JPH0195779A - 安定な酵素組成物および酵素組成物の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）発明の技術分野 本発明は、酵素の安定化、そして特に蛋白質分解阻害剤
（インヒビタ）を使ってホスボエ／　−ルビルピン酸カ
ルボキシラーゼおよびホスホグルコムターゼとｎ−アセ
チルホスホグルコサミンムターゼとの酵素溶液を安定什
する技術に関する。

（ロ）　従来技術とその問題点 酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＲ
ＰＣ）が、血液中の二酸化炭素量測定のために自動分析
機中で用いられている。血流または他の体液中の二酸化
炭素の測定は医学的診断学においては重要彦測定である
。血流中の二酸化炭素の異常な濃度は種種り病気、代謝
や呼吸の酸性症およびアルカローシスの結果、あるいは
ある状況では、原因の何れかである。

血流中に導入された二酸化炭素の少量部分は物理的に溶
解された状態のままでいる。それは赤血球中に溶解され
てもよく、そこでは溶解された二酸化炭素は炭素脱水酵
素の接触作用によ重炭酸に変換される。こんどはその炭
酸が、血液のＰＨで、水素イオンと重炭酸イオン（ＨＣ
Ｏλ）に解離する。

その平衡を回復するために、ＨＣ蝦はその細胞から血漿
中に拡散する。分光測光によるＨＣＯ玉の存在量の測定
は、ＨｃｏＨと光吸収を示す材料との結合によシ行うこ
とができる。この材料の存在量を測光によシ測定し、存
在していた重炭酸イオン濃度カ決定される。ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）はこの目
的のために用いられ、関与する反応は次の通りである （ここでＰｌは無機リン酸塩である）。ここで形成され
たオキサロ酢酸塩は更に次のように反応する ＭＤＨ オキサロ酢酸塩十ＮＡＤＨ〜）リンゴ酸塩十ＮＡＤ（こ
こでＭＤＨはリンゴ酸デヒドロゲナーゼであシ、ＮＡＤ
ＨとＮＡＤとはそれぞれ、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドの還元型と酸化型である）。

ＮＡＤＨのＮＡＤへの変換速度またはこの反応の終点の
何れかを、標準的手順規則に従って測定できる。

速度測定法は終点測定法よシも用いる酵素が実質的に少
く、酵素の価格が高いと云う見地からは、速度測定法が
好ましい。しかし、前記の方法の何れによっても、ＨＣ
Ｏ３測定を行うに伴う１つの問題は、ＰＥＰＣが貯蔵中
にその活性を失い、それによって正確でない測定が起る
傾向があると云う事である。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ安定化の１
つの既知の方法は米国特許第３．９６３．５７８号に記
載されている。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼは、それを、リン酸ナトリウム０．００２〜０．０
５モルと、アスパラギン酸塩１〜１０ミリモル、好まし
くは３〜８ミリモルと、エチレンジアミン四酢酸０．０
２〜０．１ミリモルと、硫酸アンモニウム０．６〜３．
１５、好ましくは０．８〜１．２モルと、グリセリン２
Ｑ容量％までとを含有する水性溶液中に混合することに
よシ、４℃で６ケ月またはそれ以上の貯蔵寿命を持つよ
うに安定化されると報告されている。リン酸ナトリウム
はその溶液のＰＨを６．０〜６．８に維持するための緩
衝剤として作用している。しかし、この特許ではその酵
素の不安定の理由が示されていない。その特許は約４℃
の貯蔵温度でのその酵素の安定化を目指している。前述
の典型的な反応が起る高めた温度、すなわち、室温また
はより高い温度における、該酵素の安定性については議
論もされていなければ、何の例も与えられていない。更
に、前記溶液中の高い塩ならびに緩衝剤濃度は自動臨床
分析機へのその溶液の使用を制限するし、他の酵素の活
性の安定化には有用でないかもしれない。

酵素ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ　）とｎ−アセチル
ホスホグルコサミンムターゼ（ＰＡＧＭ　）とは酵素を
組合せた免疫検査に使用するのに魅力的である。ＰＣ）
Ｍは、（ａ）そのジホスホ型はグルコース−１，６−ニ
リン酸に対し強い親和性を持ち（Ｋｍ。

１０　’　Ｍ　；　Ｗ、　ＲａｙおよびＥ、　Ｐｅｃｋ
　、　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ。

