JPH02107190A - 癌胚抗原の構成員の遺伝情報を指定するｃＤＮＡ類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌胚抗原（ＣＥ　Ａ）の抗原族のペプチドの
配列の遺伝情報を指定する（ｃｏｄｅ　　ｆｏｒ）核酸
配列に関する。

癌胚抗原は、最初に、ゴールド（Ｇｏ　ｌ　ｄ）および
フリートマン（Ｆｒｅｅｄｍａｎ）、ジャーナル・オブ
・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、１２１，４３９−４６２（１９６
５）に記載された。ＣＥＡはほぼ２００゜０００の分子
量をもち、５０〜６０重量％が炭水化物である糖タンパ
ク質として特性付けられる。

ＣＥＡは正常のヒト胎児の発育の間に存在するが、正常
の大人の腸管中に非常に低い濃度で存在する。

それはある数の異なる肺癌により産生され、そして分泌
される。

ＣＥＡは結腸直腸癌の患者の管理のための臨床的に有用
な腫瘍マーカーである。ＣＥＡは感受性イムノアッセイ
法を使用して測定することができる。ＣＥＡの外科前の
血清レベルが増加したとき、正常範囲への外科後の血清
ＣＥＡの低下は、典型的には、腫瘍の切除が成功したこ
とを示す。外科後のＣＥＡレベルが正常へに戻らないこ
とは、しばしば、腫瘍の切除が不完全であるか、あるい
は追加の腫瘍部位が患者において存在することを示す。

正常レベルへ戻った後、引き続く血清ＣＥＡレベルの急
速な上昇は、通常、転移の存在を示す。

正常レベルからの外科後のより遅い上昇は、最もしばし
ば、前に検出されなかった新しい一次腫瘍の存在を示す
と解釈される。こうして、結腸癌の患者の外科後の管理
は、ＣＥＡの測定により促進される。

ＣＥＡは抗原族のｌ員である。このため、現在利用可能
な方法によりＣＥＡのイムノアッセイは、ＣＥＡがいく
つかの潜在的に反応性の抗原のただ一つであるという事
実によって複雑となる。文献に少なくとも１６のＣＥＡ
様抗原が記載れてきている。これらのあるものは異なる
研究者らにより記載された同一の抗原であるように思わ
れるので、異なる抗原の実際の数はこの数より多少少な
い。

それにもかかわらず、腫瘍により解放されるＣＥＡのイ
ムノアフセイを潜在的に妨害し得る、交差反応性抗原の
複雑な列が存在する。ＣＥＡ様抗原の血清レベルは、多
くの癌以外の状態、例えば、炎症性肝臓の病気Ｊｉよび
また喫煙者において増大する。癌患者の状態の管理のた
めのイムノアッセイは、これらの他のＣＥＡ様抗原によ
り妨害されないことが重要である。逆に、イムノアフセ
イにより抗原を区別できることが重要である。なぜなら
、異なる腫瘍のタイプはＣＥＡの異なるタイプを侵先的
に発現することができるという可能性があるからである
。そのような場合、異なるタイプのＣＥＡを信頼性をも
って測定できることのより、癌の異なるタイプを診断し
、あるいはより首尾よく処置する手段を提供することが
できる。

ｒＣＥＡ族」の構成員は、いくつかの抗原決定基を共有
する。これらの共通のエピトープは抗原の族の構成員の
区別において有用でなく、そしてそれらを認識する抗体
は腫瘍特異的ＣＥＡレベルの測定のためほとんど有用で
はない。

米国特許第３，６６３，６８４号は、［癌胚抗原および
ヨウ素を使用する診断法」と題し、ＲＩＡにおいて使用
するためのＣＥＡの精製および放射性ヨウ素化に関する
。

米国特許箱３，６９７，６３８号は、ＣＥＡが抗原の混
合物（この場合において成分ＡおよびＢ）であることを
記載している。米国特許箱３．６９７．６３８号は、各
成分を分離し、そして放射性ヨウ素化する方法およびそ
れらの特別のＲＩＡにおける使用を述べている。

米国特許箱３，８５２．４１５号は、「癌腫抗原の決定
における血漿抽出物の代用物として、ラジオイムノアッ
セイにおいて使用する組成物」と題し、ＣＥＡ　　ＲＩ
Ａのための希釈剤として血漿の代用物として、ＥＤＴＡ
およびウシ血清アルブミンを含有する緩衝液の使用にに
関する。

米国特許箱３，８６７．３６３号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離、それらの標識付け
およびＲＩＡにおけるそれらの使用に関する。

米国特許箱３．９２７，１９３号は、「放射性標識した
抗体の腫瘍の局在化」と題し、体全体の腫瘍の映像にお
ける放射性標識した抗ＣＥＡ抗体の使用に関する。

米国特許箱３，９５６．２５８号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡ成分成分上びＢの分離に関する。

米国特許箱４，０８６，２１７号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡ成分成分上びＢの分離に関する。

米国特許箱４，１４０，７５３号は、「診断の方法およ
び試薬」と題し、ＣＥＡ−５１と呼ぶＣＥＡ異性体の精
製およびＲＩＡにおけるその使用に関する。

米国特許箱４，１４５，３６６号は、「癌腫抗原の異性
体」と題し、抗原ＣＥＡ−３ｌに関する。

米国特許箱４，１８０，４９９号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡ成分Ｂを産生する方法を記載している。

米国特許箱４，２２８，２３６号は、［癌腫抗原を産生
する方法」と題し、ＣＥＡの産生のためのＬ　Ｓ　−］
、　７４　ＴまたはＬＳ−１８０の確立された細胞系ま
たはそれらのクローンまたは誘導体に関する。

米国特許箱４．２７２．５０４号は、「癌腫抗原のアッ
セイのための抗体吸着した支持体の方法」と題し、ＣＥ
Ａのラジオイムノアッセイの２つの概念に関する。１つ
は、米国特許箱４．２７２゜５０４号はｐＨ５において
６５〜８５°Ｃに加熱することにより試料を予備処理し
て、異質タンパク質を沈澱させ、そして排除することに
関する。第２に、それは分析物および標識したＣＥＡト
レーサーを補足する手段として固相の抗体（ビーズまた
は管上）の使用に関する。

米国特許箱４．２９９，８１５号は、「癌腫抗原の決定
」と題し、ＣＥＡ試料を水で希釈し、そしてタンパク質
の沈澱が起こる温度以下の温度に加熱することによって
予備処理することに関する。

次いで、予備処理した試料をＲＩＡｌＥＩＡ、ＦＩＡま
たは化学発光のイムノアッセイを使用してイムノアッセ
イする。

米国特許箱４．３４９，５２８号は、「高分子量の癌腫
抗原について特異的なモノクローナルハイブリドーマ抗
体」と題し、１８０ｋＤのＣＥＡと反応するが、他の分
子量の形態と反応しないモノクローナル抗体に関する。

米国特許箱４，４６７．０３１号は、「癌腫抗原のため
の酵素−イムノアッセイ」と題し、ＣＥＡのためのサン
ドインチ酵素イムノアッセイに関し、ここで２つの抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体の第１を固相に取り付け、そし
て第２モノクローナル抗体をベルオキシグーゼと接合す
る。

米国特許箱４，４８９，１６７号は、［癌の検出の方法
および組成物」と題し、ＣＥＡがアルファ酸糖タンパク
質（Ａ　Ｇ）と抗原決定基を共有し、この糖タンパク質
はヒ］・血清の正常成分である。

ここに記載する方法は、１つの抗体としてＡＣを認識す
る抗体およびＣＥＡを認識するが、ＡＧを認識しない他
の抗体を使用する、固相サンドイッチイムノアッセイに
関する。

米国特許箱４，５７８，３４９号は、［癌胚抗［（ＣＥ
Ａ）のだめのイムノアッセイ」と題し、ＣＥＡイムノア
ッセイにおける希釈剤として高い塩を含有する緩衝液を
使用することに関する。

欧州特許（ＥＰ）ｌ　１３０７２−Ａ号は、血液試料を
癌腫抗原についてアッセイすること−シリカゲルと一緒
のインキュベーションによる妨害物質の除去後」と題し
、シリカゲルで予備処理することにより妨害物質を血漿
試料の血清から除去することに関する。

欧州特許（ＥＰ）１０２００８−Ａ号は、「癌の診断の
癌腫抗原−電気泳動しないで過塩素酸の抽出物から産生
された」と題し、電気泳動工程を使用しないで、過塩素
酸からＣＥＡを調製する手順に関する。

欧州特許（ＥＰ）９２２２３−Ａ号は、［細胞質ゾルま
たは組織中の癌腫抗原の決定−後退の治療の抑制および
早期の認識」と題し、血清または血漿中ではなく、腫瘍
組織それ自体の細胞質ゾル中におけるＣＥＡのイムノア
ッセイに関する。

欧州特許（ＥＰ）８３１０３７５９．６号は、「癌、と
くに乳癌における予測試験として細胞質ゾル−ＣＥＡ−
測定」と題し、欧州特許（Ｅ　Ｐ）９２２２３−Ａ号に
類似する。

欧州特許（ＥＰ）８３３０３７５９号は、［癌腫抗原に
対して特異的なモノクローナル抗体」と題し、ｒＣＥＡ
特異的」モノクローナル抗体およびイムノアッセイにお
けるそれらの使用に関する。

ＷＯ８４１０２９８３号し；ｉ、「特ｒ４的ＣＥＡ−族
抗原、それらに対して特異的な抗体およびそれらの使用
法」と題し、試料中の個々の成分の各々を選択的に測定
するように設計されたイムノアッセイにおける、ＣＥＡ
−胎便（ＭＡ　）−およびＮＡＣ−特異的エピト−ブに
対するモノクローナル抗体の使用に関する。

以上のＣＥＡアッセイのすべては、選択する完全な抗原
で動物を免疫化することにより、発生したモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体を利用する。それらの
いずれも、種々の抗原の独特−次配列の検出のために、
配列特異的抗体をつくという考えを扱っていない。それ
らは、自然産生物の合成ペプチドまたは断片に対する抗
体を産生ずるために、−次アミノ酸配列を使用すること
を包含しない。それらは、ＣＥＡ族の構成員を区別する
ために一次アミノ酸配列を使用する概念を包含しない。

それらのいずれも、−次配列を決定するために使用する
遺伝子を分離するために、ＤＮＡまたはＲＮＡのクロー
ンを使用することを包含しない。

置市において、ＣＥＡ遺伝子族の構成員を発現する細胞
を発生させるためにＤＮＡまたはＲＮＡクローンを使用
すること、あるいは特定のモノクローナル抗体の発生ま
たはスクリーニングにおいてこれらの細胞を使用するこ
とを包含する教示は存在しない。

