JPH02113885A - 多層培養上皮細胞の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、薬物の毒性試験、刺激性試験、浸透性試験
および代謝性試験等の薬物試験を生体外で行なうのに好
適な多層培養上皮細胞の製法に関する。

従来の技術 従来から薬物の毒性試験、刺激性試験、浸透性試験およ
び代謝性試験等においては、特定の病原菌を保持しない
ように管理された環境下で飼育されるＳ　Ｐ　Ｅ（ｓｐ
ｅｅｉｆｉｃ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｆｒｅｅ）動物ま
たは管理された交配下で得られる系統や遺伝特性の明確
な動物等の実験動物が生きして利用されている。

例えば、毒性試験や刺激性試験においては、薬物を種々
の手段によって動物体内へ投与してその生体的変化を追
跡し、また浸透性試験においては、動物の皮膚表面に塗
布して経時的に採取する血液中の薬物や代謝物の濃度を
調べるか、または動物の腹部や背面等の特性の部位から
採取する皮膚片に対する薬物の浸透性を種々の手段で調
べる等の方法が採用されている。

しかしながら、実験動物を用いる試験には相当な費用と
労力を必要とするばかりでなく、最近特に活発化してい
る動物愛護運動の影響等もあって入手源や使用が制限さ
れ、また動物個体間でデ−夕のばらつきが大きい等の問
題がある。

このため、実験動物を用いる試験法に代替する方法とし
て培養上皮細胞を用いる生体外試験法が利用されるよう
になっている。

例えば、初代もしくは株細胞を培養皿上において培地と
薬物の共存下において培養させ、該培養皿上に付着増殖
する細胞の数や形態等を種々の手段で評価することによ
って薬物の毒性や刺激性等を試験する方法、細胞層上部
もしくはゲルの内部から培地と薬物を供給し、て細胞培
養を行ない、増殖する細胞の数や形態等を評価すること
によって薬物の毒性や刺激性等を試験する寒天ゲル拡散
法もしくはコラーゲンゲル拡散法が知られている。

しかしながら、これらの方法によ−）で得られる結果は
生体内での状態、即ち、被験細胞は三次元的溝戊をとり
、該細胞、智の上部から薬物が供給され、下部から栄養
分が供給されるという状態を正確に反映するものではな
い。

また、別の生体外試験法として、培養ウェル内に膜フィ
ルター付培養セルを配設し、両者の間隙内に培地、例え
ばＭ　Ｅ　Ｍ、　Ｍｅｄｉｕｍ　ｌ　９９、ＭｃＣｏｙ
ｓ　５　Ａ、　ＭｅｄｉｕｍまたはＨａｍ　Ｆ　ｌ　２
等に血清を約１０〜２０％添加した培地を入れ、培養セ
ルの膜フィルター上で培養して得られる培養上皮細胞に
対する薬物の影響を調べる方法が知られている。しかし
ながら、この方法の場合は、被験細胞の培養において、
細胞の接種直後から細胞の増殖と分化が起こり、均一な
細胞層が形成されるまでに細胞分裂が停止するためにピ
ンホールのない均一な三次元的な培養細胞が得られない
という難点がある。ピンホールのある不均一な単層培養
上皮細胞を使用する生体外薬物試験法の場合には、生体
内での状態を正確に友映する結果が得られないばかりで
なく、毒性試験や刺激性試験においてはデータがばらつ
き、また、浸透性試験や代謝性試験を行なうことは不可
能である。

発明が解決しようとする課題 この発明は、従来の薬物の生体外試験法の上記諸問題を
解決し、実験動物を使用する薬物の生体内試験法に十分
に代替し得る生体外薬物試験法に使用するのに好適な培
養上皮細胞を提供するためになされたものである。

課題を解決するための手段 即ち本発明は、培養セルの底部に設けた生体親和性高分
子膜上に上皮細胞を接種し、該上皮細胞をＭＣＤＢ　ｌ
　５３、インスリン、表皮細胞成長因子、ハイドロコー
チゾンおよびウシ下垂体抽出物を含有する培地を用いて
培養することを特徴とする多層培養上皮細胞の製法に関
する。

