JPH02100679A - レギュレーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、大豆の発芽期に発現しているリポキシゲナー
ゼ遺伝子由来のレギュレーターに関するものである。

また、本発明は、大豆の発芽期に強く発現しているリポ
キシゲナーゼ（ＥＣ，１，１３，１１，１２）（以下Ｌ
ＯＸと略す）のレギュレーターＤＮＡ配列、及び核ＤＮ
Ａ配列を保持しているプラスミド、そして核プラスミド
で形質転換した大腸菌に関するものである。

本発明のレギュレーターは発芽期の大豆から単離された
りボキシゲナーゼ遺伝子の一部を構成するものであるが
、このレギュレーターは各種植物体における酵素の発現
や酵素生産の促進等を研究するのに大きく貢献するもの
である。

（技術的背景及び問題点） 一般に、ＬＯＸはすべての高等動物、高等植物に存在し
ており、微生物での存在も知られている。

本酵素は、リノール酸、リルン酸、アラキドン酸といっ
た１、４−ペンタジェン構造を有する不飽和脂肪酸に分
子状酸素を直接導入する酵素作用を有している。

ＬＯＸの生化学的性状は、生物種間で違いがみられるも
のの１分子量は８万〜１０万の範囲にあり。

１分子の非ヘム鉄を有する点で共通している。動物にお
いては、プロスタグランジン等を生成するアラキドン酸
カスケードの初発反応を触媒する重要な酵素である。植
物においては１分化、発生。

老化に関する代謝系に関するとの報告がある。また、大
豆かすに含まれるＬＯＸは小麦粉の漂白に実用されてい
る。

また、大豆においては、種子の登熱期に生合成され、乾
燥種子に蓄積する３種のＬＯＸが詳しく研究されている
。（Ａｘｅｌｒｏｄ　Ｂ、　Ｃｈｅｅｓｂｒｏｕｇｈ　
Ｔ、　Ｍ。

Ｌａａｋｓｏ、　Ｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｎ＋
ｏ１．７１．４４１−４５１（１９８１）またそれらに
対するｃＤＮＡが最近単離された。

（Ｓｈｉｂａｔａ、　Ｄ、　５ｔｅｃｚｋｏ、　、１．
　Ｄｉｘｏｎ、　Ｊ、　Ｅ。

１１ｅｒｍｏｄｏｓｏｎ、　Ｍ、　Ｙａｚｄａｎｐａｒ
ａｓｔ、　Ｒ，Ａｘｅｌｒｏｄ、　Ｂ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２．　＋００８０
−１００８５（１９８７））　シかしながら、種子が発
芽する過程で発現しているＬＯＸについては研究は少な
く、既に存在するＬＯＸとの関係は不明であった。また
、それらに対する遺伝子の単離はまったく行われていな
い。

また、発芽する過程で発現しているＬＯＸのレギュレー
ターについても全く不明であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、大豆発芽期のＬＯＸ発現タンパク量が酵
素タンパク質としては極めて多く、全タンパク量の約０
．５％にあたる点に着目した。

このような発芽種子での顕著な発現をコントロールして
いるＬＯＸ遺伝子のクローニングに成功すれば、このコ
ントロール領域即ち、レギュレーターを利用して遺伝子
操作によって他の有用遺伝子と連結させ、これを培養植
物に組込んで１種子の中で有用物質の生産に役立たせる
ことが可能となる。また最近、ＬＯＸ活性と病害虫に対
する抵抗性との関係が示されており、病害虫に対して高
い抵抗性を示す植物を作出することも可能となる。その
意味において、ＬＯＸ　ｍ伝子の解明は産業上重要な意
義を有するものである。

本発明者らは、かかる観点から大豆種子の発芽期に強く
発現しているＬＯＸ遺伝子のクローニングについて検討
を重ねた結果、ｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤ
ＮＡライブラリーから、ＬＯＸの実質的機能部分をコー
ドしているｃＤＮＡ断片を選択してこれをクローニング
し、そのヌクレオチド配列を決定する際に、実質的機能
部分の上流にレギュレーターの存在を確認し、そのヌク
レオチド配列を決定することに成功したのである。

