-08-12 | 2009-05-12 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Articles from plasticized polyolefin compositions |
| US7622523B2 (en) | 2002-08-12 | 2009-11-24 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Plasticized polyolefin compositions |
| CN100345896C (zh) | 2002-08-12 | 2007-10-31 | 埃克森美孚化学专利公司 | 增塑聚烯烃组合物 |
| US7652092B2 (en) | 2002-08-12 | 2010-01-26 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Articles from plasticized thermoplastic polyolefin compositions |
| US8003725B2 (en) | 2002-08-12 | 2011-08-23 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Plasticized hetero-phase polyolefin blends |
| US7652094B2 (en) | 2002-08-12 | 2010-01-26 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Plasticized polyolefin compositions |
| US7998579B2 (en) | 2002-08-12 | 2011-08-16 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Polypropylene based fibers and nonwovens |
| US7271209B2 (en) | 2002-08-12 | 2007-09-18 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Fibers and nonwovens from plasticized polyolefin compositions |
| US8192813B2 (en) | 2003-08-12 | 2012-06-05 | Exxonmobil Chemical Patents, Inc. | Crosslinked polyethylene articles and processes to produce same |
| US8389615B2 (en) | 2004-12-17 | 2013-03-05 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Elastomeric compositions comprising vinylaromatic block copolymer, polypropylene, plastomer, and low molecular weight polyolefin |
| WO2007011530A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Exxonmobil Chemical Patents, Inc. | Elastomeric compositions |
| CN106124716B (zh) * | 2016-07-21 | 2018-09-07 | 武汉市农业科学技术研究院农业环境安全检测研究所 | 一种克伦特罗快速检测方法 |
| CN107870244B (zh) * | 2017-11-02 | 2020-05-05 | 蔡慧娜 | 一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体lamp方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1575344A (en) * | 1978-03-03 | 1980-09-17 | Ici Ltd | Method for the manufacture of liposome composition |
| US4668638A (en) * | 1983-03-24 | 1987-05-26 | The Liposome Company, Inc. | Liposome composition for lupus assay |
| US4666830A (en) * | 1984-08-23 | 1987-05-19 | Wagner Daniel B | Assay employing sacs and sac lysing agent |
| US4622294A (en) * | 1985-02-08 | 1986-11-11 | Kung Viola T | Liposome immunoassay reagent and method |
| WO1987004795A1 (en) * | 1985-06-11 | 1987-08-13 | University Of Tennessee Research Corporation | Immunoliposome assay - methods and products |
-
1988
- 1988-07-13 JP JP17485588A patent/JPH0194261A/ja active Pending
- 1988-07-13 EP EP88306427A patent/EP0300682A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0300682A1 (en) | 1989-01-25 |
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