６．４０７頁　１９７２）、（ｂ）　ＰＧＭＯ比活性、
即ち５　［１［１（Ｖ、　Ｄｅｓｈｐａｎｄｅおよび、
Ｔ、　Ｊｏｓｈｉ　、　Ｊ。

Ｂコｏ１．　ｃｈｅｍ、、　２６０　＋　７５７頁　１
９８５）は代謝回転数３２，５００に対応する故に、指
示酵素として用いる高い可能性を持っている。グルコー
ス−１，６−ニリン酸はＰＧＭとＰＡＧＭとの基質でも
ち多活性剤でもある（以下に説明する）。このことはグ
ルコース−１−リン酸がホスホ酵素（ＰＧＭの活性型）
と反応できる場合は、ＰＧＭの各活性分子はグルコース
−６−リン酸３２，５００分子を生成することを意味す
る。グルコース−６−リン酸の生成はグルコース−６−
リン酸デヒドロデナーゼとＮＡＤとの存在の下に定量で
きる。ＮＡＤはＮＡＤＨに還元される。後者は３４０　
ｎｍにλｍａｘを持つ（Ｗ、　ＲａｙおよびＣ）、　Ｒ
ｏｓｅｌｌｉ　＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ｃｈｅｍ、、　２３９　、１２２８頁、１９６４）。ど
の両方の性質は、生化学的および免疫化学的方法による
低濃度検体測定に対しＰＧＭを有用な酵素とする。

Ｎ″″″アセチルホスホグルコサミンムターゼＰＡｆｌ
Ｍ　）はグルコース−１，６−二リン酸誘導体と反応出
来る（　Ａ、　５ｏｒｅｎｓｏｎおよびり。

Ｃａｒｌｓｏｎ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
２４６　＋　３４８５頁。

１９７４）。それ故、２−アミノグルコース−１，６−
ニリン酸のアミノ基に結合した血清検体はＰＡＧＭをリ
ン酸化（活性化）できる筈である。

ＰＡＧＭのホスホ型はグルコース−１，６−ニリン酸を
生成することができる。グルコース−１，６−ニリン酸
はＰＧＭによってＰＡＧＭにょるよシもよく利用される
。

免疫化学的検査においては、抗体は遊離の検体またはグ
ルコース−１，６−ニリン酸と結合した検体の何れかと
結合できる。これらの酵素の他の有力な使用領域は、臨
床的関心のある血清成分がこれらの酵素の活性に直接に
影響する領域である。

（ハ）本発明の目的と作用 本発明の目的は、成る酵素を試薬として用いる正確な臨
床的測定を可能とするためにそれらの酵素の有効寿命を
延ばすことにある。

この目的に従って、本発明では安定化剤として蛋白質分
解阻害剤を使用し、水性酵素組成物を安定化することを
目指している。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、任意の
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（Ｂ菌株およびＷ
菌株を含むすべての菌株）、たとえばこの目的には本の
ような他の細菌からと同様に、単離できることが知られ
ている。また、他の細菌も使用できる。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの相対的な
不安定さは知られている。実験を通じて、この不安定性
の可能性のある理由は蛋白質を劣化させるプロテアーゼ
の存在であることが見出された。さらに、実験でホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼが蛋白分解防止剤
添加により安定化できることが見出された。それらの実
験を以下に要約する。

先ず、その酵素の不安定性の原因を調べた。幾つかの可
能性の中で、酵素の蛋白質分解物による劣化がその活性
喪失の１つの理由であると考えた。

商業的に入手できる源からの酵素調製物中のプロテアー
ゼ存在の検査を行い、蛋白質分解物による汚染を示す肯
定的結果を得た。

有機および天然に存在する阻害剤をプロテアーゼの活性
抑制のために試験した。試験された幾つカ（ＩＤ　［書
割の中で、フエニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭ
ＳＦ　）　、α−抗トリプシンインヒビタ、少量の硫酸
アンモニウム存在の下での部分的に精製されたオボムコ
イドおよびオボインヒビタ、および大豆トリプシンイン
ヒビタが、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
の安定化に有効であった。

粗大豆トリプシンインヒビタは、５日間酵素活性を保護
し、その溶液が貯蔵中透明のままであったので、好まし
い安定剤である。この阻害剤はまた、α−抗トリプシン
インヒビタおよびオボインヒビタに比較して安価である
。

α−抗トリゾシンおよびオボインヒビタは製品調合物に
用いるには高価すぎる。部分的に精製されたオボムコイ
ドは安価であシ、大豆インヒビタ、α−抗トリゾシンお
よびオボインヒビタと同様に有効であるが、オボムコイ
ドの存在の下では貯蔵中溶液が濁って来る。ＰＭＳＦは
その毒性のために前記したもの程は望ましくない。

ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ　）とｎ−セセチルホス
ホグルコサミンムターゼ（ＰＡＧＭ　）との酵素活性は
微生物、動物および植物中に存在するが、その不安定性
を、それが非常に苛酷な豚の顎下線の場合で評価した。

ＰＧＭとＰＡＧＭとの酵素活性は、精製の初段階の間に
、４℃、２４時間で５０％失はれることが判った。この
ことは酵素溶液中のプロテアーゼの存在によるものであ
ることが判った。