本発明は、大豆の発芽期に発現しているＬＯＸ遺伝子由
来のレギュレーターであり１本発明のレギュレーターの
ＤＮＡ配列は第１図に示される。

また１本発明は１．ＯＸのレギュレーターＤＮＡ配列を
含むプラスミドであり、更には、ＬＯ）ｅのレギュレー
ターＤＮＡ配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌
である。

本発明では、発芽期に強く発現している大豆ＬＯＸの実
質的機能部分をコードしているＤＮＡ配列（遺伝子配列
）を大豆の］、ｏｘということとする。

本発明に於いて大豆発芽期ＬＯＸの「実質的機能部分を
コードしているＤＮＡ配列」という用語は、ＬＯＸの全
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列、核ＤＮＡ配
列を含み、その転写及び翻訳に悪影響を及ぼすことのな
い部分のＤＮＡ配列が付加しているＤＮＡ配列、及びＬ
ＯＸのアミノ酸配列の全てをコードしていないがＬＯＸ
活性を示すのに必要な最小限のアミノ酸配列をコードし
ているＤＮＡ配列、並びに、これらの構造遺伝子にその
発現に必要な調節遺伝子（レギュレーター）及びその関
連遺伝子が付加しているＤＮＡ配列のいずれかを意味す
る。即ち、この用語は、適当な宿主細胞中でＬＯＸ活性
を実質的に発現することができるという意味で機能的に
定義された用語であり、物理化学的に単一の物質を指す
ものではない。

次に、発芽期に強く発現している大豆１ａｘのクローニ
ング及びレギュレーターの塩基配列の決定の実施例を示
す。

（実施例） Ａ、実験に供した試薬 プラスミドベクターｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴは５ＴＲＡ
ＴＡＧＥＮＥ社、制限酵素類、及びライゲーションキッ
トは宝酒造社、（ａ−”Ｐ］ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａ
ｍ社、ラベリングキットはベーリンガー社より購入した
。

し膨」友杯且 大豆種子ＬＯＸｃＤＮＡ　（プラスミドρＭＸ８５）、
及び大豆ゲノムＤＮＡライブラリーは、Ｐｕｒｄｕｅ大
学Ｂ、Ａｘｅｌｒｏｄ博士より提供された。大豆発芽期
ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔｌｌファージ・ベクター
を用いて作成されている）は、　５ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ
社より購入した。

大腸菌Ｙ１０９０株、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、５ＴＲＡ
ＴＡＧＥＮＥ社から購入した。

９２人贋ｊ伐り１襄 通常の培養には富栄養培地としてＬＢ培地（１１２当り
トリプトンＬｏｇ、イースト抽出物５ｇ、食塩５ｇを含
むｐ）１７．２の培地）を用いた。固体培地は液体培地
に１．５％（ｗ／ｖ）の寒天を加えて調製した。

選択圧として抗生物質を加える場合の濃度は、アンピシ
リンが５０μｇ／ｍ１１、テトラサイクリンが１２μｇ
、／ｍＱとなるように加えた。抗生物質は培地滅菌後５
５℃以下になってから添加した。なお、培養の温度は通
常３７℃とした。λファージを加えて培養する場合は４
２℃とした。

Ｄ、実験上の基本操作 １、試薬の略号 本明細書中で使用した試薬の略号を表１に示す。

表１ ２、　アガロースゲル電気泳動法 １％となるようにアガロースをＴＡＥ液中に加熱融解後
、ゲル化させ、試料ＤＮＡを添加してのち、電気泳動装
置ミューピッドを用いて１００ｖで泳動させ、染色マー
カー、ブロモフェノールブルーがゲルの端に達したとき
泳動を止めた。ゲルは、２μ名／ｍＱのエチジウムブロ
マイド液に浸して染色後、紫外線を当ててＤＮＡバンド
を検出した。

