JPH02115200A - ヘモグロビン系血液代用物質およびその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血液代用物質に関する。さらに詳しくは、本発
明はヘモグロビン系血液代用物質およびその調製方法に
関する。

〔従来の技術〕

公知のように、輸血は、現代の臨床医学で用いられる一
般的に許容された救命手段となってきている。相当量の
血液損失は、これが血量および血圧を低下させ、重要組
織への酸素供給を制限しそして代謝の進行を遅らせるた
めに大変危険である。

しかしながら、輸血用血液を集め、これを保管しそして
投与することは、たとえば制限された供給源、適合性お
よびある種の疾病（たとえば、肝炎、エイズ、マラリア
等）を媒介する危険性等の深刻な問題を含むやっかいな
課題である。さらに、実際に輸血を行なうこと考えた場
合、医学的原因によるばかりでなく論理上、たとえばそ
の場所での入手可能性、輸送および保存状態等のより複
雑な課題に遭遇する。

上記課題を考慮した上で、血液代用物についての追求が
真剣に考えられ、多くの関連論文および特許文献を、関
連文献中に見い出すことができる。

血液代用物の２つの主なグループが文献中に言及されて
いる：　（ａ）ペルフルオロカーボン系、および（ｂ）
ヘモグロビン系である。ペルフルオロカーボン系代用物
は環状−１枝分れしたまたは直鎖の分子であり、それら
の水素原子がフッ累原子で置換されている。強い炭素−
フッ素結合のために、これらの化合物は化学的にも生物
学的にも非常に不活性なものと一般的に考えられている
。

これらは物理的溶解により酸素を吸着することができ、
吸着量は平衡ガス相の組成に応じて直線的である。しか
しながら最近の研究では、ペルフルオロカーボンが幾つ
かの欠点、たとえば免疫系における不利な反応、血液学
上の障害、プロスタグランジン代謝の変性、凝集過程の
悪化等を有することがわかった。

従って、本発明はヘモグロビン系代用物に関し、さらに
幾つかの検討が前記課題に対して提供されるであろう。

既知のように、ヘモグロビンは非直線的特性を有する態
様で酸素と結合し、これによりオキシヘモグロビンとし
て公知である化学種が形成される。理想的ヘモグロビン
系血液代用物は、肺からの酸素を重要組織および器官へ
輸送供給し、そしてこれらの組織と器官から二酸化炭素
を肺へ戻すことができるべきものである。同時に、多量
の投与量にも耐えることができるように最小の副作用を
有すべきである。

また、ヘモグロビンは四量体タンパク質であり、２つの
異なったタンパク質相、αとβの同数からなる。生理学
的条件下では、主要な分子種は前記四量体であり、約６
５．０００の分子量を有する。浦乳動物において、ヘモ
グロビンは赤血球に存在し、その膜はリン脂質、コレス
テロールおよびタンパク質からなるストロマを含む。

以後、「ストロマ不含有ヘモグロビン」および「ストロ
マ減損ヘモグロビン」は交換可能に使用され、そして両
方ともほとんどすべてのストロマ成分が除去されたもの
に由来する生成物であることを意味する。

血液代用物として、酸素輸送能力を示すストロマ不含有
ヘモグロビン溶液を用いる試みが行なわれてきた。これ
らの溶液は限定された期間室温下でこれらの性質の変化
を受けることなく貯蔵に耐える。しかしながら、酸素は
ヘモグロビンと非常に強く結合し、このため結合した酸
素のほんの少量部分だけが通常組織で広く行なわれてい
る酸素圧で細胞へ放出されるにすぎない。また、これら
溶液の主要な特性のすべてがヒト血液のものと同じであ
るとは限らない。これらの例としては、必要とされる濃
度において、相当する膠質浸透圧（ｏｎｃｏｔｉｃ　ｐ
ｒｅｓｓｕｒｅ）は通常の血液のものとかけはなれる。

別の研究でもまた、ストロマは、たぶん細い腎臓脈管構
造の閉塞を起こすことにより毒性要因となる。ストロマ
不含有ヘモグロビンが有する幾つかの好ましい特性を考
慮した上、血液代用物としてこれを使用した場合に遭遇
する欠点を改善させる目的で、集中的に研究が行なわれ
てきた。

１つのアプローチは、その構造を変化させその酸素親和
性を減少させることであった。この目的のために、ベネ
シュらは（Ｂｅｎｅｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）　［Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１１．３５７６−３５８２
（１９７２）　］により、］ピリドキサル−５′−ホス
フェート以後、ｒＰＬＰ　Ｊと称する）でストロマ不含
有ヘモグロビンを処理することが提案された。得られた
生成物、すなわちピリドキサル−５フーホスフエートヘ
モグロビン（以後、ｒＰＬＰ−ヘモグロビン」と称する
）は、実際に満足する酸素親和力を有するが、しかし血
管的寿命が再生物質に要求されるものと比べてあまりに
短かい。