豚の顎下腺はトリプシンに加えて、セリンプロテアーゼ
とカリクレンとを含有している。カリクレンは酵素前駆
体で、トリプシンのような他の蛋白分解酵素によシ活性
化される。ＰＧＭ／ＰＡＧＭ酵素溶液の蛋白質分解を阻
止するため、種種のインヒビタを用いて、一連の実験を
行った。

ｐＨ７，５ではα−抗トリプシンインヒビタによって長
期間に成る程度の蛋白質分解阻止ができることを見出し
た。このＰＨにおいては、大豆トリプシンインヒビタも
、ＰＨ５−０における程効果的にではないが、この酵素
を変性から保護する。この酵素はプロテアーゼインヒビ
タが存在しない場合には本質的に安定性がないが、大豆
トリプシンインヒビタの存在下では３週間は安定であっ
た。ＴＰＣＫはＰＨ５，０においてＰＧＭ７／ＰＡ、Ｇ
Ｍ酵素を不活性化し、ＰＨ７，５においてそれ以上の不
活性化は示さない。

アプロチニンは最も有効な安定剤であシ、その酵素溶液
を１ケ月以上も安定化することを見出した。ロイペプチ
ンも等しく有効である。酵素溶液は大豆トリプシンイン
ヒビタによっても１週間は安定化される。その溶液の酵
素活性はｐ−アミノベンズアミジンの存在で１４日間、
ベンズアミジンを用いれば５日間保護される。α、ａ′
−ビピリダールは試験した安定剤の中綴も効果的でない
。

ＰＧＭ／ＰＡ（）Ｍ溶液の精製中での蛋白質分解活性の
抑制に対してはｐ−アミノベンズアミジンが適尚である
ことが判った。ＰＧＭ／ＰＡＧＭ酵素の単離においては
大容量の酵素溶液を調製するので、他のプロテアーゼイ
ンヒビタ例えば大豆トリプシンインヒビタ、ロイペプチ
ンおよびアプロチニンの使用は高価となる。さらにＰＧ
１４／ＰＡＧＭ精製の最終段階において、蛋白質分解活
性のインヒビタとして蛋白質を用いることは、酵素調製
物から蛋白質不純物を分離するのが困難であるので、不
適当である。

しかし、ｐ−アミノベンズアミジンは小分子量化合物で
あり、そのままで透析または加圧ろ過により容易に酵素
溶液から除去できる。

に）本発明の実施例 以下に本発明の実施例を述べる。可能な場合にはいつで
も、標準的な商業的に入手し得る試薬級化学薬品を用い
た。これらの実施例は本発明の説明と考えるべきで、本
発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの安定性測
定のための活性検査は、そのような検査の確立された手
順規則に従いＴＥＣＨＮＩＣＯＮ　ＲＡ−１０００臨床
分析機で行う（ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ　ＲＡ　−１００口
はＴｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、　Ｔａｒｒｙ−ｔｏＷｎ　、　
Ｎ、Ｙ、の登録商標である）。そのような手順規則に従
って、酵素溶液Ｒ２を試料カップ中に入れる。検査混合
物の他の組成Ｒ工を試薬ボート中に入れる。Ｒ２１０μ
ｔヲＲユ３５０μｔと混合する。６７°Ｃで反応させ、
読みを行う前３０秒の温良期間をおく。残存活性は、始
め新鮮な溶液を作った時測定された活性の百分率とする
。

試料ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ中の蛋
白質分解活性の存在はＥｊ、ｏ−Ｒａｄ　（Ｂｕｌｌｅ
−ｔｉｎ　１１１１　）によシ供給されたキット法で測
定する。これは非常に鋭敏な方法で、検出限界はプロテ
アーゼ存在量までである。貯蔵中のプロテアーゼの活性
化を説明するため、固体試料を以下に記載する緩衝液中
に溶解し、ＴＥＣＴ−ＴＮＩＣＯＮ　ＲＡ−１０００臨
床分析機に、６７℃で６時間貯蔵する。

固体酵素試料は０．１％のベンゾイックと０．０１％の
ゲンタマイシン（Ｒ２）とを含有する、ＰＨ７，０の５
０ｍＭへペス（Ｈｅｐｅｓ　）中に溶解する。

安定性の研究は室温で、約２０〜／酎の酵素を含有する
Ｒ２中で行う。大豆トリプシンインヒビタ対ホスホエノ
ールピルビン酸塩の比ハ、ｍｇ／ｍｌで１０：２０であ
る。大豆の比活性は７０００　ＢＡＥＥインヒヒタ単位
／ｍ９で、ホスホエノールピルビン酸塩のそれは１単位
／ｍｇである。Ｒ１中において、活性検査の成分は、Ｎ
ＡＤＨ１，３Ｘ　１０−’　Ｍ、ホスホエノールピルビ
ン酸塩２．５　Ｘ　１０−３　Ｍ、　酢酸マグネシウム
１．０６Ｘ１０”ＭおよびＮａＨＣＯ３５Ｘ１０’Ｍで
あシ、ｐＨ８，３のＩ　Ｏ４ｍＭ　トリス−アセテート
中（室温）にある。