Ｅ、　ＤＮＡプローブの作成 大豆登熱期ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＭＸ８５５０μ
ｇを、１００μｇの反応液中で制限酵素Ｐｓｔｌ　５０
ユニツトを用いて切断した後、１％アガロース電気泳動
を行い、ｃＤＮＡ断片とベクタ一部分を分け、ｃＤＮＡ
断片を回収した。ＤＮＡの回収は、ｃＤＮＡ含むゲル断
片を注射器から押し出して、粉砕後フェノール／トリス
を加え、−８０℃にして凍結させた後、遠心分離を行っ
てＤＮＡを水層に移した。この水層に２倍量のエタノー
ルを加えて沈澱させた。沈澱は遠心分離により回収し、
２０μＱのＴＨに溶解した。

ＤＮＡ断片は〔α−”Ｐ）ｄＣＴＰ及びベーリンガー社
ラベリングキットを用いてランダムプライマー法で比活
性Ｉ　Ｘ　１０”ＣＰＭ／μｇのプローブを作製した。

Ｆ、大豆発芽期１ｏｘのｃＤＮＡクローニングと塩基配
Φス主 発芽期ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔｌｌファージ・ベ
クターを用いて作成されている）を希釈して、１００　
μＱ中に２，０ＯＯｐｆｕの濃度のλｇｔｌｌファージ
を含むファージ液を調製した。このファージ液１００μ
Ｑに対して、　ＬＢ培地で一晩、３７℃培養した大腸菌
Ｙ１０９０株１００μＱを加え混合後、３７℃で１５分
間インキュベートしてファージを大腸菌に吸着させた。

０．７％寒天を含むＬＢ培地を融解後５５℃に保った培
地に吸着させたファージ液を加え混合後、ＬＢ寒天培地
（直径９ｃｎ＋のベトリシャーレ）上に流し込み固化さ
せた。固化後、４２℃で４時間保持し大腸菌を生育させ
るとともに、ファージプラークを形成させた。このプラ
ーク上にニトロセルロースフィルターを接触させ、１０
分間放置してファージをこのフィルターに移した。フィ
ルターに位置決めのため注射針で穴を開けた後、フィル
ターを剥がし、０．５Ｍ　ＮａＣＱ、　１，５Ｍ　Ｎａ
ＣＱを含む口紙上に３分間置き、ファージに含まれるＤ
ＮＡをアルカリ変性させた。

その後直ぐに０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＱ　ｐＨ８，０，
１，５Ｍ　ＮａＣＱを含む口紙上に移し５分間中和した
。このフィルターを８０℃で２時間以上ベーキングした
。フィルターを、３　Ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳで６
５℃にて５時間プレウオツシングした後２０％ホルムア
ミドを含むハイブリダイゼーション溶液（フィルター１
枚当り２ｎ＋Ｑ）に入れ、加熱したＤＮＡプローブを加
えて、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション後、ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤ
Ｓを用いて３７℃で洗浄後、フィルターをＸ線フィルム
に当て一２０℃で２０時間露光した後現像した。フィル
ムに現われているポジティブスポットを元のプレートに
合せてポジティブなプラークを同定した。

上記の操作を繰返して、プローブにハイブリッドする４
０個のファージクローンを単離した。

ファージＤＮＡの調製 各ファージを大腸菌Ｙ１０９０株を用いて増殖させた。

即ち、ファージプラークを爪楊枝で突き刺し。

先に付いたファージを大腸菌Ｙ１０９０株（−晩培養し
たもの）１００μＱに懸濁させ、３７℃で３０分間ファ
ージを吸着させた後、１２ｍｕのＬＢ培地と１２０μＱ
の１０％グルコース、１２０μＱのＬＭ　ＭｇＣｌ１２
を含む試験管（直径２ｃｍ　Ｘ長さ２０ｃＩＩ＋）に移
し３７℃で一晩培養した。この培養液０．７５１１１１
２に、ＬＢ培地に懸濁させたＤＥ５２−セルロース（ワ
ットマン社）０．７５ｍＱを加え混合した。

