JPH02122254A - 酵素電極を用いる測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、過酸化水素生成オキシダーゼを同体電極」二
に、直接もしくは選択透過膜を介して固定化した酵素電
極を用いて、緩衝液中に混入された試料中の被検出物質
を酸化し、生成する過酸化水素を検出することにより、
試料中の被検出物質濃度を測定する方法に関する。

従来の技術 固定化酵素作用電極を用いた計測装置は、簡便性、迅速
性および基質特異性等に優れた特徴を有し、臨床分析、
食品分析および環境計測等の広範な分野において、その
応用範囲を広げつつある。

なかでも、アンペロメトリックな計測を行う装置、すな
わち酵素反応によって生成または消費される電極活性物
質の増減を、定電圧を印加した作用電極からの電流出力
値の変化として捉える形式の装置は、高感度の測定を容
易に行うことができる。

したがって、このような測定方法に使用される各種の電
極、装置および方法が開発されている。

アンペロメトリックな測定方法の代表例としては、電極
反応で消費される酸素を、酸素電極によって計測する方
法と、電極反応で生成される過酸化水素を、過酸化水素
電極によって測定する方法とがある。この２種の測定方
法は、固定化酵素電極に最もよく用いられているが、応
答速度およびＳ／Ｎ比の点で、固定化過酸化水素生成オ
キシダーゼと過酸化水素電極とを組み合わせた方法が優
れている。

しかしながら、酵素電極の１つの欠点として、使用され
る過酸化水素電極が、一般的に固体の白金、金またはカ
ーボン等の固体電極からなるので固体電極表面の汚染に
よる感度変動は避けられないことが挙げられる。この汚
染の原因は、試料中の被検出物質以外の種々の化合物や
、酵素反応による過酸化水素以外の生成物なとであり、
さらに被検出物質自体が汚染原因となる場合がある。こ
のような固体電極表面の汚染は、固体電極上に直接酵素
を固定化した電極では、特に顕著となり、避けられない
現象である。

また、一般に、過酸化水素電極では、過酸化水素以外の
酸化可能な化合物、たとえばアスコルビン酸や尿酸によ
る測定の妨害を防ぐために、過酸化水素を透過し、これ
らの妨害物を透過させない選択透過膜を、固体電極表面
に設ける。したがって、過酸化水素と比べて汚染原因の
分子量が極度に大きい場合は、固体電極表面だけに汚染
が引き起こされることはない。このような比較的大きな
分子による汚染は酵素電極の接液表面、すなわち酵素を
固定した固定化膜の表面に発生し、基質である被検出物
質自体が透過しににくなるなどのトラブルの原因になる
。現状では試料調製方法を工夫して、予め試料から、こ
のような分子量の大きな汚染原因を除去し、上記トラブ
ルを避りている。

一方、過酸化水素と同程度の分子量、すなわち比較的低
分子の化合物の中には、選択透過膜を透過し、電極上で
化学反応を行わないながらも、固体電極表面に吸着し、
測定感度を変動させるものがある。したがって選択透過
膜を設けた場合においても、やはり固体電極表面の汚染
は問題となる。

このような固体電極表面の汚染による感度変動に対して
、固体電極表面の清浄化を目的として逆電位の印加（特
開昭第５７−６０２５５号、特開昭第６０−１５５９５
９号、特開昭第６２−１５６５５５号）や三角波電位走
査を行う方法（特開昭第６３−１２２９４２号）が提案
されている。

しかしながら、これらの方法の欠点としては、徐々に感
度変動か起きた場合に、清浄化操作を行う時点を決める
判定基準を定めなけれはならない点、および電位を変化
させるＶ＆横を設ける必要があり、装置自体が複雑化し
、装置の作成費用が高くなる点が挙げられる。

さらに、過酸化水素生成オキシダーゼの中には、酵素反
応の結果、それ自体が固体電極表面を汚染する可能性が
ある化合物を生成するものがある。

たとえば、低級アルコールの酸化反応を触媒するアルコ
ールオキシダーゼは、生成物として、そのアルコールに
対応するアルデヒドを生成する。このアルデヒド自体、
またアルデヒドの一部が電極上で酸化されて生成される
カルボン酸は、固体電極表面に吸着して、測定感度の低
下を引き起こす。