ストロマ不含有ヘモグロビンの構造を変性する同様のア
プローチに基づいて、米国特許第４．０６１．７３６号
明細書には、アルデヒド、ジアルデヒド、活性化尿素、
カルボン酸誘導体、複素環式トリアジンオヨびハロゲン
化芳香族シクロアルカンから選ハれる試薬と反応させる
ことにより分子内架橋したストロマ不含有ヘモグロビン
を得る方法が記載されている。

米国特許第４．５９８．０６４号明細書によれば、スト
ロマ不含有ヘモグロビンは、アシル化剤を用いて四量体
のα鎖の間で分子内架橋することにより変性される。得
られる生成物は、適切な酸素結合能力たとえば低酸素親
和力を有する有効な血液代用物であり、特に虚血症の処
置に有効である。同じく研究された別のアプローチは、
ヘモグロビンの変性により酸素結合特性と血管内滞留の
両方ともを向上させる試みからなる。すなわちＰＣＴ特
許出願第８４１０４２４８号明細書によれば、ヘモグロ
ビンはまず最初に２つのβ鎮の間で共有結合的に分子内
架橋し、次いでＰＬＰと反応する。このようにして得ら
れた生成物は安定な酸素運搬物質であり、潅流組織へ酸
素を伝達する能力があり、そして血管内で有利に残存す
ると特許請求されている。

しかしながら、ここで記載した方法により得られる血液
代用物の主な欠点の１つは、その制限された酸素運搬能
力である。

さらに別のアプローチは、ＰＬＰ−ヘモグロビンの重合
法に関する〔シイ、ニス、モス（Ｇ、　Ｓ、　Ｍｏ５ｓ
）ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ　９５，２４９−２５５（１９ｇ
４））　。しかしながら、こうして得られた生成物は、
ここでも制限された酸素運搬能力を有する。

上記従来技術の短かい概説を要約すると、実際、ストロ
マ不含有ヘモグロビンの使用以外にもヘモグロビン系血
液代用物の使用に向けられた幾つかの改良点があるもの
と結論される。したがって、正常血液の性質１種以上を
有する血液代用物に出会うことはできるが、いまだに正
常血液の特性のほとんどを有する血液代用物に対する強
い欲求が存在する。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、正常血液の特性のほとんどを有する血
液代用物を提供することにある。本発明の別の目的は、
正常血液の特性のほとんどを有するヘモグロビン系血液
代用物を提供するものである。本発明のさらに別の目的
は、臨床用途に利用可能なヘモグロビン系血液代用物を
提供するものである。本発明の別の目的は臨床用途に有
用なヘモグロビン系血液代用物を得る簡単な方法を提供
するものである。

〔課題を解決するための手段および作用〕本発明は、出
発物質としてのストロマ不含有ヘモグロビンから得られ
るヘモグロビン系血液代用物に関し、そして （ａ）ストロマ不含有ヘモグロビンをピリドキシル化（
ＰＬＰ）Ｌ； （ｂ）ＰＬＰ−ヘモグロビンを分子内安定化し；（ｃ）
分子内安定化したＰＬＰ−ヘモグロビンを嫌気性条件下
で４０％程度以上に重合する、工程を含んでなる。

得られた生成物は、適当な溶媒と再構成すると、ヒトの
全血の特性とほとんど同じでそして未変性ヘモグロビン
溶液の特性と比較して非常に向上した性質により特徴ず
けられる血液代用溶液が得られる。以下の東１表に正常
な生理学的条件下でのヒト全血と、未変性ヘモグロビン
溶液と本発明により得られるヘモグロビン系血液代用物
溶液の主な特性を要約する〔未変性ヘモグロビン溶液の
値は１．ラクス？　ン（Ｌａｋｓｈｍａｎ）ら、Ｊｏｕ
ｒｍａｌ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｉ−ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、　３０＝　１４−２０（１９８１）から取る〕。

第１表 特　性　　　　　　ヒト全血　未変性ヘモグ　血液代用
物ロビン溶液　　　溶　液 Ｐ５０（）ル）　　　　　２６−２９　　　　１２−１
４ＣＯＰ（）ル）　　　　　　　２５−２９　　　　２
０−２５ｐ５０＝ヘモグロビン結合部位の５０％が酸素
で飽和されるときの酸累分圧：通常の生 理学的条件（ｐＨ＝　７．４　、　ｐｃｏ□＝４０トル
、温度３７．０℃）で測定 ｃｏｐ＝コロイド浸透圧（すなわち、オンコテイック）
圧。

上記第１表から明らかなように、本発明により調製され
た血液代用物溶液は、その適切な酸素親和力ならびに通
常のヘモグロビンの生理学的濃度における適切なＣＯＰ
により特徴づけられる。

