JPH0211232B2 - - Google Patents

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JPH0211232B2
JPH0211232B2 JP55012111A JP1211180A JPH0211232B2 JP H0211232 B2 JPH0211232 B2 JP H0211232B2 JP 55012111 A JP55012111 A JP 55012111A JP 1211180 A JP1211180 A JP 1211180A JP H0211232 B2 JPH0211232 B2 JP H0211232B2
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glucose isomerase
solution
glucose
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bacterial cells
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Unilever Bestfoods North America
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化グルコースイソメラーゼの製
造方法に関する。
グルコースイソメラーゼはグルコースとフラク
トースを相互に変換する酵素の一般名であり、グ
ルコースからフラクトースを製造する目的に主と
して使われている。即ち、現在グルコースイソメ
ラーゼは工業的にグルコースを異性化してフラク
トース含有シロツプを製造するために使われてい
る。この反応は従来回分式で、高濃度のグルコー
ス含有液を60〜70℃で48時間位グルコースイソメ
ラーゼと接触させる事により行なわれている。し
かしこの反応は回分式のためグルコースイソメラ
ーゼの利用効率が悪く、又高温で長時間反応させ
るため製品が着色し、さらに反応後の精製費が高
くつく等の問題点がある。
そして近年、グルコースイソメラーゼを特殊な
担体、例えばイオン交換樹脂やDEAE−セルロー
スなどに吸着または結合させた固定化グルコース
イソメラーゼを用いての連続異性化が工業的に行
なわれている。
ところでグルコースイソメラーゼは一般に微生
物細胞内で生産される。即ち、グルコースイソメ
ラーゼは大部分それが生産される微生物の細胞壁
の内側及び（又は）細胞壁上に存在する。そのた
め、グルコースイソメラーゼをイオン交換樹脂等
の担体に吸着させるには、グルコースイソメラー
ゼを細胞から取り出し、溶液の形として用いてい
る。このようにグルコースイソメラーゼを溶液の
形として用いる例としては、米国特許第3708397
号明細書、同第3788945号明細書、同第3850751号
明細書及び同第3868304号明細書の記載の方法等
があげられる。しかしこのようにしてグルコース
イソメラーゼをイオン交換樹脂等の担体に吸着さ
せると、イオン交換樹脂等の担体に吸着されるグ
ルコースイソメラーゼの吸着量が低く、その結果
として得られた固定化グルコースイソメラーゼの
連続異性化における異性化反応の効率が低いとい
う問題がある。
本発明者等は、さきにこの原因について研究し
た結果、上記したグルコースイソメラーゼの溶液
中に含まれる多糖類がイオン交換樹脂等の担体に
拮抗的にあるいは優先的に吸着され、イオン交換
樹脂等の担体に対するグルコースイソメラーゼの
吸着を阻害していること、即ち多糖類がグルコー
スイソメラーゼのイオン交換樹脂等の担体による
固定化を困難にしているか、あるいはイオン交換
樹脂等の担体に対するグルコースイソメラーゼ吸
着量が低い原因となつていることを発見した。こ
の多糖類はグルコースイソメラーゼの溶液を一晩
イオン交換水に対して透析した際に透析外溶液中
に遊離されずグルコースイソメラーゼ溶液中に残
留する比較的高分子の糖類を意味する。
そして本発明者等は、さらにグルコースイソメ