このような現象に類似の現象は、乳酸オキシダーゼを用
いた乳酸の定量の際にも認められる。この場合には、基
質である乳酸自体と、電極反応によって生成されるピル
ビン酸とによる感度変動が起こり得る。このような問題
点には、これまで有効な解決策が提示されず現在に至っ
ている。

発明が解決しようとする課題 本発明の１」的は、酵素電極を用いる測定を行う際に、
試料中に予め含まれるか、あるいは酵素反応の結果生し
た低分子の化合物が、白金、金またはカーボン等の固体
電極表面を汚染し、酵素電極の感度低下、あるいは再現
性不良を起こすことを防止し、高精度かつ再現性の良好
な測定を行うことかできる酵素電極を用いる測定方法を
提供することである。

課題を解決するための手段 本発明は、緩衝液中に試料を混入し、過酸化水素生成オ
キシダーゼを固体電極」−に直接固定化した酵素電極を
用いて、試料中の被検出物質を酸化し、生成する過酸化
水素を検出することにより、試料中の被検出物質濃度を
測定する方法において、前記緩衝液中に、一般式（１）
で表される化合物を含有させ、 Ｒ１，Ｒ２−ＣＨＣｏＯＨ（１） Ｒ］かアミノ基および水酸基から成る群から選択された
置換基であり、 Ｒ２か水素原子および炭素数が１がら４までの間である
アルキル基から成る群から選択された置換基であること
を特徴とする酵素電極を用いる測定方法である。

さらに本発明は、緩衝液中に試料を混入し、過酸化水素
生成オキシダーゼを、過酸化水素を選択的に透過する選
択透過膜を介して固体電極上に固定化した酵素電極を用
いて、試料中の被検出物質を酸化し、生成する過酸化水
素を検出することにより、試料中の被検出物質濃度を測
定する方法において、 前記緩衝液中に、一般式（１）で表される化合物を含有
させ、 Ｒ１，Ｒ２−ＣＨＣｏＯＨ・（１） Ｒ１がアミノ基および水酸基から成る群から選択された
置換基であり、 Ｒ２が水素原子、メチル基およびエチル基から成る群か
ら選択された置換基であることを特徴とする酵素電極を
用いる測定方法である。

作　　用 一般的に、清浄な固体電極表面は、各種の化合物により
汚染され易く、特にアミノ類またはカルボン酸類の汚染
物質によって著しく汚染されることか知られている。酵
素電極を用いた測定では、測定対象である試料は、臨床
試料、食品試料、あるいはＩＪ［水等の環境試１５１で
あり、」−述した汚染物質を含んでいる。したかつてこ
れらの汚染物質によって、固体電極表面か汚染されるこ
とは避けられない。

本発明者は、特に過酸化水素生成オキシダーゼを固定化
した酵素電極を用いて、酵素電極上て被検出物質を酸化
し、生成する過酸化水素を電気化学的に検出することに
より、被検出物質濃度を測定する方式において、酵素電
極に各種汚染物質を作用させ、その影響を阻止する方法
を検討し、本発明を完成するに至った。

汚染物質の固体電極表面への吸着を阻止するために、特
定の化合物を使用する場訃には、その化合物は、固体電
極表面に到達する必要かある。したかつて、本発明者は
、まず酵素電極を構成する固定化酵素層、もしくは固体
電極表面と固定化酵素層の間に設けられた妨害物を除去
するだめの選択透過膜を、一部ではあるが透過し、それ
自体は電極反応を起こさず、なおかつ固体電極となんら
かの相互作用を行う化合物を探索した。