本発明により調製される血液代用物は、その有利な特性
により特徴づけられる。

ａ）非毒性であること。

ｂ）循環系において適切な寿命を有すること。

Ｃ）適当な溶媒で再構成して得られる溶液が良好な酸素
結合力性と放出性を有すること。

ｄ）適当な溶媒で再構成して得られる溶液がヘモグロビ
ンの生理学的濃度で通常の膠質浸透圧および対応する適
切な酸素輸送能力を有すること。

上記の観点から、この血液代用物溶液を輸血する方が全
血を用いる輸血よりもその実施がより一層簡単である。

なぜならば、輸血の前に“型および適合試験”を行なう
必要がなくしたがって貴重な時間を節約することにより
生命を救うことできるはずだからである。

血液代用物に要求される重要な特性の１つは、適切な酸
素解離曲線を有することである。第１図には、ヒトの全
血（ＩＩ）と、本発明により調製された血液代用物の溶
液（ＩＩＩ）そしてストロマ不含有ヘモグロビンであっ
て前記血液代用物の出発物質の溶液（Ｉ）に対する特性
を明瞭な態様で示す図である。第１図から明らかなよう
に、血液代用物溶液のＰ、。（２５−３０１−ル）は、
ヒト全血のもの（２６−２９）ル）とほとんど等しいが
、一方ストロマ不含有ヘモグロビン溶液のＰ５０　（１
２−１４）ル）は全血のものより非常に低い。

血液代用物に必要な別の重要な特性は、肺から組織へ酸
素を運ぶ適切な能力を有することである。

この特性は第２図に図式的に示されており、図中（Ａ）
はヒト全血に対し、（Ｂ）は本発明により調製された血
液代用物溶液、（ｃ）は従来技術で記載されている重合
ＰＬＰ−ヘモグロビンから得られた血液代用物溶液〔シ
イ、ニス、モス（Ｇ、　Ｓ。

Ｍｏ５ｓ）　　ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ９５，２４９−２５
５（１９８４）Ｅおよび（Ｄ）は従来技術で記載される
分子内架橋ピリドキシル化ヘモグロビン（ＰＣＴ特許出
願第８４１０４２４８）号明細書、（Ｅ）はフルオロゾ
ル（Ｆ　１ｕｏ５０ｌ）　ＯＡフルオロカーボンエマル
ジョン〔エイチ、オーヤナギ（Ｈ９Ｏｈｙａｎａｇｉ）
　　とライ。サイトウ（Ｙ、　５ａｉｔｏｈ）、Ｉｎｔ
−Ｊ、　Ａｒｔ、　Ｏｒｇａｎｓ　９．３６３−３６８
（１９８６）　］および（Ｆ）は必要な膠質浸透圧を示
すストロマ不含有ヘモグロビンである。この図から明ら
かなように、酸素運搬能力（これは通常の生理学的条件
下でヒトの全血と比較して測定される）は、本発明によ
り調製される血液代用物が１００％であり、これに比べ
て従来技術の血液代用物溶液が６５％または６０％、フ
ルオロカーボンは８％、そしてストロマ不含有ヘモグロ
ビン溶液が６％である。

本発明により調製されるヘモグロビン系血液代用物は、
患者に室内空気を当てたとき酸素の適切な量を運ぶ能力
のために、体液喪失性ショックにかかった嫌性者の血液
代用物として提案されたペルフルオロ化学物質と比べ非
常に優れている。またこれは急性の心筋梗塞および脳血
管障害の治療にも使用される。

本発明により調製される血液代用物の向上した特性は、
分子内で安定化したＰＬＰ−ヘモグロビンの重合の結果
である。この重合は酸素の不存在下でのみ行なわれ、そ
して重合割合は少なくとも４０％以上、好ましくは５０
％〜８０％の範囲であることが条件である。

第３図では酸素飽和度（％）と酸素分圧（トル）を相関
させる２つのグラフを示す。曲線Ｉは、特に前記重合を
酸素不存在下に行なう場合の本発明により調製された血
液代用物溶液の酸素解離曲線であり、一方曲線■は前記
重合を酸素の存在下に行なう場合のものである。次の第
２表に酸素の存在または不存在下で得られる生成物の主
な特性を示す。

第２表 特 性 一ヘモグロビン濃度 （ｇ／　１００ｍｆ） 酸素の不存在下で　酸素の存在下で 得られる生成物　　得られる生成物 １２、４　　　　　　１４．５ 上記データから、酸素存在下での重合によりＰ５Ｑ＝２
４）ルの生成物が得られ、これは酸素不存在下の重合に
より得られる相当する生成物のもの（ＰＳＧ＝２８　）
ル）よりも非常に低いことが明白である。また、重合を
酸素の存在下に行なった場合の生成物におけるメトヘモ
グロビン含有率は不存在下のものより非常に高い（それ
ぞれ１６．９％と５．５％）。

