JPH0211596A - ヌクレオチド化合物ならびに該化合物を有効成分とするウイルス性疾患治療剤および抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は。塩基性アミノ酸ペプチド、特にポリーＬ−リ
ジンまたはポリオルニチンと結合したヌクレオチド化合
物ならびにその化合物を有効成分として含有するウィル
ス性疾患治療剤および＠腫瘍剤に関する。

〔技術の背景および先行技術〕

ウィルス感染に対しては、へ体の防御機能が千金に機能
する条件の下では、容易に克服することができるが、そ
の防御機能が損なわれたときに発症し、強い障害を起し
て、人を死に到らす。

単純庖診ウィルスの感染によって発症する性器ヘルペス
症は、近年増加の傾向にあるウィルス性疾患の一つであ
り、新生児ヘルペス症の感染源となっている他、子宮原
題の病因とも密接に関係していることが知られている。

またＲ５　　（Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔ
ｉａｌ　）ウィルスは、小児の気道感染症、特に肺炎お
よび気管支消炎等の最も重要な病原ウィルスとされてい
る。また成人の場合、上気道感染によって鼻炎、咽頭炎
または気管支炎などの症状をもたらす。さらにウィルス
性脳炎にあっては、致死率も高く、生命をとりとめても
、後遺症を残し、ウィルス性疾患のうちでも予後の不良
な疾患である。

現在、ウィルス性疾患の治り剤は、全身投与がもたらす
副作用を生じるとともに、また大量投与によっては、結
晶腎障害（Ｃｒｙｓｔａｌ　ｎｅｐｈｒｏｐｈａｔｈｌ
ｍ）症候群さえも起すものがある。また、ウィルスのチ
ミジンキナーゼ酵素によって活性化される払ウィルス剤
の使用は、将来、チミジンキナーゼ酵素の存在しないウ
ィルスの変異耐性株の出現を促がすという問題を有する
。それ故、副作用および毒性の発現ができるだけ少なく
、かつ耐性変異株の出現の可能性の少ない有効な坑ウィ
ルス剤が待望されている。

２′、５′結合リボアデニル酸塩は、一般式＝ｐｐｐ　
５’　　Ａ２’　　（ｐ５’Ａ）　　（ｎ≧２、ｐはリ
ン酸、Ａはアデニン　２１および２′、５′は結合位置
を表わす）または、一般式： 〔式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上
を除いて、常にＨ１アデノシンコールである。

一鳳は、０．１１２．３または４である。

−ｎは、ｌかう１４までの整数である。〕で表わされる
ヌクレオチド化合物であり、ウィルスに感作されたイン
ターフェロン処理細胞抽出液から発見された強力な蛋白
質合成阻害物質である（Ｋｅｒｒ　１．Ｍ、　ａｔ　ａ
ｌ　、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｅｔ
。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、　第２５巻　２５６−２６０頁　１
９７８年）。

２′５′結合リボアデニル酸塩は、インターフェロン誘
起物質である２１　、５′結合リボアデニル酸合成酵素
によって２本鎖ＲＮＡの存在下で、ＡＴＰから生合成さ
れ、細胞内に存在する２’　５’アデニル酸依存性エン
ドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＬ）を活性化して、ｍ
ＲＮＡを切断し、ウィルスの蛋白合成をイルスの細胞内
の増殖を抑制する作用を有する。

したがって　２１５＋結合リボアデニル酸塩はインター
フェロンの尻ウィルス作用の重要なメデイエータ−と考
えられている。さらに、インターフェロンは細胞増殖抑
制による抗腫瘍作用が認められているので（Ｋｌｍｕｅ
ｈｉ　Ａ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ　
−ｅｈｅｍ　、第１１４巻　第５−１Ｏ頁、１９８１年
）、２′５′結合リポアデニル酸塩は、抗ウィルス作用
のみならず、抗ｌｌｌ１１１ｇ作用との関連性について
も、適用の可能性が示唆される。

また、２’、５’結合リボアデニル酸塩は、イオン的性
質のために細胞内に入り込むことが困難であるとともに
　２＋　、　５１−ホスホジェステラーゼによって分解
されるので、生体内または細胞抽出物内の寿命が短かく
、生物学的活性が弱いことが指摘され、この解決のため
に、より安定な２１　、　ｓｌ結合リポアデニル酸塩の
誘導体が提案された（特開昭５９−２０５３９４号公報
）。

しかしながら、この提案された誘導体であっても、その
ままの形では、細胞膜を通過することができず、薬物と
して利用するには、細胞内への何らかの導入手段が必要
とされた。２’、５’結合リボアデニル酸塩については
、現在までに微量注射法（Ｈｉｇａｓｈｉ　Ｙ、　ｅｔ
　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　（Ｔｏｋｙｏ）
　第９１巻　第２０２１〜２０２８頁　１９８２年〕、
リン酸カルシウム共沈法（Ｈｏｒａｎｅｓｓｌａｎ　Ａ
、　Ｇ、＋　ｅｔ　ａｌ。

