JPH02119772A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞を培養する装置に関し、特に温度、ｐ　＋
−［、溶存酸素濃度（Ｄｏ）を適正に保ち、栄養分供給
と老廃物除去のために培養液を自動的に交換する細胞培
養装置に関するものである。

このような細胞培養装置は、例えば細胞を高密度に培養
する高密度細胞培養装置として利用される。

（従来の技術） 高密度細胞培養装置では細胞を含み培養槽に収容された
培養液の上面にガスが供給されて接触する。培養液には
ｐ　Ｈセンサ、溶存酸素濃度センサ及び温度センサが浸
され、液面レベルを検出するレベルセンサが設けられて
おり、ｐ　Ｈセンサの検出信号によって培養液上面への
Ｃ０２ガス供給量が制御され、溶存酸素濃度センサの検
出信号によって培養液上面への０２ガス供給量が制御さ
れ、温度センサの検出信号によって培養液を加熱するヒ
ータへの通電が制御され、培養液の一部が取り出された
ときレベルセンサの検出信号によって新鮮培地ポンプが
作動して新鮮培地が培養槽に供給されて培養槽内の培養
液量が一定に保たれる。

培養の進行に伴なって細胞密度が増加してくる。

細胞密度の増加に伴なう環境条件の設定は、人間が培養
液の一部を系外に取り出し、細胞密度を測定して環境条
件の変更を行なっている。

（発明が解決しようとする課題） 細胞を培養する上で成長率と環境条件の間には密接な関
係があり、環境条件の設定を誤まると以降の細胞の成長
に悪影響がある。

環境条件の因子としては温度、ｐＨ１溶存酸素濃度、培
地交換量、スターラ回転数、培養液量などがある。人間
が細胞密度を測定しながらこれらの条件を最適化してい
くことは面倒な作業である。

本発明はこのような環境条件の変更を自動的に行なうこ
とを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 第１図と第３図を参照して本発明を説明する。

本発明の細胞培養装置では、培養槽２に収容された培養
液４の上面にガスが供給されて接触し、培養液４には溶
存酸素濃度センサ１２が浸され、溶存酸素濃度センサ１
２の検出信号によって制御部４２を介して培養液４の」
−面へのガス供給を制御するガス制御系８４と、培養液
４の一部が取り出されたときレベルセンサ１４の検出信
号によって制御部４２を介して培地交換ポンプ８０（５
０゜５４）が作動して新鮮培地を培養槽２に供給するレ
ベル制御系と、培養液に光を照射しその吸収から細胞密
度を測定する光学的な密度センサ７０と、制御部４２の
指示によって液面レベル設定値を変えるアクチュエータ
７６をもつレベルセンサ】４とを備えている。制御部４
２は前記各機能の他に、密度センサ７０の出力の変化量
として成長率を算出する成長率算出部７２と、密度セン
サ７０の出力と成長率とから培養液増加量を決定し、ア
クチュエータ７６の駆動を制御する培養液増加量決定部
７４−と、密度センサ７０の出力と成長率とから培地交
換量を決定し、培地交換ポンプ８０　（５０゜５４）の
駆動を制御する培地交換量決定部７８と、密度センサ７
０の出力が所定の値以上になると、ガス制御系８４を経
て溶存酸素濃度を増加させる溶存酸素濃度決定部８２と
を備えている。

（作用） 第２図は無血清培地を用いた高密度連続培養実験の結果
を表わしている。縦軸は生細胞密度、横軸は培養時間で
ある。

用いた細胞はＮＡＴ−３０（ヒト・リンパ系細胞）、基
本培地は（ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０）＋ＤＭＥ＋（Ｆ−
１２）、成長因子などはインスリン、トランスフェリン
、エタノールアミン、セレン、リポタンパク質、血清ア
ルブミンである。設定条件は、ｐＨが７．２、温度が３
７℃、攪拌は６０ｒｐｍであり、溶存酸素濃度が図のｔ
ａ、ｔｂ期間では５．０ｐｐｍ、、ｔｃ期間ではそれよ
りも高濃度である。培養液交換率はＬ１ｉ養槽の培養液
最大容量を１．０Ｑとすると、期間ｔａでは０、期間ｔ
ｂ、ｔｃでは２．ＯＱ７日とした。