遠心分離を行った後、上清０　、６ｍＱに０　、５ｍＨ
のフェノール／トリスを加えて、５分間振とうする。　
　１００μＱのクロロホルムを加えて混合後、遠心分離
した。この上清に７．５Ｍ酢酸アンモニウム１００μＱ
と６００μＱのイソプロパツールを加え、　−８０℃で
２０分分間−た。遠心分離を行い、沈澱を回収した。沈
澱を８０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、２０μＱの
水に溶解した。

クローンのサブクローニング 得られたλＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した後プラスミド
ベクターｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ−ＰＫＳ＋　（以下ｐ
ＫＳ＋と略す）のＥｃｏＲＩ部位に導入した後、大腸菌
ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。即ち、　λＤＮＡ液５μ
Ｑに水３μＱ、制限酵素緩衝液１μＱ、ＥｃＯＲ１１μ
Ｑ（１０ユニツト）ヲ加工、３７℃で３時間反応後、１
分間１００℃で処理して酵素を失活させた。この反応液
３μＱにｐＫｓ＋　（２５ｎｇ、１μＱ）を加え、宝酒
造のライゲーションキットによってライゲーションを行
わせた（終審量３０μＱ）。

このライゲーション液を用いてＨＡＮＡＨＡＮ法（ＨＡ
ＮＡＨＡＮ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６
６、５５７−５８０（１９８３））で調製した大腸菌コ
ンピテントセル（０８５１株）を形質転換した。即ち、
凍結コンピテントセル（−８０℃）　２０μＱを氷上で
溶解後、１μＱのライゲーション液を加え、氷上で３０
分間装いた後、４２℃で９０秒間ヒートショックを行っ
た。１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏい２０ｍＭグルコースを含むＬ
Ｂ培地を８００μＱ加えた後、３７℃で１時間培養した
。これをアンピシリン、テトラサイクリン、８０μｇ／
ｒａＱ５−ブロモー４〜クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド、２０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドを含むＬＢ寒天培地にまき３７℃
で一晩培養した。培地上に現れた白色のコロニーを拾い
上げ、（、Ｂ培地で培養した後、３０％グリセリンを加
えて一２０℃で保存した。

クローンの解析 得られたクローンが同一種類かどうかを調べるために、
ドツトハイブリダイゼーション法を行った。クローンか
らのｃＤＮＡ断片の回収及び３２ｐによる標識は、Ｅｃ
ｏＲＩ消化後、上記の方法で行った。

λＤＮＡ液各１μｇをニトロセルロースフィルター上に
スポットした後、上記のプラークハイブリダイゼーショ
ン法と同様にしてフィルターを処理した。ハイブリダイ
ゼーションは５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼ
ーション液を用いた点と、ハイブリダイゼーション後、
０．２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＯＳを用いて６５℃でフィ
ルターを洗浄した点を除いて他は同じ条件で行った。

１つのクローンからのプローブでハイブリッドしたクロ
ーンを１つのグループとしてまとめ、ハイブリッドしな
かったものの中から１つを選び、ハイブリダイゼーショ
ンを行い順次分類していくと、３つのグループに分れる
ことがわかった。これらのグループ名を５ＧＬ−Ａ、　
５ＧＬ−Ｂ、　５ＧＬ−Ｃと名付けた。それぞれの中で
最も長いｃＤＮＡを含むものを組み込んだプラスミドは
、ｐｓ５１４、ＰＳ５０１、ρ５１７４と名付けた。ま
た、それぞれのｃＤＮＡは、５５１４．５５０１．５１
７４と名付けた。

ゲノムＤＮＡのクローニング 上記プラークハイブリダイゼーションと同様に大豆ゲノ
ムＤＮＡライブラリーより８５１４をプローブとして、
これにハイブリッドするゲノムＤＮＡ　を単離した。即
ち、ｐｓ５１４からのｃＤＮＡの回収、３２ｐによる標
識は、クローンの解析で示した方法によった。