定義 核酸の略号 Ａ　　　　アＴニン Ｇ　　　　グアニン Ｃシトシン Ｔ　　　　チミジン アミノ酸の略号 ｓｐ ｓｎ ｈｒ ｅｒ ｌｕ １ｎ Ｐｒ。

ｙｌ ｌａ ｙｓ ａｔ ｅｔ ｉｅ ｙｒ ｈｅ 　ｒ　ｐ ｙｓ 　ｉ　ｓ ウラシル アスパラギン酸 アスパラギン スレオニン セリン グルタミン酸 グルタミン プロリン グリツツ アラニン システィン バリン メチオニン イソロイシン チロシン フェニルアラニ トリブトファン リジン ヒスチジン Ａｒビ　　アルギニン ヌクレオシド　−　糖部分（ペントース）、ホスフェー
トおよび窒素の複素環族塩基を含有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡのモノマー単位。この塩基グリコシドの炭素（ペン
トースのビ炭素）を経ては糖部分に結合しており、そし
て塩基と糖との組み合わせはヌクレオシドと呼ばれる。

この塩基はヌクレオチドを特徴づける。４つのＤＮＡ塩
基はアデニン（ｒＡＪ　）、グアニン（「Ｇ」）、ント
シン（「Ｃ」）、およびチミジン（ｒＴＪ　）である。

４つのＲＮＡ塩基はＡ、ＧＸＣおよびウラシルて「Ｕ」
）である。

ＤＮＡ配列　−隣接するペントースの３′および５′炭
素の間のホスホジエステル結合によりお互いに結合した
、ヌクレオチドの直線の列である。

機能的同等体　−この分野においてよく知られているよ
うに、ＤＮＡ配列において、あるヌクレオチドは、発現
産生体の配列に影響を及ぼさないで、置換することがで
きる。このペプチドに関すると、この用語は、特定の用
途において機能をもたない１種または２種以上のアミノ
酸が欠失されているか、あるいは他のものにより置換さ
れることができることを意味する。

コドン　−　ｍＲＮＡによりアミノ酸をエンコードする
３ヌクレオチド（トリップレット）のＤＮＡ配列、翻訳
開始シグナルまたは翻訳停止シグナルをエンコードする
。例えば、ヌクレオチドのトリップレットＴＴＡ、ＴＴ
Ｇ、ＣＴＴ、ＣＴＣ。

ＣＴＡおよびＣＴＣはアミノ酸のロイシン（［ＬｅｕＪ
）をエンコードし、ＴＡＧｌＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止シグナルであり、そしてＡＴＧは翻訳開始シグナル
である。

リーディング７レーム　−　アミノ酸配列へのｍＲＮＡ
の翻訳の間のコドンの群。翻訳の間、適切なリーディン
グフレームを維持しなくてはならない。例えば、配列Ｇ
ＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３つのＲＦまたは相で翻訳さ
れることができ、それらの各々は、隣接するするアミノ
酸のアルファーアミノ基とカルボキシ基との間のペプチ
ド結合によりお互いに接続された異なるアミノ酸配列Ｇ
ＣＴ　　ＧＧＴ　　ＴＧＴ　　ＡＡＧ　　−ＡｌａＧｌ
ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　ＧＴＡ　　ＡＧ　　−Ｌｅ
ｕ−Ｖａ　１−Ｖａ　Ｉ ＧＣＴＧＧ　　ＴＴＧ　　ＴＡＡ　　Ｇ　　−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−（停止） を与える。

ポリペプチド　−　隣接するアミノ酸のアルファアミノ
基おおびカルボキシ基の間のペプチド結合によりお互い
に接続されたアミノ酸の線状の配列。

ゲノム　−　細胞またはウィルスの完全なりＮへ〇それ
は、なかでも、細胞またはウィルスのポリペプチドの遺
伝情報を指定する構造遺伝子、ならびにそのオペレータ
ー　プロモーターおよびリポソームおよび、例えば、シ
ャインーダルガルノ（Ｓｈ　ｉ　ｎｅ−Ｄａ　Ｉｇａ　
ｒｎｏ）配列を包含する相互作用配列を包含する。

構造遺伝子　−その鋳型またはメツセンジャーＲＮＡ　
（ｒｍＲＮＡＪ　）を通して、特定のポリペプチドに特
徴あるアミノ酸の配列をエンコードするＤＮＡ配列。

転写　−構造遺伝子からｍＲＮＡを産生ずるプロセス。

翻訳　−ｍＲＮＡからポリペプチドを産生ずるプロセス
。

発現　−ポリペプチドを産生ずるＩ；めに構造遺伝子が
なしたプロセス。それは転写と翻訳との組み合わせであ
る。

プラスミド　−　グラスミドが宿主細胞中で復製するよ
うな完全な「レプリコン」からなる非染色体二本鎖ＤＮ
Ａ配列。プラスミドが単細胞の有機体内に配置されたと
き、その有機体の特性は、プラスミドのＤＮＡの結果、
変化または形質転換され得る。例えば、テトラサイクリ
ン耐性（Ｔｅｔｌ）のための遺伝子を有するプラスミド
は、前にテトラサイクリンに対して感受性である細胞を
それに対して耐性の細胞に形質転換する。プラスミドに
より形質転換された細胞は「形質転換体」と呼ばれる。

ファージまたなバクテリオファージ　−　それらの多く
はタンパク質のエンベロープまたはコート（ｃｏａｔ）
（ｒカプシドタンパク質」）中にカプセル化されたＤＮ
Ａ配列から成る。

クローニングベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）宿主細胞中で
複製することができるプラスミド、ファージＤＮＡまた
は他のＤＮＡ配列、これは、ＤＮＡの必須の生物学的機
能、例えば、複製、コートタンパク質の産生またはプラ
スミドまたは結合部位の損失、を付随的に損失しないで
、決定可能な方法でこのようなりＮＡ配列を切断するこ
とができる、１つまたは小さい数の部位によって特徴づ
けられ、そして形質転換された細胞、テトラサイクリン
耐性またはアンピシリン耐性の細胞の同定における使用
に適当なマーカーを含有する。

クローニングベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。

クローニング　−　無性生殖により１つの有機体または
ＤＮＡ配列から誘導される、このような有機体またはＤ
ＮＡ配列の１集団を得るプロセス。

組み換え体ＤＮＡ分子または雑種ＤＮＡ生きている細胞
の外側で末端対末端で接合されており、そしである細胞
に感染しかつその中で維持されうる能力を有する、異な
るゲノムからのＤＮＡのセグメントから成る分子。

ｃＤＮＡ発現ベクター　−真核細胞中のｃＤＮＡ配列の
発現を促進するヌクレオチドの配列をまた含有する、原
核細胞のクローニングベヒクル。

これらのヌクレオチドは、真核細胞のプロモータ、別の
きり継ぎ部位およびポリアデニル化シグナルとして機能
する配列を包含する。

形質転換／トランスフェクション　−　ＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、遺伝子の発現を可能とするような方法で、細胞
中に導入される。「感染した」は、ここでは、ウィルス
のベクターによりＲＮＡまたはＤＮＡを宿主中に導入す
ることに関する。

ここで使用する「注入した」は、細胞中へのＤＮＡのミ
クロ注入（小さい注射器を使用する）に関する。

ＣＥＡ抗原族（ＣＥＡ遺伝子族）　一部分的ｃＤＮＡ　
　ＬＶ−７（ＣＥＡ−（ａ））に対して相同性のヌクレ
オチド配列を共有し、そしてこれらの類似性の結果、そ
れらの抗原エピトープのサブセットを共有する、遺伝子
（遺伝子族）およびそれらの産生体（抗原族）の組。Ｃ
ＥＡ抗原族の例は、ＣＥＡ　（＝ＣＥＡ−（ｂ））、ト
ランスメンブレン（ｔ　ｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ）Ｃ
ＥＡ（ＴＭ　　ＣＥＡ）−ＣＥＡ−（ｃ）および正常交
差反応性抗原（ＮＣＡ）（＝ＣＥＡ−（ｄ））を包含す
る。

本発明は、ＴＭ−２（ＣＥＡ−（ｅ））　、ＴＭ−３（
ＣＥＡ−（ｆ））　、ＴＭ−４（ＣＥＡ（ｇ））　、Ｋ
ＧＣＥＡｌおよびＫＧＣＥＡ２と表示する次のＤＮＡ配
列に関し、これらはそれらと交雑可能である塩基配列（
ＤＮＡまたはＲＮＡ）を有するＣＥＡ抗原族のペプチド
の配列の遺伝情報を指定するニ ベト ２； Ｕ＜ Ｉ：）＋−４ Ｌ）Ｌ） ・Ｏ方 −ｄ、２ ・Ｕ　飄 ・Ｑ　− 本発明は、また、ＣＥＡペプチドまたはそれと交雑可能
な塩基配列の遺伝情報を指定する塩基配列からなる、核
酸、例えば、ＤＮＡからなるインサートを有する、複製
可能な組み換え体クローニングベヒクル（「ベクター」
）に関する。

本発明は、また、前述の複製可能な組み換え体クローニ
ングベヒクルまたは前述のｃＤＮＡと交雑可能な核酸で
トランスフェクション／形質転換、感染または注入した
細胞に関する。こうして、本発明は、また、クローニン
グベヒクルを使用しないで、遊離核酸を使用して細胞を
トランスフェクションすることに関する。

なおさらに、本発明は、前述のトランスフェクション、
感染または注入した細胞により発現されたポリペプチド
ならびにこのポリペプチドの標識した形態に関し、この
ポリペプチドはＣＥＡとの免疫学的交差反応性を示す。

本発明は、また、アミノ酸配列を有するポリペプチド、
すなわち、合成ペプチド、または前述の複製可能な組み
換え体クローニングベヒクルでトランスフェクション、
注入、感染した細胞の発現産生体、ならびにその標識し
た形態に関する。換言すると、本発明は、全体のアミノ
酸配列に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチド、
または前述の発現産生体の５以上のアミノ酸を有するそ
の一部分に関する。

本発明は、さらに、前述のポリペプチドに対して特異的
な抗体調製物に関する。

本発明の他の面は、次の工程からなる、試験試料中のＣ
ＥＡまたはその機能的同等体を検出するイムノアッセイ
法に関する： （ａ）試料を前述の抗体調製物と接触させ、そして （ｂ）試料中のＣＥＡへの結合を決定する。

本発明は、また、次の工程からなる、試験試料中のＣＥ
Ａまたは関連する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の試料を
検出する核酸交雑法に関する＝（ａ）試験試料を核酸か
らなる核酸プローブと接触させ、前記核酸はＣＥＡペプ
チド配列の遺伝情報を指定する塩基配列またはそれと交
雑可能な塩基配列からなり、そして （ｂ）得られる交雑したプローブの形成を決定する。