ラーゼを吸着する担体、例えばイオン交換樹脂等
による固定化グルコースイソメラーゼの開発に関
し鋭意研究を重ねた結果、グルコースイソメラー
ゼ生産微生物の培養物より多糖類を除去すること
により、グルコースイソメラーゼの固定化に用い
る担体にグルコースイソメラーゼを多量に吸着さ
せることができ、かくして得られる固定化グルコ
ースイソメラーゼの連続異性化における異性化反
応の効率を高めることができることを見出し、こ
れにもとずいて特願昭53−55691号を発明した。
本発明者等は、更にグルコースイソメラーゼ生産
微生物の培養物より多糖類を除去することについ
て研究を続けた結果、本発明を完成するに至つ
た。即ち本発明は、グルコースイソメラーゼ生産
微生物の培養物又はこれより分離した湿潤菌体も
しくはこれに水を加えたものに、非イオン性界面
活性剤を加え自己消化させて多糖類を可溶化せず
にグルコースイソメラーゼを可溶化し、この自己
消化液より固型物を除いて多糖類を全くあるいは
ほとんど含まないグルコースイソメラーゼ含有液
を得、この溶液をそのまゝあるいは精製した後、
グルコースイソメラーゼを吸着する担体に通して
グルコースイソメラーゼを吸着させることを特徴
とする固定化グルコースイソメラーゼの製造法で
ある。
上記のグルコースイソメラーゼ生産微生物の培
養物としてはグルコースイソメラーゼを生産する
微生物の培養物であればすべて用いることができ
る。その具体例としては、例えば放線菌〔例えば
ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス
（Streptomyces olivochromogenes）等〕又はバ
クテリア〔例えばラクトバチルス・ブレビス
（Lactobacillus brevis）又はバチルス・コアギ
ユランス（Bacillus coagulans）等〕等のグルコ
ースイソメラーゼ生産菌として知られている微生
物を培地に培養して得られた培養物があげられ
る。
次に上記グルコースイソメラーゼを生産する微
生物の培養物に直接非イオン性界面活性剤を加え
て自己消化を行わせる。又、上記グルコースイソ
メラーゼ生産微生物の培養物を適当な手段例えば
遠心分離により処理して湿潤菌体を集めこの湿潤
菌体に水を加えたもの例えば上記湿潤菌体の水性
懸濁液に非イオン性界面活性剤を加え自己消化を
行わせることもできる。界面活性剤はその分子中
に親水基と親油基を持ち界面現象の調節に用いら
れている。非イオン性界面活性剤は水溶液中で電
離しないものをいう。
上記の自己消化に際して加える非イオン界面活
性剤としては、例えば以下のものが挙げられる： トリトン（TritonR）〔ローム・アンド・ハース
社（Rohm and Haas Co.）の登録商標〕、ポリ
エチングリコールアルキルフエニルエーテル系の
非イオン界面活性剤であり、例えばトリトンＸ−
100はその１例である； ブリジ（BrijR）〔米国アトラス・パウダー・カ
ンパニー社（Atlas Powder Co.）の登録商標〕、
RO（C2H4O）oＨ〔Ｒ：ラウリル〕なる構造を有す
るポリエチングリコールエーテル系の非イオン界
面活性剤であり、例えばブリジ30、ブリジ35その
他がある； トウイーン（TweenR）〔米国アトラス・パウ
ダー・カンパニー社（Atlas Powder Co.）の登
録商標〕、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪
酸エステル系の非イオン界面活性剤であり、例え
ばトウイーン60は、ソルビタンモノステアレート
のエチレンオキシド縮合物である。
しかしながら、多糖類を可溶化せずにグルコー
スイソメラーゼを可溶化するものであれば、その
他の界面活性剤もまた使用することができる。
上記非イオン性界面活性剤の添加量としてはグ
ルコースイソメラーゼ生産微生物の乾燥菌体重量
当り0.1から20％が適当で、好ましくは0.5から５
％である。
次に上記非イオン性界面活性剤を添加した培養