Ｖｉｖｌｏｇｙ、、　　第１０１巻　第８１〜９ｏ頁　
１９８０年）および高張培地法（Ｂｒｙａｎ　Ｒ，Ｇ、
　ｅｔ　ａｌ、　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、第１０５巻　第４
７〜５２頁　１９７９年）の手段を用いて　２′、　５
＋結合リボアデニル酸塩だけを細胞内に導入し、細胞増
殖およびウィルス増殖の抑制作用が確認されている。し
かしこれらの方法では、細胞膜に障害を生じる欠点があ
るために、生体への応用が不可能であり、結局、２’、
５“結合リボアデニル酸塩またはその誘導体にしても事
実上薬剤としての利用は困難であった。

このように２’、５’結合リボアデニル酸塩またはその
誘導体の一般的な抗ウイルス性お・よび抗腫瘍性は教示
されていたとはいえども、薬物としての利用に問題のあ
ることもあり、特定ウィルスに対する選択的特異的作用
については、不明であった。

一方分子量の大きい、または細胞膜を透過しない物質に
細胞膜の透過性を付与する技術として、毒性の少ない担
体、たとえばポリーＬ−リジンと結合させ、ｍｓ内へ導
入する方法が知られるに至った（Ｓｈｅｎ　Ｗ＋Ｃ，ｅ
ｔ　ｍｌ、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｔ、　ｔｌ、ｓ、Ａ、　７５．１８７２〜１８７６
　、１９７８年）。しかしこの方法の利用可能性につい
ては　２１　、５＋結合リボアデニル酸塩またはその誘
導体に関しては、全く知られていない。

本発明者らは、上記の細胞内への導入手段が２＋　、　
ｓｌ結合リボアデニル酸塩およびその誘導体に利用可能
であり、かつ上記担体に結合したこれらの物質が特に病
原ウィルス、単純ヘルペスウイルスＩＩ型およびＩ型、
ＲＳウィルス、ポリオウィルスおよび水疱性口内炎ウィ
ルスに感作された細胞に対して、細胞内でのウィルス増
殖を非常に仙痛する抗ウィルス作用が見出され、この知
見に基づいて、本発明に到達した。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の目的は、仇ウィルス性およびａｍ瘍性を有する
新規ヌクレオチド化合物を提供することにあり、本発明
のもう一つの目的は、生体細胞内へ容易かつ安全に導入
することができる薬剤として利用可能な新規なヌクレオ
チド化合物を提供することにあり、本発明のさらにもう
一つの目的は、活性が極めて少なく、かつ副作用がない
抗ウィルス剤および坑腫瘍剤を提供することにあり、本
発明の他のもう一つの目的は、病原ウィルス、単純ヘル
ペスウィルス■型および！型、ＲＳウィルス、ポリオウ
ィルスおよび水疱性口内炎ウィルスに対して著効を示す
抗ウィルス剤を提供することにある。

（以下余白） 本発明は、一般式（Ｉ）： Ｃ式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上
を除いて、常にＨ１アデノシン、またはＣ１〜２．Ｆ）
ｔｇｌｆｆｉまたは第２級アルコールである。

腸は、Ｏ１！、２．３または４である。

ｎは、ｌから１５までの整数である。

Ｋは、塩基性アミノ酸ペプチドである。

Ｘは、ｌから１０までの整数である。〕ををし　〕２’
＋５’−インターヌクレオチド結合少なくとも１個のリ
ボースアデニンユニットを有することを特徴とするヌク
レオチド化合物である。

また、本発明は、 一般式（Ｉ）： 〔式中、−Ｙは、Ｙが）でありうる末端ホスフェート上
を除いて、常にＨ１アデノシン、または■は、０．１１
２．３または４である。

ｎは、ｌかう１５までの整数である。

−２は、ＨまたはＣの炭化水素或いは置換炭ｌ　＋−４
０ 化水素であって、その炭素原子の１つを通してモルホリ
ン環のＮ原子に結合する基である。

には、塩基性アミノ酸ペプチドである。

Ｒ′は、水素、アルキル基、芳香族基および他の基から
なる群より選択された基である。

Ｘは、ｌからｌＯまでの整数である。〕を留し　２１　
、５１−インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の
リボースアデニンユニットおよび末端モルホリンユニッ
トを有することを特徴とするヌクレオチド化合物であり
、本発明はまた、上記いずれかのヌクレオチド化合物を
有効成分とするウィルス性疾患の治原剤であり、そのウ
ィルス性疾患の治療は、単純ヘルペスウイルスＩＩ型お
よびＩ型、ＲＳウィルス、ポリオウィルスおよび水疱性
口内炎ウィルスの群から選択されたウィルスに起因する
ウィルス性疾患に対して、特に有効である。

本発明は、さらに上記いずれかのヌクレオチド化合物を
盲動成分として含をするａｍの治蟹剤であり、その腫瘍
の治療は、ｗ瘍がウィルスに起因する腫瘍に対して、特
に有効である。