第２図の実線で示される結果は実験者の判断で手動制御
したものであるが、環境条件設定がうまく行なわれた場
合である。

もし、培地に細胞を植え込んで密度の低い状態（期間ｔ
ａ）ｊこおいて、培地の交換を行なえば、破線Ａで示さ
るように細胞が死んで減少していく。

また、対数増殖期（期間ｔｂとｔｃで生細胞密度が飽和
するまで）において培養液の交換を行なわなければ、破
線Ｂで示されるようにやはり細胞が死んでいく。

また、生細胞密度が高密度になる期間ｔｃにおいて、溶
存酸素濃度を増加させなければ、破線Ｃで示されるよう
に生細胞密度が十分高くならずに飽和状態となってしま
う。

そこで、本発明では密度センサ７０によって細胞密度を
自動的に測定し、細胞密度と成長率とから第２図に実線
で示されるような細胞密度の増加登仙るように制御を自
動的に行なわせる。

そのため、制御部４２には第２図に示されるような実験
結果に基づくデータを知識データベースとして与え、細
胞密度が実線で示されるような結果になるように、糸ｌ
ｉｔ胞密度と成長率とから１８養液風、培地交換量及び
溶存酸素ａ度を自動的に設定させる。

培養液量の増加は、１ｇ養液増加量決定部７４かＪ′：
）の信号によってレベルセンサ１４のアクチユエータ７
Ｇが駆動されることによって実現される。レベルセンサ
１４が現在の１ｆ（養液４の液面より」−がるど、その
４−がった泣訴まてｈｔｆ地交換ポンプ８０によって１
合養液４が増加させられる。

培地交換量を変更するときは、培地交換旦決定部７８か
らの信号により、培地交換ポンプ８０か駆動される。

溶存酸素濃度を増加させるときは、溶存酸素濃度決定部
８２からの信号によりガス制御系８４が制御されて培養
液４の４−面と接する雰囲気中の酸素圧か高められる。

（実施例） 第３図は一実施例を表わす。

２は培養槽であり、培養液４が収容さ唱、でいる。

Ｉｆ（養液４には細胞か含まれている。培養槽２の」−
部は蓋６によって密閉され、ｌｔ′γｆ養液４の−Ｌ部
空間で培養液４とガスとが接触する。

蓋６を経て温度センサ８、ｐ　Ｈセンサ１０、溶存酸素
濃度センサ１２が培養液４に浸されている。

蓋６にはまた、培養液４の上部空間にガスを供給する供
給管１６とカスを排出する月に出管１８とが設けられて
いる。

培養液４の液面レベルを検出するために培養槽２の外側
にレベルセンサ１４が設けられている。

ガス供給管］６には０２、Ｃ○〜及びＮ＝　　（又は空
気）かそれぞれレキュレータ２２−１〜２２−３、電磁
弁２４−１〜２４〜３及び逆止弁２６１〜２６−３を経
て供給される。２８はフィルタ、４０は安全弁である。

排出管１８には排気ノズル３０、逆井弁３２、オリフィ
ス３４及び電磁弁３６が接続されている。３８は排気管
に設けられた圧力計である。

０２を供給するための電磁弁２４−１は、溶存酸素濃度
センサ】２の検出信号により、制御部４２によって溶存
酸素濃度が設定値になるように開閉が制御される。ＣＯ
：＝を供給する電磁弁２４２はｐ　Ｈセンサ１０の検出
信号により、制御部４２によってＰＨが設定値になるよ
うに開閉が制御される。Ｎ３を供給するための電磁ブ１
２４−３は培養槽２内の０２及びＣＯ？分圧を低くする
ため、また培養槽２内の０２．ＣＯＣガスを置換するた
めに用いられるものであり、ｐ　＋−（センサ１０と溶
存酸素濃度センサ１２の検出信号に従って制御部４２に
よって開閉制御される。

溶存酸素濃度センサ１２と電磁弁２４−１．２４−３に
よってガス制御系を構成し、ｐ　Ｉ−１センサ１０と電
磁弁２４−２．２４−３によってｐ　ｌ−１制御系を構
成し、でいる。

