JPH02104276A - 無菌培養方法及び培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、粘稠カルチャー（培養液）を培養するのに殊
に適当な培養方法及び装置に関する。

好気培養において、培養中のカルチャーの充分な通気を
なすことが非常に重要である。カルチャーが粘稠である
とき、例えばカルチャーが糸状菌を含むときには、充分
な通気をなすことは困難である。なんとなれば、カルチ
ャーへ供給される酸素含有ガスが、液相へ効率的に入り
うる小さい気泡に分裂するのが困難であるからである。

本発明によれば、廃ガスを連続的に放出される培養器中
で機械的攪拌下にモノカルチャーを無菌１合資する方法
であって： モノカルチャーの一部分を培養器の外の隔室中へ連続的
に送り込み；そして実質的に（屯粋な酸素を、ベンチュ
リーの首部においてまたはカルチャーがベンチュリーを
通過する前に培養器の外のカルチャー中へ射出し：射出
後、カルチャーを培養器へ連続的に返還し；いずれの時
点における培養器外のカルチャーの量もカルチャーの全
１１の５％を越えることがなく；かつ培養器の外のカル
チャー中へ射出される酸素の容積よりも大きな容積の空
気及び／または不活性ガスを培養器内のカルチャー中へ
射出することを特徴とする上記無菌培養方法が提供され
る。

本発明によれば、本体中に機械的攪拌手段、栄養添加手
段、製品取出手段及び廃ガス放出手段を備えた培養器で
あって： （イ）その培養器は、外部隔室を有し、その外部隔室が
その中に含まれるカルチャー中へ、ベンチュリーの首部
のところで、またはカルチャーがペンチエリ−を通過す
る前に、実質的に純粋な酸素を射出する手段を備え； （ロ）その培養器の本体からカルチャーの一部分を上記
隔室中へ送り、その後に本体へ返還するための接続手段
が備えられており； （ハ）上記隔室の容積は、いずれの時点でも培養器中の
カルチャーの全体量の５％未満が隔室中に存在しうるよ
うな容積であり；そして（ニ）培養器は、その本体中の
カルチャーに空気及び／または不活性ガスを１またはそ
れ以上の位置で、隔室中のカルチャーへ供給される酸素
よりも大きな量で射出するためのガス供給手段を備えて
いる； ことを特徴とする上記培養器も提供される。

本発明の方法は、回分式プロセスまたは連続式プロセス
で実施できる０本発明の方法連続式で実施するときには
、装置は、栄養の連続添加手段及び製品の連続射出手段
を有する。回分式または連続式のプロセスのためには、
装置は廃ガスの連続放出、好ましくは装置への外部微生
物の介入を防ぐことによって無菌性（培養目的微生物以
外について）を維持するに足る速度での廃ガスの連続放
出、のための手段を有する。

適当には、外部隔室は管ループであり、接続手段は、培
養器の本体の壁に設けられた開口（複数）からなり、そ
れらの開口に管ループの両端部が接続される。好ましく
は、カルチャーは培養器の底近くの低い方の開口を介し
て、管ループ中に配管されたポンプによって引き出され
、そして、培養器の頂部近くの上方の開口を介して培養
器へ返還される。実質的に純粋な酸素は、外部隔室中を
上向きに流れているカルチャー中へ射出されるのが適当
である。好ましくは、酸素はペンチエリ−装置の首（ス
ロート）のところで射出されるが、酸素は、カルチャー
がペンチエリ−を通過する前にカルチャー中へ射出され
てもよい。ベンチュリーは、好ましくは、実用的にポン
プ排出口にできるだけ近いところで管ループ中に配置さ
れる。

酸素を隔室内流動中のカルチャー中へ、典型的にはベン
チュリーの酸部′のところで射出する場合、その結果性
じる酸素気泡と液体との混合物は、大きな剪断力を受け
る。これは、培養器へ返還されるカルチャー中の気泡の
寸法を低減させる効果をもつ、ベンチュリー系は、欧州
特許明細書第１５２２０１号及び第１５２２０２号に記
載されたものと類僚であるのが適当である。

未発明方法は、いずれの培養（発酵）にも応用できるが
、使用微生物がフサリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒ
ｉｕｍ　Ｉａｔｅｒｉｔｉｕｓ）またはアスペルギルス
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）のよう
な糸状菌である場合に最も有用である．しかしながら、
本発明方法は、メチロフィルス・メチロトロフス（Ｍｅ
ｔｈ−ｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ
ｕｓ）のようなその他の微生物を使用する培養にも応用
しうる。