選択透過膜は、過酸化水素を優先的に透過し、試料中に
共存するアスコルビン酸、尿酸等の還元性物質の透過を
制限するものであり、理想的酵素電極用選択透過膜にお
いては、分子量３４の過酸化水素のみが透過され、それ
を越える分子量の化合物は一切透過されないことが望ま
れる。しかし現実には、分子量１００前後を境界として
、それ以」二の分子量の化合物を透過しに＜＜、それ以
下の分子量の化合物を透過し易い膜を選択透過膜として
用いることになる。このような選択透過膜としては、公
知のアセチルセルロース膜、シリコン系膜、アクリル系
膜、さらにタンハク質を利用した膜く特開昭第６３−１
８２５５９号）等があるか、いずれの膜も同様の特性を
有している。

また選択透過膜を設けず、固１本電極表面に直接酵素層
を形成した場合にＪ３いても、基質となる化合物より分
子量か小さい物質は、固体電極表面へ拡散し易く、容易
に固体電極表面に到達することができる。したかつて、
目的とする化合物は、分子量が２００程度以下の化合物
から選ばれることになる。

具体的には、固体電極として白金電極をヘースとし、選
択透過膜として牛血清アルブミンを用い、グルコースオ
キシダーセを固定化したグルコース測定用電極を、１０
０＋ｎＭリン酸すトリウム緩衝液中に入れる。次に、そ
のＭ両液中に、汚染物質として１ｍＭの酢酸を添加し、
グルコースを測定するという実験を行う。このような実
験では、上記ＭｆＲ液に酢酸を添加して１５分以内に、
過酸化水素に対する電極応答が７０％程度に低下し、固
体電極表面が汚染された場合に相当する現象が起こる。

予め各種化合物を、上記緩ｆ＃液中に含有させ、上記実
験を行い、上述した感度低下を防止する化合物を探した
。

この結果、本発明にかかわる１ヒ合物、Ｒ１、Ｒ２−Ｃ
ＨＣＯＯＨ−（１） すなわち一般式（１）の構造を存する化合物を加えてお
くと、このような感度低下は認められず、さらにこれら
の化合物を１０ｍＭ程度含む緩衝液中に、１０　ｒｎ　
Ｍ以上の酢酸を添加しても感度変動が見られないことが
見いだされた。

緩衝液中に含まれる化合物は、一般式（１）の構造を有
し、固体電極上に直接酵素を固定化した酵素電極におい
ては、Ｒ１がアミノ基もしくは水酸基、Ｒ２が水素もし
くは炭素数が１がら４までのアルキル基のいずれかから
選ばれるものである。

つまり、このような化合物として、・グリコール酸およ
びその誘導体、クリシン、アラニン等のアミノ酸、およ
びその誘導体が好適に用いられる。

また選択透過膜を固体電極上に設け、選択透過膜を介し
てその溶液側に酵素を固定化した酵素電極においては、
Ｒ１がアミノ基もしくは水酸基、Ｒ２が水素、メチル基
またはエチル基のいずれがから選ばれるものである。

このような選択透過膜を有していない電極においては、
比較的分子量の大きな化自物も、固体型極表面に到達す
ることができる。しかしなから、上記アルキル基の長さ
かヘキシル基を越えると、水溶性が低下し、このような
化合物は固体電極表面に油状汚染物として吸着する恐れ
がある。したがってこれらの化合物をＭ＠液液中添加す
ることによって、逆に感度低下をもたらすことになり、
分子量の大きな化合物を利用することは困難である。特
に良好な結果を得るためには、アルキル基の炭素数は４
辺下であることが望まれる。

選択透過膜を固体電極上に設け、選択透過膜を介してそ
の溶液側に酵素を固定化した電極においては、Ｒ１がア
ミノ基また水酸基、Ｒ２が水素、メチル基またはエチル
基のいずれががら選ばれるものである。このような場合
には、選択透過膜をある程度透過し、固体電極表面と相
互作用を行うために、Ｒ２に制限が加えられる。

これらの化合物が効果を示す理由は、おそらく電極表面
との相互作用を強めるカルボキシル基、およびアミノ基
または水酸基を有し、さらに妨害物である酢酸等に比ノ
＼て大きな原子団が含まれているからだと考えられる。