〔発明の詳細な説明〕

本発明のヌクレオチド化合物は、２’、５’結合リボア
デニル酸塩またはその誘導体に塩基性アミノ酸ペプチド
を結合したものである。

細胞内に導入された２１．５１Ｍ合リボアデニル酸塩は
、ホスファターゼまたはホスフォジェステラーゼなどの
分解＃素により速やかに分解され、不活性化されるため
に、マウスＬ細胞抽出液中における２Ｆ　、　５１結合
リボアデニル酸塩の半減期は約２０分である。従ってこ
れら２′、５′結合リボアデニル酸塩分解酵素に対する
親和性が弱く、活性の持続性があり、またより蛋白合成
狙害作用が強い堰々の誘導体を利用することが望ましい
。これらの誘導体は、次のものが知られている。（特開
昭５９−２０５３９４号公報） 一般式： 〔式中、−Ｙは、ＹｔｆｉＨでありうる末端ホスフェー
ト上を除いて、常にＨ１アデノシン、または謙は、０，
１，２．３または４である。

ｎは、ｌから１５までの整数である。

ｎ＋は、水素、アルキル基、芳香族基および他の基から
なる群より選択された基である。

−２は、ＨまたはＣの炭化水素或いは置換炭１〜５０ 化水素であって、その炭素原子の１つを通してモルホリ
ン環のＮ原子に結合する基である。〕ヲ有り、、、２’
、５’−インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の
リボースアデニンユニットおよび末端モルホリンユニッ
トををすることを特徴とするヌクレオチド化合物である
。

また、塩基性アミノ酸ペプチドは、２′、５＋結合リポ
アデニル酸塩またはその誘導体に担体として結合される
ものであって、例えば、ポリーＬ−リジンは、正電荷を
有する極性の高い、しかもεアミノ酸を持つものであっ
て、２′、５＋結合リポアデニル酸塩の負電荷を中和し
、細胞膜の透過性を高めるため有用であり、また他の担
体としては、毒性が少なく分子の小さいもの、例えばポ
リオルニチンを使用することができる。

次に　２１　、５＋結合リボアデニル酸塩またはその誘
導体と塩基性アミノ酸ペプチドとの結合反応およびそれ
によって得られるヌクレオチド化合物について詳述する
。

２＋　、　ｓｌ結合リポアデニル酸塩とポリーＬ−リジ
ンとの結合反応については、次のとおりである。

先ず、２’、５’結合リボアデニル酸塩の２１末端に存
在するリポースの２１位および３１位の水酸基を水冷下
で過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してアルデヒド基とする
。次に、この酸化型２’、５’結合リボアデニル酸塩に
ポリーＬ−リジンを加え、アルデヒド基とポリーＬ−リ
ジンの６−アミノ基とによってシップ塩基を形成し、さ
らに遊離しているアルデヒド基をシアノ化ホウ素ナトリ
ウムで還元し、ポリーＬ−リリンとの結合反応を完了す
る。

ポリーＬ−リジンと結合した２’、５’結合リポアデニ
ル酸塩は、セファデックスカラムを用い未反応のポリー
Ｌ−リジンから分離し、酢酸ナトリウムで溶出する。次
いで、透析、脱塩、凍結乾燥し、本発明の一つのヌクレ
オチド化合物を得る。また、２１　、　ｓｌ結合リボア
デニル酸塩のうちポリーＬ−リジンと結合しているもの
の割合は、酢酸ナトリウム緩衝液において分光光度計を
用いて吸光度の比の測定から求められる。以上のように
して得られたヌクレオチド化合物は、一般式（Ｉ）：以
上の如く得られた本発明の他の一つのヌクレオチド化合
物は、 一般式（Ｉ）： 〔式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上
を除いて、常にＨ，アデノシン、またはＣの第１晟また
は第２級アルコールである。

１〜２０ 諺は、Ｏｌｌ、２．３または４である。

ｎは、ｌかう１４までの整数である。

Ｘは、ｌからｌＯまでの整数である。〕で表わされる化
合物である。

また　２１　、５１結合リボアデニル酸塩の誘導体の一
つである前記特開昭５９−２０５３９４号公報記戴の２
．５−リボアデニレート−モルホリノアデニレートヌク
レオチドとポリーＬ−リジンとの結合反応についても同
様の方法で調製することができる。

〔式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上
を除いて、常にＨ１アデノシン、またはＣのｇｔ級また
は第２級アルコールである。

１〜２０ ■は、０，１，２．３または４である。

ｎは、ｌから１５までの整数である。

−２は、ＨまたはＣの炭化水素或いは置換炭化水素であ
って、その炭素原子の１つを通してモルホリン環のＮ原
子に結合する基である。

Ｋは、塩基性アミノ酸ペプチドである。

Ｒ′は、水素、アルキル基、芳香族基および他の基から
なる群より選択された基である。

Ｘは、ｌからｌＯまでの整数である。〕を有し、２’　
＋５’−インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の
リボースアデニンユニットおよび末端モルホリンユニッ
トを有するヌクレオチド化合物である。

次に本発明のヌクレオチド化合物の構造は、次のように
して決定された。

（１）ポリ−ローリジンと結合した２、５”結合リボア
デニル酸塩の構造 後記実施例１により得られたポリ−ローリジンと結合し
た２’、５’結合リボアデニル酸塩の酢酸ナトリウム溶
液（ｐＨ：　４・７５）中で吸収スペクトルは、２５８
ｎ■および２２２ｎ■に吸収ピークを持つ特徴的なもの
であり、その結果を第１図に示した。