カルチャー全体のうちで、いずれの時点においても隔室
中に存在するものの割合は、５％以下であるべきであり
、典型的には１〜２％の範囲である。

空気及び／または不活性ガスは、培養器の本体中のカル
チャー中へ、隔室中のカルチャー中へ射出される量より
も大きな量で、射出される。典型的には、空気及び／ま
たは不活性ガスは、培養器中の１個所よりも多くの個所
で射出され、その大部分が頂部に近いところで射出され
る．空気及び／または不活性ガスの合計量は、酸素（外
部隔室）の量よりも著しく多いのが適当であり、はとん
どの場合に、培養微生物の種類に応じて２０倍までの量
である。その空気及び／または不活性ガスは培養器中で
の循環を助長するが、その主目的は培養中に生成される
酸素ガスをカルチャーから取り除くことである。それが
取り除かれなければ、炭酸ガスは培養に有害な影響を与
える。空気及び／または不活性ガスは、炭酸ガスをカル
チャー内を上方へカルチャーより上の培養器空間まで運
び、その空間中でカルチャーから空気及び／または不活
性ガスは（炭酸ガスと共に）脱離する．不活性ガスの存
在は、カルチャーより上の炭酸ガスの圧力を低減させ、
かくして、溶存する炭酸ガスの量を低減させる。

カルチャーから脱離したガスは、管を介して培養器から
脱出させるのが適当であり、その管は、ガスの流動に抗
して培養器に外部微生物が侵入するのを防止するのに充
分に狭小な管であるか、またはそのような防止をするの
に充分な速度でガスを流出させるのに足る狭小な断面を
有する管である。このような管は培養器内に無菌性を維
持可能とする。

カルチャーに通気するのに実質的に純粋な酸素を使用す
ることは、カルチャーによって占有される培養器の本体
の割合を、空気を用いてカルチャーに通気する慣用培養
法と比較して、増大することを可能にする．この理由は
、不活性な窒素が酸素と共に供給されないので、カルチ
ャーの通気のためにカルチャーへ供給される気体の容積
が、減少されるからである。

培養器でのカルチャーの循環は、機械的攪拌装置を用い
ることによって主に達成される。循環は、培養器に内部
区画を（円筒形培養器の場合には一つの円筒形同軸区画
を）設けて内部ドラフト管を形成することによって、改
善されうる．このようにすると、培養器の外壁に近いと
ころで下向きに流れ、ドラフト管内を上向きに流れる規
則的な流動パターンをカルチャーに生じさせることがで
きる。

本発明は、培養（特に粘稠カルチャーの培養）について
の多くの利点をもたらすが、そのうち下記のものは特に
重要である。

１、！ｌｉ質移動制限の軽減からもたらされる増大した
乾燥細胞重量及びそれに伴なう増大した生産性。

２、培養器内を通過する気体のより小さい容積の結果と
して培養器において必要とされる気体頂部空間の減小か
らもたらされる増大した液体内在量及びそれに伴なうよ
り高い生産速度（例えば２０％高い）。

本発明を添付図により以下説明する。

第１図は、外壁１、基部２及び頂部３を有する円筒状培
養器を示す。このものは、２枚の羽ＩＩ５及び６を有し
、上向き流発生機として作用する攪拌機４を備えている
。空気及び／または不活性ガスは、パイプ７ａ及びスパ
ージ環８、及び／またはパイプ７ｂを介して培養器へ導
入される。他方、栄養はパイプ９を介して導入され、カ
ルチャーはパイプ１０を介して取り出される。隔室は、
ポンプ１２、酸素供給パイプ１３及びベンチュリー１４
を有する管ループ１１である。管ループ１１は培養器の
本体と開口１５及び１６を介して連結している。酸素通
気されたカルチャーはノズル装置１７で培養器の本体へ
返還されうる。廃ガスは、狭さく部１９を有するパイプ
１８で培養器から脱出しうる。培養器しま、図面に示さ
れていないが冷却手段をも有する。

第２図は、第１図のものと、類似であるが、ドラフト管
の形態の円筒状内部区画２０を含む培養器を示す。

第１図及び第２図の培養器の運転は相互に類似である。

空気及び／または不活性ガスと栄養とは、それぞれパイ
プ７ａ、マｂ及び９を介してＩ＠養器・＼連続的に供給
され、そしてカルチャーはパイプ１０を介して培養器か
ら連続的に取り出される。またカルチャーは開口１５を
介して培養器から、ポンプ１２によって連続的に管ルー
プｌｌ中へ取り出される。

管ループ１１において、純粋酸素が取出カルチャー中へ
、ヘンチュリー装置１４の首（スロート）部分でパイプ
１３を介して射出され、ここでカルチャー中の酸素は分
散して微細気泡となる。酸素通気されたカルチャーは、
開口１６及びノズル装置１７を介して培養器の本体中の
カルチャーへ返還される。