つまり、一般式（１）で表される化合物は、予め固体電
極表面に吸着することにより、酢酸等の化合物に対して
は、拮抗的にその吸着を阻害するか、側鎖の立体障害か
らその被覆率は低く、過酸化水素程度の分子量のものに
関しては、電極反応を阻害するまてには電極表面を覆い
きらないと渚えられる。

これらの化合物は、水溶性が高いために酵素反応に用い
る緩衝液中に加えることは、きわめて容易である。一般
に、Ｆ！ｊ、両液中に、０．１〜１００ｍＭ程度、より
好ましくは１〜１０ｍＭ程度の濃度となるように添加す
ると効果を示す。低濃度過きる場合には、効果が薄れる
し、この範囲を越える濃度では、緩衝液のＭ衝能に影響
を与えたり、添加された化合物自体が温度の変動により
析出することがあり好ましくない。

また、これらの化合物は、特に酵素反応を阻害する作用
を有さず、その点ても利用しやすい。たたし、過酸化水
素生成オキシターゼの中で、アミノ酸オキシターセを利
用する場合には、たとえはＬ　アミノ酸オキシターセに
対しては、Ｌ−アミノ酸は使用できず、Ｄ−アミノ酸を
利用するように配慮するか、あるいはクリコール酸系の
化合物を使用するへきである。また、一般に、アミノ酸
系ｆヒ合物の方か安価であるため利用しやすいが、微生
物汚染による分解等も起き易いため、アミノ酸系化音物
を使用する場合には、各種の殺菌剤、制菌剤を併用する
ことか望ましい。また本発明の化合物を古む緩衝液は、
ハッヂａ１１１定系ても、フロー型ｊ１測装置を用いた
計測系でも、その効果を発揮する。

実施例 以Ｉζに実施例を示し、本発明をより具体的に説明する
か、もちろん本発明はこｉシのみに限定されるものでは
ない。なお、％は重量％を表ず。

実施例１ （１）電極グ）前処理方法 直径２　＋ｎ　ｍの白金線の側面を熱収縮テフロンて被
覆し、その白金線の一端をやすりおよび１５００番のエ
メリー紙で平滑に仕上けな。この白金線を作用極、ｌ　
ｃ　ｍ角白金板を対極、飽和カロメル電極（以下、ＳＣ
Ｅと略称する〉を参照電極として、０．１Ｍ硫酸中、＋
１．４Ｖて１０分間の電解酸化処理を行った。その後、
白金線をよく水洗した後、４０℃で５分間乾燥し、］、
　Ｏ％　７−アミツプロピルトリエｌ−キジシランの無
水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄した。このアミノ
シラン化した白金線上に酵素を固定化した。

（２）酵素の固定化方法 アルコールオキシタ゛−ゼ（シグマ社製、Ｐ　ｉ　ｃ　
ｌ＋　ｉ　ａ［匹蛙咀由来、液状酵素標品）］００μｒ
に、牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ
　Ｖ）　５　ｍｇを添加し、硫酸アンモニウムを飽和し
た］、　ＯＯｒｎ　Ｍリン酸す１ヘリウムＭ街液（ｐＨ
７，５）を、水冷下で１ｍＮ添加した。この操作で、溶
液は白濁し、酵素およびアルブミンが不溶化した。この
液を、４°Ｃで２００００Ｘｇ　（ｇは重力過速度を表
す）て、１０分間遠心分雌した。」二清を除き、１、０
０　ｍ　Ｍリン酸すトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を１
００μｒ加え、沈澱したタンパク質を再溶解］６ させた。この溶液を再溶解に用いたものと同し緩衝液に
対して、４°Ｃて１時間透析した。透析後の溶液を、Ｉ
づ下の固定化操作に用いた。透析までの操作により、」
−肥液状酵素標品に安定化剤として含まれる糖類やクリ
セロール、さらにタンパク質を沈澱させるのに用いた硫
酸アンモニウムか除去された。