培養槽２の下部にはヒータ４４が設けらオｔている。温
度センサ８の検出信号によって、制御部４２により、温
度が一定になるようにヒータ４４の通電が制御される。

培養液４は潅流ポンプ４６によって培養槽２とタロスフ
ローフィルタ４８の間を循環させられる。

タロスフローフィルタ４８はセラミック製の円筒状フィ
ルタであり、細胞を含む培養液はフィルタ４８の内部を
通過する。培養液の一部はフィルタ４８外に濾過されて
排出される。濾過された培養液はスパン１−メディウム
ポンプ５０によって培養装置の系外に取り出される。５
２は取り出されたスペントメディウムである。培養槽４
には新鮮培地ポンプ５４によって系外の新Ｍ培地５６が
供給される。潅流ポンプ４６、スペントメディウムポン
プ５０及び新鮮培地ポンプ５４は制御部４２によって制
御される。

レベルセンサ１４が培養液４の液面レベルＬ検出してお
り、クロスフローフィルタ４８を経て培養液が排出され
ると培養槽内の培養液４の液面レベルが下がるので、制
御部４２はレベルセンサ１４の検出信号によって新鮮培
地ポンプ５４を作動させ、培養槽２に新鮮培地５６を供
給して培養液４の液面レベルがレベルセンサ１４の位置
になるように制御する。

レベルセンサ１４、制御部４２、潅流ポンプ４６、スペ
ントメディウムポンプ５０及び新鮮培地ポンプ５４はレ
ベル制御系を構成している。

培養液４中にはスタータ５８が設けられ、培養槽２の下
部にはマグネット６２が設けられている。

スタータモータ６０を介してマグネット６２を回転させ
ることによりスタータ５８を作動させる。

スタータモータ６０も制御部４２によって制御される。

６４は制御部４２の表示部であり、温度、ｐＨ１溶存酸
素濃度などを表示する。６６は制御部４２に温度などの
設定値を設定する設定部である。

潅流ポンプ４６とクロスフローフィルタ４８を含む流路
には第４図に示される光学的密度センサ７０が設けられ
ている。

第４図の密度センサでは、流路を構成するシリコンゴム
チューブ８６．８７の間に透明ガラス製のセル８９が設
けられ、培養液はセル８９中を通過する。セル８９を挟
んで一方からＬＥＤ９０によって光が照射され、セル８
９を透過した光はフォトダイオード９１によって受光さ
れる。光を用い、懸濁液試料による光吸収から懸濁液の
密度を求めるセンサは、一般には濁度センサとして使用
されている。本実施例における密度センサは、そのよう
な濁度センサと同じ原理を使ったものである。

第５図は細胞密度と密度センサ７０の出力の関係を表わ
したものであり、１対１の関係がある。

レベルセンサ１４は液面レベルの設定値を自動的に変え
ることのできるものであり、第６図にその一例を示す。

９２はＬＥＤ、９３はフォトダイオードであり、培養槽
２を挟んで対向するように支持部材９４により支持され
ている。支持部材９４はガイド９５によって上下方向に
移動可能に支持され、また支持部材９４にはねじ９６が
設けられ、そのねじ９６にはパルスモータ９８によって
回転する捧ねじ９７が螺合している。

支持部材９４、ねじ９６，９７及びパルスモータ９８は
レベルセンサ１４のアクチュエータであり、パルスモー
タ９８が作動することにより支持部材９４が上下方向に
移動すると、その移動した位置が新たな液面レベル設定
値となり、培養液４の液面が培地交換ポンプ５０．５４
によって移動させられる。

この液面センサ１４ではＬＥＤ９２から照射されてフォ
トダイオード９３に入射する光の強度が、培養液４の液
面位置により変化することを利用している。液面がＬＥ
Ｄ９２から照射されてフォトダイオード９３に入射する
光の光路よりも下にあれば受光される光強度が強く、液
面が上がって光路が液中を通ると屈折により光路が曲げ
られて光強度が弱くなる。

第７図は本実施における制御部４２と各種センサ及び駆
動部分との接続関係を示したものである。

制御部４２はＣＰ　Ｕ　４２　ａと第２図に示されるよ
うな実験結果を環境条件設定のための設定値として利用
する知識データベース４２ｂとから構成されている。知
識データベース４２ｂには、すでに設定されている培養
条件にさらにデータを追加することができる。

次に、一実施例の動作を第８図により説明する。

細胞を植え込み（ステップＳ１）、溶存酸素濃度、ｐＨ
１温度及び攪拌数を所定の値になるように設定する。密
度りを測定しくステップＳ２）、密度りの変化率から成
長率Ｒを算出する（ステップＳ３）。