パイプ７ａ及びスバージ環８を介して培養器の本体へ導
入される空気及び／または不活性ガスは、培養中に生成
する炭酸ガスを同伴してカルチャーの表面１−Ａまで上
昇する。パイプ７ｂを介して培養器の本体へ導入される
空気及び／または不活性ガスは、表面Ａ−Ａの上の空間
を満たし、炭酸ガス分圧を低い水準にまで低減する。表
面Ａ−Ａにおいて、ガスはカルチャーから脱離し、パイ
プ１８を介して大気へ脱出する。パイプ１８中で、脱出
ガスは狭さく部１９を通過することによって加速され、
外部微生物がガス流動に抗して培養器へ侵入するのを防
止する速度になる。区画２０が存在する場合、２０によ
って形成された内部ドラフト管内の中央部を、スバージ
環８からの空気流によって助長されて上昇するカルチャ
ーと、ドラフト管の外側の培養器の側壁１近くを、ノズ
ル装置１７からの酸素通気カルチャーの下方向流によっ
て助長されて降下するカルチャーと、からなる規則的流
動パターンが発生する。

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。

実施炭上 第１図に示され、上記説明された培養器で、フサリウム
・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　１ａｔｅｒｉｔｉ
ｕｔＢ）のカルチャーを連続培養法により培養（発酵）
した。培地は下記の組成であった。

培地 グルコース　　　　　　３０ｇ／／２（供給物）存在微
量元素Ｐ、　Ｆｅ、　Ｃａ、　Ｍｇ、　Ｋ、門ｎ、　Ｃ
ｕ−、Ｚｎｐ　、　Ｋ　　　　　　　　　５００〜１１
０００ｐｐ”　　　　　　　　　　　　　　１００１０
０ｐｐ　　　　　　　　　　　　　　２５ｐｐｍＦｅ、
　Ｍｎ、　Ｃｕ、　Ｚｎ　　　　　　　＜　５ｐｐｍ培
養のための操作条件は下記の通りであった。

ｐｌ＋　　　　　　　　　　　　　６．０温度　　　　
　　　　　　　２９．５°Ｃ加圧　　　　　　　　　　
　５　ρｓｉｇ容器容積　　　　　　　　　２５ＯＮ ポンプ流量　　　　　　　８醒／時（推定）ポンプ動力
（入力）１８００−（推定）攪拌速度　　　　　　　　
　２００　ｒｐｍ攪拌動力（入力）　　　　　　　２４
０　　Ｗ不活性ガス（窒素）パージ流量（合計）６．６
Ｎが７時 （このうちの１０％はカルチャーの）くルクで、残部は
頂部空間を経て排出された） 培養は１２時間継続した。その時間後に下記の培養成績
特性が達成された。

乾燥細胞重量　　　　　　　　２５ｇ／Ｑ稀釈率　　　
　　　　　　　　０．１２／時生産性　　　　　　　　
　　　３ｇ／ｊ！／時酸素供給　　　　　　　　　　０
．９２　ｋｇ／時酸素要求　　　　　　　　　　０．５
５　ｋｇ／時酸素利用効率　　　　　　　　６０％ 炭素変換効率　　　　　　　　６２％ 炭素！（グルコース）基準細胞収率　６０％同し培養器
、カルチャー及び条件を用いての別の実験においては、
実質的に純粋な酸素を用し）た場合、及び実質的に純粋
な酸素を用いずに慣用の通気及び攪拌条件下で操作した
場合に、それぞれ下記の成績が達成された。

乾燥細胞型！　（ｇ／ｌ）　　　　２９．４　　　２９
．０生産性（ｇ／ｌ・時）　　　　　　４．８　　　　
４．３瞬間増殖速度（毎時）　　　　　　０．２６　　
　０．２２これらの結果から、本発明の使用によって高
生産性培養（発酵）がもたらされることが判る。

実施桝Ｉ 第１図に示し、上記説明した培養器において、メチロフ
ィルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ
＠ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）のカルチャーを連続培
養法によって培養した。この実験においては、槽内液体
存在量を最大限とし、第１の場合、培養器を慣用法（ボ
ンプループを閉鎖して、酸素要求量を攪拌及び空気通気
によって供給する方式）で運転し、第２の場合、ボンプ
ルーブを用いて酸素通気カルチャーを作り、これを攪拌
することにより運転した。

それぞれの最大液体存在量とは、培養器の内容物が容器
の上部から泡立って脱出することなく培養を一定に制御
できる液面水準であると見做した。

上記第１及び第２の場合の運転条件を下表に示す。

表 ｐＨ’６．６　　　　　　６．６ 温度　　　　　　　　３９°Ｃ３９’Ｃ加圧　　　　　
　　　１５ｐｓｉｇ　　　　５９５１ｇポンプ流１　　
　　　　　　　　１０．５＋ｆ／時（推定）ポンプ動力
（入力）　　　−１２００〜１６００Ｗ（推定）攪拌速
度　　　　　　３５０ｒｐｎ　　　　１６０ｒｐｍ攪拌
動力（人力）　　　１２５０Ｗ　　　　４００Ｗ空気流
！ｉ　　　　　　　１８Ｎポ／時　　−Ｎａパージ流１
　　　　　　　　　　７．６Ｎｎｆ／時稀釈率　　　　
　　　０．ｌ／時　　　０．ｌ／時最大液存在量　　　
　２００　ｆｆｉ　　　　２４０　ｊ！容器容積　　　
　　　２５０１　　　２５０　Ｎ容器容積利用率　　　
８０％　　　　９６％両方の操作モードにより同様な培
養成績（下記）が得られた。