本発明は、また、次の工程からなる、動物またはヒトの
患者における癌腫抗原またはその機能的同等体の存在を
検出する生体内の方法に関する：（ａ）前記患者に、本
発明による標識した（例えば、Ｘ線により検出可能な放
射線に不透明の物質、放射線したまたはＮＭＲにより検
出可能な常磁性物質で標識した）抗体調製物を導入し、
そして （ｂ）標識を検出することにより、患者中のこのような
抗体調製物の存在を検出する。

他の面において、本発明は、治療の目的で本発明よる抗
体調製物を使用することにに関する。すなわち、抗体調
製物にラジオヌクレオチド、毒素または他の生物学的エ
フェクターを取り付けて複合体を形成し、そして有効量
のこのような複合体を動物またはヒトの患者に、例えば
、注射によりまたは経口的に、導入する。抗体の複合体
は患者中のＣＥＡに結合し、そしてラジオヌクレオチド
、毒素または他の生物学的エフェクターはＣＥＡ発現細
胞を破壊するであろう。

親の出願において、次のＣＥＡを記載する：ＣＥＡ−（
ａ）　　　部分的ＣＥＡ　（ｐｃＬＶ７）ＣＥＡ−（ｂ
）　　　完全な解読ＣＥＡ：ｐｃ１５ＬＶ７）（ＡＴＣ
ＣＮｏ、６７７０６）ＣＥＡ−（ｃ）　　　ＴＭ−１（
ＦＬ−ＣＥＡ；ｐｃ　　１９−２２）（ＡＴＣＣＮｏ、
６７７１ｃＥＡ−（ｄ）　　　ＮＣＡ　（ｐｃＢＴ　　
２０）（ＡＴＣＣＮｏ、６７７１１） この出願と同時に提出した出願において、次のＣＥＡを
記載する： ＣＥＡ　−（ｅ） （ＡＴＣＣＮｏ。

ＣＥＡ−（ｆ） （ＡＴＣＣＮｏ。

ＣＥＡ−Ｃｇ） Ａ’ｒＣＣＮｏ。

７７　ｌ　Ｏｌ　６７７　ｌ ＴＭ−２（ｐｃ　　　Ｅ２２） ＴＭ−３（ｐｃ　　　ＨＴ−６ ＴＭ−４゜ ６７７０６、６７７０９、６ １および６７７１２はすべて ＡＴＣＣＩ：１９８８年５月２５日に受託された。

ＣＥＡ−（ａ）　、ＣＥＡ−（ｂ）　、ＣＥＡ（ｃ）お
よびＣＥＡ−（ｄ）についての配列を下に記載する： 騎　８ 　　Ｕｗ Ｎ＠　Ｌ：１　（ Ｌ ２．５王１ ψ　暉　　１−：）（Ｏ Ｑン 昌Ｃ− （）　　ｌｊ　ＩＡ　ｌｊ’１ ｆ″騒ｊ ｔｊ＞寸 ３δ− ０５，！♀ Ｖ蓼じく ス；彎 むヨ５粗 ０　　　０　Φ　「１ ０−くψ −（４。

（）ｌ−４の Ｎ　ａく 引上ス ４．５糞 ＪＩＪ Ｑ　　　Ｕ　ｔ　旧 ５クス く− 騒；ゝ ５Ｇ″″ くΦト くΦψ ０ン ｏＵ６１１／１ マ　＜−− ＩＪＩ＋寸 ｅ＋　　　　１ｊｌｌ＋ＩＶ＋ マ　ｕ　＜　− ３己ろ 昌Ｃ≧ ３Ｎ ｊ工４ ８．１；ゞ ＯＵＯＩｎ 外　Ｗ　　Ｕ　Ｌ　Ｉ／′Ｉ 訃η＝ ｊη皐 Ｓ、＝ηに ３−！た り＜〜 ５王吊 ｕｔ−ｔ。

ｇ　ｗ　３　ｒ−η ＱＩＪｔＡＬ／１ Ｇｌ　　ｍ　　ｔｊ　　＞ψ ０％　　　　ｔ−ｕ　　Ｎ １ｊＬ−臂 くヒ〜 リ　〉　Ｎ ＜Ｌ−ｒワ ″　　ヰ；ヱ くＩ−１ ２ｇ ＯｔＪ４Ｌｎ ｒ−ｔｊ（〜 ０　　　リ　α　寸 寸　輪　　リ　Ｉ＋　寸 訃ηｇ ８．４参 （＞Ｑ ５−：　　　　　ＵΦ− ３Ｅ＋茸　　　？、實ミ粗 くく〜　　ｃｏＩ−ｈ＋〜 Ｏ４Ｊ　　Φ　１ の　く−へ 炎：ｔ℃ ＬＺｌ　　Ｌ、　　− トス己ぢ ６２工 ５η六　　　２．？ニア く−臂 Ｑ＋１寸 ５３戎　　訃百！虱 ←　Ｌ−寸 ＜１−１　　寸 訃；咎 ツη禽 ５５ス ０　　１＋　Φ　ψ ０＜−一 〇：１寸 ５５ち Ｏａｊ＋３Ｌｌ’１ くく円 ０・　　ｌｊｌｌｌＭ Ｏ儒　　＜１／１　　円 ＜−１ ５η六 ｇ、ツ；繋 （（Ｍ Ｕ　Ｐ　Ｉ＋′＋　　　　　　　　　　　　１＋　ｔ−
Ｎ　　　　　　Ｐｌ−Ｐａ　ｔ−＋　　　　　　ｏ　　
　　＜　＞（ｈ５：！二 〇＜寸 ５王藁 ３＜努 Φ　〉　ｎ −ＬＬＯ ＜　　ｌ／ｌ　　Ｍ Ｎ　　　　（Ｊ　　Ｉ−０コ （誹　−ト （ｘ　ｎ ｕｔ−Ｌｎ Ｏ愼ＬＪ　Ｊ：　０） Ｎ（）−Ｍ り罐Ｏ Ｕ＜マ ｇ　、５．！： ＭＬ）（マ ５王♀ 訃、ｃ凋 ８．５）刈 ５王５ ｇ己印 Ｌ）　　＞　　Ｌｌ’１ ３：を号 Ｌｌｅ　　の 訃；エ フ、５ｆη トｃＤ＜　ψ ０Ｌ）ｌ＋　− 〇−〇〇の １）　　←　Ｌ／ＩＩ／’１ く−の 訃、２寸 １＋−一 〇〉１ ト髄Φ〉１ ５、！″ま Ｕ＜ψ ＋−＃　（４１（０ 以°　騒η３ ｊよＪ ｔｐ　　＞　　ｔ。

（ＬＭ 渇　Ｉ−Ｌ　ａ− 昌よＳ 寸−＜　＋、　ｔａ −七一 く 茹“ヨ ＬＯ翻（り 〜く ８″　昌 。　　ｊ シｌｌ　Ｑ ご 訃 ０　　ご く ご ・　ＯＣ ・　Ｑ　コ ・すψ イ・− ５； Ｕく くト ベし ・　リ　し ・Ｑ　Ｃ ・Ｅ４　ψ ・　［−ＴＩ−Ｊ ５髪 ０〉 べ← くト ＜　− づ ０べ ′：？、！ すＯ 〔−ＩａＪ ・Ｅ−４← −４０Ｊ ２″Ｓ ←　の　　　の　−ト　の 明ま田店のン了１１１ｒ（内′６（こ変更なし）←−１
′＋−の−り占（Ｄ 明細書の浄ｒｙｙ　（内ζｉに変更なし）ｍ（ビ トランスメンブレンＣＥＡ、すなわち、ＴＭｌ　（ＣＥ
Ａ−（ｃ））　、ＴＭ−２（ＣＥＡ　　（ｅ））、ＴＭ
−３（ＣＥＡ−（ｆ））およびＴＭ−４（ＣＥＡ−（ｇ
））の概略的関係か第１図に描かれている。

ＴＭ−１が第１図に描くように５つの区画、すなわち、
１０．１２．１４．１６および１８から構成されている
と仮定すると、ＴＭ−２はＴＭｌと異なり、１００アミ
ノ酸（１，０ＯＡＡ）区画１４は欠失されており、そし
て区画１２と１６との間のきり継ぎ点２０に、驚くべき
ことには、余分のアミノ酸、すなわち、Ａｓｐが存在す
る。

ＴＭ−３はＴＭ−１と同一であるが、ただし区画１８は
きり継ぎ点２２において切頭されており、すなわち、７
０アミノ酸の区画は欠失されており、そして下位区画２
４＋２６から構成された新しい区画が生ずる。しかしな
がら、驚くべきことには、６つの新しいアミノ酸（区画
２６）が発生する。

核酸配列の欠失から生成する新規なアミノ酸配列の他の
例は、血小板誘導増殖因子についてである。

ＴＭ−４は下位区画２４の末端までＴＭ−２と同一であ
る。

下位区画２４はＴＭ−１およびＴＩＶＩ−２の区画１８
中に含有されるか、ＴＭ−１およびＴＭ−２について第
１図に描かれていない。

あるＣ　Ｅ　Ａ　′ｆｆ−ビト−ブは独特であＺ）。こ
れらは、種々のＣＥＡ様抗原を免疫学的（二区別するた
めに有用であったエピト−プである。ペプチドのゴビ１
−−ブは抗原の直線のアミノ酸配列および／またはタン
パク質の折り畳みから生成−４る特徴により定められる
。タンパク質の折り畳みについて要求される情報は、−
次アミノ酸配列中に一エンコードされる。〔、だが１で
、抗原の差は、究極的には、異なるＣ　Ｅ　Ａ分イの一
次構造にＪＫける差から生、檄４る。こうして、ｃｒｐ
、へ種におけ６ＣＥＡタンパク質中に存在する差は、−
次アミノ酸配列を決定することにより決定することがで
きる。これは、最も容易に、ＣＥＡについての遺伝ｆの
各・′７をり〔Ｉ−二〉・グおよび配列決定することに
よって達成することができる。どの遺伝子産生体が癌の
診断に最も有用であるかとうかを決定するため、独特プ
ローブを各遺伝子について選択）−１ぞしＣ各遺伝子の
発現を核酸交雑技術により異なる■・■瘍のタイプにつ
い（決定するＪ二とかできる。本発明は、ＣＥＡ族の異
なる構成員の遺伝情報を指定する潜在的遺伝イを同定し
５、そしてそれらについての理論的−次アミノ酸配列を
ｌｋ定するために使用する道具をＰ）供する。自動化ペ
プチド合成の方法をイ・Ｊｙ用１、て、これらの抗原中
の独特配列に対応Ｊるペプチドを次にａ成することかＣ
きる。これらのペプチドを使用して、これらｊ′一対す
る抗体を産生する二とができ、こＪ′Ｉは、完全なＣＦ
Ａにむいて、免疫化される動物により認識さＪするごと
ができ・５でわうっ、１こ１″１．が達成されると、各
１Ｊ１．原σ）＞：１定のための特別の１′ノ・ノアノ
七・イを発ｉｋさ博（る、ｒこめに、こＦｌもの１′７
１ハ；（における差を利用できるという利点か得らＪす
る。