物、湿潤菌体もしくは湿潤菌体に水を加えたもの
のPHを５乃至８、好ましくは5.5乃至7.5に調整
し、撹拌しながら30℃から70℃、好ましくは45℃
から66℃の温度で10乃至24時間、好ましくは８乃
至15時間自己消化させる。この様に自己消化させ
ると、多糖類は可溶化されず、グルコースイソメ
ラーゼは可溶化されて液中には透析後フエノール
硫酸法で測定した結果全くあるいはほとんど多糖
類が含まれておらず、グルコースイソメラーゼが
含まれることになる。
そこでこの自己消化液を好ましくは室温迄冷却
し、適当な手段例えば過又は遠心分離により固
型物を分離する。この場合、例えばメタノール、
エタノール、プロパノール、イソプロパノール、
アセトン、ｔ−ブタノール、ｐ−ジオキサン等の
有機溶媒を添加して固型物の分離を行うのが効果
的であり、特にイソプロパノールの添加が好まし
い。そして此等有機溶媒の添加量としては、グル
コースイソメラーゼを沈澱させない程度の量を選
んで添加する。例えばイソプロパノールの場合の
添加量は上記自己消化液重量当り30から45％好ま
しくは36〜40％である。尚上記の有機溶媒は自己
消化の終了前迄に添加することもできる。尚この
場合には自己消化の温度としては有機溶媒が実質
的に揮発しない温度を選ぶのがよい。
かくして多糖類が全くあるいはほとんど除去さ
れたグルコースイソメラーゼの溶液を得る。
上記の如くにして得られた多糖類が完全に又は
ほとんど除去されたグルコースイソメラーゼ溶液
をグルコースイソメラーゼを吸着する担体に吸着
させるにあたつては、上記有機溶媒を含まないグ
ルコースイソメラーゼ溶液はそのまゝあるいはこ
れを濃縮して用いることが出来る。上記グルコー
スのイソメラーゼ溶液が上記有機溶媒を含む場合
は、一度グルコースイソメラーゼを適当な手段
で、例えば本溶液当り10〜200ｍMol好ましくは
40〜60ｍMol濃度になるように塩化マグネシウム
又は硫酸マグネシウムを加えてグルコースイソメ
ラーゼを沈澱させ、上澄液を例えば遠心分離して
除き、生じたグルコースイソメラーゼの沈澱をイ
オン交換水に溶かして多糖類を全くあるいはほと
んど含まないグルコースイソメラーゼの含有液を
得る。
上記の如くにして得られた、多糖類が完全に又
はほとんど除去されたグルコースイソメラーゼ含
有溶液をグルコースイソメラーゼを吸着する担体
に通してグルコースイソメラーゼを吸着させる。
このグルコースイソメラーゼを吸着する担体と
しては、例えばグルコースイソメラーゼを吸着す
るイオン交換樹脂、DEAEセルローズ、塩基性炭
酸マグネシウム、コロイダルシリカ、活性炭、コ
ントロールドポアアルミナなどが挙げられる。
そしてグルコースイソメラーゼを吸着するイオ
ン交換樹脂としては、例えばアンバーライトIRA
−904、アンバーライトIRA−938、アンバーライ
トIRA−93〔いずれも東京有機化学工業(株)製、商
品名〕、ダイヤイオンPA−302、ダイヤイオンPA
−304、ダイヤイオンPA−308、ダイヤイオン
WA−20〔いずれも三菱化成工業(株)製、商品名〕、
デユオライトＡ−２、デユオライトＡ−７、デユ
オライトＳ−30、デユオライトES−561、デユオ
ライトES−562〔いずれも米国ダイヤモンド・ジ
ヤムロツク・ケミカル社製商品名〕等が挙げられ
る。
つぎにグルコースイソメラーゼを吸着する
DEAEセルロースとしては例えばセレクターセル
−20（西独ブラウン社製商品名）が、コロイダル
シリカとしては例えばルドツクスHS−30、ルド
ツクスHS−40、ルドツクスAM、ルドツクス
TM（米国デユポン社製品、商品名）及びスノー
テツクス20、スノーテツクス30、スノーテツクス
Ｎ（日産化学社製品、商品名）などが、コントロ
ールドポアアルミナとしては例えば米国コーニン
グ社製品が、そして活性炭としては例えばダルコ
Ｓ−51、ダルコG60（デンマークアトラス社製品、
商品名）等があげられる。
そしてグルコースイソメラーゼを吸着する上記
担体に多糖類を全くあるいはほとんど含まないグ
ルコースイソメラーゼ含有溶液を通してグルコー