この工程での重合剤は様々な化合物から選択され、これ
はたとえばグルタルアルデヒドまたはコハク酸ジアルデ
ヒドもしくはその前駆体たとえば２−エトキシ−３，４
−ジヒドロ−１，２−ピラン、２・５−ジェトキシテト
ラヒドロフラン、２−アミノ−４，６−ジクロロ−３−
）リアジン、ビス−ジアゾベンジジン２．２′−スルホ
ン酸、１．５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン
、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタジェ
ンジェポキシド等である。

一般に、重合剤は、ｐＨ６，５〜８．５好ましくは７．
５の安定化ＰＬＰ−ヘモグロビンのＰＩＵ　ｔｊｒ溶液
へ添加される。

最も好ましい態様においては、得られた重合生成物をア
ミン溶液で不活化し重合剤の活性基を含む部分が最終生
成物に残ることを避ける。

したがって、アミンは重合剤の未反応基すべてを不活化
するのに十分な量添加される。たとえばエタノールアミ
ンやリジンのようなアミンが好ましい試薬であるが、他
の試薬も使用することができ、たとえば亜硫酸水素塩、
ジオール、アルコール、イソシアネートおよびメルカプ
タンでもよい。

嫌気的に行なう場合、メトヘモグロビン含有率の増加を
避ける追加の任意の工程は、ホウ水素化ナトリウムを用
いた還元である。この段階は重合剤により作られる二重
結合の飽和を確実にしこれにより重合したヘモグロビン
へ侵れた安定性を付するものである。ホウ水素化ナトリ
ウムの導入時点で二重結合の還元とは別に重合剤により
導入された残留カルボニル基もまた還元されるので、不
活化剤の添加は一般に不必要である。はとんどの場合、
重合後に１つの追加工程のみ、すなわちホウ水素化物で
不活化または還元することが必要であろうが、重合生成
物の高度の安定性が重合工程の正確な調節とともに必要
であるような特殊な場合には、２つの追加工程を必要と
してもよい。当業者であれば、血液代用物に対し特別に
要求されるものにしたがって適切な工程を選ぶことがで
きるであろう。

本発明によるヘモグロビン系代用物を得る方法の利点の
１つは、市販されまたは容易に合成されうる普通の薬剤
の使用であり、これらの試薬は一般に、本発明の目的に
対し有用である。得られた生成物は、３％グルコースま
たは当該技術分野で公知の他の保護剤の存在下で凍結乾
燥してもよく、再構成により強力な再生液としてのその
酸素−輸送特性に変化がない。

本発明により調製される血液代用物溶液のみが第１表お
よびこの方法の第１図と第■図に示されるように正常な
血液の主要な特性のすべてを有するということは重要で
ある。文献に記載される様々な方法で調製される他の生
成物は、グルタルアルデヒドを用いて得られるものでさ
え正常血液の少なくとも１つの主要な特性が欠けている
。たとえば、グルタルアルデヒドで重合したデオキシヘ
モグロビン（米国特許第４．０５３．５９０号明細書の
例■）およびピリドキシル化グルタルアルデヒド−重合
ヒトデオキシヘモグロビン〔エフ、デベヌト（Ｆ、　　
ＤｅＶｅｎｕｔｏ）　　ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ３４、２０５−２１
２（１９８３）　）のような場合である。

要約すると、本発明により調製される血液代用ヘモグロ
ビン系物質は、これが遅滞なく医療補助費により使用さ
れ得るので、体液喪失性ショックの緊急治療用として優
れた製品である。このものは調製が容易で、長期間の貯
蔵寿命を有し、そして患者が室内空気を吸い込んでいる
とき広がった組織へ酸素を放出するものである。このも
のは戦闘犠牲者および体液喪失性ショック以外の多くの
緊急事態において使用されうる。このものは心臓外科に
おいて使用される体外ポンプまたは血液循環もしくは血
液透析のような血液療法に使われる体外装置において呼
び水として使用するための理想的全血代用物である。こ
のものはまた鎖状赤血球症状におけるスラッジ凝集およ
び痛みを含む虚血性エピソードの治療に使用され得る。

これは移植するまで器官生存能力を維持するための器官
潅流液として使用され得る。

〔実施態様〕

第一工程ではストロマ不含有ヘモグロビンを得ることが
必要である。これはパックした赤血球細胞または様々な
浦乳動物種由来の全血を出発物質として行なわれる。ス
トロマ不含有ヘモグロビンを得る様々な公知方法があり
、それらの多くは本発明に適する出発物質を調製する。

公知のように、スト叱マがヘモグロビン製剤中に多量に
存在すると、腎機能を妨害する。過去の研究によればス
トロマが細い腎臓血管の閉塞を起こすことが示されてい
る。すでに多くの文献に、ヘモグロビン溶液からストロ
マのほとんどを除くことによりこの欠点を除（ことが記
載されている。