広範な種類の宿主７．′りＵ−−ングベヒクルの徂み合
わせを使用し“Ｃ１本発明により調製された本鎖核酸を
クローニングすることかできる。例えば、有用クローニ
ングベヒクルは染色体、次のものから成る：非染色体お
よび合成のＤＮＡ配列、例えば、種々の既知のＳＶ４０
の誘導体および既知のバクテリアのプラスミド、例えば
、Ｅ、ｃ。

１１からのプラスミド、例えば、（ｏｌ　　Ｅｌ、ｐＣ
Ｒ］、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ８９、およびファージのＤ
ＮＡ、例えば、ファージの多くの誘導体、例えば、Ｎ　
Ｍ　９８９、および他のＤ　Ｎ　Ａファーン、例えは、
Ｍ１３およびフィンメンテウス（Ｆ　ｉ　１８１、　ｍ
　ｅ　ｎ　Ｌ　ｅ　Ｏｕ　Ｓ　）−本鎖のＤＮＡファー
ジお上びプラスミドおよびファージＤＮＡの組み０才）
セから誘導されたベクター、例えば、ファージＤＮＡＰ
′Ｐたは他の発現制御配列を使用するように修飾さ才Ｉ
ｌニブラスミド」］たは酵ｆｆ）プラスミド、例えは、
２μグラＡｑ＋ｙ：Ｆｔ・、はその誘導＜４’ｏ有用宿
主は、次のものを包６４ることがｒさる：・くクチリア
宿主、例えば、ト：、ｃｏｌｉの菌株、例え１１Ｊ′、
Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｈ１３１０１、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｘｌ
７７６、Ｅ、ｃｏｉｉ　　Ｘ２２８２、Ｅ、ｃｏｌＭ　
ＲＣｌ　ｊ−；よびシフトモナス（Ｐｓｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ）、バ／ルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｕｓ
　　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、　　ノくンルス・ステアロ
テルモフィルス（Ｌ（ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓ（ｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　１ｕｓ）および他の１：、。

（：　ＯＩ　ｉ　　バ、ルス、酵母および他の菌かび、
動物または植物の宿主、例えば、培養における動物（ヒ
１〜を包含する）または植物の細胞または他ＬＪ）宿主
。もちろん、宿主／ベクタ〜の組み合わ（１のすべてが
ｌ　Ｌ、、〈効率よいというわけではない。宿主、／り
１＝）−ニングベヒクルの特定の選択は、本発明の範囲
を逸脱しないで、記載−傷る原Ｐ１１を・正しく考慮し
、た後、当業者によりなさＩ］ることかでさイ〉。

す６．に、特定のクローニングベヒクルの各々内で、種
々の部位４本発明による核酸の挿入のために選択オろ、
−とができ６ｏ　これらＵ）部位は、通常、それらを切
断ずろ′１ｌｌｌ＋限エントヌタレアーゼに、より表示
される。Ｙ’　ｓ　ｔ　！部位はベーターラクタマゼの
遺伝子中に、その夕〉バク質のアミノ酸１８１および１
Ｂ２の遺伝情報を指定するヌクレオチドのトリソゲレッ
トの間に位置する。２一つのＨｉｎｄｌｌエンドヌクレ
アーゼの１つは、アミノ酸１０１および１０２の遺伝情
報を指定するトリップレッドと、ｐＢＲ３２２中のベー
ターラクタマーゼのアミノ酸４５の遺伝情報を指定する
トリップレットにおけるいくつかのＴａｑ部位の１つと
の間に存在する。同様な方法で、このプラスミド中のＥ
ｃｏＲｒ部位およびＰｖｕ１１部位は解読領域の外側に
存在し、ＥｃｏＲ１部位、それぞれ、テトラサイクリン
およびアンピシリンに抵抗性の遺伝情報を指定する遺伝
子の間に位置する。これらの部位は当業者によりよく認
識されている。もちろん、本発明において有用なりロー
ニングベヒクルは選択したＤＮＡ断片の挿入のために制
限エンドヌクレアーゼを必ずしももつ必要はないことを
理解すべきである。その代わり、ベヒクルは別の手段に
より切断および接合することができる。

選択した核酸断片を取り付けて組み換え体積酸分子を形
成するために、ここにおいて選択したベクターまたはク
ローニングベヒクルおよびとくに部位は、次の種々の因
子により決定される二例えば、特定の制限酵素に対して
感受性の部位の数、発現スべきタンパク質の大きさ、宿
主細胞の酵素のタンパク質加水分解の分解に対する所望
のタンパク質の感受性、精製の間に除去困難な宿主細胞
のタンパク質により発現させるべきタンパク質の組み合
わせ、発現の特性、例えば、ベクター配列に関する開始
および停止のコドンの位置、および当業者により認識さ
れる他の因子。ベクターおよび特定の遺伝子についての
挿入部位は、これらの因子のバランスにより決定され、
すべての区画が所定の場合において等しく有効であるわ
けではない。

クローニングベヒクル中に核酸配列を挿入して組み換え
体積酸を形成する方法は、例えば、ｄＡティリング、直
接結合、合成リンカ−、エキソヌクレアーゼおよびポリ
メラーゼ結合修復反応および引き続く結合、または適当
なポリメラーゼおよび適当な一本鎖鋳型を使用する核酸
鎖の伸長および引き続く結合を包含する。

また、クローニングベヒクルの選択した部位に挿入され
たヌクレオチド配列または核酸断片は、実際の構造の一
部ではないヌクレオチドを含むことかできるか、あるい
は所望のタンパク質または成熟タンパク質のための完全
な構造遺伝子の断片のみ含むことができる。

異質遺伝子を含有するクローニングベヒクルまたはベク
ターを使用して、適当な宿主を形質転換して宿主が異質
遺伝子を複製することかできるようにすることができ、
そして異質遺伝子またはその一部分により解読されるタ
ンパク質を発現するようにすることができる。適当な宿
主の選択は、また、この分野において認識されているあ
る数の因子により制御される。これらは、例えば、選択
したベクターとの適合性、雑種によりエンコードされる
タンパク質の毒性、所望のタンパク質の回収の容易さ、
発現の特性、生物安全性およびコストを包含する。これ
らの因子のバランスは、すべての宿主が特定の組み換え
体ＤＮＡ分子の発現に等しく有効ではないことを理解す
ると、思い当たるであろう。

タンパク質の産生のレベルは、２つの因子により支配さ
れる：細胞内のその遺伝子のコピーの数およびそれらを
使用して遺伝子のコピーが転写および翻訳される効率。

転写および翻訳（これらは−緒になって発現を構成する
）の効率は、次に、通常所望の解読配列の前に位置する
ヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配
列は、なかでも、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して転
写を開始しくプロモーター配列）およびリボツムがｍＲ
ＮＡ　（転写の産生体）と結合しかつそれと相互作用し
て翻訳を開始する位置を定める。すべてのこのような発
現が等しい効率で配列の機能を制御するわけではない。

こうして、所望のタンパク質のための特異的解読配列を
それらの隣接するヌクレオチド配列から分離し、そして
その代わりにそれらを他の既知の発現制御配列に融合し
て発現のレベルを好適にすることは有利である。これか
達成されると、新しく操作した核酸、例えは、ＤＮＡ、
断片はマルチコピーまたはバクテリオファージ誘導体中
に挿入して、細胞内の遺伝子のコビ−の数を増加し、こ
れにより発現タンパク質の収率をさらに改良することが
できる。

いくつかの発現制御配列を前述したように使用すること
ができる。これらは、次のものを包含する：Ｅ、ｃｏｌ
ｉのラクトースオペロン（「！ａＣ系」）オペレーター
、プロモーターおよびリポソーム結合および相互作用配
列［シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ）配列ような配列を包含する］、Ｅ、ｃｏｌｉのト
リプトファンシンセターゼ系（ｒｔｒｐ系」）の対応す
る配列、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモ
ーター領域（ｏ　ｔ　ｐ　ＬｉダよびＯＲＰ　’　Ｒ）
　、フィラメンテウス（Ｆｉｌａｍｅｎｔｅｏｕｓ）−
末鎖ＤＮＡファージ、または原核生物または真核生物の
細胞またはそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御する
他の配列。したがって、適当な宿主における特定のポリ
ペプチドの産生を改良するために、そのポリペプチドの
遺伝情報を指定する遺伝子を選択し、そしてそれを含有
する組み換え体核酸分子から除去し、そしてその前者の
発現制御配列に密接してまたはそれに対してより適当な
関係でまたは前述の発現制御配列の１つの制御下に、組
み換え体核酸分子中に再挿入することができる。

このような方法はこの分野において知られている。

ここで使用するとき「関係」は、次の多くの因子を包含
する：例えば、組み換え体核酸分子およびその挿入され
た核酸配列の発現増強および促進領域を分離する距離、
挿入された核酸配列またはそのベクター中の他の配列の
転写および翻訳の特性、挿入された核酸配列の特定の配
列およびベクターの他の配列、およびベクターの発現増
強および促進領域の特定の特性。

所望の産生体の細胞の収率をさらに増加することは、細
胞中で利用することができる遺伝子の数の増加に依存す
る。これは、例示の目的で、次のようにして達成される
・鋳型バクテリオファージλ（ＮＭ９８９）中に操作し
た組み換え体核酸分子を挿入することによ−って、最も
簡単にはプラスミドを制限酵素で消化して、直線の分子
を形成し、次いでこれを制限した７アージＡクローニン
グ−＼ヒクル［例えば、Ｎ、Ｅ、ムレイ（Ｍｕｒｒａｙ
）ら、「生体外組み換え体の回収を簡素化するラムドイ
ドファージ」、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
エネティックス（Ｍｏ　ｌ　ｅ　ｃ、　Ｇｅ　ｎ。

Ｇｅｎｅｔｉｃ、）、１５０、ｐｐ、５３−６１（１９
７７）およびＮ、Ｅ、ムレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、「バ
クテリオファージＴ４かものＤＮＡリガーゼ遺伝子の分
子クローニング」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、１３２、ｐ
ｐ、４９３−５０５　（１９７９）ｌ　ｊイよびＤＮＡ
リガーゼどのインキコベーンヨンにより再環化された組
み換え体ＤＮＡ分子と混合する。次いで、所望の組み換
え体ファージを前のように選択し、モしてＥ、ｃ。