また、遊離のポリ−ローリジンは、酢酸ナトリウム緩衝
液中で波長２１２　ｎ■にピークを記録したが、２’、
５’結合リボアデニル酸塩との結合によりピークが２２
２　ｎｍに移動し、アデニル環に由来する２５８ｎ■の
吸収ピークに変化がなかつたことから、リボース環とポ
リ−ローリジンの間の結合がわかる。また、ポリ−ロー
リジンおよび２１　、　ｓｌ結合リボアデニル酸塩の構
成モル比は、酢酸ナトリウム緩衝液中での吸収スペクト
ルにおける２５８ｎ■および２２２　ｎｍの吸収ピーク
の比から算出する。この結果から前記一般式（Ｉ）にお
けるーＩの値が求められる。

即ち、２量体、３量体および４量体の２’　＋　５’結
合リボアデニル酸塩の分子吸収係数（ε２５８）は、２
５８００．３４，５００およびａ　ｌ、　６００であり
、ポリ−ローリジンの分子吸収係数は、２０．２１８で
あるから、次式： 吸光度（２５８ｎＪの値７２０，２１８分子吸収係数 より構成モル比が算出される。

なお、水溶液中のポリ−ローリジンと結合した２’、５
’結合リボアデニル酸塩の吸収ピークは、２５８ｎ鳳お
よび２４０　ｎｍ付近から立ち上がり、２２２ｎｍの吸
収ピークを欠く特徴的なものであった。

以上から、ポリ−ローリジンは２’、５’結合リボアデ
ニル酸塩のリボース環に結合していること、酢酸ナトリ
ウム緩衝液中の吸収スペクトルの２５８ａｍと２２２ｎ
■の吸収ピークの比から求めた２’、５’結合リボアデ
ニル酸塩とポリ−ローリジンの構成モル比は１：１〜１
：１０の範囲である。即ち１モルの２’、５’結合リボ
アデニル酸塩に対して１〜１０モルのポリ−ローリジン
が結合している。従って前記一般式（１）で表記される
構造を有する。

（２）ポリ−ローリジンと結合した２Ｔ　、　５Ｔ結合
リボアデニル酸塩の誘導体の構造 後記実施例２により得られた上記誘導体の一つである２
１−末端を修飾した四量体トリホスフェートを上記（１
）と同様にして調べた結果から、誘導体についてもポリ
−し一リジンの結合部位など（１）と同一であった。

他の誘導体についても同様にして、ポリ−Ｌ　−リジン
の結合部位およびポリ−ローリジンとｚ＋　、　５Ｔ結
合リボアデニル酸塩の誘導体の構成モル比が決定され、
前記一般式（１）で表記される構造を有することが確認
された。

本発明の一つのヌクレオチド化合物、即ちポリ−ローリ
ジンと結合した２Ｔ　、　ｓ＋結合リボアデニル酸塩の
抗ウィルス活性について記せば、次のとおりである。即
ち、 ＤＮＡ型ウィルスである単純ヘルペスＩ型ウィルス、単
純ヘルペスＩ型ウィルス、ポリオウィルスおよび水疱性
口内炎ウィルスをヒト由来胎児線継芽細胞腫に感染させ
、増殖阻害濃度を測定したところ、１９Ｍの濃度ではい
ずれのＤＮＡ型ウィルスに対しても有意な増殖抑制効果
を示し、水疱性口内炎ウィルスでは約２５％、ポリオウ
ィルスでは約７５％および単純ヘルペスウィルスではい
ずれも１００％増殖が阻止された。さらに単純ヘルペス
ウイルスＩＩ型およびＩ型に対しては、５０％有効濃度
が約２８　ｎ１４　　（２８ｐｏｏｌ　／ｄ）で得られ
、形態学的変化で観察した細胞毒性も示さず、特異的か
つ非常に低濃度で桓ウィルス作用を発揮することが確認
された。

また、ＲＮＡ型ウィルスであるＲＳウィルスを子宮頴部
癌細胞に感染させ、このウィルスの増殖抑制試験をプラ
ーク検定法で行なったところ、５０％狙害効果が１１　
ｎＭ　（Ｉｆ　ｐｏｏｌ　／　ｍＡ）の濃度で得られ、
細胞毒性は認められなかった。即ち、増殖抑制効果は単
純ヘルペスウィルスに対するものよりさらに効果的であ
った。

本発明の他の一つのヌクレオチド化合物として、２’　
Ｉ　ｓ’　Ｍ合すボアデニル酸塩のグー末端を修飾した
四量体トリホスフェートを誘導体として利用した場合、
同様な試験結果から単純ヘルペスウイルスＩＩ型および
！型に対して０．２ｎＭの濃度で５０％狙害効果がおよ
びＲＳウィルスに対して０＋２　ｎＨの濃度で約４０％
の阻害活性が観察された。それ故、誘導体にもＷＩＮな
扼ウィルス作用があることが示された。