ＰＥＰＣ酵素試料はプロテアーゼの存在を示した。

プロテアーゼ存在の検査の間に、その試料は稀釈され、
プロテアーゼの活性には最適の条件にされた。

汚染物としてのプロテアーゼの存在が観察されて、その
活性の抑制と、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼの安定化のため、幾つかの実験を行った。この目的
達成のため、種種な源からのプロテアーゼインヒビタが
検査された。

セリンプロテアーゼは中性のｐＨ近くでより活性である
ので、これらのインヒビタの多くハセリンプロテアーゼ
に対するものである。酵素の安定化に対するこれらのイ
ンヒビタのあるものの効果を表１に示す。

多くの場合、酵素は５時間までは安定であり、この時間
の間では活性のそれ程の損失はない。不安定性は室温で
２３時間後に見られる。

ＰＭＳＦは公知のセリンプロテアーゼインヒビタであシ
、示されているように、最も有効な安定化剤である。

ＰＭＳＦを含む幾つかのインヒビタの効果を５０ｍＭ　
（ＮＨ４）２８０４の存在および不存在の両方で試験し
、その結果を表■に示す。

表　　■ １、対照　　　　　　３５２６ ２、　ＰＭＳＦ　（１ｍＭ）　　　　　７１　６１３、
　ＰＭＳＦ　（１ｍＭ）　＋　（ＮＨａ）２ｓＯ４（５
０ｍＭ）　９０８８４、　　α−抗トリプシンインヒビ
タ（５１ｎ９／罰）５８５８８、　オボムコイド（１Ｑ
ｍ９／ｍ／；）　　　　　６４　　６３９　オボムコイ
ド＋（ＮＨ４）２Ｓｏ、　　　　　８３　　８７１２．
４−フェニルブチルアミン（１０ｍＭ）　　　　　５７
　　５１１６、Ｄ−アルギニン　（１０ｍＭ）　　　　
　　　　　３１］　　　２４１４、Ｄ−フェニルアラニ
ン　（５ｍＭ）　　　　　　　５７　　５１メチルエス
テル＋Ｄ−フェニルアラニン１６、　　（１２）＋　　
（ＮＨ４）２３０４　　　　　　　　　　　８２　　　
８９硫酸アンモニウムと組合せたＰＭＳＦは、２４時間
で元の活性の８８％の程度に酵素を安定化する。

α−抗トリプシンインヒビタはトリプシンとキモトリプ
シンとエラスターゼとコラゲナーゼを包含する広い範囲
の特異性を持っている。それは血清プロテアーゼ防止活
性の９０％を示している。α−抗トリプシンインヒビタ
は２５時間抜５８％の活性を保持する程度（試料４）、
（ＮＨ４）２８０４と組合せれば元の活性の８２係を保
持する程度（試料５）にその酵素を安定化している。

ｐ−ニトロフェニル−ｐ−グアニジノベンソエ−）ｌｄ
多くのセリンプロテアーゼの優れた活性点滴定液である
ことが知られている。Ｄ　−トリプトファンメチルエス
テルとＤ−フェニルアラニンと４−フェニルブチルアミ
ンとはキモトリプシンを阻止することが知られている。

Ｄ−１リプトフアンメチルエステルとＤ−フェニルアラ
ニンとｐ−ニトロ−ｐ−グアニジノベンゾエートの場合
には貯蔵中温シができる。Ｄ−トリプトファンメチルエ
ステルとＤ−フェニルアラニンとにα−抗トリプシンイ
ンヒビタを包含させてもα−抗トリプシン単独以上の有
利さを示さない。

オボムコイドは糖蛋白質で鶏卵白から得られる既知のプ
ロテアーゼインヒビタである。オボムコイドの粗調製物
はトリプシンに加えてキモトリプシンも防止する。酵素
は、オボムコイドと（ＮＨ４）２ＳＯ４との存在の下に
、８７係の程度に保護される。

酵素の安定化に必要なオボムコイドの濃度を最適化した
。オボムコイド８〜１０ｍ９／ｍｌで酵素活性を最高に
保護する。それよシ高濃度では一夜の貯蔵で濁りが生ず
る。他にインヒビタのない場へ（ＮＨ４）２８０４の最
適濃度は７５ｍＭであると決定されている。それより高
濃度は貯蔵中蛋白質の沈澱を起す。