乾燥細胞重量　　　　　　　　　１８　ｇ　／　１炭素
変換効率　　　　　　　　　５０％メタノール基準細胞
収率　　　　３２％これらの結果から、培養器（培養槽
、あるいは発酵槽）の有効容積利用率の著しい向上が本
発明により達成できることが判る。この場合に、容積利
用率は２０％だけ上昇し、かくして同一の容器での生産
速度を２０％向上させた。この増加を達成するに際して
、培養成績に対する有害な影響は何ら見られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による培養器のうちの単純な形態のも
のの概略樅断面図である。 第２図は、本発明による培養器のうちの別の形態の、よ
り精巧なものの概略縦断面口である。 培養器外壁−１，攪拌機−４、 空気及び／または不活性ガス導入パイプ−７８及び７ｂ
。 栄養導入パイプ−９，カルチャー取出パイプ　１０゜管
ループ　１１．　　　　酸素供給パイプ−１３゜ヘンチ
ュリー−１４，廃ガス脱出バイブ＝−＝１８゜円筒状内
部区画−＝２０ （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、廃ガスを連続的に放出させる培養器中で機械的攪拌
   下にモノカルチャーを無菌培養する方法であって： モノカルチャーの一部分を培養器の外の隔室中へ連続的
   に送り込み；そして実質的に純粋な酸素を、ベンチュリ
   ーの首部においてまたはカルチャーがベンチュリーを通
   過する前に培養器の外のカルチャー中へ射出し；射出後
   、カルチャーを培養器へ連続的に返還し；いずれの時点
   における培養器外のカルチャーの量もカルチャーの全体
   量の５％を越えることがなく；かつ培養器の外のカルチ
   ャー中へ射出される酸素の容積よりも大きな容積の空気
   及び／または不活性ガスを培養器内のカルチャー中へ射
   出することを特徴とする上記無菌培養方法。 ２、実質的に純粋な酸素を、培養器外で上向きに流動し
   ているカルチャー中へ射出する請求項１記載の方法。 ３、実質的に純粋な酸素を培養器外のカルチャー中へ、
   ベンチュリーの首部のところで射出する請求項１または
   ２記載の方法。 ４、カルチャーは糸状菌のカルチャーである請求項１〜
   ３のいずれかに記載の方法。 ５、本体中に機械的攪拌手段、栄養添加手段、製品取出
   手段及び廃ガス放出手段を備えた培養器であって： （イ）その培養器は、外部隔室を有し、その外部隔室が
   その中に含まれるカルチャー中へ、ベンチュリーの首部
   のところで、またはカルチャーがベンチュリーを通過す
   る前に、実質的に純粋な酸素を射出する手段を備え； （ロ）その培養器の本体からカルチャーの一部分を上記
   隔室中へ送り、その後に本体へ返還するための接続手段
   が備えられており； （ハ）上記隔室の容積は、いずれの時点でも培養器中の
   カルチャーの全体量の５％未満が隔室中に存在しうるよ
   うな容積であり；そして （ニ）培養器は、その本体中のカルチャーに空気及び／
   または不活性ガスを１またはそれ以上の位置で、隔室中
   のカルチャーへ供給される酸素よりも大きな量で射出す
   るためのガス供給手段を備えている； ことを特徴とする上記培養器。 ６、隔室は管ループであり、そして接続手段は、培養器
   の本体の壁に複数の開口を設け、それらの開口に管ルー
   プの両端部を接続してなるものである請求項５記載の培
   養器。 ７、隔室の容積は、培養器中のカルチャーの全量のうち
   で隔室中に存在しうるものの割合がいつも１〜２％の範
   囲内であるような容積である請求項５または６記載の培
   養器。 ８、廃ガス放出手段は、外部微生物が廃ガスの流動に抗
   して培養器中へ入り込むのを防止するのに足りる狭小な
   パイプであるか、または、そのような防止するのに足り
   る速度での廃ガスの流出を生じさせるに足りる狭小断面
   を有するパイプである請求項５〜７のいずれかに記載の
   培養器。 ９、本体がその中での循環を向上させるための内部区画
   を備えている請求項５〜８のいずれかに記載の培養槽。