ストロマ不含有ヘモグロビンを調製するために本発明で
選ばれる方法は、デヌートらによる論文ＣＪ、Ｌａｂ、
　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　８９．５０９−５１６（１９
７７）］に十分に記載されている。

第２工程では、ストロマ不含有ヘモグロビンがベネシｘ
　（Ｂｅｎｅｓｃｈ）　　らが記載したもの（Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１．３５７６−３５８２（１９
７２）　Ｅと同様の方法を用いてピリドキシル化される
。文献に言及されているように、ＰＬＰ−ヘモグロビン
の得られる溶液は普通の生理学的条件でＰＳ（ｌが２０
−２４　）ルであり、これに対し未変性ヘモグロビンの
相当する溶液で示されるｐ５０は１２−１４）ルである
。

第三工程は、ＰＬＰ−ヘモグロビンの分子内安定化に関
する。これはジカルボン酸のハロエステルから選ばれる
化合物を用いる化学反応により行なわれる。これらのハ
ロエステルとしては、たとえばビス（３，５−ジブロモ
サリシル）グルタレート；ビス（３，５−ジブロモサリ
シル）アジペート、ビス（３，５−ジブロモサリシル）
フマレート；ビス（３，５−ジクロロサリシル）フマレ
ート；ビス（３，５−ジョードサリシル）フマレート；
ビス（３，５−ジブロモサリシル）スクシネートである
。反応によりヘモグロビン分子の２つのβ鎖の間に共有
結合によるグルタレート（またはアジペート、スクシネ
ート、フマレート等〉の架橋が導入される。この変性に
よりＰＬＰ−ヘモグロビン溶液と比較して生成物の向上
した血管的滞留と酸素輸送能力とがもたらされる。普通
の生理学的条件下で、この分子内安定化後の溶液のＰ５
０は、２８−３１　）ルまで上昇し、この値はヒト全血
の通常のＰＳＱよりもなおかなり高い。この反応を行な
うには幾つかの変法があるが、本発明に特に適するもの
はアール、ダブリュ、タイ（Ｒ，Ｗ、　Ｔｙｅ）らによ
り記載された経路［：Ａｄｖｏｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｌｏ
ｏｄＳｕｂｓｔ、１ｔｕｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、ア
ール、ビイ、ボリン（Ｒ，Ｂ、Ｂｏｌｉｎ）　、アール
、ピ仁ゲイヤー（Ｒ９Ｐ。

Ｇｅｙｅｒ）とシイ、ジェイ、ネモ（Ｇ、　Ｊ、　Ｎｅ
ｍｏ）著、アランアール、リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ
５ｓ　Ｉｎｃ、）１９８３．　ｐ４１−４９〕である。

第四工程は、循環系における向上した寿命と適切なオン
コテインク圧を備えた血液代用物を得るための重要なも
のである。この工程は、前段階で得られた安定化ＰＬＰ
−ヘモグロビンを、嫌気性条件下で重合度４０％以上好
ましくは５０％〜８０％の程度に重合することを含む。

この重合は、アミン基とヘモグロビン分子内の他の結合
可能な部位とを反応させうる基を有する多官能薬剤を用
いて行なわれる。特に、二価または多官能カルボニル含
有化合物との反応が有用である。この群の物質のうぢで
グルクルアルデヒドが優れた結果を生ずることが見出さ
れた。重合剤とヘモグロビンの好ましいモル比は１；１
〜３０：１であることがわかった。この工程で必要とさ
れる無酸素露囲気は、窒素のような不活性ガス気流を連
続的にバブルすることにより維持される。好ましくは、
ヘモグロビン濃度７〜１６％ｗ　／　ｖを有する安定化
ＰＬＰ−ヘモグロビンを溶液中で反応を行なう。反応期
間中の発泡を防ぐために消泡剤の添加が提案される。

場合により、この工程の最後に生成物をホウ水素化ナト
リウムで不活化および／または還元してその品質を向上
するようにしてもよい（同様に、本発明の詳細な説明の
項を参照）。

得られた生成物は、血液代用物に望まれる特性を有する
。

本発明をさらに次の例を用いて説明するが、本発明はこ
れらに限定されない。例■は本発明を説明するものでは
なく比較の目的でのみ提示されていることを指摘してお
（。

例　　■ 工程１゜ ストロマ不含有ヘモグロビンの洗浄した結晶の溶液を、
デベヌト（ＤｅＶｅｎｕｔｏ）らの方法ＣＪ、　Ｌａｂ
。

Ｃｌ１ｎ、、　！、４ｅｄ　８９５０９−５１６（１９
７７）　〕にしたがって調製し、そして最初に４℃にて
蒸留水（１：２４容量）に対し２回透析してカリウムお
よびホスフェートの含有量を減らし、次いで３回以上（
１：１６容量）トリス−ＨＣβＣβ型を液（０，１Ｍ　
、ｐＨ７，４、またアスコルビンＭ０．２ｇ／βオヨヒ
クルコース（ｇ／β含有）に対し透析した。この工程の
最後に、レテネート（ｒｅｔｅｎａｔｅ）溶液のｐＨは
７．４であった。