次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例Ｉ：ポリーＬ−リジンを結合した２＋　、　＝、
ｌ結合リボアデニル酸塩からなるヌクレオ チド化合物の調製 ■ポリーし一リジンと２’、５’結合リボアデニル酸塩
との結合反応 ２′、５’結合リボアデニル酸塩四量体３リン酸（生化
学工業社製）　　６０ｐＭｏｌ　　（９０ｐｇ）を４０
μｌの注射用蒸留水に溶解し、水冷下に置いた。これに
６ＯｎＭｏ１の過ヨウ葉酸ナトリウム（シグマ社りが溶
解している０、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：　ａ
、７５）　４μｌを水冷下に加え、タッチミキサーで撹
拌した。水冷下で時々撹拌しながら、３０分間反応を継
続した。

次に、この反応液にポリーＬ−リジン（ＭＷ。

Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　：　２２＋０００、シグマ社製）
　　１４　ｎＭｏ１が溶解している４０ｐＪ！の０．２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：　８．０）およびシ
アノ化ホウ素ナトリウム（半井化学社製）２ｐＭｏｌが
溶解している２０μｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７８，０）を添加し、室温において２時間放置
して、ポリーＬ−リジンと２’、５’結合リボアデニル
酸塩の結合反応を完了した。

■ポリーＬ−リジンを結合した２′、５＋結合リポアデ
ニル酸塩の分画 乾燥重量３ｇのセファデックスＧ５０〔ファイン２２０
−８０ｐ、ファルマシア・ファイン・ケミカル社（スエ
ーデン）製〕に１５０−の注射用蒸留水を加え、１００
℃において３時間膨潤させてゲルを調製した。このゲル
を、直径ｌα、高さ４０αのガラスカラムに充填し、０
．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：　４．７５　）で
平衡化した。この緩衝液を約１−７４分の流量で流して
、２＋ｄ毎に分別した。カラムのボイドボリュームは、
ブルーデキストラン（ＭＷ　：　２　Ｘ　１０６）の０
．１％水溶液１００μＥを用いて測定したところ、約１
４−であった。

次に、ポリーＬ−リジンを結合した２１　、５１結合リ
ボアデニル酸塩の反応液１００μｌをカラムに重層し、
緩衝液と同じ条件において分別した。得られた分画を分
光光度計（日本分光社製）を用い、２５８　ｎｍの波長
において吸光度を測定し、ポリーＬ−リジンを結合した
２’、５’結合リボアデニル酸塩の分画を得た。

■上記の■の分画の精製 セルロースチューブ（シームレス、２０／３２、直径：
１６０ｎ■、三光純薬社製）に、上記の■で得た分画を
入れ、４℃の蒸留水中で一夜透析した後、脱塩し、凍結
乾燥して、本発明のヌクレオチド化合物の一つのポリー
Ｌ−リジンを結合した２＋　、　ｓｌ結合リボアデニル
酸塩からなるヌクレオチド化合物を含有する凍結乾６品
７５μｇ　　（５０ｎＭｏ１　）を得た。回収率は９０
％以上であった。

またこの凍結乾燥品７５　ｕｇ　　（５０ｍＭｏ１　）
を５００μｌの注射用蒸留水に溶解し、さらに１０倍希
釈して、５ｏｏｐｚのセル（光路長：１ｃｍ）を用いて
、２５８　ａｍの波長において吸光度を副室し、分子吸
光係数から、ポリーＬ−リジンを結合した２＋　、　ｓ
＋ｌ結合リボアデニル酸塩濃度を求めたところ、１００
９Ｍであった。

そして２’、５’結合リボアデニル酸塩に対するポリ−
し一リジンの構成モル比は、前述の算出式によると、 １＋６７２０，２１８ ０．７　／　４１，６００ であり、この化合物は、前記の一般式（Ｉ）におけるＸ
の値が５の化合物であった。

実施例２：ポリーＬ−リジンを結合した２＋　、　５＋
結合リポアデニル酸塩の誘導体の２１− 末端を修飾した四量体トリホスフェー トからなるヌクレオチド化合管の調製 実施例１において２’、５’結合リボアデニル酸塩四量
体３リン酸６０　ｎＭｏ１の代りに、その誘導体の２１
−末端を修飾した四量体トリホスフェート６０ｎｅｏ　
１を使用したこと以外は、実施例１と同様にして、ポリ
ーＬ−リジンを結合したこの誘導体の凍結乾燥品６７ｐ
ｇ　　（４５ｎＭｏ＋　）を得た。

２′−末端を修飾した四量体トリホスフェートは次の構
造式を有するものである。

（以下余白） 実施例３：ポリーＬ−リジンを結合したｚｌ、　ｓ＋結
合リボアデニル酸塩からなるヌクレオ チド化合物の！純ヘルペスウイルスＩＩ型および夏型に
対する増殖抑制効果 プラーク検定法を用いて、感染価の測定を行ない、ウィ
ルス増殖抑制効果を確認した。

ヒト由来胎児線維芽細胞腫（１２ないし１３継代）をプ
ラスチックスシャーレ（２４ｙｅｌｌ　、　ＮＵＮＫ社
製）を用い、８％の１牛血清（Ｇｉｂｅｏ社製）添加の
イーグルＨＥＭ培１１１１＋＋＋ｊｌで単層培養した。