スイソメラーゼを吸着させるにあたつては、該溶
液をそのまゝあるいは適当な濃度（グルコースイ
ソメラーゼ濃度は50U／mlから1000U／ml好まし
くは3000U／ml前後）（なおグルコースイソメラ
ーゼの活性は、グルコースイソメラーゼを10ミリ
モルMgCl2、１ミリモルCocl2の存在下で、60℃
で100ミリモルのグルコース溶液に作用させた時、
１分間に１マイクロモルのフラクトースを生成す
る酵素量を１単位（1Uユニツト）として表わ
す。）に濃縮又は稀釈した後、これを上記担体に
カラム内あるいは適当な容器内で接触させる。担
体がイオン交換樹脂である場合、その交換基は
OH型、Cl型、SO4型等いずれの型でもよいが、
食塩又は塩酸でCl型にしたものを用いるのが好ま
しい。
グルコースイソメラーゼの上記担体への吸着に
あたつては上記グルコースイソメラーゼ含有溶液
のPHは４〜11、特に７〜８附近であることが望ま
しい。またグルコースイソメラーゼの吸着時の温
度は４〜60℃、特に室温が望ましい。カラム内で
のグルコースイソメラーゼの吸着は上記グルコー
スイソメラーゼ含有溶液をSV0.5からSV10（SV
はSpace Velocity：空間速度の略で１時間当り
担体の容積の何倍の液が流れるかを示す値）、好
ましくはSV1.0で流し込むか、又は３時間から24
時間、好ましくは10時間から15時間上記グルコー
スイソメラーゼ含有溶液をカラム内に循環させる
ことにより行なわれる。
また容器内でのバツチ式吸着では、30分から24
時間、好ましくは２時間から５時間撹拌しながら
上記グルコースイソメラーゼ含有溶液を上記担体
に接触させることにより行ない、グルコースイソ
メラーゼを該担体に吸着させる。
かくして多糖類を全くあるいはほとんど含まな
いグルコースイソメラーゼ含有溶液をグルコース
イソメラーゼを吸着する担体に接触させて吸着さ
せ、固定化グルコースイソメラーゼを得る。
かくして本発明によれば、グルコースイソメラ
ーゼ生産微生物の培養物から多糖類を選択的に分
離したグルコースイソメラーゼの溶液を得て、こ
れを用いることにより、グルコースイソメラーゼ
を吸着せしめる担体に対するグルコースイソメラ
ーゼの吸着率を非常に高め、きわめて高い効率で
グルコースイソメラーゼによる連続異性化反応を
行なうことのできる固定化グルコースイソメラー
ゼを容易に得ることができ、その結果として固定
化グルコースイソメラーゼ製造のコストおよび異
性化反応における酵素コストを著しく減じること
ができる。
次に実施例および比較例を挙げて本発明をさら
に具体的に説明するが、本発明はこれにより制限
されるものではない。
実施例 １ グルコースイソメラーゼ生産菌であるストレプ
トマイセス・オリボクロモゲネス（微工研菌寄第
1604号、ATCC21715）を40液体培地（キシロ
ーズ２％、コーンスターチ１％、CSL4％、硝酸
アンモニウム0.2％、MgSO4 7H2O0.05％）に30
℃で約50時間培養し、得られた培養物を１分間に
10000回転で20分間遠心分離して菌体を集め、ミ
キサーで均一にして2700ｇの湿潤菌体を得た。こ
の湿潤菌体の一部を凍結乾燥し、乾燥菌体量を測
定したところ、湿潤菌体の80.0％は水分であつ
た。又、この湿潤菌体の一部を超音波処理し、菌
体を可溶化し、そのグルコースイソメラーゼ活性
を測定したところ、湿潤菌体１ｇあたり384単位
であつた。
この湿潤菌体250ｇ（乾燥菌体重量50ｇ、96000
単位のグルコースイソメラーゼ活性を有する）を
２容フラスコに秤取し、約700ｇのイオン交換
水に懸濁した後、乾燥菌体重量１ｇあたり１％の
Triton Ｘ−100（500mg、米国シグマ社製）を加
え、1N CH3COOH溶液でPHを6.0に調整し、さ
らにイオン交換水で全重量を1000ｇに調整した。
この菌体懸濁液を１分間に200回転の速度で撹拌
バネで撹拌しながら50℃で12時間自己消化を行つ
た。このようにして得られた自己消化液を室温ま
で冷却後、冷イソプロパノール582ｇをゆるやか