（ＮＨ４）２８０４０安定化効果の本性が一般的なイオ
ン強度効果によるものかあるいはその塩のイオンの特殊
々効果によるものかを調べる実験が行われた。オボムコ
イド１０Ｔｎ９／Ｉｎｌ含有する試料は、（ＮＨ４）２
８０４を２００ｍＭまでの異った濃度でＮａＣｔに置換
えても透明であるａＮａＣｔによる安定化は無視出来る
。それ故、（ＮＨ４）２８０４の部分的安定化はこの塩
のイオンに依シ、一般的な塩効果によるものではないよ
うである。

酵素活性に対する基質ホスホエノールピルビン酸塩の効
果を研究した。酵素はホスホエノールピルビン酸塩５ｍ
Ｍの存在の下では不安定である。

オボムコイドと（ＮＨ，）２８０．との組合せの下で存
在するその基質はそれ以上の有利な効果を与えない。

鶏および七面鳥の精製オボムコイドは安定化効果を示さ
ない。粗オボムコイドはまた蛋白質分解活性を阻止して
いるかもしれないオボインヒビタを含むかあるいはオボ
ムコイドから精製する前のオボムコイドは違った構造を
もっている。オボムコイドの自然のｉ！まの型はそれが
精製される前より効果的であってもよい。またオボムコ
イドは牛トリゾシンおよびα−キモトリプシンを阻止す
る効果があること（Ｍ、　ＬａｓｏｗｓｋｉおよびＲ，
５ｅａｌｏｃｋ。

Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　、　３　＊　３７５−４８４
頁、　１９８４゜第６版、　ＡＣａａｅｍｉＣＰｒｅｓ
ｓ　）を留意しておくのは有用である。

次に、異った商業的出所から得たホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ、すなわちＣａｒｂｉ−ｏｃｈｅ
ｍからのＡ　、　ＢｅｃｋｍａｎからのＢおよびＢｉｏ
ｚｙｍｅからのＣの安定化におけるオボムコイド（部分
的精製）の普遍性を調べる実験を行い、その結果を表■
に報告する。

表　　■ Ａ、対照　　　　　　　　　　２８ ＋オボムコイド　　　　　８５ Ｂ、対照　　　　　　　　　　２９ ＋オボムコイド　　　　　８５ Ｃ１対照　　　　　　　　　　７０ ＋オボムコイド　　　　　９１ それらの試料は、０．１％安息香酸塩と０．０１％ｒン
タマイシンとを含む、ＰＨ７，０の５［］ｍＭヘペス緩
衝液中、室温で貯蔵した。酵素およびオボムコイドの量
は５，７５　ｍＭｍ酸アンモニウム存在の下で、それぞ
れ２０ｍ９／ｄおよび１０■／　ｍｌｊである。

ＡおよびＢからの酵素は甚しい活性損失を示し、インヒ
ビタによシ同程度に安定化されている。その損失は初め
の２４時間の間に両方共約１５％に減少している。Ｃか
らの酵素の場合、インヒビタネ存在の下では６０％の活
性損失が起９、オボムコイドを添加するとこの損失は１
０％以下に減少する。

オボムコイドは６日間は効果があるが、貯蔵中に酵素溶
液に濁シが起る。他のインヒビタを試験した。大豆トリ
プシンインヒビタとオボインヒビタとは酵素活性を保持
することが判った。０．５ｍｇ／　ｍｌとｏ、ｉｍｇ／
ｍｘとの濃度で、オボインヒビタは酵素活性を２４時間
に亘り、それぞれ９０％と８０％との程度に保護する。

大豆トリプシンインヒビタは（ＮＨ４）２８０４の存在
または不存在の下でホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを５日間安定化する。その試料が（ＮＨ４）２
ＳＯ４を含有しない場合、その溶液は透明である。大豆
トリプシンインヒビタ存在の下ではその酵素は５日間安
定であった。

他の実験において、種種々出所からの大豆トリプシンイ
ンヒビタを試験した。これらの出所にはＵ、Ｓ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　、
　Ｆｌｕｋａ　。

Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍおよびＢｉｏ
ｚｙｍｅ　；　Ｓｏｙ　ＩとＳｏｙ　ｌとＳｏｙ　ｌ［
が包含される。

Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌからのインヒビタが
最も効果的で、次はＣａｌ　ｂｊ−ｏ　ｃｈｅｍからの
ものであった。

Ｆｌｕｋａ　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍおよびＥｉｏｚｙｍｅからの大豆トリプシンインヒ
ビタは２日間は良好であるが、後日試験すると、これら
の出所からのものの効果は減少した。

前記の実験に基いて、ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼの蛋白質分解による劣化はＰＭＳＦ　、α−
抗トリプシンインヒビタ、オボイン（２６〕 ヒピタおよび部分的精製されたオボムコイド（Ｈ。

ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒおよびＣ，Ｍｕｒｒａｙ　、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

１７１．５６５頁　１９４７）ならびに大豆トリプシン
インヒビタによって阻止できると結論できた。、ＰＭＳ
Ｆは毒性があり、この化合物の取扱いには特別な注意を
要する。α−抗トリプシンとオボインヒビタとは高価で
あり、その使用は高価となるかもしれない。成る程度精
製されたオボムコイドは高価ではなく、塩（ＮＨ４）２
ＳＯ４の存在の下で可溶である。オボムコイド調製物は
酵素の安定化に用いるのに、より便利である。Ｂｉ　ｏ
　ｚｙｍｅとＣａ１ｂｉＯＣｈｅｌｌｌとからのＰＥＰ
Ｃは貯蔵中に７０％の活性を失い、オボムコイド（１０
ｍ９／ｍｌ）と（ＮＨ４）２８０４　（７５ｍＭ　）と
の存在の下では酵素活性の損失は１５％に減少、すなわ
ち酵素活性の約８５％が保持される。Ｂｅｃｋｍａｎ　
ＰＥＰＣ酵素は比較的安定であるが、尚３０％の酵素活
性の損失を示し、この損失は、オボムコイドの存在する
場合約１０係に減少する。精製オボインヒビタは酵素に
対し類似の安定化効果を持っている。

この研究から大豆トリプシンインヒビタは好ましい安定
剤である。それはこの研究で考慮された他のものより高
価ではなく、貯蔵中溶液は透明のままであることが判っ
た。オボムコイドとオポインヒビタとの場合、（ＮＨ４
）２８０４存在の下でも混濁がおこる。ホスホエノール
ピバリン酸カルボキシラーゼの長期安定化のためには、
大豆トリプシンインヒビタ程効果的な防止剤は他になか
った。その酵素は、室温、５日間、集成試薬中にあった
場合、元の活性の８０〜９０％の程度に安定であった。

このインヒビタの使用は、必要とするホスホエノールピ
バリン酸カルボキシラーゼ量を低下させ、結果として検
査光りの費用が減少する。凡ての効果的インヒビタの比
較を表■に示す。

表　　■ α−抗トリプシン　　　　　　　２４−４８オボインヒ
ビタ　　　　　　　　２４−４８オボムコイド　　　　
　　　　　　４８−４８−７２Ｐ　　　　　　　　　　
　　　　２４−４８大豆トリプシンインヒビタ　　　　
１４０本発明に従って安定化される他の酵素はスルホグ
ルコムターゼ（ＰＣ）Ｍ　）とｎ−アセチルホスホグル
コサミンムターゼ（ＰＡＧＭ　）とである。酵素活性は
微生物、動物および植物に存在している。豚顎下腺はこ
の酵素の豊富な源である（　Ｄ、　Ｃａｒｌｓｏｎ。

Ｍｅｔｈｏｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　＋　８
　＋　１７９頁。

１９６６）。しかし、この組織はまた相当なプロテアー
ゼ活性全含有しく　Ｍ、　ＬｅｍｏｎおよびＨ，Ｆｒ１
ｔｔ。

Ｂｉｏｃｂｅｍ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　、　１７７　＊　
１５９頁、　１９７９）、そのプロテアーゼがその酵素
の活性も破壊する。

以下に記述するごとく、これらの酵素はプロテアーゼイ
ンヒビタを用いることにより安定化される。

プロテアーゼの存在は前述の手続規則に従って検出され
る。プロテアーゼ活性の定量的検定は基質としてＮ−α
−ベンゾイル−Ｌ−７３４ニン−ｐ−ニトロアニリドを
用い、公表されている方法（、Ｈ，Ｆｒ１ｔｚ　、　１
．　Ｔｒｕｎｔｓｃｈｏ１４およびＥ、　Ｗｅｒｌｅｓ
″Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ″Ｈ，Ｂｅｒｍｅｙｅｒ編、第■巻、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｑ　＋　Ｎ、４．１９７４）に従
って行われた。その方法は、（１）　Ｃ’ａＣ’Ａ２２
０　ｍＭを持つ０．２　Ｍ　トリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７，８）、（２）１ｍＭ　ＨＣｌ中のトリプシ
ン標準液、（３）水中２．２　ｍＭ基質溶液から成る。

若し基質濃度を５倍増加させれば感度は４倍増大させる
ことができる。沸騰水浴に５分間入れておくことによシ
基質の透明な溶液が得られる。反応混合物は０．６７５
ｍ１の緩衝液と０．３２５１ｆＬｌの基質溶液とからな
る。