密度りを知識データベースにより設定された第１の密度
Ｄ＋　　（例えばＩ　Ｘ　１０Ｇセル／　ｍ　Ｑ　）と
比較する（ステップＳ４）。密度りがＤ１以下の間は培
地を交換せず（ステップＳ５）、かつ、培養液の増加も
させない（ステップＳ６）。

培養を続けていると、やがて密度Ｄ　）　Ｄ　ｌとなる
（ステップＳ４）。密度りが設定された第２の密度Ｄ２
　　（例えばＩ　Ｘ　１０７セル／　ｍ　Ｑ　）以下で
ある間は溶存酸素濃度を一定のままとしくステップＳ８
）、成長率Ｒが５０％を越えていれば培地交換量を１日
当り５００　ｍ　ＱとしくステップＳ１０．５ｌｌ）、
培養液増加量を１目当り全培養液量の１１５とする（ス
テップ５１２）。ただし、培養槽に収容できる培養液の
最大容量を５００ｍＱとする。

さらに培養を続けて密度ｌ〕が第２の密度設定値１つ２
を越えると、そのときから溶存酸素濃度を増加させる（
ステップＳ７．Ｓ９）。溶存酸素濃度の増加には、培養
槽内の培養液上部の圧力を０．５ｋｇ／ｃｍ”増加させ
る。成長率Ｒが５０％を越えている間は交換量を５００
　ｒｎ　Ｑ　／日、増加量を１日当り全培養液量の１１
５として（ステップＳＩＯ，Ｓｌ　１，５１２）、培養
を続ける。

やがて、細胞密度が飽和状態に近づいてくると、成長率
が５０％以下になってくる。その後は培養液量を増加さ
せることなく、培地交換量を１０００　ｍ　Ｑ　／日と
する（ステップｓｔｏ、ＳＩ３．Ｓ６）。以後はこの条
件で培養を続ける。

（発明の効果） 本発明では密度センサによって培養液の密度を自動的に
測定し、測定した密度と、密度の変化量である成長率と
から培地交換量、培養液増加量及び溶存酸素濃度を自動
的に変化させるように制御したので、少址の培養液及び
細胞数からスター１〜して大量培養を行なう培養過程を
自動化することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の制御部に関係する部分を示すブロック
図、第２図は培養実験の結果を示す図、第３図は一実施
例を示す構成図、第４図は密度センサを示す概略正面図
、第５図は細胞密度と密度センサ出力の関係を示す図、
第６図はレベルセンサの一例を示す概略斜視図、第７図
は一実施例の制御部と各センサ及び駆動部の接続関係を
示すブロック図、第８図は一実施例の動作を示すフロー
チャー１〜図である。 ２　　・培養槽、４・　・培養液、１２・・・・・溶存
酸素濃度センサ、１４　　レベルセンサ、４２・制御部
、７０　・・密度センサ、７２　　・成長率算出部、７
４　　培養液増加量決定部、７Ｇ・・・・レベルセンサ
アクチュエータ、７８　　培地交換量＝１５ 決定部、８０　・・・培地交換ポンプ、８４交換系。 ガス 特許出願人　株式会社島津製作所 代理人　弁理士　野【」繁Δ１：

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞を含み培養槽に収容された培養液の上面にガ
   スが供給されて接触し、培養液には溶存酸素濃度センサ
   が浸され、溶存酸素濃度センサの検出信号によって制御
   部を介して培養液上面へのガス供給を制御するガス制御
   系と、培養液の一部が取り出されたときレベルセンサの
   検出信号によって制御部を介して培地交換ポンプを作動
   させて新鮮培地を培養槽に供給するレベル制御系と、培
   養液に光を照射しその吸収から細胞密度を測定する光学
   的な密度センサと、制御部の指示によって液面レベル設
   定値を変えるアクチュエータをもつレベルセンサとが備
   えられており、前記制御部は前記各機能部の他に、前記
   密度センサ出力の変化量として成長率を算出する成長率
   算出部と、前記密度センサ出力と成長率とから培養液増
   加量を決定し、前記アクチュエータの駆動を制御する培
   養液増加量決定部と、前記密度センサ出力と成長率とか
   ら培地交換量を決定し、前記培地交換ポンプの駆動を制
   御する培地交換量決定部と、前記密度センサ出力が所定
   の値以上になると、ガス制御系を経て溶存酸素濃度を増
   加させる溶存酸素濃度決定部とを備えている細胞培養装
   置。