また、ハイブリダイゼーションの条件も、クローンの解
析に示した方法によった。この方法によって、このプロ
ーブに強くハイブリッドする２つのファージクローンを
得た。それぞれ、λ５Ｇ１４、λ５Ｇ１９３と名付けた
。

した。これを、クローンのサブクローニングで述べた方
法でＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡ断片をサブクローニング
した。これらは、ＰＳＧ１４−４、ｐＳＧ１４−２ｃｍ
　ｐｓＧ１４−１，５、ｐｓＧ１４−２ｄ、　ｐｓＧ１
４−１、ｐｓＧ１４−２ａ、　ｐｓＧ１４−２ｂ、ｐｓ
Ｇ１４Ｋｐ、　ｐｓＧ１４Ｈ１ＰＳＧ１３９Ｋｐと名付
けた。ＬＳＧ１４、λ５Ｇ１９３の制限酵素地図とサブ
クローニングされた部分は、第２図に示す。

大腸菌の形質転換 上記で得られた各プラスミドｐｓ５１４、ｐｓＧ１４−
４、ｐｓＧ１４−２ｃ、　　ｐｓＧ１４−１，５．　ｐ
ｓＧ１４−２ｄ、　ｐｓＧ１４−１、ｐＳＧ１４−２ａ
、　ｐｓＧ１４−２ｂ、　ｐｓＧ１４Ｋｐ、　ｐｓＧ１
４Ｈ，ｐｓＧ１３９Ｋｐは、それぞれ常法によって大腸
菌Ｙ１０９０株に挿入し、形質転換し、大腸菌ＤＨ５α
／ｐｓ５１４、大腸菌ＤＨ５α／ｐｓＧ１４−４、大腸
菌ＤＨ５ａ　／　ＰＳＧ１４−２ｃ、大腸菌ＤＨ５ａ　
／ｐｓＧ１４−１．５、大腸菌ＤＨ５ｒｘ　／　ｐｓＧ
１４−２ｄ、大腸菌ＤＨ５α／　ｐｓＧ１４−１、大腸
菌ＤＨ５ｃｔ　／　ｐｓＧ１４−２ａ、大腸菌ＤＨ５α
／　ｐｓＧ１４−２ｂ、大腸菌ＤＨ５ａ　／　ｐｓＧ１
４Ｋｐ、大腸菌ＤＨ５α／ＰＳＧ１４Ｈ１大腸菌ＤＨ５
α／ｐｓＧ１３９Ｋｐを得た。

ゲノムＤＮＡの塩基配列の決定 各クローンの塩基配列は、ジデオキシ法によって決定し
た。即ち、Ｐｒｏｍｅｇａ社のプリージョンキットを用
いてプリージョンを行った後、宝酒造社の塩基配列キッ
トを用いて配列決定を行った。

レギュレーターの塩基配列の決定 ｐｓＧ１４−４　をＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ断片を
ジデオキシ法で配列決定を行い、最初の塩基（１）から
ＬＯＸ蛋白質の開始を示すコドンが出現する前の塩基（
１１０４）までがレギュレーターの塩基配列と決定した
。レギュレーターの塩基配列は第１図に示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のりボキシゲナーゼ遺伝子由来のレギュ
レーターのＤＮＡ配列を示す図で、第２図はλＤＮＡか
らクローニングしたλ５Ｇ１４及びλ５Ｇ１９３の制限
酵素地図とサブクローニングされた部を示す図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大豆の発芽期に発現しているリポキシゲナーゼ遺伝
   子由来のレギュレーター。 ２、第１図に記載の配列を有する第１項に記載のレギュ
   レーターＤＮＡ配列。 ３、第２項に記載のレギュレーターＤＮＡ配列を含むプ
   ラスミド。 ４、第２項に記載のレギュレーターＤＮＡ配列を含むプ
   ラスミドで形質転換した大腸菌。