得られた溶液に対し滅菌を確実にするため、ペニシリン
Ｇナトリウム、ゲンタマイシンおよび硫酸ストレプトマ
イシンを加え最＃濃度を以下のようにしたニ ー５０．０００１位／β　ペニシリンＧナトリウム−５
０ｍｇ／β　ゲンタマイシン； −５０ｍｇ／ｊ２　　硫酸ストレプトマイシン工程２゜ １５％〜２０％ｗ／ｖの濃度を有する工程１で得られた
ストロマ不含有ヘモグロビン溶液５００Ｔｒ１１を、消
泡剤としてカプリル酸アルコール２．５ｄとともに１．
５β密閉パイレツクス容器へ導入した。窒素気流を連続
してバブルしながら無酸素雲囲気を達成し、そして５０
ｄ）リスーＨＣβ緩衝液（１，０Ｍ。

ｐＨ７，４）　　と２５−トリス−ＨＣｊ’緩衝液（１
，０Ｍ・ｐＨ８，０）との混液にＰＬＰ（１０モル／ヘ
モグロビン１モル）が溶解した脱酸素化溶液を加えた。

ヘモグロビンとＰＬＰとの反応は約２５℃で約１時間連
続した窒素起泡下に行なった。次いで、得られた溶液を
、１ｍ！、ＩのＮａ叶中に脱酸素化したホウ水素化ナト
リウム溶ａ１５ｍｌ？　（２０モル／ヘモグロビン１モ
ル）で処理した。この反応は窒素起泡下、２５℃で２時
間行なった。

工程３゜ この工程は、工程２で得られたＰＬＰ−ヘモグロビン生
成物の分子内安定化である。同じ容器において、トリス
−ＨＣβ緩衝液（０，５Ｍ、ｐ）１８．０）５０ｍｆに
ビス−（３，５−ジブロモサリシル）フマレート（２モ
ル／ヘモグロビン１モル）を溶解した脱酸素化溶液を加
えた。反応は酸素の不存在下に行なわれ、窒素ガスを約
２時間３５℃にて連続的にバブルさせながら吹込み、得
られた混合物をそれぞれ３０分間４℃にて１２．０００
　ｘ　ｇで２回遠心分離して粒状物質を除去した。続い
て、このようにして得られた透明溶液を、０．２ｇ／β
アスコルビン酸と１．０ｇ／βグルコースも含む標準腎
透析液（組成比について次を参照；デベヌトら、Ｊ、　
ＬａｂＣｈｉｎ、　Ｍｅｄ、８９．５０９−５１６（１
９７７）　’］　１６容量に対し４℃にて４回透析する
；ｐＨを乳酸で７．０に調整した。

この方法の最後に、滅菌を行うための試薬をレテネート
へ加えて工程１の最終ストロマ不含有ヘモグロビン溶液
に関し言及した濃度にした。

工程４゜ 工程３で得られ、そして１５％Ｗ／Ｖヘモグロビンを含
む分子内安定化ＰＬＰ−ヘモグロビンの５００ｍ１溶液
を、カプリル酸アルコール２．５ｍｆ！（消泡剤として
）とともに１，５β密閉パイレツクス容器へ導入した。

窒素ガスの連続流を約１．５時間溶液中にバブルさせた
。得られた脱酸素化溶液へ、標準腎透析液（ｐＨ７，０
）中のグルタルアルデヒド（２，５％ｗ　／　ｖ　）の
脱酸素化溶液２４−（すなわち、ヘモグロビン１．０ｇ
につきグルタルアルデヒド３ｍｇ）を徐々に加え、その
間窒素ガス気流を続けた。

反応を窒素気流下、２５℃にて約３時間続けると所望の
重合度４０％〜８０％の範囲が得られた。残留活性基の
除去を行うために、上記で得られた生成物を、脱酸素化
した１、０Ｍエタノール−標準腎透析液溶液５０ｍ１で
不活化し、そのｐＨを６Ｍ塩酸で７．５に調節した。２
５℃で１時間不活化後、１ｍ！４のＮａＯＨ中ホウ水素
化ナトリウム溶液１５ｄ　（２０モル／ヘモグロビン１
モル）を嫌気的に加え、そして溶液への窒素ガスのバブ
ルを続けた。２時間後、反応を、４℃にて４回（各々１
　：２０Ｖ／ｕ）標準腎透析液に対し透析することによ
り終了させた。その際、前記透析液には０．２ｇ／βア
スコルビン酸およびＩｇ／βグルコースが含まれ、ｐＨ
は乳酸で７．４に調整されている。重合度分析は、ＴＳ
Ｋ　Ｇ３０００ＳｌｌｌＬＫＢカラムを用いた高性能ゲ
ル透過クロマトグラフィ　（ＨＰ−ＧＰＣ）により行な
われ、そして得られた溶出曲線は反応が５０％重合であ
ることを示した。