その速度は３７℃で、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ　Ｉｎｃ。

から得られるＤＵ　８分光光度計によ勺４　Ｄ　５　ｎ
ｍで測定される。基質Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギ
ニンーｐ−ニトロアニリドを用い、標準トリプシンが活
性１１０００ｕ／ｍ９である場合、トリプシン１■／を
相等のプロテアーゼ活性を検出できる。ＰＣ）Ｍ／ＰＡ
ＧＭ酵素溶液の活性は次の反応混合物、即ち、ＰＨ７，
５の５［］ｍＭ酢酸イミダゾール中の、ＮＡＤ＋１［１
−３Ｍとグルコース−１−リン酸２×１０−４Ｍとグル
コース−１，６−ニリン酸１０−５Ｍと酢酸マグネシウ
ム２Ｘ１０−３ＭとＥＤＴＡ　２　Ｘ１０−’Ｍと１　
単位／　ｗのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
とを用いて測定される。反応はその酵素溶液アリコート
を加えて開始させ、３７’Ｃで、ＤＵ　８分光光度計を
用い３４０　ｎｍで速度を測定する。この方法は本質的
には文献の方法（Ｗ。

ＲａｙおよびＥ、　Ｐｅｃｋ　、　Ｔｈｅ　Ｅｎｇｙｍ
ｅｓ　＋　６　＋　４０７頁＋　１９７２　；　Ｈ，Ｂ
ｅｒｇｍｅｙｅｒ　＋　”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎ
ｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　”　Ｈ，Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ編、第１巻。

ＡＣａｄｅｍｉＣＰｒｅｓｓ　＋　Ｎ、Ｙ−１９７４）
と類似のものである。

ＰＧＭ／ＰＡＧＭ酵素溶液の不安定性はプロテアーゼの
存在によることが判った。豚顎下腺はトリプシンに加え
て、セリンプロテアーゼとカリクレンを含有している。

カリクレンは酵素前駆体であシ、他のプロテアーゼによ
って活性化される。酵素調製物中にプロテアーゼが存在
すると、　ＰＧＭ／ＰＡＧＭは４℃で１夜貯蔵して５０
％の程度劣化する。

種種のインヒビタの安定化効果を測定するため一連の実
験が行われた。１つの実験においては、酵素調製物は３
０−７０％の硫酸アンモニウム画分を含有した。大豆ト
リプシンインヒビタ（５ＢＴＩ　）（１０■／ＩｒＬｌ
）トドシルフェニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ　）
　（２ｍＭ　）ととα−抗トリプシンインヒビタＣ２ｍ
９／ｍｉ）との効果をｐＨ５，０ドア、５　、！：で、
５０ｍＭ酢酸イミダゾール緩衝液、Ｑ、２ｍＭＥＤＴＡ
および１ＱｍＭ酢酸マグネシウム中で研究した。トリプ
シンとの防止剤複合体の形成と解離とはＰＨ依存性があ
るので２２）の値のＰＨで安定性を調べた。第１図に示
したように、ＰＧＶＰＡＧＭ酵素溶液はＰＨ５，０で大
豆インヒビタが存在すると、５°Ｃで３週間以上も安定
である。ＴＰＣＫは対照よシも早く活性を破壊する。Ｐ
ＧＭは活性セリン残基をもっている。ＰＡＧＭもまた活
性点にセリン残基をもっていてもよい。その酵素はＴＰ
ＣＫ存在の下では不活性にされる。α−抗トリプシンイ
ンヒビタはＰＨ７，５で長い時間に亘って成る程度の保
護を与える。大豆トリプシンインヒビタもまたＰＨ７，
５において酵素を変性に対して保護する。ｐＨ５，０の
場合と違って、ＴＰＣＫｌｌ″）：ｐＨ７，５で酵素の
不活性化をそれ以上には示さない。

他の実験においては、硫酸アンモニウム分別後のその酵
素調製物をＤＥＡＥ　−）リスアクリルカラムクロマト
グラフィーを通して精製した。蛋白質分解活性の定量的
検定では、この酵素調製物がトリプシン様活性１ｍ９／
を相当を含有することが示された。これら痕跡量のプロ
テアーゼも酵素の変性を起すには充分である。プロテア
ーゼの種種のインヒビタ、即ち、アプロチニン（０，５
■／駐）、大豆トリプシンインヒビタ（５ｍ９／７ｕＡ
）、ｐ−アミノベンズアミジン（５ＩｎＭ）、ベンズア
ミジン（５ｍＭ　）、α、（ＩＩ’−ビピルダール（２
ｍＭ）ならびにロイペプチン（０，５ｉ／ｄ）を用い安
定性の研究を行った。酵素は５０ｍＭイミダゾール塩酸
塩、２ｍＭ酢酸マグネシウムおよび０．２　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ中、ＰＨ７，５，４°Ｃで貯蔵した。その活性を種
種の時間に検定した。アプロチニンは最も強力な安定剤
であり、酵素はその存在の下では１ケ月以上も安定であ
った。酵素は大豆トリプシンインヒビタの存在では１週
間安定であった。酵素活性はｐ−アミノベンズアミジン
存在の下で１４日間、ベンズアミジンを用いては５日間
保護された。α，α′−ビピリダールは試験された安定
剤の中で最も効果的ではないが、プロテアーゼによる変
性に対しては成る程度の保護を与えた。