に撹拌しながら加えた。この混合物をセライト
535（純正化学社製）を過助剤に用いて、吸引
過し、さらに38重量パーセントのイソプロパノー
ル溶液の約200ｇで菌体残渣を十分洗浄し、液
及び洗液を合せ（1700ｇ）、グルコースイソメラ
ーゼの溶液Ａとし、そのグルコースイソメラーゼ
活性を測定したところ可溶化に用いた菌体のグル
コースイソメラーゼ活性の99.6％にあたる95600
単位のグルコースイソメラーゼが可溶化された。
次に、このグルコースイソメラーゼの溶液
A1700ｇを２容ビーカーにとり、撹拌しながら
MgCl2・6H2O17ｇを加え、室温で１時間撹拌を
続けた後、１分間に15000回転で15分間遠心分離
を行つた。上澄液をデカンテーシヨンによつて捨
て去つた後、沈澱物を約30mlのイオン交換水に溶
解させ精製グルコースイソメラーゼの溶液P43.2
ｇを得、そのグルコースイソメラーゼ活性度及び
全糖類量を測定した。その結果、グルコースイソ
メラーゼの溶液Ｐは、可溶化に用いた菌体のグル
コースイソメラーゼ活性の97.8％にあたる93890
単位のグルコースイソメラーゼ活性を有し、その
単位活性度あたりの全糖類量は2.03（γ／Unit）
であつた。
次にアンバーライトIRA−904、20ml（湿潤）
を2.2×20cmのカラムに詰め、上記の如く調整し
たグルコースイソメラーゼの溶液P4.60ｇ（グル
コースイソメラーゼ9998単位を含む）をSV1の流
速で室温で一晩上記カラム内を循環させたとこ
ろ、100％のグルコースイソメラーゼが吸着され
ることが認められた。
実施例 ２ 実施例１に記載したようにして調製したストレ
プトマイセス・オリボクロモゲネスの湿潤菌体
250ｇ（乾燥菌体重量50ｇ、96000単位）を２容
フラスコに秤取し、約700ｇのイオン交換水に懸
濁した後、乾燥菌体重量１ｇあたり１％の
Triton Ｘ−100（500mg、米国シグマ社製）を加
え、1N CH3COOH溶液でPHを7.0に調整し、さ
らにイオン交換水で全重量を500ｇに調整した。
この菌体懸濁液を１分間に200回転の速度で撹拌
バネで撹拌しながら50℃で12時間自己消化を行つ
た。このようにして得られた自己消化液を室温ま
で冷却後、冷イソプロパノール582ｇをゆるやか
に撹拌しながら加えた。この混合物をセライト
535を過助剤に用いて、吸引過し、さらに38
重量パーセントのイソプロパノール溶液の約200
ｇで菌体残渣を十分洗浄し、液及び洗液を合せ
（1700ｇ）、グルコースイソメラーゼの溶液Ｂと
し、そのグルコースイソメラーゼ活性を測定した
ところ、可溶化に用いた菌体のグルコースイソメ
ラーゼ活性の82.7％にあたる79390単位のグルコ
ースイソメラーゼが可溶化された。
次にこのグルコースイソメラーゼの溶液B1700
ｇを２容ビーカーにとり、撹拌しながら
MgCl2・6H2O17ｇを加え、室温で１時間撹拌を
続けた後、１分間に15000回転で15分間遠心分離
を行つた。上澄液をデカンテーシヨンによつて捨
て去つた後、沈澱物を約30mlのイオン交換水に溶
解させ精製グルコースイソメラーゼの溶液Q41.8
ｇを得、そのグルコースイソメラーゼ活性度及び
全糖類量を測定した。その結果、グルコースイソ
メラーゼの溶液Ｑは、可溶化に用いた菌体のグル
コースイソメラーゼ活性の82.6％にあたる79300
単位のグルコースイソメラーゼ活性を有し、その
単位活性度あたりの全糖類量は6.07（γ／Unit）
であつた。
次にアンバーライトIRA−904、20ml（湿潤）
を2.2×20cmのカラムに詰め、上記の如く調整し
たグルコースイソメラーゼの溶液Q5.27ｇ（グル
コースイソメラーゼ9997単位を含む）をSV1の流
速で室温で、一晩上記カラム内を循環させたとこ
ろ、73.5％のグルコースイソメラーゼが吸着され
ていることが認められた。
実施例 ３ 実施例１に記載したようにして調製したストレ
プトマイセス・オリボクロモゲネスの湿潤菌体
250ｇ（乾燥菌体重量50ｇ 96000単位）を２容