細胞間隙が完全に消失した後、培地を捨て細胞表面を１
回洗浄した。洗浄後、θ〜１００Ｏｐ　ＭのＨｉ囲の各
覆濃度に調整した実施例１と同じポリーＬ−リジンを結
合した２’＋５’結合リボアデニル酸塩の水溶液をシャ
ーレの各々の穴（ｔｅｌｌ）に１ｔＲ１ずつ添加し、３
７＠（において３時間培養した。

この培養物に対し、予めＭＥＭ　ｉ地で完全に１回洗浄
し、かつ３０ＰＦＵ（プラーク形成単位）に調整した単
純ヘルペスウィルス夏型（Ｋ２Ｓ株）および夏型（０株
）の希釈薬ｌ−をＭＮした。１０分毎に１〜１．５時間
３７℃においてシャーレを振とうし、これらのウィルス
を細胞へ吸着した。増殖培地で２回洗浄した後、溶解し
た０、８％寒天培養液（２％仔牛血清を含むＭＥＭ　ｉ
地を含む）を吸着後のシャーレに重層した。重層後の寒
天が凝固した後、３７℃において２日間培養して感染増
殖を行ない、プラークを形成し、ニュートラルレッド（
中性、赤色）の適量を添加して染色し、さらに３７℃に
おいて１時間培養した。これに５％ホルマリン溶液の適
量を添加して固定し、その固定液を洗浄し、形成したプ
ラーク数を測定し、次式に従って増殖阻止率（％）を算
出した。

なお対照のプラーク数は、単純ヘルペスウィルス夏型お
よび夏型がそれぞれ３１．５　　（平均値）および４１
．５　　（平均値）であった。

また細胞属性をウィルス感染による培養細胞の形態変化
の観察による＋、士および−の３段階に分けて検定した
。

この２回の測定結果の平均は８１表に示すとおりであっ
た。

（以下余白） （対照のプラーク数） 第１表 （注１） 単純ヘルペスウィルス１型および１型に薬剤濃度はポリ
ーＬ−リジンと結合した２１　、５１結合リボアデニル
酸塩の濃度第１表によると、ポリーＬ−リジンを結合し
た２＊　、　５＊結合リポアデニル酸塩は、濃度２５０
μ賛（２５０ｐｏｏｌ　／＋ａｇ）で、単純ヘルペスウ
ィルス１型およびＩ型の増殖を完全に阻止し、５０％有
効濃度は、Ｉ型およびＩ型が共に約２８ｍＭ（約２８ｐ
ｏｏｌ　／ｍｊ）であった。細胞毒性は、ＩｐＭｌｌ１
度以上の時だけ観察された。また第１表に示した５０％
有効１度（ＥＤ　　）から算出された選択毒性係数は、
単純ヘルペスウィルス１型およびＩ型に対して、 ０．５〜１７０．０２８　＝＝　１８〜３６であった。

実施例４：ポリ−し一リジンを結合した２１　、５１結
合リボアデニル酸塩からなるヌクレオ チド化合物のＲＳウィルスに対する増 殖抑制効果 実施例３と同様に、プラーク検定法により感染価の測定
を行ない、ウィルス増殖抑制効果を確認した。

実施例３において、ヒト由来胎児ｌＩ雄芽細胞（！２な
いし１３継代）の代りに、ヒト由来子宮頚部癌Ｈｅ１ａ
ＪＩ胞を使用したこと、３０ＰＦｔｌ（プラーク形成単
位）に調整した単純ヘルペスウィルス１型（Ｋ２Ｓ株）
および■型（０株）の代りに、１００ＰＦＵに調整した
ＲＳウィルス（ｔ、ｏｎｇ株）を接種したこと、培養温
度の３７℃を３５”Ｃにしたこと、および寒天凝固後に
感染細胞の増殖を３日間行なったこと以外は、実施例３
と同様にして、プラークを形成し、増殖狙止率（％）を
算出した。

その結果は第２表に示すとおりであった。

Ｎ２表 ＲＳウィルスに対する増殖■止効果 （以下余白） （注１） 薬剤濃度はポリーＬ−リジンを結合した２１　、５１結
合リボアデニル酸塩の１度第２表によると、ポリーＬ−
リジンを結合した２’、５’結合リボアデニル酸塩は、
濃度５００　ｎＭ（５００ｐＭｏｌ　／ｄ）で、ＲＳウ
ィルスの増殖を完全に狙止し、５０％有効濃度は１１　
ｎＭ　（１１ｐｏｏｌ　／−）であった。細胞毒性は１
９Ｍ以上において観察された。また第２表に示した５０
％有効濃度（ＥＤ　　）から算出された選択毒性係数は
、１〜２７０．０１　：　９１〜１８２ であって、単純ヘルペスウィルスに対するよりもＲＳウ
ィルスに対する方の２１　、５１結合リボアデニル酸塩
のを力性が高い、という特徴を有する。