以下、本発明を添付図に基づいて説明する。

第１因は本発明を実施するのに好適な培養セルの一態様
を示す平面図、第２図は該セルの下面図、第３図は該セ
ルの背可図、第４図は該セルの正面図および第５図は第
１図〜第４図に示す培養セルをマルチ培養ウェルプレー
トに懸垂して上皮細胞を培養する状態を示す部り的断面
図である。

培養セル（１）の底部に設ける生体親和性高分子膜（２
）としては、培養細胞を良好に付着させ、その生存と増
殖を阻害せず、栄養成分や細胞代謝物等を適度番こ通過
させる摸を使用する。

この種の嘆として１よ、生体親和性高分子から製膜して
得られるものをそのまま使用してもよく、あるいは常套
の嗅フィルター（２′）、例えば混合セルロースエステ
ノ呟ポリカーポ坏−ト、ポリエチレン−テレフタレート
、ポリスチレンまたは７ノ素樹脂等を材質とする精密濾
過膜、限外濾過膜または透析膜等を生体親和性高分子で
被覆したものを使用してもよい。但し、顕微鏡的観察を
必要とする場合には、水性溶媒中で透明な四フッ化エチ
レン樹脂、フン素樹脂と他の親水性高分子の共重体もし
くは７ノ素樹脂表面に生体親和性高分子を被覆した膜、
コラーゲンもしくはポリアミノ酸（ポリメチルグルタメ
ート、ポリリジン）から成る膜またはこれらの膜の表面
をプラズマ放電加工した膜が好適であ乙。

生体親和性高分子としては、コラーゲン（１型、■型、
■型、■型）、ファイプロネクチン、ラミニン、イガイ
（Ｍｙｔｉｌｕｓ　ｅｄｕｌｉｓ）の可溶化抽出物［例
えば、バイオ・ポリマーズ社の製品「セル・タフ（Ｃｅ
ｌｌ−Ｔａｋ）コ等］、ポリ−Ｄ−りン゛ン、ＥＨＳマ
ウス腫瘍の可溶化抽出物［例えば、コラポレイティブ社
の製品［マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）Ｊ等］、ヒド
ロネクチンおよび血清中の細胞接着因子含有成分等が例
示されるが、特にコラーゲン■型及び■型と他型の複合
またはイガイ可溶化抽出物が好ましい。

上記の生体親和性高分子を膜フィルターに被覆する態様
においては、生体親和性高分子を溶媒、例えば、培地、
水、緩衝液（例えば、ダルベツコのリン酸緩衝液、ＨＥ
ＰＥＳＪｉｉ衝液、Ｈａｎｋｓ’バランス塩溶液、Ｅａ
ｒｌｅのバランス塩溶液）または官製溶媒（例えば、エ
タノール等のアルコール、）に約０，０１〜１％の濃度
で溶解させた溶液を膜フィルター上に塗布し、無菌的に
乾燥を行なった後、紫外線もしくは放射線を照射する。

この場合、溶媒として培地を使用すると、細胞の増殖が
特に良好に行なわれる。

上記の生体親和性膜（２）を底部に設けた培養セル（１
）はマルチ培養ウェルプレート（３）に懸垂され、該生
体親和性膜（２）の上に上皮細胞（４）が接種される。

接種された上皮細胞（４）は、ヒト、マウス、ラット、
ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サノ呟ウシ、
ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギ等の動物に由来する初代
培養上皮細胞もしくは正常二倍体上皮細胞、例えば表皮
角化細胞、乳腺上皮細胞および角膜上皮細胞等から、薬
理試験の目的等に応じて適宜選定すればよい。

この種の上皮細胞は通常、接種前に次の前処理に付され
る： ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質の緩衝液
（ｐＨ約６．８〜７．２）を用いて殺菌される上皮細胞
は数ｍ屑角の大きさに刻んだ後、コラゲナーゼ、ディス
パーゼ、ヒアルロニダーゼやトリプシン等の酵素を用い
組織を細胞ごとに切断し、約３０〜３７°Ｃにおいて約
５〜１５分間保持した後、濾取し、次いで遠心分離処理
に付して得られる沈降細胞を水性媒体に再懸濁させる。