透析後の液に、クルタルアルデピトを、０，２％になる
３１うに加えた。この混合液を、手早く先に用意したア
ミノシラシ（ヒ白金線」二に、３μｐのぜ、４０Ｔて１
５分間１に煤硬化した。その後、１００　川Ｍ　’、、
Ｊ　シＭ　ｔ　ｈ　リ’）　ムｉＪ衝？’ｌ　（ｐＨ７
，５）中に室温で保存した。

（３）測定方法 本発明に１ｘう測定方法で使用さハるフロー型測定装置
は、第１図に示される。上述のようにして作成された酵
素電極を作用型ｔｆ！６とし、また参照′、Ｅ極として
銀　塩１ヒ銀電極８を用い、これらを測定用セル５に収
りイ・１りた。このＩＩＩ定用上用セル５その内容積を
４０μβとした。作用電極６および銀　塩化銀電極８は
、緩衝液管路を介して対向して配置されている。対極７
として、測定用セル５からの出口側に取り（ｔ　ｉ−Ｊ
たステンレス管を用いた。

第１図において、緩衝液は、参照電極として用いた銀　
塩化銀電極８の電位を安定化するために、５０　ｍ　Ｍ
塩化カリウムを含み、かつ本発明に係わる化合物として
旧、−１ｃｕｃｉｃ　ａｃｉｄ（（ＣＩ＋、）　２ＣＨ
ＣＩＩ２Ｃ１ｌ　（Ｏｌｌ）　ＣＯＯ１１）　、すなわ
ち−・般式（１）において、旧−０１１，Ｒ２＝　（Ｃ
Ｉ＋３）　、ＣｌｌＣｌ＋。

を１　ｍ　Ｍ添加した１　００　ｍ　Ｍリン酸す１〜リ
ウム緩衝液（１）Ｉ（７，５）であり、緩衝液リザーバ
１がら供給される。この緩衝液は、高速液体クロマＩ・
クラフ用ポンプ２によって、流ｍ］、、ＯｍＮ／分て送
？夜された。

試料は、５μ！川のザンプリングループを装着したレオ
タイン社製７１２５型試ｆ−１１注入装置３／ｌ）ら注
入された。注入された試４パ１を緩衝液と混合および希
釈し、かつ温度を平衡化させるために、たとえは内径０
．５ｍｒｎ、長さｌ１１１のテフロン管をコイル状に巻
いた希釈混合用配管・１が設置されている。

注入装置３から測定用セル５までは３７±０２℃に制御
された恒温槽１２中に配置されている。

測定用セル５を出た廃液は、廃液リザーバ１１に排出さ
れる。また１１−用電極６の電位を規制し、電梳の検出
を行うポテンシオスタット９によって、作用電極６には
、銀　塩化銀型８ｉ！８に対して、＋〇、４５Ｖの電圧
が印加され、また検出された電流は、電圧変換後、増幅
されて記録計１０に出力され、これによって出力電流値
が記録された。

（４）測定方法および結果 まず、恒温槽の温度が安定した後、０．１ｍＭから４　
ｍ　Ｍの濃度のエタノール水溶液を５μｒ注入し、記録
計１０によって記録された曲線のベースラインからのピ
ークの高さを計測した。注入されたエタノールの濃度と
ピークの高、さ（電流値）より、第２図に示される検量
線を作成した。得られたデータは、最小二乗法により直
線近似し、その検量線の勾配を求めた。

次に、実試料としてビールの２５０倍希釈液５μｐを６
０回注入し、再び検量線を作成する。この操作を５回繰
り返したところ、検量線の勾配はほとんど変動せず、第
３図中○印で示すように一定であった。このときの検量
線の勾配の変化はライン１！１で示される。なお、ＤＬ
−ｌｃｕｃｉｃ　ａｃｉｄを含まない測定系において、
標準物質のみの注入により本酵素電極が熱失活により感
度変動しないことは別途確認しているため、ＤＬｉｅｕ
ｃｉｃ　ａｃｉｄの効果はビールに含まれる電極汚染物
質、たとえば酢酸等の有機酸による汚染を防いでいるも
のと考えられる。さらにこのＭ缶液中で、酵素電極を保
存しても、リン酸Ｍ缶液のみの場合と保存安定性に差は
認められなかった。