１ｉの宿主菌株を溶原化するために使用する。

とくに有用λクローニングベヒクルは、発現遺伝子ｃｌ
中に温度感受性突然変異および遺伝子Ｓ（その産生体は
宿主細胞の溶菌に必要である）および遺伝子Ｅ（その産
生体はウィルスの主要なカプシドタンパク質である）中
に抑制可能な突然変異を含有する。この系を使用すると
、溶原性細胞を３２°Ｃに８いて増殖［７、次いで４５
°Ｃに加熱してファージの切断を誘発する。３７°Ｃに
おいて長く増殖させると、タンパク質は高いレベルで帝
土され、これは細胞内に保持され、これらは通常の方法
でファージ産生体により溶菌されず、そして７アージ遺
伝子のインサー１へはカプセル化されないので、それは
さらに転写のために利用される１）る。次いで、細胞の
人工的溶菌は所望の産生（、ドを高い収率で解放する。

さらに、本発明により調製されるポリペプチドの収率は
、また、異なるコドンをこのｆ）　Ｎ　Ａ配列のコドン
のあるものまたはすベーＣの代わりに使用するすること
（こよ−って改良することがでさ、こ４″Ｌらの置換さ
れたコドンは置換された＝１トンにより遺伝情報を指定
されるものと同一のアミノ酸の遺伝情報を指定すること
を理解すべきである、。

最後に、本発明の組み換え体核酸分子により産生された
ポリペプチドの活性は、本発明の範囲から逸脱しないで
、本発明の核酸配列上ｔ−はボリペプチドを、よく知ら
れた手段により、断片化、修飾または誘導化することに
よって改良することができる。

本発明のポリペプチドは、次のものを包含する：（１）
＠述の細胞により発現されたポリペプチド、 （２）合成手段により調製されたポリペプチド。

（３）上の（１）または（２）のポリペプチドの断片、
このような断片はアミノ酸の合成によりまたは消化また
は切断により産生される。

本発明による合成ペプチドに関すると、ペプチドの化学
的合成は次の刊行物に記載されている：Ｓ、Ｂ、Ｈ，ケ
ント（Ｋｅｎｔ）ら、生化学的ポリマーズ（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ボルドバーブ（
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）、Ｅ、Ｐ、およびナカジマ、Ａ、編
、（アカデミツク・ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒ
ｅｓｓ）、ニューヨーク）、２１３−２４２　（１９８
０）；Ａ、Ｒ，ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌ　＋）、Ｓ
。

Ｂ、Ｈ，ケント（Ｋｅ　ｎ　ｔ）　、Ｍ、ｘンゲルハル
ド（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ）およびＲ，Ｂ、メリフィール
ド（Ｍｅｒｒ　ｉ　ｆ　ｉｅ　ｌｄ）、ジャーナル・オ
ブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、）、４３．２８４５−２８５２　（１９８７
）；Ｊ、Ｐ、タム（Ｔａｍ）　、Ｔ、−Ｗ、つオンゾ（
Ｗｏｎｇ）、Ｍ、リーメン（Ｒｉｅｍｅｎ）、Ｆ、−３
，ジエング（Ｔ　ｊ　ｏ　ｅ　ｎ　ｇ）およびＲｌＢ、
メリフィールド（Ｍｅｒｒ　ｉ　ｆ　ｉｅ　Ｉｄ）、テ
トラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｃｌｒｏｎ　
　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、４０３３　４０３６（１９７８）
；ｓ、モジソフ（Ｍｏｊｓｏｖ）、Ａ。

Ｒ，ミッチェル（Ｍｉ　ｔｃｈｅ　ｌ　Ｉ）Ｒ，Ｂ、メ
リフィールド（Ｍｅ　ｒｒ　ｉ　ｆ　ｉｅ　Ｉｄ）　、
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ。

Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）　、４５．５５５−５［３０（１
９８０）；Ｊ、Ｐ、タム（Ｔａｍ）、Ｒ２Ｄ、デイマル
チ（ＤＩＭａｒｃｈｉ）およびＲ，Ｂ、メリフィールド
（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）、テ］・ラヘドロン・レタ
ーズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｉ−ｅｅｔｅｒｓ）
、２８５１−２８５４（１９８１）；Ｓ、Ｂ、Ｈ，ケン
ト（Ｋ　ｅ　ｎ　ｔ　）　、Ｍ　、　　リーメン（Ｒｉ
　ｅｍｅ　ｎ）　、Ｍ、し・ドウクス（ｄ　ｏ　ｕ　ｘ
）およびＲ，Ｂ、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ）、タンパク質配列の分析の方法についての第１■回
国際シンポジウムの会議録（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃｅｅｄｉｎ
ｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ＩＶ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　ｏｎＭｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｏｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ　
　Ａｎａｌｙｓｉｓ）、（Ｂ　ｒ　ｏ　ｏ　ｋｈａｖｅ
ｎ　　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ブルックヘブン、刊
行中、１９８１゜ メリフィールドの固相手順において、Ｌ−アミノ酸の適
当な配列をカルボキシ末端アミノ酸からアミノ末端アミ
ノ酸まで構成する。樹脂のクロロメチル基、ベンズヒド
リルアミン基または他の反応性基への化学的結合を経て
ボリスヂレン（または他の適当な）樹脂へ取り付けられ
た適当なカルボキシ末端アミノ酸を使用して出発して、
アミノ酸を次の手順に従いお互いに付加する。ペプチド
−樹脂を： （ａ）塩化メチレンで洗浄し、 （ｂ）１０分間室温において塩化メチレン中の５％（Ｖ
／Ｖ）のジイソフロビルエチルアミン（他のヒンダード
塩基）で中和し、 （Ｃ）塩化メチレンで洗浄し、 （ｄ）生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい量の
アミノ酸を半分のモル量のカーポジイミド（シンクロへ
キシルカーポジイミドまたはジイソプロピルカーポジイ
ミド）と０°Ｃにおいて１０分間−緒にすることによっ
て活性化して、アミノ酸対称無水物を形成する。使用す
るアミノ酸は本来Ｎ−アルファーｔｅｒｔ、−７’チル
オキシカルボニル誘導体どして提供されるべきであり、
側鎖はベンジルエステル（例えは、アスパラギン酸また
はグルタミン酸）、ベンジルエーテル（例えば、セリン
、スレオニン、システィンまたはチロシン）、ベンジル
オキシカルボニル基（例えば、リジン）またはペプチド
の合成において普通に使用されている他の保護基で保護
し、 （ｅ）活性化されたアミノ酸をペプチド−樹脂と２時間
室温において反応させて、生長するペプチド鎖の末端に
新しいアミノ酸を付加し、（ｆ）ペプチド−樹脂を塩化
メチレンで洗浄し、（ｇ）Ｎ−アルファ＝（ｔｅｒｔ、
−ブチルオキシカルボニル）基を最も最近付加されたア
ミノ酸から、塩化メチレン中の３０〜６５％、好ましく
は５０％（Ｖ　／　Ｖ　）のトリフルオロ酢酸と室温に
おいて１０〜３０分間反応させることにより除去し、 （ｈ）ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、（ｉ）
要求されるペプチドの配列が構成されるまで、工程（ａ
）〜（ｈ）を反復する。

次いで、１０％Ｖ　／　Ｖのアニソールまたは他の適当
な（芳香族）スカベンジャーを含有する無水フッ化水素
酸とのにより、ペプチドを樹脂から分離する。引き続い
て、ペプチドをゲル濾過、イオン交換、高圧液体クロマ
トグラフィー、または他の適当な手段により精製するこ
とができる。

ある場合において、化学的合成は同相樹脂を使用しない
で実施することができ、この場合において合成反応は完
全に溶液中で実施される。この反応はこの分野において
同様な反応であり、よく知られており、そして最終産生
体は本質的に同一である。

ポリペプチドの消化は、タンパク質加水分解酵素、こと
にその基質の特異性がアミノ酸の所望の配列にすぐに隣
接する部位においてポリペプチドを切断する酵素を使用
して、達成することができる。

ポリペブチｌ！の切断は化学的手段により達成すること
ができる。アミノ酸間の特定の結合は、特定の試薬との
反応により切断することができる。

例は次の通りであるニメチオニンを含む結合を臭化シア
ンにより切断し、アスパラギニル−グリシン結合をヒド
ロキシルアミンにより切断する。

本発明は次の利点を有する： （１）ＴＭ−］　、ＴＭ−２およびＴＭ−３の遺伝情報
を指定する核酸をプローブとして使用して、ＣＥ　Ａ遺
伝子族の他の構成員を分離することかできる。

（２）ＴＭ−１，ＴＭ−２およびＴＭ−３の遺伝情報を
指定する核酸をグローブとして使用して、オリゴヌクレ
オチドプローブを誘導して、種々の腫瘍のタイプ中のＴ
Ｍ−１、ＴＭ−２、Ｔ〜１−３および他のＣＥＡ遺伝子
の発現を決定することができる。

（３）ＴＭ−１，ＴＭ−２、ＴＭ−３およびＴＭ−４ヌ
クレオチド配列を使用して、合成タンバタ質の産生のた
めの一次アミノ酸配列を予測することができる。

（４）上の配列から誘導された合成ペプチドを使用して
、配列特異的抗体を産生ずることができる。

（５）ＣＥＡ抗原族の構成員の各々についてのイムノア
ッセイを、これらの配列特異的抗体および合成ペプチド
を使用して、生成することができる。

（６）ＣＥＡ族の異なる構成員か癌の異なるタイプのた
めの臨床的に通常なマーカーであるかどうかを決定する
場合、前述のイムノアッセイを癌の異なるタイプについ
ての診断剤として使用することができる。

本発明によるペプチドは、普通の手段により、例えば、
放射性部分（例えば、＋２５０、酵素、色素および蛍光
化合物を使用して標識することかできる。

本発明によるイムノアッセイのだめのいくつかの可能な
立体的配置を使用することができる。これらのイムノア
ッセイにおいて使用することができる読み収り系は多数
であり、そしてこのようなシステムの非制限的例は、蛍
光性および比色酵素系、放射性同位元素の標識および検
出よりよび化学発光の系を包含する。・イムノアッセイ
法の２つの例は、次の通りである： （１）同相（このようなマイクＩコタイタープレートま
たはラテックスビーズ）への本発明による抗体調製物（
それから誘導されたＦａｂよたはＦ（ａ　ｂ）　’　を
包含する）を使用する酵素結合イムノアッセイ（ＥＬｉ
ＳＡ）を、酵素に接合したちの以外のため特異性をもつ
精製した抗体へ収り付ける。この固相抗体を、ＣＥＡ抗
原族の構成員を含有する試料と接触させる。洗浄後、固
相抗体抗原複合体を、接合した抗ペプチド抗体（または
接合した断片）と接触させる。結合しない接合体を洗浄
除去した後、酵素のための発色性または蛍光性の基質を
添加することによって色または蛍光を発生させる。発生
した色または蛍光の量は、試料中に存在する抗原の量に
比例する。