培養セル（１）の生体親和性高分子膜（２）の上に接種
した上皮細胞の培養は、培養セルと培養ウェルとの間隙
に培地（５）を導入することによって行なう。培地（５
）はＭＣＤＢ１５３［ｒグロウス・アンド・ディファレ
ンシェーション・オン・ママリー・エビセリアル・セル
ズ・イン・カルチャー（Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄＤｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｅｐ
ｉｔｈｅｌｉａｌＣａｌｌｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）
Ｊ、ジャパン・サイエンティフッタ・ソサイアティーズ
・プレス、東京（１９８７年）、第７２頁〜第７３頁参
照］、インスリン、表皮細胞成長因子、ハイドロコーチ
ゾンおよびウシ下垂体抽出物を必須成分とし、通常、Ｍ
ＣＤＢ１５３　１０００ｄあたり、インスリン約１〜２
０ｔｔｔｉ／ｒｎＱ、表皮細胞成長因子約１．−５０　
ｐ　ｇ／ｍ（１゜ハイドロコーチゾン約１００〜１００
０μｇ／ｄおよびウシ下垂体抽出物約ｔｏ−１００μｇ
／ｍＱ含有する。

上皮細胞（４）の培養温度および培養時間は所望の培養
上皮細胞の層の厚さ、上皮細胞の種類、上皮細胞の入手
源等に応じて適宜選定すればよく、特に限定的ではない
が、通常は約３５〜３９°Ｃにおいて約５〜２０日間行
ない、これによって約２〜１０層の培養上皮細胞が調製
される。

なお、上記の培養中においては、適当な時間、例えば２
４〜４８時間毎に培養セル（＋）内および培養セル（１
）と培養ウェル（３）との間隙内に存在する培地を新鮮
な培地と適宜交換するのが好ましい。

また、上記の培養を行なった後、所望によりＣａ２＋ま
たは血清等の分化誘導因子を培地に添加してさらに培養
を続行することによって細胞の分化を併発させ、分化細
胞に対する薬物試験用の試料を調製してもよい。

上記のようにしても調製される培養細胞は、生体上皮細
胞に近い層化細胞であり、種々の薬物試験において信頼
性の高いデータを提供する。

本発明による多層培養上皮細胞は、例えば次の様な薬物
試験に使用することができる。

毒性試験 第５図に示す容器に用いて培養した細胞を保をする培養
セル内に、培地に溶かした薬物を入れ、培養セルと培養
ウェルとの間に薬物不含培地を入れた後（培養セルと培
養ウェル内の培地の液面はほぼ等しくする）、インキュ
ベータを使用して、ＣＯ２を５％前後含含量る空気中に
おいて３７℃で培養を所定時間待なう。培養後、生死細
胞の選択的染色を、例えばギムザ染色法等の常法によっ
て行ない、死細胞面積を観察により求めることによって
薬物の毒性を評価する。

なお、薬物は培地に溶かさないで、細胞層上に直接載せ
てもよい。

刺激性試験 上記の毒性試験と同一の方法によって培養を行なった後
、細胞の形態的変化を顕微鏡によって観察して薬物の刺
激性を評価する。

細胞膜浸透性試験 第５図に示す培養細胞を保有する培養セルの内外に培地
を入れ、培養セル内にはさらに薬物または蛍光性物質も
しくは放射性物質で標識しｔ；薬物を入れた後、培養を
所定時間待ない、薬物とは反対側の細胞層へ浸透した成
分、例えば糖、アミノ酸、ステロイド、脂肪酸、無機イ
オン、ペプチド等を分析する。