比較例１ （１）電極の前処理方法 実施例１と同様に電極を処理しな。

（２）酵素の固定化方法 実施例１と同様に固定化した。

（３）測定装置 測定に用いるＭ缶液からＤＬ−Ｉｅｕｃｉｃ　ａｃｉｄ
を除いたり外、実施例１と同様の装置を用いた。

（４）測定方法および結果 実施例１と同様の測定を行い電極感度の変動を評価した
・。その結果は第３図において、・印て示されている。

このときの検量線の勾配の変化は、ライン１２で示され
る。これより添加されたＤＬｅｕｃｉｃ　ａｃｉｄが、
電極感度には影響を及ぼさず、かつ実試料注入による感
度変動を防いでいることかわかる。

実施例２ （１）電極の前処理方法 実施例１と同様に電極を処理した。

（２）酵素の固定化方法 実施例１と同様に固定（ヒした。

（３）測定装置 測定に用いるＭ缶液に旧、１ｅｕｃｉｃ　ａｃｉｄのか
わりに、１０　ｍ　Ｍのグリシン、すなわち一般式く１
）においてＲ１＝ＮＨ２，Ｒ２＝Ｉ（、を加えた以外、
実施例１と同様の装置を用いた。

（４）測定方法および結果 実施例１と同様の測定を行い、電極感度の変動を評価し
た。その結果は、第４図において○印で示されている。

第４図に示されるように添加されたグリシンが、ＤＬ−
ｌｅｕｃｉｃ　ａｃｉｄと同様に電極感度には影響を及
ぼさず、かつ実試料注入による感度変動を防止している
ことがわかる。

実施例３ （１）電極の前処理 実施例１と同様に処理した。

（２）酵素の固定化方法 蒸留水１ｍｆに牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａ
ｃｔｉｏｎ　Ｖ）　２　ｒｎ　ｇを溶解し、水冷下で０
．２％になるように、グルタルアルデヒドを添加した。

この溶液を、前処理の完了した白金電極上に３μ！塗布
し、４℃で３０分間放置した。その後、４０°Ｃで１５
分間加熱処理を行い、架橋反応を完結し選択透過膜が形
成された。次に、牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒ
ａｃｔｉｏｎ　Ｖ）　５　ｍ　ｇとタルコースオキシダ
ーゼ（シグマ社製、Ｔｙｐｅ　Ｕ、配月すリーｇｉｌｌ
ｕｓユＬ１鶴」〜由来）５０１ｇとを、１００　ｒｎＭ
リン酸す１ヘリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７、０）　１　ｍ　
ｌに溶解し、０２％になるようにグルタルアルテヒトを
添加した。この溶液３μｐを、さきに選択透過膜を形成
した電極上Ｌに塗布し、４０°Ｃて１５分間加熱処理を
行い、固定化酵素層を形成した。

その後、１００　ｒｎ　Ｍリン酸すｌ−リウム緩衝液（
ｐＨ６０）中に保存した。

（３）測定装置 測定に際しては、緩衝液として、５０　ｍ　Ｍ塩化カリ
ウムと、５　ｒｎ　Ｍアラニン、ずなわち一般式（１）
において、Ｒ］−Ｎ　Ｈ２、Ｒ，２＝　ＣＨ３、とをｆ
ηむ］、　ＯＯｍ　Ｍリン酸すトリウムＭ＠液（ｐ’　
Ｈ６０）を用いた以外は、実施例１と同様の装置を使用
した。