（２）蛍光で標識したペプチドまたはＴＭ−１゜ＴＭ−
２、ＴＩＶＩ−３３よびＴＭ−４のための配列の合成ペ
プチドを使用する競合蛍光測定イムノアッセイ。この例
にわいて、細胞により発現された精製したペプチドまた
はその合成ペプチドを蛍光的に標識する。固相に精製し
た抗体を取り付ける。

次いで、蛍光性ペプチドのプローブを加えである、ＣＥ
Ａ抗原族の構成員を含有する試料と、この固相を接触さ
せる。結合後、過剰のプローブを洗浄除去し、結合した
プローブの量を定量する。結合した蛍光性プローブの量
は、試料中に存在する抗原の量に逆比例するであろう。

本発明による核酸交雑法において、核酸プローブを標識
、例えば、酵素、蛍光団、放射性同位元素、化学発光化
合物などと接合させる。はとんどの一般の場合において
、プローブを試料と接触させ、そして交雑可能な核酸配
列の存在は、発色性酵素基質の存在下に発色させ、エビ
蛍光（ｅｐｉｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）による検出
により、放射性同位元素で標識したプローブのオートラ
ジオグラフィーにより、または化学発光により、検出す
ることができるであろう。交雑可能なＲＮＡ配列の検出
は、（Ｉ）ドツトプロット法または（２）その場の交雑
法により達成することができる。これらの最後に述べた
２つの技術は、それぞれ、次の文献に記載されている：
Ｄ、ギレスピ−（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）およびＪ、ブレ
ラセル（Ｂｒｅｓｓｅｒ）、ｒＮａＴ中のｍ　ＲＮ　Ａ
の固定化：急速なプロット」、バイオテクニークス（Ｂ
　ｉ　ｏ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１８１−１９２．
１１月／１２月、１９８３およびＪ、ローレンス（Ｌａ
ｗｒｅｎｃｅ）およびＲ，シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、
［細胞骨格タンパク質のだめのメツセンジャＲＮＡの細
胞内局在化」、細胞（Ｃｅｌｌ）、４５．４０７−４１
５．１９８６年５月。読み取り系は、前述のものと同一
であり、例えば、酵素の標識、放射性同位元素などであ
る。

前述したように、本発明は、また、本発明の前述の複合
体の医学における使用に関する。

本発明は、さらに、活性成分として、本発明の複合体を
無菌のおよび／または物理学的に等張の水溶液の形態で
含有する製薬学的組成物を提供する。

非経口的投与のために、活性成分として、本発明の複合
体を含有する溶液および乳濁液は、無菌であり、そして
、適当ならば、血液等張性であるべきである。

活性複合体は、経口的、非経口的（例えば、筋肉内、腹
腔内、または静脈内）、直腸内または局所的に投与され
るであろう。

調製 実施例１ａ：　　ＲＮＡの調製 メツセンジャーＲＮＡを、Ｊ、ファポラロ（Ｆａｖｏｌ
ａｒｏ）、Ｒ，トレイスマン（Ｔｒｅｉｓｍａｎ）およ
びＲ，カメン（ｋａｍｅｎ）、メソソズ・イン・エンジ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、６５．７１８アカデミツク・プレス・インコーポ
レーテンド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ
、）のプロイテイナーゼに抽出法により調製し、次いで
オリゴｄＴセルロースのクロマトグラフィーにかけてポ
リＡ＋ＲＮＡ　（ポリペプチドに翻訳され得るほとんど
のｍＲＮＡを含有する３′−ポリアデニル化真核生物Ｒ
ＮＡ）を生成した。はぼｌｏｏｐｇのポリＡ＋ＲＮＡを
得るために、ｌ−ランスフェクション体２３．４１　　
（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ９７３１）のほぼ３Ｘ１０８細
胞［ＴＭ−１，ＴＭ−２、ＴＭ−３およびＴＭ−４発現
する、カマルク（Ｋａｍａｒｃｋ）ら、プロシーデイン
ダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、
）ＵＳＡ、影↓、５３５０−５３５４．１９８７年８月
］り、後期の指数増殖後、ローラーびんで収穫した。細
胞を、１４０ミリモルのＮａＣｌ、ｌ　。

５ミリモルのＭｇＣｌ２．１０ミリモルのトリスＨＣＩ
、ｐ！−１８，０，０，５％のＮＰ４０．４ミリモルの
ジチオスレイトールおよび２０単位の胎盤リボヌクレア
ーゼ阻害因子／　ｍ　Ｑを含有する水冷溶液中で、ホモ
ジナイゼイションにより溶菌した。次いで、ナトリウム
デオキンコレートを０２％に加えた。細胞質および核を
ホモジネートを１２、ｏｏｏｘ−ｇで２０分間遠心する
ことによって分離した。細胞質の分画を等しい体積の０
．２モルのトリス−１−（ＣＩ、　　ｐＨ７，８，２５
ミリモルのＥＤＴＡ、０．３モルのＮａＣｌ、２％のド
デ／ル硫酸ナトリウムおよび４００μｇ　／　ｍ　Ｑの
プロイディナーゼにと混合し、３７°Ｃにおいて１時間
インギュベーションし、次いで等しい体積のフェノール
／クロロホルノ・（１：　ｌ／ｖ　：　ｖ）溶液で１回
抽出した。核酸を分離した水性相のエタノール沈澱によ
り得た。合計のＲＮＡを０．５モルのＮａＣＩ、１０ミ
リモルのトリス−１（ＣＩ　。

ｐＨ７，８，０，１％のサルコシル中でオリゴｄＴ（１
２−１８）カラムに通過させることによって濃縮した。

洗浄後、結合したＲＮＡを塩化ナトリウムを含有しない
同一溶液で溶離した。

実施例１ｂ：　　ｍＲＮＡの逆転写 ｌＯμｇのポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴｄＴ　（１２−１
８）およびｐｄＮ、ブライマーを使用する逆転写により
プライミングした。ｌｏｏμＱの反応を、２００単位の
ＡＭＶ逆転写酵素（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ、
、米国フロリダ州セン１−ペテルスブルグ）を使用して
、４２℃にＪりいて４時間実施した。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ、
　／　ｍ　ＲＮ　Ａの雑種のＲＮ　Ａ成分を、ＲＮアー
ゼＬ（、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ポリメラーゼＩＪイよびＥ、
ｃｏｌｉ　　ＤＮＡリガーゼで、各々１２°Ｃおよび２
２°Ｃにおいて１．５時間処理することによって、第２
相補的鎖と置換した。分子の末端をＴ４　　ＤＮＡポリ
メラーゼで処理して平滑にした。ｃＤＮＡをフコ−ノー
ル／クロロホルムで抽出し、そして１０ミリモルの１−
リス１−ｉＣＩ、　　ｐＨ７，８，１ミリモルのＥＤＴ
Ａ　（ＴＥ）中で調製した「セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｃｌｅｘ）Ｇ　　５Ｊ　スパン（ｓ　ｐ　ｕ　ｎ）カ
ラムで精製　し　ｌ二　。

合成りＮＡリンカ− ５’　　Ｉ）　ＣＣＣＧ　Ｇ　Ｇ　　　　　　３　’３
°　　ＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡ　　５″を、過剰のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを使用１．て平滑末端の才、へ合により、
ｃＤＮＡの末端に取り付けた。

’ｒＥ中の「セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　
　５」（中程度）のクロマトグラフィーにより、および
０，８％の低い融点のアガロースクールートの分画によ
り、過剰のリンカ−を除去した。ノザン・プロ／ト分析
に基づいて、ＣＥＡ関連ｍ　ＲＮ　Ａの大きさは３．６
ｋｂであると推定された。したがって、２〜４　ｋ　ｂ
　＋７）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片がゲルのスライスから回
収され、そして断片はエタノール沈澱した。

ＴＥ中のｃＤＮＡの再懸濁後、ＥｃｏＲＩ切断ラムダｇ
う　ＩＱアームをＣＤＮＡに１：ｌの推定モル比でイ］
加した。結合を７°ＣにおいてＴ４　　ＤＮＡＮカリゼ
の存在下に２日間進行させた。結合反応のアリコートを
商業的に入手したパンケージ混合物（Ｓｔｒａｔｏｇｅ
ｎｅｈ米国カリフォルニア州サンジエゴ）に添加しす。

５ＸＩＯ’のファージ粒子が、生体外パッケージおよび
Ｅ、ｃｏ１１宿主ＮＭ５１４の感染後、得られた。

実施例１ｄ：　組み換え体ライブラリーのスクリニング ５ＸＩＯ５のパソケー７′シたラムダ粒子を、Ｅ。

ｃｏｌｉＮＭ５１４の菌叢上に配置し、そして複製のパ
ターンを、Ｗ、Ｄ、ベントン（Ｂｅｎｔ。

ｎ　）およびＲ，Ｗ、デイビス（Ｄａｖ　ｉ　ｓ）、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９６．１８０１８２（
＋９７７）に記載されるように、セルロースシー１・上
に持ち」二げた。陽性のファージを、種々のＣＥＡ族の
構成員の間に反復するドメインを含有する、３２ｐ標識
したＬＶ７　　ｃＤＮＡインサートプローブと交雑させ
た。多数ラウンドのスクリーニングにより、個々のプラ
ークからのファージを増幅し、滴定し、そしてこれらを
使用して、少量の組み換え体ファージＤＮＡを調製した
。

実施例１ｅ：　　ＤＮＡの操作 Ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ）、Ｅ、７リトシ
ユ（Ｆｒｉｔｓｈ）およびＪ、サムブルンク（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室のマニュアル（
Ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド
・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　
　Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８２）に従い、ファージＤＮ
Ａを調製した。

ＤＮＡのセグメントを低い融点のアガロースゲルから分
離し、そしてブルースクリプト（Ｂ　Ｉ　ｕ　５ｃｒｉ
ｐｔ）プラスミドベクター（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ、米国
カリフォルニア州すンジエゴ）中にサブクローニングた
めに挿入した。ＤＮＡの配列決定は、Ｆ、サンガー（Ｓ
ａｎｇｅｒ）、Ｓ、ニノクレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ）およ
びＡ、クールソン（Ｃｏｕ　ｌ　５ｏｎ）　、プロシー
デインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　Ｌ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ
　ｉ、）ＵＳＡ。

７４．５４６３−５４６７　（１９７７）のジデオキシ
停止法により実施した。ｐｃＥ２２中のｃＤＮＡのため
の核酸および翻訳された配列は、上に記載しである（Ｔ
Ｍ−２（ＣＥＡ−（ｅ））。