なお、培養セルの外側のみに培地を入れ、薬物を培養セ
ル内の細胞層上に直接載せることによって上記試験を行
なってもよい。

細胞内代謝性試験 上記の細胞膜浸透性試験の場合と同様にして培養を行な
い、細胞層の反対側に浸透した薬物の代謝物を分析する
。

以下、本発明を実施例によってさらに説明する。

実施例１ 第１図〜第４図に示す培養セルの底部に設けたフッ素樹
脂製膜に、滅菌した３、０ｍｇ／ｍＱの酸可溶性Ｉ型コ
ラーゲン１ｍ（ｌと培地（ＭＣＤＢＩ５３１０００ｍＱ
１インスリン３ｍｇ、表皮細胞成長因子５Ｉ１１９、ハ
イドロコーチゾン１００ｇ＋９およびウシ下垂体抽出物
５６ｍｇ）９＋ｎｐとの混合液０　、２　ｍＱを塗布し
、２０℃で１０時間乾燥した後、紫外線を２０分間照射
した。塗膜を前記の培地０．２ｍＱで３回洗浄した（１
５８μｇ／ｃが）。

次いで、ヒトの表皮角化細胞（５，０ＸＩＯ’細胞／ｒ
ａＱ）をコラーゲン膜上１：　０　、２　ｒｘＱ接種し
、この培養セルを第５図に示すようにしてマルチ培養ウ
ェル内に懸垂させ、培養ウェル内に上記の培地０゜５蝦
入れ、培養を７２時間行なった。この間、２４時間毎に
、培養セルと培養ウェル内の培地を新鮮な培地と交換し
た。

得られた培養細胞層が均一な厚さを有することおよびピ
ンホールを有しないことは、顕微鏡観察において、同一
視野の細胞層の焦点距離が同時に合ったことおよび細胞
染色によって膜上の細胞全体が均一に染まったことによ
ってそれぞれ確認しｔこ。

また、培養細胞層のパラフィン薄片を常法によって作成
し、これを顕微鏡で観察したところ、細胞層は均一な３
層であった。

実施例２ 実施例）で使用した培養セルと同様の培養セル内には、
上記培地にラウリル硫酸ソーダを５　ｐ［’４１０ｐｐ
ｍ、２５ｐｐｍ、　　５０ｐｐｍまたはｌ　ＯＯｐｐｍ
添加した培地を入れ、培養を２４時間行なった後、培養
セル内の細胞層をトリバンブルーで染色し、染色した死
細胞面積を顕微鏡によって調べたところ、ラウリル硫酸
ソーダを５ｐｐｍ、　　ｌ　Ｏｐｐｍまたは２５ｐｐｍ
添加しＩ；培地を用いた場合には細胞の染色は認められ
なかったが、５０ｐｐｍまたはｌ　ＯＯｐｐｍ添加した
培地を用いた場合にはほぼすべての細胞が均一に染色し
、すべての細胞層が薬物に対して同等の感受性を示した
。

発明の効果 本発明によって得られる多層培養上皮細胞は、厚さが均
一で、ピンホールを有さない生体上皮細胞に近似する層
化細胞であり、種々の薬物試験等に使用する場合には、
生体内の状態を正確に反映する信頼性の高いデータを提
供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施するのに好適な培養セルの一態様
を示す平面図、第２図は該セルの下面図、第３図は該セ
ルの背面図、第４図は該セルの正面図および第５図は第
１図〜第４図に示す培養セルをマルチ培養ウェルプレー
トに懸垂して上皮細胞を培養する状態を示す部分的断面
図である。 （１）は培養セル、（２）は生体親和性高分子膜、（２
″）は膜フイルタ−、（３）はマルチ培養ウェルプレー
ト、（４）は上皮細胞、（５）は培地を示す。 第１ 図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、培養セルの底部に設けた生体親和性高分子膜上に上
   皮細胞を接種し、該上皮細胞を、ＭＣＤＢ１５３、イン
   スリン、表皮細胞成長因子、ハイドロコーチゾンおよび
   ウシ下垂体抽出物を含有する培地を用いて培養すること
   を特徴とする多層培養上皮細胞の製法。 ２、請求項１記載の製法によって得られる多層培養上皮
   細胞。 ３、請求項２記載の多層培養上皮細胞を使用する薬物試
   験方法。