（４）測定方法および結果 恒温槽１２の温度平衡に達してから、１０　ｍ　Ｍクル
コース標準液の応答泣を記録し、市販缶入りオレンジジ
ュースの２０倍希釈液を試料とし、１日当り５００回の
注入を行った。翌日、同じくクルコース標準液の応答値
を記録し、再びジュース希釈液の注入を繰り返した。以
後１００目まで、この測定を繰り返し、１日日の標準液
に対する応答値を１００％としたときの１０目目までの
相対感度を第５図中○印で示した。第５図かられかるよ
うに、感度の変動は、１２％の範囲であり、実質的に感
度低下は起きていない。

比較例２ （１）電極の前処理 実施例３と同様に処理した。

（２）酵素の固定化方法 実施例３と同様に固定化した。

（３）測定装置 測定に用いる緩衝液から、アラニンを除いた以外、実施
例３と同様の装置を用いて測定した。

（４）測定方法および結果 実施例３と同様に、繰り返し測定を行い、１０目の標準
液に対する応答値を１００％としたときの１０目目まで
の相対感度を、第５図において・印で示した。第５図か
られかるように、アラニンを禽まない緩衝液を用いたと
きには］、　Ｏｌ’］間に、約１５％の感度低下か認め
られた。さらに、この感度低−Ｉζした固定化酵素作用
電極に、銀　塩化銀電極８に対して、−０，］、Ｖから
＋−０，７Ｖの範囲て三角波電位走査を１００回繰り返
し行うことにより、感度か回復することを確認した。し
たかつて、アラニンの効果は、酵素の安定化に寄与して
いるわりてはなく、固体電極の汚染を防止していること
かわかる。

−１−述した実施例においては、このような測定に、通
常使用される緩衝液に、一般式（１）で示される各化音
物を添加しておけは、測定感度の低下を防止することが
てきるのて、測定装置のバー１〜ウエアを特に改善する
必要もなく、電位走査法等と比へて、きわめて簡便に実
施することができる。

発明の効果 辺−Ｌ説明したように、本発明によれは、固定化酵素作
用電極を用いて測定を行う際、高精度かつ安定な測定結
果を容易に得ることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例におけるフロー型側定装置を
示す系統図、第２図は本発明の実施例１における検量線
を示すグラフ、第３図は実施例１と比較例１の結果を示
すグラフ、第４図は実施例２の結果を示すグラフ、第５
図は実施例３と比較例２の結果を示すグラフである。 １　緩衝液リザーバ、２　ポンプ、３　注入装置、４　
希釈混合用配管、５　測定用セル、６固定１ヒ酵素作用
電極、７　対極、８　参照電極、９　ボテンシオスタツ
１へ、１０　記録３１．１１廃液リサーバ、１２・恒温
槽 代理人　　弁理士　西教　圭一部

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）緩衝液中に試料を混入し、過酸化水素生成オキシ
   ダーゼを固体電極上に直接固定化した酵素電極を用いて
   、試料中の被検出物質を酸化し、生成する過酸化水素を
   検出することにより、試料中の被検出物質濃度を測定す
   る方法において、 前記緩衝液中に、一般式（１）で表される化合物を含有
   させ、 Ｒ１、Ｒ２−ＣＨＣＯＯＨ・・・（１） Ｒ１がアミノ基および水酸基から成る群から選択された
   置換基であり、 Ｒ２が水素原子および炭素数が１から４までの間である
   アルキル基から成る群から選択された置換基であること
   を特徴とする酵素電極を用いる測定方法。
2. （２）緩衝液中に試料を混入し、過酸化水素生成オキシ
   ダーゼを、過酸化水素を選択的に透過する選択透過膜を
   介して固体電極上に固定化した酵素電極を用いて、試料
   中の被検出物質を酸化し、生成する過酸化水素を検出す
   ることにより、試料中の被検出物質濃度を測定する方法
   において、 前記緩衝液中に、一般式（１）で表される化合物を含有
   させ、 Ｒ１、Ｒ２−ＣＨＣＯＯＨ・・・（１） Ｒ１がアミノ基および水酸基から成る群から選択された
   置換基であり、 Ｒ２が水素原子、メチル基およびエチル基から成る群か
   ら選択された置換基であることを特徴とする酵素電極を
   用いる測定方法。