メツセンジャーＲＮＡを、Ｊ、ファポラロ（Ｆａｖｏｌ
ａｒｏ）、Ｒ，）レイスマン（Ｔｒｅｓｍａｎ）および
Ｒ，カメン（ｋａｍｅｎ）、メソッズ・イン・エンジモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）、６５．７１８アカデミツク・プレス・インコーホレ
ーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、
）のプロイテイナーゼに抽出法により調製し、次いでオ
リゴｄＴセルロースのクロマトグラフィーにかけてポリ
Ａ＋ＲＮＡ　（ポリペプチドに翻訳され得るほとんどの
ｍＲＮＡを含有する３′−ポリアデニル化真核生物ＲＮ
Ａ）を生成した。はぼ１００μｇのポリＡ＋ＲＮＡを得
るために、３ＸＩＯ’細胞のＨＴ−２９腫瘍細胞（ＡＴ
ＣＣＨＴ８３８）を、後期の指数増殖後、ローラーびん
で収穫した。

細胞を、１４０ミリモルのＮａＣ１，１，５ミリモルの
ＭｇＣ１，、ｌＯミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，
０，０，５％のＮＰ４０．４ミリモルのジチオスレイト
ールおよび２０単位の胎盤リボヌクレアーゼ阻害因子／
ｍＱを含有する氷冷溶液中で、ホモジナイゼイションに
より溶菌した。次いで、ナトリウムデオキシコレートを
０．２％に加えた。細胞質および核をホモジネートを１
２，０００×ｇで２０分間遠心することによって分離し
た。細胞質の分画を等しい体積の０．２モルのトリス−
ＨＣｌ％　ｐＨ７，８，２５ミリモルのＥＤＴＡ、０．
３モルのＮａＣｌ、２％のドデシル硫酸ナトリウムおよ
び４００μｇ　／　ｍ　ａのプロイテイナーゼにと混合
し、３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションし、次
いで等しい体積のフェノール／クロロホルム（１：　ｌ
／Ｖ　：　Ｖ）溶液で１回抽出した。核酸を分離した水
性相のエタノール沈澱により得た。合計のＲＮＡを０．
５モルのＮａＣ１，１０ミ　リ　モルの　ト　リ　ス　
−ＨＣＩ　　、　　ｐＨ７゜８．０．１％のサルコシル
中でオリゴｄＴ（１２１８）カラムに通過させることに
よって濃縮した。洗浄後、結合したＲＮＡを塩化ナトリ
ウムを含有しない同一溶液で溶離した。

実施例２ｂ：　　ｍＲＮＡの逆転写 １０１１　ｇのＪ−ＩＴ−２９ポリＡ＋ＲＮＡを、オリ
ゴｄＴ（１２−１８）およびｐｄＮ６プライマーを使用
する逆転写によりプライミングした。１００μＱの反応
を、２００単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ、、米国７０リダ州セントペテルス
ブルグ）を使用して、４２°Ｃにおいて４時間実施した
。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ｍ　ＲＮＡの雑種のＲＮＡ成分
を、ＲＮアーゼＨ，Ｅ、ｃｏｌｉ　　ポリメラーゼＩお
よびＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡリガーゼで、各々１２°Ｃ
および２２°Ｃにおいて１．５時間処理することによっ
て、第２相補的鎖と置換した。分子の末端をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処理して平滑１こした。ｃＤＮＡをフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、そしてｌＯミリモルの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，１ミリモルのＥ丁）ＴＡ
（ＴＥ）中で調製しｆ−ｒセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−５」スパン（３ｐ　１１１ｔ　）カラムで
精製した。

合成１）　Ｎ　Ａリンカ ５″　ｐＣＣＣＧＧＧ　　　　　　３’３’　　ＧＧＧ
ＣＣＣＴＴＡＡ　　５’を、過剰のＴ　Ｚｉ　　１１）
　Ｎ　Ａリガーゼを使用して平滑末端の結合により、Ｃ
Ｄ　Ｎ　Ａの末端に取り付けた。

ＴＥ中の「セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５
Ｊ　　（中程度）のクロマＩ・グラフィーにより、Ｊイ
よび０．８％の低い融点のアカロースクール上の分画に
より、過剰のりンカーを除去した。ＨＴ２Ｓ］のポリＡ
　−１−ＲＮ　Ａのノザン・プロット分析に基づいて、
ＣＥＡ関連ｍＲＮＡの大きさは２．２ｋｂであると推定
された。したがって、２〜３ｋｂのｃＤＮＡ断片がゲル
のスライスから回収され、そして断片はエタノール沈澱
した。ＴＥ中のｃＤＮＡの再懸濁後、ＥｃｏＲＩ切断ラ
ムダｇうｔ　１０アームをｃＤＮＡｌ：ｌ：ｌの推定モ
ル比で付加しｔユ。結合を７°ＣにおいてＴ４　　ＤＮ
Ａリガーゼの存在下に２日間進行させた。結合反応のア
リコートを商業的に人手したパッケージ混合物（Ｓｔｒ
ａｔｏｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州すンジエゴ）に
添加した。５×ｌＯｔ′の７ア一ジ粒子が、生体外パン
ケージＨよびＥ、ｃｏｌｉ宿主ＮＭ５１４の感染後、得
られた。

実施例２ｄ：ｍみ換え体ライブラリーのスクリニンゲ ５ＸＩＯ５のパックー−ジしたラムダ粒子を、Ｅｃｏｌ
ｉＮＭ５１４の菌叢上に配置し、イして複製のパターン
を、Ｗ、Ｄ、ベントン（Ｂｅｎｔ。

ｎ）およびＲ７〜Ｖ、デイビス（Ｄａｖｉｓ）、ザイエ
ンス（ｓｃｉｅｎｃｅ）、＋９６．１８０１８２（１９
７７）に記載されるＪ：うに、セルローメン−１−十に
持ち−Ｆげた。陽性のファージを、種々のＣＥＡ族の構
成員の間に反復するドメインを含打する、３２ｐ標識し
たＬＶ７　　ｃＤＮＡＤＮＡリガ−ゼ１−ブと交雑させ
た。多数ラウンドのス〈ノリーユング（こより、個々の
プラークからのファージを増幅し、滴定し、そしてこれ
らを使用し、て、少ｒ１の組み換え体〕了−ジＤＮＡを
調製した。

実施例２ｅ：　　Ｉ）Ｎ、Ａの操作 ］゛、、マニアチスａｎｉａｔ　ｉｓ）、Ｅ、フッＩ−
シュ（Ｆｒｉｔｓｈ）お４にびＴ４　リームプルｙり（
Ｓａｍｂｒｏｎｋ）、モレキュラー−クロユング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室のマニユ
アル（Ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａり、コー
ルド・スプリング・）＼バー（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８２）に従い、ファー・
二フＬ）　Ｎ　Ａを調製ｔ、　ｔ−。

ＤＮＡのセグメントを低い融点のアガロースゲルから分
離し、そしてブルースクリプト（Ｂ　ｌ　ｕ　５ｃｒｉ
ｐｔ）プラスミドベクター（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ、米国
カリフォルニア州すンジエゴ）中にサブクローニングな
ｙ）に挿入した。ＤＮＡの配列決定は、Ｆ、ザンガー（
Ｓａｎｇｅ　ｒ）、Ｓ、二・リクレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ
）およびＡ、クールソ〉（（コｏｕｌｓｏｎ）、フロン
〜デインダス・才ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンらズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．、Ａｃａｄ、
Ｓｃ　ｉ、）ＩＪＳＡ。

７４．５４６３−５４６７　（１９７７）の・、゛ｆオ
キシ停止法により実施した。Ｈ”ｌ”−６巾のｃ　Ｄ　
ＮＡのための核酸および翻訳さね！−配列は、その解読
領域の５′末端において完結口ず、ＨＴ　−Ｇイン倶−
トのヌクレオチド配列は、ＣＥＡ−（ｃ）およびＣＥＡ
−（ｅ）の遺伝情報を指定するｃＤト４・λクローンの
核酸配列にそれが関連するこ、ヒを水田、　ｉ（′Ｆ−
ｆ３イ〉・ザー　＋−の核酸配列は、これらのクローン
どＣＥＡ　−（ｃ）　　ｃＤＮＡのヌクレオチド位ａ　
１４６３〜１５１５および１６７６〜２４２ｇにおいて
のみ叉なる。この結果から理解されるように、ｐｃＨＴ
６インサートはＣＥＡ（【）のための部分的解読配列で
あり、そしてＣ，ＥＡ−（ｆ）の推定される核酸および
翻訳された配列は上に記載しである（Ｔｒｖｌ−３（Ｃ
ＥＡ（ｆ））。

メツセンジャーＲＮＡを、Ｊ、ファポラロ（Ｆａｖｏ　
ｌ　ａ　ｒｏ）　、Ｒ，トレイスマン（Ｔｒｅｉｓｍａ
ｎ）およびＲ，カメン（ｋ　ａ　ｍ　ｅ　ｎ　）　、メ
ソッズ・イン・エン・ジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５．７１８アカデミツ
ク・プレス・インコーホレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ
　　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）のプロイテイナーゼに抽出
法により調製し、次いでオリゴｄＴセルロースのクロマ
トグラフィーにかけてポリＡ＋ＲＮＡ　（ポリペプチド
に翻訳され得るほとんどのｍ　ＲＮ　Ａを含有する３′
−ポリアデニル化真核生物ＲＮＡ）を生成した。はぼ１
００μｇのポリＡ＋ＲＮＡを得るために、３Ｘ１０’細
胞の組み換え体２３．４１１またはＨＴ　−２９腫瘍細
胞系（ＡＴＣＣＨＴＢ３８）を、後期の指数増殖後、ロ
ーラーびんで収穫した。細胞を、１４０ミリモルのＮａ
Ｃ：１．１．５ミリモルのＭｇＣｌ２．１０ミリモルの
トリス−ＨＣｌ、ｐ　Ｈ８，０，０゜５％のＮＰ４０．
４ミリモルのジチオスレイトールおよび２０単位の胎盤
リボヌクレアーゼ阻害因子／ｍＱを含有する水冷溶液中
で、ホモジナイゼイションにより溶菌した。次いで、ナ
トリウムデオキンコレートを０．２％に加えた。細胞質
および核をホモジネートを１２，０００Ｘｇで２０分間
遠心することによって分離した。細胞質の分画を等しい
体積の０．２モルのトリス−ＨＣｌ、ｐ■１７．８．２
５ミリモルのＥＤＴＡ、０．３モルのＮａＣ１，２％の
ドデシル硫酸ナトリウムおよび４００μｇ／ｍＱのグロ
イテイナーゼにと混合し、３７°Ｃにおいて１時間イン
キュベーションし、次いで等しい体積のフェノール／ク
ロロホルム（１：ｌ／ｖ：ｖ）溶液で１回抽出した。核
酸を分離した水性相のエタノール沈澱により得た。