ＰＡＧＭ／ＰＧＭ溶液の精製中の蛋白質分解活性抑制に
は、ｐ−アミノベンズアミジンがプロテアーゼインヒビ
タとしては適当であることが判った。これらの酵素の単
離には大容量の酵素溶液が調設される故に、他の蛋白質
分解インヒビタ例えば大豆トリプシンインヒビタ、ロイ
ペプチンならびにアプロチニンの使用は相当高価になる
。更に、ＰＧＭ／ＰＡＧＭ精製の最終段階では、蛋白質
汚染物の酵素調製物からの分離が困難である故に、蛋白
質分解インヒビタとして蛋白質を用いることは不適光で
ある。ｐ−アミノベンズアミジンは小分子量化合物であ
るから透析または加圧ろ過によって酵素溶液から容易に
それを除去できる。

これらの結果は、本発明の臨床的有用性を示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は種種の蛋白質分解インヒビタによるＰＧｈｌＰ
ＡＧＭ酵素溶液の安定化効果を示す線図的説明図である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）安定剤として蛋白質分解阻害剤を含む安定な水性
   酵素組成物。 （２）酵素成分としてホスホエノールピルビン酸カルボ
   キシラーゼを含む前項（１）に記載の組成物。 （３）安定剤としてフエニルメチルスルホニルフルオリ
   ドを含む前項（２）に記載の組成物。 （４）安定剤としてα−抗トリプシンインヒビタを含む
   前項（２）に記載の組成物。 （５）安定剤として部分的に精製されたオボムコイドを
   含む前項（２）に記載の組成物。（６）安定剤としてオ
   ボインヒビタを含む前項（２）に記載の組成物。 （７）安定剤として大豆トリプシンインヒビタを含む前
   項（２）に記載の組成物。 （８）酵素成分がホスホグルコムターゼとｎ−アセチル
   ホスホグルコサミンムターゼの溶液である前項（１）に
   記載の組成物。 （９）安定剤として大豆トリプシンインヒビタを含む前
   項（８）に記載の組成物。 （１０）安定剤としてα−抗トリプシンインヒビタを含
   む前項（８）に記載の組成物。 （１１）安定剤としてアプロチニンを含む前項（８）に
   記載の組成物。 （１２）安定剤としてｐ−アミノベンズアミジンを含む
   前項（８）に記載の組成物。 （１３）安定剤としてロイペプチンを含む前項（８）に
   記載の組成物。 （１４）安定剤としてベンズアミジンを含む前項（８）
   に記載の組成物。 （１５）安定剤としてα，α′−ビピルダールを含む前
   項（８）に記載の組成物。 （１６）安定剤として蛋白質分解阻害剤を添加すること
   から成る、水性酵素組成物の安定化方法。 （１７）酵素成分としてホスホエノールピルビン酸カル
   ボキシラーゼを使う前項（１６）に記載の方法。 （１８）安定剤としてフエニルメチルスルホニルフルオ
   リドを使う前項（１７）に記載の方法。 （１９）安定剤としてα−抗トリプシンインヒビタを使
   う前項（１７）に記載の方法。 （２０）安定剤として部分的に精製されたオボムコイド
   を使う前項（１７）に記載の方法。 （２１）安定剤としてオボインヒビタを使う前項（１７
   ）に記載の方法。 （２２）安定剤として大豆トリプシンインヒビタを使う
   前項（１７）に記載の方法。 （２３）酵素成分としてホスホグルコムターゼとｎ−ア
   セチルホスホグルコサミンムターゼの溶液を使う前項（
   １６）に記載の方法。 （２４）安定剤として大豆トリプシンインヒビタを使う
   前項（２３）に記載の方法。 （２５）安定剤として抗トリプシンインヒビタを使う前
   項（２３）に記載の方法。 （２６）安定剤としてアプロチニンを使う前項（２３）
   に記載の方法。 （２７）安定剤としてｐ−アミノベンズアミジンを使う
   前項（２３）に記載の方法。 （２８）安定剤としてロイペプチンを使う前項（２３）
   に記載の方法。 （２９）安定剤としてベンズアミジンを使う前項（２３
   ）に記載の方法。 （３０）安定剤としてα，ａ′−ビピルダールを使う前
   項（２３）に記載の方法。