ヒト由来子宮頚部癌細胞に対する増殖抑制効果は！μＭ
以上の濃度において観察された。

実施例５：ポリーＬ−リジンを結合した２’、５’結合
リボアデニル酸塩のヌクレオチド化 合物の単純ヘルペスウィルス夏型およ び夏型、ポリオウィルス、および水泡 性口内炎ウィルスに対する増殖抑制効 果 ヒト由来胎児線維芽細胞をプラスチックスシャーしく９
６　ｗｅｌｌ　、　ＮＵＮＫ社Ｗ）を用い、２％の子牛
血清（Ｇｉｂｃｏ社製）添加のイーグルＭＥＭ培地にお
いてｍ層培養した。濃度＋ｐｕの実施例１のポリ−し一
リジンを結合した２″、５″結合リボアデニル酸塩（２
％の修生血清含有ＭＥＭ培地に溶解）をシャーレの各々
の穴（ｙｅｌｌ）にｌ−ずつ添加し、３５℃において３
時間培養した。その後ＭＥＮ培地で１回洗浄し、単純ヘ
ルペスウィルス夏型（ＫＯＳ株）および夏型（０株）、
ポリオウィルスタイプｌ　　（ＭａｈｏｎｅＹ株）、な
らびに水泡性口内炎ウィルスの各希釈ウィルス（感染多
重度：　Ｍｏｌ　＝０．０１　）を接種し、緩やかに振
とうしなから３５”（において１時間吸着した。吸着後
ＨＥＭ培地で洗浄し、２％の子牛血清（Ｇｉｂｃｏ社製
）を含むＭＥＮ培地を１−ずつ各々の穴（ｔｅｌｌ）に
添加し、３５℃において培養し、経口的に採取した各サ
ンプルを一８０℃において凍結した。凍結細胞を３回凍
結、融解し、３０００　ｒｐｍおよび４℃において１０
分間遠心分離し、上滑のウィルス液のウィルスを常法に
従って同定し、ウィルスの力価をウィルス感染価測定法
により測定した。

これらの結果は、第２図および第３図に示すとおりであ
った。

第２図および第３図におけるＡ、Ｂ、ＣおよびＤはそれ
ぞれ単純ヘルペスウィルス夏型（Ｋ２Ｓ株）、その夏型
（０株）、水泡性口内炎ウィルスおよびポリオウィルス
（Ｍａｈｏｎｅｙ株）の場合であり、図における（−・
−）は対照であり、縦軸はウィルス力価（ＴＣＤ　　／
−の対数値）、そして横軸は各ウィルス吸着後の経過時
間（時間）を示す。

第２図によると、ポリーＬ−リジンを結合した２’、５
’結合リボアデニル酸塩はｌμにの濃度において単純ヘ
ルペスウィルス夏型および夏型の増殖を完全に阻止し、
優れた抗ウィルス作用が確認された。またａａ３図によ
ると、他の開Ａ型ウィルスの水泡性口内炎ウィルスおよ
びポリオウィルスに対しても、ウィルス感染後２日の培
養を経過した時にウィルス力価が対照のそれに対し、約
７８％低下し、１ｇ！著なウィルス増殖抑制効果のある
ことがわかった。

このことは、またウィルス増殖抑制の検定はウィルス感
染後２日間の培養期間が好ましいことを示す。

実施例６：ポリーＬ−リジンを結合した２’、５’Ｍ合
リボアデニル酸塩コ導体の２１−末 端を修飾した四量体トリホスフェート からなるヌクレオチド化合物の単純ヘ ルペスウィルス夏型および夏型に対す る増殖抑制効果 実施例３において、ポリーＬ−リジンを結合した２１　
、５１結合リポアデニル酸塩の代りに、実施例２で得た
ポリーＬ−リジンを結合した上記の誘導体を使用したこ
と以外は、実施例３と同様にして、ウィルス抑制効果を
確認した。

その結果は、実施例３における第１表の結果と対比して
示すと、次のとおりであった。

ポリーＬ−リジンを結合した上記の誘導体は、濃度１　
ｐＭ（１ｐＭｏｌ　／ｉ）において、単純ヘルペスウィ
ルス夏型および夏型の増殖を完全に狙止し、５０％有効
濃度（Ｅｅｌ　　）は、単純ヘルペスウイルスＩＩ型お
よびｌ型の双方ともに、約０．２　ｍＭの低濃度であり
、実施例３の２’、５’結合リボアデニル酸塩四量体３
リン酸の揚台に比べて１００倍以上の活性のあることが
わかった。

この結果は、単純ヘルペスウィルスｌｆｆ１および■型
の増殖駆出と濃度の相関関係が、Ｌ細胞抽出物を使用し
たｉｎ　ｖｉｔｒｏによる蛋白合成阻止と濃度とのそれ
に対して類似していることを示す。また活性の向上は２
′−末端を修飾した四量体トリホスフェートが２’、５
’結合リボアデニル酸塩分解酵素に対する低損性を付与
したことを示唆する。