フラスコに秤取し、約700ｇのイオン交換水に懸
濁した後、乾燥菌体重量１ｇあたり１％の
Tween60（500mg、東京化成工業社製）を加え、
1N CH3COOH溶液でPHを6.0に調整し、さらに
イオン交換水で全重量を500ｇに調整した。この
菌体懸濁液を１分間に200回転の速度で撹拌バネ
で撹拌しながら50℃で12時間自己消化を行つた。
このようにして得られた自己消化液を室温まで冷
却後、冷イソプロパノール582ｇをゆるやかに撹
拌しながら加えた。この混合物をセライト535を
過助剤に用いて、吸引過し、さらに38重量パ
ーセントのイソプロパノール溶液の約200ｇで菌
体残渣を十分洗浄し、液及び洗液を合せ（1700
ｇ）、グルコースイソメラーゼの溶液Ｃとし、そ
のグルコースイソメラーゼ活性を測定したとこ
ろ、可溶化に用いた菌体のグルコースイソメラー
ゼ活性の98.8％にあたる94850単位のグルコース
イソメラーゼが可溶化された。
次にこのグルコースイソメラーゼの溶液C1700
ｇを２容ビーカーにとり、撹拌しながら
MgCl2・6H2O17ｇを加え、室温で１時間撹拌を
続けた後、１分間に15000回転で15分間遠心分離
を行つた。上澄液をデカンテーシヨンによつて捨
て去つた後、沈澱物を約30mlのイオン交換水に溶
解させ精製グルコースイソメラーゼの溶液R44.1
ｇを得、そのグルコースイソメラーゼ活性度、及
び全糖類量を測定した。その結果、グルコースイ
ソメラーゼの溶液Ｒは、可溶化に用いた菌体のグ
ルコースイソメラーゼ活性の97.3％にあたる
93410単位のグルコースイソメラーゼ活性を有し、
その単位活性度あたりの全糖類量は2.18（γ／
Unit）であつた。
次にアンバーライトIRA−904、20ml（湿潤）
を2.2×20cmのカラムに詰め、上記の如く調整し
たグルコースイソメラーゼの溶液R4.72ｇ（グル
コースイソメラーゼ9998単位を含む）をSV1の流
速で室温で、一晩上記カラム内を循環させたとこ
ろ、100％のグルコースイソメラーゼが吸着され
ていることが認められた。
実施例 ４ 実施例１に記載したようにして調製したストレ
プトマイセス・オリボクロモゲネスの湿潤菌体
250ｇ（乾燥菌体重量50ｇ、96000単位）を２容
フラスコに秤取し、約700ｇのイオン交換水に懸
濁した後、乾燥菌体重量１ｇあたり１％の
Briji35（500mg、花王アトラス社製）を加え、1N
CH3COOH溶液でPHを6.0に調整し、さらにイオ
ン交換水で全重量を500ｇに調整した。この菌体
懸濁液を１分間に200回転の速度で撹拌バネで撹
拌しながら50℃で12時間自己消化を行つた。この
ようにして得られた自己消化液を室温まで冷却
後、冷イソプロパノール582ｇをゆるやかに撹拌
しながら加えた。この混合物をセライト535を
過助剤に用いて、吸引過し、さらに38重量パー
セントのイソプロパノール溶液の約200ｇで菌体
残渣を十分洗浄し、液及び洗液を合せ（1700
ｇ）、グルコースイソメラーゼの溶液Ｄとし、そ
のグルコースイソメラーゼ活性を測定したとこ
ろ、可溶化に用いた菌体のグルコースイソメラー
ゼ活性の97.5％にあたる93600単位のグルコース
イソメラーゼが可溶化された。
次にこのグルコースイソメラーゼの溶液D1700
ｇを２容ビーカーにとり、撹拌しながら
MgCl2・6H2O17ｇを加え、室温で１時間撹拌を
続けた後、１分間に15000回転で15分間遠心分離
を行つた。上澄液をデカンテーシヨンによつて捨
て去つた後、沈澱物を約30mlのイオン交換水に溶
解させ精製グルコースイソメラーゼの溶液S45.3
ｇを得、そのグルコースイソメラーゼ活性度、及
び全糖類量を測定した。その結果、グルコースイ
ソメラーゼの溶液Ｓは、可溶化に用いた菌体のグ
ルコースイソメラーゼ活性の97.1％にあたる
93210単位のグルコースイソメラーゼ活性を有し、
その単位活性度あたりの全糖類量は2.35（γ／
Unit）であつた。
次にアンバーライトIRA−904、20ml（湿潤）
を2.2×20cmのカラムに詰め、上記の如く調整し