合計のＲＮＡをＱ、５モルのＮａＣｌ、１０ミリモルの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８、Ｏ，１％のサルコシル中
でオリゴｄＴ　（１２−１８）カラムに通過させること
によって濃縮した。洗浄後、結合したＲＮＡを塩化ナト
リウムを含有しない同一溶液で溶離した。

実施例３ｂ：　　ｍＲＮＡの逆転写 １０μｇの２３．４１１またはＨＴ　−２９ポリＡ十Ｒ
ＮＡを、オリゴｄＴ（１２−１８）およびｐｄＮｓプラ
イマーを使用する逆転写によりブライミングした。１０
０μＱの反応を、２００単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉ
ｆｅ　　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｉｎｃ、、米国フロリダ州セントペテルスブルグ）を使
用して、４２°Ｃにおいて４時間実施した。ＣＤ　Ｎ　
Ａ　／　ｍ　ＲＮ　Ａの雑種のＲＮＡ成分を、ＲＮアー
ゼＨＳＥ、ｃｏｌｉ　　ポリメラーゼＩおよびＥ。

ｃｏｌｉ　　ＤＮＡリガーゼで、各々１２°Ｃおよび２
２°Ｃにおいて１，５時間処理することによって、第２
相補的鎖と置換した。分子の末端をＴ４　　ＤＮＡポリ
メラーゼで処理して平滑にした。ｃＤＮＡを７エノール
／クロロホルムで抽出し、そしてｌＯミリモルのトリス
−ＭＣ１％　ｐＨ７，８，１ミリモルのＥＤＴＡ　（Ｔ
Ｅ）中で調製した「セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ−５Ｊスパン（Ｓｐｕｎ）カラムで精製しｔこ。

実施例３ｃ：　　ＣＥＡ−（ｇ）のクローニング合成り
ＮＡリンカ− ５’　　ｐＣＣＣＧＧＧ　　　　　　３’３”　　ＧＧ
ＧＣＣＣＴＴＡＡ　　５’を、過剰のＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼを使用して平滑末端の結合により、ｃＤＮＡの末
端に取り付けた。

ＴＥ中の［セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５
Ｊ　　（中程度）のクロマトグラフィーにより、および
０．８％の低い融点のアガロースゲル上の分画により、
過剰のリンカ−を除去した。２３゜４１１またはＨＴ　
−２９のポリＡ＋ＲＮＡのノザン・プロット分析に基づ
いて、ＣＥＡ関連ｍＲＮＡの大きさは１．７ｋｂである
と推定された。したがって、ｌ〜２ｋｂのｃＤＮＡ断片
がゲルのスライスから回収され、そして断片はエタノー
ル沈澱した。ＴＥ中のｃ　ＤＮＡの再懸濁後、ＥｃｏＲ
■切断ラムダｇｔｌｏアームをｃＤＮＡｌｌ：ｌ：ｌの
推定モル比で付加した。結合を７°ＣにおいてＴ４　Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下に２日間進行させた。

結合反応のアリコートを商業的に入手したパンケシ混合
物（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ１米国カリフォルニア州サン
ジエゴ）に添加しす。５Ｘ］０６の７ア一ジ粒子が、生
体外パッケージおよびＥ、ｃｏ１ｉ宿主ＮＭ５１４の感
染後、得られた。

実施例３ｄ：　組み換え体ライブラリーのスクリユング ５Ｘ１０５〜ｌＸｌ０’のパッケージしｌニラムタ゛粒
子を、Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉＮＭ５１４の菌叢上に配置し、
そして複製のパターンを、Ｗ、Ｄ、ベントン（Ｂｅｎｔ
ｏｎ）およびＲ，Ｗ、デイビス（Ｄａｖ　ｉ　ｓ）　、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９６．１８０−１８
２　（１９７７）に記載されるように、セルロースシー
１・上に持ち上げた。陽性のファージを、種々のＣＥＡ
族の構成員の間に反復するドメインを含有する、３２ｐ
標識したＬＶ７ｃＤＮＡインサートプローブと交雑させ
た。この選択法により、多数ラウンドのスクリーニング
後、陽性のファージかえられる。個々のプラークからの
ファージを増幅し、滴定し、そしてこれらを使用して、
少量の組み換え体ファージＤＮＡを調製し　Ｉこ　。

実施例３ｅ：　　ＤＮＡの操作 Ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｅ、フリトシュ
（Ｆｒｉｔｓｈ）およびＪ、サムプルツク（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室のマニュアル（Ａ
　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・
スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
ｌ１ａｒｂｏｒ）、（１９８２）に従い、ファージＤＮ
Ａを調製した。

ＤＮＡのセグメントを低い融点のアガロースゲルから分
離し、そしてブルースクリプト（Ｂ　ｌ　ｕ　５ｃｒｉ
ｐｔ）プラスミドベクター（Ｓｔａｔａｇｅ　ＩＩ　ｅ
　％米国カリフォルニア州ザンジェゴ）中にザブクロー
ニングために挿入した。ＤＮＡの配列決定は、Ｆ、ザン
ガー（Ｓａｎｇｅ　ｒ）　、Ｓ、ニックレン・（Ｎｉｃ
ｋｌｅｎ）およびＡ、クールソン（Ｃｏｕ　ｌ　５ｏｎ
）、プロンーデインダス・才ブ・ナンヨカル・アカデミ
−・オブ・サイエン／ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ。

７４．５／１６３−５４６７　（１９７７）のジブすキ
ン停止法により実施した。ＣＥＡ−（ｇ）の遺伝情報を
指定するヌクレオチドおよび翻訳された配列は、上に記
載しである（ＴＭ−４（ＣＥＡ（ｇ））。

癌腫抗原［ＬＶ７またはＣＥＡ−（ａ）］の−部分の遺
伝情報を指定するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのセグメントを、ラン
ダムブライミングにより放射線標識し、そしてバクテリ
オファージのベクターλｇｔｌｌ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、、米国カリフォルニア州バロアルト）中のＫＧ
−１細胞から調製した商業的ｃＤＮＡライブラリーのフ
ィルターのレプリカ上で、相同性配列を検出するために
使用した。交雑は６８°Ｃにおいて２ＸＳＳＳＰＥ　（
ＩＸｓｓＰＥ−０，１５モルのＮａＣｌ、０．０１モル
のリン酸ナトリウムおよび１ミリモルのＥＤＴＡ、水酸
化カリウム７）、５×デンハル［・溶液およびｌ　ＯＯ
μｇの変性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ｍ　Ｑ中で実施し
、そして交雑後０゜２ＸＳＣＣ１（１，２５９不のドデ
シル硫酸ナトリウム中で洗浄した。

陽性のファージを取り上げ、均質に再スクリユングし、
そしてＤＮＡの産生のため増幅した。

ｃＤＮＡのインサー１−をファージＤＮＡからＥｃｏＲ
Ｉで切除し、そしてプラスミドベクターｐｒ＋Ｉｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ　　ＫＳのＥｃｏＲ［部位中にスクリーニン
グした。二本鎖ＤＮＡ上のＤＮＡの配列決定は、ザンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、５ｕｐｒａ、の方法により実施
した。ＫＧ−１ｃＤＮＡからの２つの異なるインサート
の配列を、下に示す： こｔ）明ｔｍＷおよび特許請求の範囲は例示を目的とし
、そして限定を目的とセーす、そして種々の変更および
変化は本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能であ
ることが明らかであろう。

本発明の主な特徴およびｆル様は、次の通りである。

ｌ、ペプチドの配列の遺伝情報を指定する塩基配列から
なり、群の核酸は次の５つの配列の群から選択されるＤ
ＮＡであるか、あるいはこのような５つの配列のいずれ
かと交雑可能であるか、あるいはこのような５つの配列
のいずれかにより遺伝情報を指定されるペプチドの配列
と実質的に同一であるペプチドの配列の遺伝情報を指定
する核酸で、す）ることを特徴とする特許 く← で； Ｕ＜ （）Ｃ→ ・Ｑ　＋）。

（つｒ→ °′５！ ・Ｑ　方 ・　Ｑ　− ８〜 Ｏ〉 ←−→ べＨ 〇− ロＱ で２ Ｕく くト り　　　　ｏ　　　　ｏ　　　　ｏ　　　　ロ　　　　
ＣＩ　　　　　ＣＩ　　　　ＩＮ　　　　　のつ　　　
　ｕｏ　　　　　ＩＮ　　　　　Ｏ）　　　　　？　　
　　　０　　　　ｕ）　　　　Ｏ（）５　　　の　　　
ｒ＋　　　さ　　　の　　　山　　　小　　　−−２、
上記第１項記載のＤＮＡ配列（１）であることを特徴と
する、タンパク質ＣＥＡ−（ｅ）の遺伝情報を指定する
塩基配列からなる核酸。

３、上記第１項記載のＤＮＡ配列（２）であることを特
徴とする、タンパク質ＣＥＡ−（ｒ）の遺伝情報を指定
する塩基配列からなる核酸。

４、上記第１項記載のＤＮＡ配列（３）であることを特
徴とする、タンパク質ＣＥＡ−（ｇ）の遺伝情報を指定
する塩基配列からなる核酸。

５、上記第１項記載のＤＮＡ配列（４）であることを特
徴とする、タンパク質ＫＧＣＥＡＩの遺伝情報を指定す
る塩基配列からなる核酸。

６、上記第１項記載のＤＮＡ配列（５）であることを特
徴とする、タンパク質ＫＧＣＥＡ２の遺伝情報を指定す
る塩基配列からなる核酸。

７、上記第１〜６項のいずれかに記載の核酸からなるイ
ンサートを有する複製可能な組み換え体クローニングベ
ヒクル。

８、上記第７項記載の組み換え体クローニングベヒクル
でトランスフェクション、感染または注入された細胞。

９、上記第１〜６項のいずれかに記載の核酸により遺伝
情報を指定されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
るタンパク質、あるいは５以上のアミノ酸を有するその
ポリペプチドまたはペプチド断片。

１０、上記第９項記載のタンパク質、ポリペプチドまた
はペプチドに対する抗体。

【図面の簡単な説明】

第１図は、トランスメンブレンＣＥＡを概略的に表す。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノステイックス・
インコーポ、レーテッド ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチドの配列の遺伝情報を指定する塩基配列から
   なり、群の核酸は次の５つの配列の群から選択されるＤ
   ＮＡであるか、あるいはこのような５つの配列のいずれ
   かと交雑可能であるか、あるいはこのような５つの配列
   により遺伝情報を指定されるペプチドの配列と実質的に
   同一であるペプチドの配列の遺伝情報を指定する核酸で
   あることを特徴とする核酸： 【遺伝子配列があります】