ヘモグロビン系血液代用物溶液をさらに処理（滅菌、等
）して従来公知の輸血液を得た。

例■ 各種濃度のグルタルアルデヒド中で分子内安定化ＰＬＰ
−ヘモグロビンの嫌気性条件下での重合。

反応ハ、ヘモグロビン１．０ｇにつキクルタルアルデヒ
ド８ｍｇの代わりに、ヘモグロビン１．Ｏｇにつきグル
タルアルデヒド１０．１２および１６ｍｇを使用する以
外は、例■に記載した手順にしたがって行った。ヘモグ
ロビンＬ　Ｏｇにつきグルタルアルデヒド１６ｍｇを含
む反応混合物は非常に粘稠になり、そしてグルタルアル
デヒド添加後５分で取扱いの全く困難なゲルへ変化した
。ヘモグロビン１．０ｇにつきグルタルアルデヒド１０
ｍｇおよび１２　ｍｇを用いて得られる生成物は第１表
および第１図と第２図で示される特性を示す。

上述の生成物において、ヘモグロビン１．０ｇにつきそ
れぞれ１０ｍｇおよび１２ｍｇのグルタルアルデヒドを
用いて得られた生成物に対し重合度をＩＩＰ−ＧＰＣで
測定したところ６７％と７６％であることがわかった（
添付の第４図を参照）。

例■ ジビニルスルホンを用いた分子内安定化ＰＬＰ−ヘモグ
ロビンの嫌気性重合。この反応の出発物質として例■の
工程３で得られた溶液を使用した。

例Ｉの工程３で得られそして１６％ｗ／ｖヘモグロビン
を含む溶液１３０ｍ７！を、１β密閉パイレツクス容器
へカプリルアルコール０．６５ｍｆとともに導入した。

窒素ガスの連続流で７５分間２５℃にて溶液をバブルし
た。得られた脱酸素化溶液へ、純粋なジビニルスルホン
０．７ｍｌを滴加し、その間窒素ガスを流し続けた。反
応を３時間以上２５℃で続け、依然として窒素ガスを流
し続けた。生成物を脱酸素化した１、０Ｍエタノールア
ミン−標準腎透析液溶液１３−で不活化し、そのｐＨを
６Ｍ塩酸で７．５に調整した。２５℃で１時間不活化後
、１ｍ）４のＮａＯＨ中ホウ水素化ナトリウム（２０モ
ル／ヘモグロビン１モル）が溶解した液４ｍｌを嫌気性
下に加え、次いで溶液への窒素ガスバブルを続けた。１
．５時間後、０．２ｇ／ｊ７アスコルビン酸と１　ｇ／
ｆ！グルコースを含みそしてｐＨを乳酸で７．４に調整
した標準腎透析液に対し４℃にて４回（各々１　：１５
Ｖ／ｕ）透析することにより反応を停止した。このヘモ
グロビン系血液代用物溶液をさらに処理すると従来技術
で公知の輸血液が得られる。

こうして得られた最終生成物は、１３％ｗ／ｖヘモグロ
ビンと６％Ｗ／Ｖメトヘモグロビンヲ含ム。

ｐ５０は通常の生理学的条件（ｐＨ７，４，１１ＣＯ２
＝４０時間）下に３７℃にて測定したところ、４５トル
であることが見出された。

生成物をＨＰ−ＧＰＣで分析しく第５図参照）、そして
重合度は６０％であることが測定された。

最終生成物の１０％ｗ　／　ｖ溶液の膠質浸透圧は２８
トルであった。

例■（比較例） ストロマ不含有ヘモグロビン反応物のピリドキシル化、
分子内安定化および重合化を、例■に記載の工程とほぼ
同じようにして行なうが、ただし重合度はＨＰ−ＧＰＣ
法で測定したときに３２％のみとする（第６図参照）。

生理学的ヘモグロビン濃度１５％ｗ／ｖを有し、適当な
溶媒で再構成して得られる血液代用物は４０トル以上の
膠質浸透圧を有し、これはヒトの全血より非常に高く、
それゆえ適当な酸素輸送能力がないであろう。

予備毒性試験は、本発明により得られる血液代用物の輸
血溶液を用いて６匹の白色マウスで行なった。すなわち
、１２．４ｇ／　１００遊ヘモグロビンを含む血液代用
物溶液０．１ｒｎｌを各マウスの尻尾へ注射した。マウ
スの通常の挙動を輸血後１５日にと殺するまで注視した
。