たグルコースイソメラーゼの溶液S4.86ｇ（グル
コースイソメラーゼ10000単位を含む）をSV1の
流速で室温で、一晩カラム内を循環させたとこ
ろ、100％のグルコースイソメラーゼが吸着され
ていることが認められた。
比較例 １ 実施例１に記載したようにして調製したストレ
プトマイセス・オリボクロモゲネスの湿潤菌体
250ｇ（乾燥菌体重量50ｇ、グルコースイソメラ
ーゼ96000単位を含む）を２容フラスコに秤取
し、約700ｇのイオン交換水に懸濁した後、1N
CH3COOH溶液でPHを6.0に調整した。この菌体
懸濁液に、乾燥菌体重量１ｇあたり0.05％のリゾ
チーム（25mg、ベーリンガー・アンハイム社製）
を加え、さらにイオン交換水で全重量を500ｇに
調整した。この菌体懸濁液を１分間に200回転の
速度で撹拌バネで撹拌しながら50℃で12時間消化
を行つた。このようにして得られた消化液を室温
まで冷却後、冷イソプロパノール582ｇをゆるや
かに撹拌しながら加えた。この混合物をセライト
535を過助剤に用いて、吸引過し、さらに38
重量パーセントのイソプロパノール溶液の約200
ｇで菌体残渣を十分洗浄し、液及び洗液を合せ
（1700ｇ）、グルコースイソメラーゼの溶液Ｅと
し、そのグルコースイソメラーゼ活性を測定した
ところ、可溶化に用いた菌体のグルコースイソメ
ラーゼ活性の97.9％にあたる93980単位のグルコ
ースイソメラーゼが可溶化された。
次にこのグルコースイソメラーゼの溶液E1700
ｇを２容ビーカーにとり、撹拌しながら
MgCl2・6H2O17ｇを加え、室温で１時間撹拌を
続けた後、１分間に15000回転で15分間遠心分離
を行つた。上澄液をデカンテーシヨンによつて捨
て去つた後、沈澱物を約30mlのイオン交換水に溶
解させ精製グルコースイソメラーゼの溶液T44.7
ｇを得、そのグルコースイソメラーゼ活性度、及
び全糖類量を測定した。その結果、グルコースイ
ソメラーゼの溶液Ｔは、可溶化に用いた菌体のグ
ルコースイソメラーゼ活性の96.8％にあたる
92930単位のグルコースイソメラーゼ活性を有し、
その単位活性度あたりの全糖類量は8.38（γ／
Unit）と極めて多量であつた。
次にアンバーライトIRA−904、20ml（湿潤）
を2.2×20cmのカラムに詰め、上記の如く調整し
たグルコースイソメラーゼの溶液T4.81ｇ（グル
コースイソメラーゼ10000単位を含む）をSV1の
流速で、室温で、一晩カラム内を循環させたとこ
ろ、61.8％のグルコースイソメラーゼが吸着され
ていることが認められた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 固定化グルコースイソメラーゼの製造方法に
    おいて、 (a) グルコースイソメラーゼ生産微生物を適当な
    媒質中で培養して上記微生物の菌体を得； (b) 上記微生物の菌体の水性懸濁液を約５ないし
    約８のPHにおいてそして約30℃ないし約70℃の
    温度において、菌体中で多糖類を可溶化せずに
    グルコースイソメラーゼを可溶化する非イオン
    性界面活性剤を、上記菌体の乾燥重量に関して
    約0.1ないし約20重量％用いて、グルコースイ
    ソメラーゼを可溶化しそしてグルコースイソメ
    ラーゼ溶液を得るのに十分な時間処理し； (c) グルコースイソメラーゼ溶液を菌体から分離
    し；そして (d) 上記多糖類を吸着しうるイオン交換樹脂上に
    上記グルコースイソメラーゼ溶液からグルコー
    スイソメラーゼを吸着せしめる、 ことを特徴とする上記固定化グルコースイソメラ
    ーゼの製造方法。
JP1211180A 1980-02-05 1980-02-05 Production of fixed glucoseisomerase Granted JPS56109586A (en)

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