実施例７：ポリーＬ−リジンを結合した２１　、５′結
合リポアデニル酸塩誘導体の２”−末 端を修飾した四量体トリホスフェート からなるヌクレオチド化合物のＲＳウ ィルスに対する増殖抑制効果 実施例４において、ポリ−し一リジンを結合したｚｌ　
、　５′結合リポアデニル酸塩に代えて、実施例２と同
一のポリーＬ−リジンを結合した２’、５’結合リボア
デニル酸塩誘導体の２′−末端を修飾した四量体トリホ
スフェートからなるヌクレオチド化合物を使用したこと
以外は、実施例４と同様にして、ウィルス増殖抑制効果
を確認した。

その結果は、実施例４の第２表の結果と対比して示すと
、次のとおりであった。

上記の誘導体は、濃度１ｐＨにおいてＲＳウィルスの増
殖を完全に阻止した。０．２μＭの濃度においても約４
０％のウィルス増殖抑制率を示したことを実施例４にお
いて４０％のウィルス増殖抑制率を示した８ｎＭと比較
すると、上記の誘導体が約４０倍以上の活性を育するこ
とが確認された。

このことは、上記の誘導体がＤＮＡウィルスだけでなく
、ＲＮＡウィルスに対しても、顕著な伝ウィルス効果を
有することを示す。

なお本発明のヌクレオチド化合物は、インターフェロン
の併用を増強するための共合剤として使用することで、
より有用な抗ウィルスおよび＠腫瘍の薬剤として使用す
ることができる。

本発明のヌクレオチド化合物は、水溶液中で大きな溶解
度を示し、各種の剤型において使用することができ、ま
た届所投与として病巣内投与、動脈局所１流投与、髄液
腔内投与、眼感染症に対する点眼ならびに上気道感染症
に対する点鼻および鼻咽喉への噴霧などが考えられる。

また皮膚科領域では、外部組繊に対して軟膏、クリーム
またはエアロゾルとして、感染部位に居所的に適用する
ことができる。

〔発明の効果〕

■２′、５′結合リボアデニル酸塩およびその誘導体に
細胞膜透過性を付与し、摂ウィルスおよび仇腫瘍の薬剤
としての利用を可能にすること。

■毒性の発現が少なく、特にウィルス変異耐性株の出現
が全くない払ウィルス剤を提供することができること。

■単純ヘルペスウィルス１型およびＩ型、ＲＳウィルス
、ポリオウィルスおよび水疱性口内炎ウィルスに起因す
るウィルス性疾唐に対し、非常に低濃度で著効を有する
治僚剤を提供しうろこと。

■ウィルスに起因する！１１１１！に対し、毒性の発現
が少なく、時にウィルス変Ｖ４ｉ＃性株の出現が全くな
い治ダ薬を提供しうること。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酢酸ナトリウム緩１１液（ｐＨ：　４．７５
）中のポリーＬ−リジン結合リボアデニル酸塩の吸収ス
ペクトルを示す図表であり、第２図は、単純ヘルペスウ
ィルス１型およびＩ型に対するウィルス力価の経時変化
を示す図表であり、また第３図は、水疱性口内炎ウィル
スおよびポリオウィルスに対するウィルス力価の経時変
化を示す図表である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上
   を除いて、常にＨ、アデノシン、またはＣ＿１＿〜＿２
   ＿０の第１級または第２級アルコールである。 ｍは、０、１、２、３または４である。 ｎは、１から１４までの整数である。 Ｋは、塩基性アミノ酸ペプチドである。 ｘは、１から１０までの整数である。〕 を有し、２′，５′−インターヌクレオチド結合、少な
   くとも１個のリボースアデニンユニットを有することを
   特徴とするヌクレオチド化合物。
2. （２）一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、−Ｙは、ＹがＨでありうる末端ホスフェート上
   を除いて、常にＨ、アデノシン、またはＣ＿１＿〜＿２
   ＿０の第１級または第２級アルコールである。 ｍは、０、１、２、３または４である。 ｎは、１から１５までの整数である。 −Ｚは、ＨまたはＣ＿１＿〜＿４＿０の炭化水素或いは
   置換炭化水素であって、その炭素原子の１つを通してモ
   ルホリン環のＮ原子に結合する基である。 Ｋは、塩基性アミノ酸ペプチドである。 Ｒ′は、水素、アルキル基、芳香族基および他の基から
   なる群より選択された基である。 ｘは、１から１０までの整数である。〕 を有し、２′，５′−インターヌクレオチド結合、少な
   くとも１個のリボースアデニンユニットおよび末端モル
   ホリンユニットを有することを特徴とするヌクレオチド
   化合物。
3. （３）請求項１または２に記載のヌクレオチド化合物を
   有効成分として含有するウイルス性疾患の治療剤。
4. （４）請求項１または２に記載のヌクレオチド化合物を
   有効成分として含有し、単純ヘルペスウイルスＩ型、単
   純ヘルペスウイルスII型、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ
   ｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、ポリオウイルスお
   よび水疱性口内炎ウイルスの群から選択されたウイルス
   に起因するウイルス性疾患の治療剤。
5. （５）請求項１または２に記載のヌクレオチド化合物を
   有効成分として含有する腫瘍の治療剤。
6. （６）請求項１または２に記載のヌクレオチド化合物を
   有効成分として含有し、ウイルスに起因する腫瘍の治療
   剤。