本発明血液代用液を用いた部分交換輸血（血液量の２５
−３５％）を４匹のウサギで行った。一方の耳の動脈か
ら血液２５ｍｆを採血し他方の耳の静脈を介して血液代
用液２５蔵を直ちに注入することにより交換輸血を行な
い、この操作を所定の交換レベルが達成されるまで１０
分間隔で繰返した。血液置換を受けた４匹のウサギを剖
検のため３〜４４日目に白目するまで生かした。膀胱、
心臓、腎臓、膵臓、肝臓、肺、骨髄、小腸および腹腔平
滑筋に由来する組織の組織病理学試験では何ら異常な徴
候は見られなかった。予備試験では上述の部分交換輸血
で使用される物質に対し６〜９時間の半一消失時間を示
した。

本明細書ではヒトヘモグロビンの利用を説明したが、他
のヘモグロビン供給源たとえばウシまたはブタに由来す
るものも利用されることが考えられるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、それぞれ、ストロマ不含有ヘモグロビン溶液
とヒト全血および本発明血液代用物溶液の酸素解離曲線
を表わし、 第２図は正常な生理学的条件下でのヒト全血および血液
代用物質溶液の酸素輸送能力を示すグラフを表わし、 第３図は血液代用物溶液に対し酸素存在または不存在下
に重合を行なった場合のそれぞれの酸素解離曲線を表わ
し、 第４図は例■において分子内安定化ＰＬＰ−ヘモグロビ
ンを各種濃度のグルタルアルデヒドで重合化した場合の
重合度を示すグラフを表わし、第５図は例■において調
製された本発明の生成物のＨＰ−ＧＰＣスペクトルを示
すグラフであり、第６図は例■（比較例）において調製
された本発明の生成物のＨＰ−ＧＰＣスペクトルを示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストロマ不含有ヘモグロビンから、ピリドキサル−
   ５−ホスフェートで変性し、分子内安定化し、続いて嫌
   気性条件下で安定化ＰＬＰ−ヘモグロビンの４０％程度
   以上に重合することにより得られるヘモグロビン系血液
   代用物質。 ２、ヘモグロビン濃度が、１２〜１０ｇ／１００ｍｌの
   範囲である請求項１記載のヘモグロビン系血液代用物質
   。 ３、Ｐ＿５＿０が、２５〜３０トルの範囲である請求項
   １および２のいずれか一に記載のヘモグロビン系血液代
   用物質。 ４、コロイド浸透圧が、２４〜３１トルの範囲である請
   求項１〜３のいずれか一に記載のヘモグロビン系血液代
   用物質。 ５、メトヘモグロビン含有率が、全ヘモグロビンの３％
   〜６％の範囲である請求項１〜４のいずれか一に記載の
   ヘモグロビン系血液代用物質。 ６、ヘモグロビンが、ヒトの全血またはパックされたヒ
   トの赤血球細胞から得られる請求項１〜５のいずれか一
   に記載のヘモグロビン系血液代用物質。 ７、重合度が、５０％以上である請求項１〜６のいずれ
   か一に記載のヘモグロビン系血液代用物質。 ８、重合度が、５０％〜８０％の範囲である請求項７記
   載のヘモグロビン系血液代用物質。 ９、（ａ）ストロマ不含有ヘモグロビンを調製し、（ｂ
   ）ストロマ不含有ヘモグロビンをピリドキシル化し、 （ｃ）ジカルボン酸のハロエステルと反応させることに
   より、ＰＬＰ−ヘモグロビンの分子内安定化を行ない、 （ｄ）ヘモグロビン分子における結合可能な部位と反応
   しうる基を有する多官能薬剤を用いて、安定化ＰＬＰ−
   ヘモグロビンを嫌気性条件下で４０％程度以上に重合す
   る工程を含んでなるヘモグロビン系血液代用物の調製方
   法。 １０、（ｄ）工程で用いられる多官能薬剤が、カルボニ
   ル基を含む請求項９記載の方法。 １１、前記多官能基が、グルタルアルデヒドまたはその
   前駆体である請求項１０記載の方法。 １２、重合剤とヘモグロビンとのモル比が、１：１〜３
   ０：１である請求項１０および１１のいずれか一に記載
   の方法。 １３、重合に用いられる安定化ＰＬＰ−ヘモグロビン溶
   液が、７％〜１６％（ｗ／ｖ）の範囲のヘモグロビン濃
   度を有する請求項９〜１２のいずれか一に記載の方法。 １４、安定化重合ＰＬＰ−ヘモグロビンを不活化剤溶液
   中で不活化する請求項９〜１３のいずれか一に記載の方
   法。 １５、前記不活化剤が、アミン、亜硫酸水素塩、アルコ
   ール、イソシアネートおよびメルカプタンからなる群か
   ら選ばれる請求項１４記載の方法。 １６、前記アミンがエタノールアミンとリジンからなる
   群から選ばれる請求項１５記載の方法。 １７、安定化重合ＰＬＰ−ヘモグロビンをホウ水素化ナ
   トリウム溶液で還元することからなる請求項９〜１６の
   いずれか一に記載の方法。